本發(fā)明涉及實時檢測煙氣暴露條件下動物腦內單胺類神經遞質變化分析的方法，本方法通過在線微透析技術收集實時暴露于煙氣中的實驗動物腦組織樣品，再利用高效液相色譜-庫侖陣列電化學檢測器對腦透析液樣品中的單胺類神經遞質及其代謝物進行快速的在線分析，從而實時評價煙氣吸入暴露前后單胺類神經遞質的變化特征。
背景技術：
：卷煙煙氣和電子煙氣溶膠都含有煙草的重要特征成分——煙堿（Nicotine）。煙堿依賴的發(fā)生是吸煙成癮的主要原因，也是持續(xù)吸食煙草制品進而危害健康的根本原因。攝入體內的煙堿能迅速透過血腦屏障并廣泛分布于腦組織各區(qū)域，其主要作用于中腦邊緣多巴胺（Dopamine,DA）系統而產生獎賞效應。事實上，包括DA、5-羥色胺（5-HT）等單胺類神經遞質都參與了煙堿神經藥理學效應的發(fā)生過程。因此，開發(fā)一種新的檢測方法能夠對煙氣暴露引起的動物腦內單胺類神經遞質的釋放及代謝變化進行準確測定和實時評價，將為揭示吸煙成癮的發(fā)生機理提供重要的手段支撐。生物樣品中單胺類神經遞質的測定多采用高效液相色譜-電化學檢測法（HPLC-ECD），其中高效液相色譜-庫侖陣列電化學檢測器因其多通道響應而呈現出的高選擇性和高靈敏度，應用較為廣泛。采用在線微透析技術(Onlinemicrodialysis)與HPLC-ECD聯用可以實現對DA、5-HT等單胺類神經遞質的活體、動態(tài)測定，但是該方法僅能評價藥物暴露（如煙堿注射）之后引起的單胺類神經遞質含量變化；采用動物整體暴露吸入煙氣（將動物置于密閉的煙氣艙內）的暴露方式亦無法同步完成煙氣實時暴露和動物腦內單胺類神經遞質的在線測定。技術實現要素：本發(fā)明正是針對目前無法同步實現煙氣吸入暴露和單胺類神經遞質在線測定的不足，而專門開發(fā)的一種實時監(jiān)測煙氣暴露條件下動物腦內單胺類神經遞質變化的分析方法。本方法通過利用改造后的實驗動物鼻部吸入暴露夾持器實現了動物口鼻式煙氣暴露系統與微透析系統的聯用，進而通過采用在線微透析與高效液相色譜-庫侖陣列電化學檢測器聯用技術實現了對煙氣吸入暴露實驗動物腦組織樣品的實時采集與在線測定，達到了煙氣吸入暴露與腦內單胺類神經遞質變化測定同步進行的技術要求。在本方法中，實驗動物采用了僅口鼻吸入（nose-only）的方式暴露于煙氣中，更加接近于人類吸食煙草制品的方式，克服了無法實時評價煙氣吸入（煙堿攝入）引起的單胺神經遞質變化的技術難題，具有操作簡便、結果準確可靠等優(yōu)點。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現的：一種實時檢測煙氣暴露條件下動物腦內單胺類神經遞質變化的方法，采用動物口鼻式吸入煙氣暴露系統將動物實時暴露于煙氣中，通過在線微透析技術收集動物腦組織樣品，再利用高效液相色譜-庫侖陣列電化學檢測器對腦透析液樣品中的單胺類神經遞質及其代謝物進行快速分析，從而實時監(jiān)測煙氣暴露前后動物腦內單胺類神經遞質的變化特征,進而根據樣品中DA、5-HT及其代謝物的分析檢測結果實時評價煙氣暴露引起的腦內單胺類神經遞質變化規(guī)律。該方法具體步驟如下：a.煙氣暴露：利用吸煙機抽吸卷煙或采用氣溶膠發(fā)生器使電子煙液產生氣溶膠，將頭部裝有微透析探針導管的動物放入一個專用的實驗動物固定夾持器，以使該夾持器挾持動物僅以口鼻吸入方式暴露于一定濃度的煙氣中；b.腦微透析樣品收集：運行微透析系統后將微透析探針插入動物頭部的導管中連續(xù)收集動物腦透析液于在線進樣器的定量環(huán)中，每隔一定時間通過在線進樣器自動注入運行的高效液相色譜中。c.高效液相色譜-庫侖陣列電化學檢測器分析：設定梯度洗脫程序和進樣序列并運行高效液相色譜-庫侖陣列電化學檢測器檢測微透析樣品，使得每個樣品的檢測時間略小于該樣品的收集時間。d.標準溶液配制及標準曲線繪制：分別稱取DA、3,4?二羥基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)、5-HT和5?羥吲哚乙酸(5-HIAA)5種標準品各10mg，分別置于100mL容量瓶中，用甲醇/水溶液（20:80，體積比，下同）溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度各為100μg/mL的標準儲備溶液；分別移取1.0mL的標準儲備溶液，置于同一支100mL容量瓶中，用甲醇/水稀釋至刻度，搖勻，得濃度各為1.0μg/mL的一級混合標準溶液；準確移取0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.0和50.0mL一級混合標準溶液，分別置于不同的100mL容量瓶中，用復方氯化鈉注射液稀釋至刻度，搖勻，得到濃度均0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0和500.0ng/mL的系列混合標準溶液。將系列混合標準溶液按由低到高的濃度順序進行高效液相色譜-庫侖陣列電化學檢測器分析，以各目標分析物的色譜峰面積（Y）對其相應的濃度（X）進行線性回歸，得到標準曲線回歸方程。e.數據分析及處理：根據標準曲線法計算透析液樣品中各目標物的含量，依據結果分別繪制煙氣暴露前、后各時間點腦內單胺類神經遞質及其代謝物的濃度-時間變化曲線，揭示煙氣暴露引起腦內單胺類神經遞質變化的規(guī)律。本發(fā)明一方面利用動物口鼻式煙氣暴露系統，能夠以更加接近于人類吸食煙草制品的方式使動物通過僅鼻吸入的方式暴露于煙氣中，另一方面還利用在線微透析與高效液相色譜-庫侖陣列電化學檢測器聯用技術，不僅能實時獲得暴露于煙氣中的動物腦部樣品并實現在線檢測單胺類神經遞質，同時還具有靈敏度高、取樣間隔時間短和分析速度快等特點。利用本發(fā)明的技術方案不僅能同時檢測出動物腦內5種單胺類神經遞質化合物，還實現了煙氣暴露時引起動物腦內單胺類神經遞質變化的在線、動態(tài)測定，與現有技術相比取得了明顯進步，開創(chuàng)了一種新的用于煙氣暴露后動物腦內單胺類神經遞質代謝變化的監(jiān)測方法。附圖說明圖1為本發(fā)明測試方式示意圖。圖1中序號：1為微透析灌流泵，2為位于夾持器中僅通過口鼻式吸入煙氣的動物，3為微透析探針，4為在線自動進樣器，5為高效液相色譜-庫侖陣列電化學檢測器系統）。圖2為大鼠腦微透析樣品中5種目標物的HPLC-ECD檢測圖譜；圖中：a.DA；b.5-HT；c.DOPAC；d.5-HIAA；e.HVA。圖3為卷煙煙氣暴露前后大鼠腦內DA的濃度-時間變化趨勢圖。圖4為卷煙煙氣暴露前后大鼠腦內DOPAC的濃度-時間變化趨勢圖。圖5為卷煙煙氣暴露前后大鼠腦內HVA的濃度-時間變化趨勢圖。圖6為卷煙煙氣暴露前后大鼠腦內5-HT的濃度-時間變化趨勢圖。圖7為卷煙煙氣暴露前后大鼠腦內5-HIAA的濃度-時間變化趨勢圖。圖8為電子煙煙氣暴露前后大鼠腦內DA的濃度-時間變化趨勢圖。圖9為電子煙煙氣暴露前后大鼠腦內DOPAC的濃度-時間變化趨勢圖。圖10為電子煙煙氣暴露前后大鼠腦內HVA的濃度-時間變化趨勢圖。圖11為電子煙煙氣暴露前后大鼠腦內5-HT的濃度-時間變化趨勢圖。圖12為電子煙煙氣暴露前后大鼠腦內5-HIAA的濃度-時間變化趨勢圖。圖13為本發(fā)明專用的實驗動物固定夾持器結構示意圖。圖中：2-1為前端口，2-2為腦微透析取樣天窗，2-3為頭部固定腔，2-4為身部固定腔，2-5為推桿，2-6為端蓋，2-7為固定螺帽，2-8為弧形推送頭。具體實施方式本發(fā)明結合以下實施例做進一步描述，但并不限制本發(fā)明。1.實驗材料：雄性成年SD正常大鼠，10周齡，體重（200±20）g，采用獨立隔離飼養(yǎng)籠具飼養(yǎng)，自由進水，標準顆粒進食。2.主要實驗器材：動物口鼻吸入煙氣暴露設備，包含轉盤式吸煙機、氣溶膠發(fā)生器和動物口鼻吸入暴露裝置（HRH-MNE63150，北京慧榮和公司）；微透析系統(包括CMA/402微透析泵、CMAon-lineinjector在線自動進樣器、CMA12微透析探針及導管，瑞典CMA公司)；SN-1N型腦立體定位儀(日本Narishige公司)；高效液相色譜-庫侖陣列電化學檢測器（5600ACoulArray，美國Thermo公司）；改造后的實驗動物鼻部吸入暴露夾持器結構參見圖13（并另行申請專利）。3.實驗方法：本發(fā)明的方法包括以下步驟：（1）微透析探針導管腦部植入：大鼠稱重后，以20%氨基甲酸乙酯溶液按1.25g/kg劑量腹腔注射麻醉，固定在立體定位儀上，開顱去除部分硬腦膜，依定位坐標(AP：+2.5mm；ML：?1.2mm；DV：?6.6mm)于大鼠腦伏隔核內植入探微透析針套管并用牙科水泥固定。手術后，大鼠單籠喂養(yǎng)恢復24小時。（2）煙氣口鼻吸入暴露：利用轉盤式吸煙機在ISO3308抽吸條件下(每次抽吸容積為35ml，抽吸2s，間隔60s)抽吸卷煙產生卷煙煙氣或將電子煙煙液加入到氣溶膠發(fā)生器中產生電子煙煙氣（氣溶膠），將腦部植有微透析探針導管的實驗大鼠置于改造后的實驗動物鼻部吸入暴露夾持器中，隨后接入動物口鼻吸入暴露裝置中；精確控制動物口鼻吸入暴露裝置的溫度、稀釋空氣流速等參數，使實驗大鼠暴露于恒定總粒相物（TPM）濃度的煙氣中。（3）微透析取樣：將微透析探針（CMA12）插入實驗大鼠頭部的探針導管中并連通微透析管路，采用濾過的林格氏液（復方氯化鈉注射液）以2.0μL/min的速度灌流取樣。（4）樣品檢測：將微透析取樣管路通過在線自動進樣器與高效液相色譜-庫侖陣列電化學檢測器連接以實現微透析樣品的在線自動進樣分析，根據5種目標化合物的色譜行為（圖2）及分析時間（在下述色譜條件下14min內可完成一次樣品的檢測）設定在線自動進樣器的進樣間隔為15min。色譜條件色譜柱：DiscoveryHSF5柱(4.6mm×150mm，3μm)；柱溫：30℃；流動相：A：甲醇，B：緩沖鹽液，含有40mmol/L檸檬酸、20mmol/L磷酸氫二鈉和0.3mmol/LEDTA；流速：0.25mL/min；梯度洗脫條件見表1；進樣量：20μL；根據各目標物的伏安曲線設置庫侖陣列電化學檢測器的8道工作電勢為：?50、0、50、175、200、350、400、500mV。表1梯度洗脫條件時間（min）流動相A（%）流動相B（%）0109042575132575141090（5）標準曲線的建立及樣品數據分析在未連通微透析系統下將系列混合標準溶液按由低到高的濃度順序進行HPLC-ECD分析，以各目標物的色譜峰面積（Y）對其相應的濃度（X）進行線性回歸，得到標準曲線回歸方程。利用標準曲線法對檢測的大鼠腦微透樣品中5種目標物進行定量分析，依據結果分別繪制煙氣暴露前、后各時間點腦內單胺類神經遞質及其代謝物的濃度-時間變化曲線，揭示煙氣暴露對單胺類神經遞質的影響規(guī)律。實施例1某參比卷煙煙氣暴露后的大鼠腦內單胺類神經遞質變化檢測試驗按照上述步驟（1）進行大鼠腦部微透析探針導管植入試驗，隨后按照步驟（2）進行參比卷煙抽吸和大鼠煙氣口鼻式吸入暴露，使實驗大鼠暴露于TPM濃度為200mg/m3的卷煙煙氣中，然后按照步驟（3）進行微透析試驗，按照步驟（4）進行樣品檢測，最后按照步驟（5）進行樣品的數據分析。圖3、圖4、圖5、圖6和圖7分別為卷煙煙氣暴露前后大鼠腦內DA、DOPAC、HVA、5-HT和5-HIAA的濃度-時間變化曲線示意圖。結果表明，卷煙煙氣暴露期間，大鼠伏隔核內DA和5-HT的釋放持續(xù)增加，DA的初級代謝產物DOPAC的含量無顯著變化，而DA和5-HT各自的終級代謝產物HVA和5-HIAA的含量明顯升高，說明本發(fā)明方法可用于連續(xù)監(jiān)測卷煙煙氣暴露前后大鼠腦內單胺類神經遞質的變化規(guī)律。實施例2某電子煙煙氣暴露后的大鼠腦內單胺類神經遞質變化檢測試驗按照上述步驟（1）進行大鼠腦部微透析探針導管植入試驗，隨后按照步驟（2）利用氣溶膠發(fā)生器進行電子煙氣溶膠的產生和大鼠煙氣口鼻式吸入暴露，使實驗大鼠暴露于TPM濃度為1000mg/m3的電子煙煙氣中，然后按照步驟（3）進行微透析試驗，按照步驟（4）進行樣品檢測，最后按照步驟（5）進行樣品的數據分析。圖8、圖9、圖10、圖11和圖12分別為電子煙煙氣暴露前后大鼠腦內DA、DOPAC、HVA、5-HT和5-HIAA的濃度-時間變化曲線示意圖。結果表明，電子煙煙氣暴露期間大鼠伏隔核內DA和5-HT的變化呈現出與卷煙煙氣暴露時相似的規(guī)律，說明本發(fā)明方法也可用于實時監(jiān)測電子煙煙氣暴露前后大鼠腦內單胺類神經遞質的變化信息。當前第1頁1 2 3