一種石墨烯信號(hào)放大的微囊藻毒素?lr電化學(xué)檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種石墨烯信號(hào)放大的微囊藻毒素?LR電化學(xué)檢測方法，該方法包括以下步驟：(1)在MCH/Au NPs/Au電極的表面分別滴加體積比為(9?11):(4?6):(2?4):(1?3)的核酸內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液、石墨烯?適配體復(fù)合物、待測的微囊藻毒素?LR溶液和核酸內(nèi)切酶溶液；(2)將MCH/Au NPs/Au電極在25?35℃下培養(yǎng)1?2個(gè)小時(shí)，用乙醇和超純水輕輕淋洗電極表面，去除結(jié)合較弱的石墨烯，隨后在氮?dú)庀赂稍铮〕龊筮M(jìn)行電化學(xué)方法檢測，測定微囊藻毒素?LR溶液的濃度。本發(fā)明所建立的方法利用了高靈敏的電化學(xué)分析技術(shù)與高專一性識(shí)別能力的核酸適配體有效地結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了環(huán)境中痕量微囊藻毒素?LR的超靈敏、高專一性的檢測，且儀器廉價(jià)便攜，方法簡單易行，可以快速得到結(jié)果。
【專利說明】
_種石墨稀信號(hào)放大的微囊藻毒素-LR電化學(xué)檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種微囊藻毒素-LR的檢測方法，尤其是涉及一種石墨烯信號(hào)放大的 微囊藻毒素-LR電化學(xué)檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，環(huán)境問題尤為嚴(yán)重，許多水域都出現(xiàn)了藍(lán)藻爆發(fā)的情況。微囊藻毒素 (MicrocystinsMCs)是由藍(lán)藻在富營養(yǎng)化水體中產(chǎn)生的一種生物毒素，它是由七個(gè)氨基酸 構(gòu)成的具有生物活性的環(huán)狀七肽類化合物。微囊藻毒素有著許多種類，目前已確認(rèn)的異構(gòu) 體就達(dá)九十多種。其中微囊藻毒素-LR(Microcystin-LR，MC-LR)便是其中的一種異構(gòu)體，微 囊藻毒素-LR在水中存在最為普遍，也是毒性最強(qiáng)的一種微囊藻毒素，對(duì)水體中微囊藻毒 素-LR含量進(jìn)行控制與高靈敏監(jiān)測具有非常重要的環(huán)境意義。
[0003] 目前，測定微囊藻毒素 -LR的方法主要是采用傳統(tǒng)儀器分析方法，例如高效液相色 譜法，液-質(zhì)聯(lián)用法等，這些方法具有好的靈敏度和準(zhǔn)確性，然而分析過程往往非常復(fù)雜，費(fèi) 力且耗時(shí)。近年來，有研究工作者利用抗體的特異性識(shí)別作用，構(gòu)建微囊藻毒素 -LR的免疫 傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)微囊藻毒素 -LR的較為簡單、快捷的檢測，并取得較高的靈敏度和選擇性。 然而，微囊藻毒素 -LR抗體提取的成本較高，過程極其復(fù)雜，且提取周期較長，因此在實(shí)際應(yīng) 用中鮮有報(bào)道。
[0004] 核酸適配體，是通過SELEX技術(shù)篩選出具有高度專一性結(jié)合靶物質(zhì)的一系列短鏈 核苷酸序列，具有類似于抗體的特異性識(shí)別性能，具有可在體外化合成，合成周期短，不需 要復(fù)雜的提取步驟，且穩(wěn)定性好等優(yōu)于抗體的諸多性質(zhì)。由于其獨(dú)特的性能，基于不同方法 發(fā)展的核酸適配體傳感器具有廣泛的應(yīng)用前景。自從微囊藻毒素-LR的核酸適配體于2004 年被篩選出來后，用于微囊藻毒素-LR測定的適配體傳感器已有大量報(bào)道，如熒光法，比色 法等。其中，熒光適配體傳感器需要對(duì)適配體進(jìn)行熒光基團(tuán)標(biāo)記來獲得響應(yīng)信號(hào)，因此標(biāo)記 過程復(fù)雜，費(fèi)時(shí)，且可能對(duì)微囊藻毒素-LR和適配體間的親和性有一定影響。比色適配體傳 感器，方法簡單，快速，但往往靈敏度較低。而電化學(xué)分析方法由于其具有操作簡單、響應(yīng)快 速，且靈敏度高，環(huán)境友好，易實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測等優(yōu)點(diǎn)，受到了越來越多的關(guān)注與應(yīng)用。因此， 我們設(shè)想將高靈敏的電化學(xué)分析方法，與具有高親和力的核酸適配體技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)筑微 囊藻毒素-LR的電化學(xué)適配體傳感器，進(jìn)而建立用于實(shí)現(xiàn)高靈敏、高選擇性檢測微囊藻毒 素-LR新型電化學(xué)分析方法。中國專利200810242879.5公開了一種微囊藻毒素-LR定量快速 檢測傳感器的制備及應(yīng)用，但是該專利為選用生物抗體作為選擇性機(jī)制的電化學(xué)傳感器， 相對(duì)于核酸適配體，抗體培養(yǎng)的成本與周期較核酸適配體高，且過程較為復(fù)雜，不是很適合 在實(shí)際檢測中使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種制備簡單、成本 低廉、高靈敏度高選擇性的檢測微囊藻毒素-LR的電化學(xué)檢測方法。
[0006]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
[0007] 金納米粒子(Au NPs)修飾裸金電極(Bare Au)為基體電極，同時(shí)在體系外將石墨 烯與適配體復(fù)合形成石墨烯_適配體復(fù)合物，與核酸內(nèi)切酶結(jié)合，構(gòu)筑了一種簡單，快速的 電化學(xué)檢測方法，可實(shí)現(xiàn)高靈敏和高選擇性檢測MC-LR。
[0008] -種石墨烯信號(hào)放大的微囊藻毒素-LR電化學(xué)檢測方法，該方法包括以下步驟：
[0009] (1)在MCH/Au NPs/Au電極的表面依次滴加體積比為（9-11): (4-6): (2-4): (1-3) 的核酸內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液、石墨烯-適配體復(fù)合物、待測的微囊藻毒素-LR溶液和核酸內(nèi)切 酶溶液；
[0010] (2)將MCH/Au NPs/Au電極在25-35°C下培養(yǎng)1~2個(gè)小時(shí)，用乙醇和超純水淋洗電 極表面，去除結(jié)合較弱的石墨烯，隨后在氮?dú)庀赂稍铮〕龊筮M(jìn)行電化學(xué)方法檢測，測定微 囊藻毒素-LR溶液的濃度。
[0011] 所述的MCH/Au NPs/Au電極采用以下步驟制備：
[0012] (1)以金電極為工作電極，含有濃度為1~5mmol/L氯金酸的0 ? 05-0 ? 2mol/L的KC1 溶液為電解液，采用三電極體系，在-1.2-1.0V電位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安法掃描，掃描圈數(shù) 為10-25圈，得到Au NPs/Au電極；
[0013] (2)將得到的Au NPs/Au電極浸入含30-60mmol/L的6-巰基-1-己醇的乙醇溶液中 密封，常溫下培養(yǎng)24小時(shí)后將電極取出，分別用乙醇和水淋洗，得到MCH/Au NPs/Au電極，在 氮?dú)庵懈稍飩溆谩?br>[0014]所述的石墨烯-適配體復(fù)合物采用以下步驟制備：
[0015] (1)在10~20wiiol/L的微囊藻毒素-LR核酸適配體的溶液中，加入濃度為0.1~ 0.3mg/mL的石墨烯水溶液，將其置于冰水浴中，超聲三小時(shí)，得到黑色分散懸浮液；
[0016] (2)將得到的黑色分散懸浮液離心5-10分鐘后，取上清液，得到石墨烯-適配體復(fù) 合物，在4°C下冷藏備用。
[0017] 所述的微囊藻毒素-LR的核酸適配體的堿基序列為：
[0018] 5 '-GGCGC-CAAAC-AGGAC-CACCA-TGACA-ATTAC-CCATA-CCACC-TCAT T-ATGCC-CCATC-TCCGC-3'。
[0019] 所述的核酸內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液為Tris-HCl緩沖液反應(yīng)緩沖液（50-200mM，含12_ 50mM MgCl2,0.5-2mM CaCl2,PH=7.5,25-35〇C) 〇
[0020] 所述的核酸內(nèi)切酶溶液的酶的活力單位為500-1500U/mL。
[0021] 所述的電化學(xué)方法為差分脈沖伏安法，根據(jù)峰電流值與微囊藻毒素-LR濃度之間 的線性關(guān)系建立工作曲線。
[0022] 所述的電化學(xué)方法采用的電解液為pH=7.0,含3-10mmol/L的二茂鐵甲酸及0.05_ 0.3mo 1 /L高氯酸鈉的10-30mmo 1 /L的磷酸鹽緩沖溶液。
[0023]本發(fā)明中用于MC-LR的選擇性檢測，可具體采用以下方法：
[0024]向含有MC-LR的溶液中加入100倍MC-LR溶液濃度的干擾物，采用差分脈沖伏安法 測定混合溶液的峰電流響應(yīng)。根據(jù)加入MC-LR和干擾物引起的峰電流的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)MC-LR的 選擇性分析;所述的干擾物為百草枯，啶蟲脒，敵百蟲，殺蟲單，氧樂果或草甘膦的一種。
[0025]本發(fā)明以微囊藻毒素-LR核酸適配體為識(shí)別元素，將其與高靈敏的電分析方法相 結(jié)合，進(jìn)一步通過設(shè)計(jì)與利用核酸內(nèi)切酶輔助石墨烯信號(hào)放大作用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)微囊藻毒素- LR的高靈敏、特異性分析。選用金納米粒子沉積修飾的金電極為基底電極，可以利用金納米 粒子提供更多的電化學(xué)活性面積和更好的導(dǎo)電性能，從而提供更加靈敏的電化學(xué)信號(hào)。之 后在電極表面組裝MCH單分子層，用以"阻斷"電極表面的電子傳遞"通道"。同時(shí)石墨烯-適 配體復(fù)合物存在于體系中，在體系中沒有微囊藻毒素-LR存在時(shí)，石墨烯由于適配體的作 用，不會(huì)自組裝到電極上。但是當(dāng)體系中存在微囊藻毒素-LR時(shí)，微囊藻毒素-LR會(huì)與適配體 結(jié)合，從而使石墨稀裸露出來，裸露出來的石墨稀可以通過與MCH的作用，自組裝到Au NPs/ Au電極表面，使得被"阻斷"的電流信號(hào)重新被"打開"，而獲得響應(yīng)電流值的增加。進(jìn)一步 地，當(dāng)在體系中滴加核酸內(nèi)切酶DNase I后，核酸內(nèi)切酶會(huì)將與MC-LR結(jié)合的核酸適配體分 解，使MC-LR又重新裸露出來，裸露出來的MC-LR又可以繼續(xù)與新的適配體結(jié)合，使得更多的 石墨烯裸露出來組裝到電極上，如此循環(huán)，實(shí)現(xiàn)對(duì)電流信號(hào)的放大效應(yīng)，從而利用所得的電 流信號(hào)與MC-LR之間的濃度關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)MC-LR的高靈敏電化學(xué)檢測。
[0026] 本發(fā)明將操作簡便，響應(yīng)迅速的電化學(xué)分析方法與對(duì)MC-LR有特異性識(shí)別作用的 核酸適配體技術(shù)結(jié)合，并結(jié)合石墨烯優(yōu)異的導(dǎo)電性與生物親和性的特點(diǎn)，發(fā)明了一種新穎 的MC-LR電化學(xué)檢測方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0027] (1)與現(xiàn)有的生物傳感器相比，本發(fā)明采用金納米粒子沉積修飾金電極為基體電 極材料，利用石墨烯優(yōu)異的導(dǎo)電性與良好的生物兼容性。進(jìn)一步通過設(shè)計(jì)與利用核酸內(nèi)切 酶輔助石墨烯信號(hào)放大作用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)MC-LR的高靈敏、特異性分析。
[0028] (2)本發(fā)明將MC-LR的核酸適配體與石墨烯復(fù)合，得到石墨烯-適配體復(fù)合物。由于 核酸適配體對(duì)待測物質(zhì)MC-LR的專一性結(jié)合能力，大大提高了選擇性，使得該電化學(xué)檢測方 法能夠在100倍于待測物質(zhì)濃度的結(jié)構(gòu)相似的干擾物質(zhì)中選擇性的識(shí)別出待測物質(zhì)MC-LR。 [0029 ] (3)與傳統(tǒng)的檢測微囊藻毒素-LR的方法相比，本發(fā)明所建立的方法利用了高靈敏 的電化學(xué)分析技術(shù)與高專一性識(shí)別能力的核酸適配體有效地結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了環(huán)境中痕量MC-LR的超靈敏、高專一性的檢測，且儀器廉價(jià)便攜，方法簡單易行，可以快速得到結(jié)果。
【附圖說明】
[0030]圖1為本發(fā)明制備的Au NPs納米結(jié)構(gòu)圖；
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0032] 實(shí)施例1
[0033] -種石墨烯信號(hào)放大的微囊藻毒素-LR電化學(xué)檢測方法，其中所涉及的傳感器的 具體制作過程如下：
[0034] (1)首先對(duì)金電極進(jìn)行預(yù)處理，處理方式如下:將金電極表面置于新鮮配置的食人 魚(H2S〇4/H2〇2 = 7: 3v/v)洗液中浸泡10-15分鐘，取出后采用超純水洗凈后，依次分別采用 粒徑為1 ? 0wii、0 ? 3mi、0 ? 05wii的三氧化二鋁以"8"字小心的打磨至表面光潔。之后用超純水 將電極表面的三氧化二鋁沖洗干凈，將電極依次分別置于超純水，乙醇，超純水超聲5至10 分鐘。超聲完畢后，將電極立即取出，以其為工作電極，鉑絲電極為對(duì)電極，SCE為參比電極 進(jìn)行循環(huán)伏安(CV)掃描，直到得到穩(wěn)定的重復(fù)的循環(huán)伏安圖為止，則表明金電極預(yù)處理完 畢。CV掃描設(shè)置參數(shù)如下：電勢范圍-0.2-1.55V，掃速50mV/s。將預(yù)處理好的金電極用超純 水淋洗干凈，氮?dú)飧稍锖笕〕?，置?mmol/L的氯金酸(含有O.lmol/L KC1)中，繼續(xù)以其為 工作電極，采用CV法對(duì)溶液中的金還原，從而在電極表面形成金納米粒子(Au NPs)，得到金 納米粒子電極。參數(shù)設(shè)置如下：電勢范圍-1.2~-0.2V，掃速50mV/s，掃描圈數(shù)15圈。得到Au NPs電極，如圖1所示。
[0035] (2)在lOwnol/L的MC-LR核酸適配體的溶液中，加入濃度為0? 15mg/mL的石墨烯水 溶液，將其置于冰水浴中，超聲三小時(shí)，得到黑色分散懸浮液。之后將懸浮液離心5分鐘后， 取上清液，得到石墨烯-適配體復(fù)合物。將制備好的石墨烯-適配體復(fù)合物放入4 °C冰箱冷藏 備用。
[0036] (3)將（1)步驟中制備好的Au NPs電極浸入40mmol/L的MCH的乙醇溶液中，密封后 常溫下培養(yǎng)24小時(shí)，使Au NPs電極表面形成致密的MCH分子層。之后將電極取出，分別用乙 醇和水輕輕的淋洗后，得到MCH/Au NPs/Au電極，在氮?dú)鈿夥障赂稍飩溆谩?br>[0037] 實(shí)施例2
[0038] 在對(duì)MC-LR濃度測量前，將制備好的MCH/Au NPs/Au電極取出，在電極表面滴加10y L核酸內(nèi)切酶(DNase I)反應(yīng)緩沖液(pH=7.0,含有濃度為100mm〇l/L的NaCl)，5yL石墨烯-適配體復(fù)合物，3yL的待測濃度的MC-LR，2yL的DNase I溶液（1000U/mL)，將電極置于30°C的 生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)后取出。用乙醇和超純水輕輕淋洗電極表面，以去除結(jié)合較弱 的石墨烯。隨后將電極在氮?dú)鈿夥障逻M(jìn)行干燥，取出后進(jìn)行DPV檢測。電化學(xué)檢測均在含 5mmol/L二茂鐵甲酸及0. lmol/L的高氯酸鈉的20mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.0)中進(jìn) 行。
[0039] 電流的變化和MC-LR的濃度在1.0X1CT12~1.0Xl(T1Qmol/L范圍內(nèi)成良好線性關(guān) 系，相關(guān)系數(shù)約為0.99.最低檢測限為8.0Xl(T13m〇l/L。這個(gè)最低檢測限足以檢測水體中微 量存在的MC-LR。
[0040] 實(shí)施例3
[0041 ] 將制備好的電化學(xué)適配體傳感器，將1.0Xl(Tnm〇l/L MC-LR分別與濃度為1.0X nrVoi/L的干擾物兩兩混合進(jìn)行測定。考察了氧樂果，草甘膦，百草枯，殺蟲單，啶蟲脒，敵 百蟲三種環(huán)境常見污染物對(duì)MC-LR測定的干擾實(shí)驗(yàn)。采用實(shí)施例2中測試條件，測定電流響 應(yīng)，研究結(jié)果顯示，100倍于MC-LR濃度的其他干擾物對(duì)MC-LR的電流造成的影響小于 10.0%。可見，所制備的適配體傳感器對(duì)MC-LR具有高的選擇性。
[0042] 實(shí)施例4
[0043] (1)按實(shí)施例1的處理方式對(duì)金電極進(jìn)行預(yù)處理，將預(yù)處理好的金電極用超純水淋 洗干凈，氮?dú)飧稍锖笕〕?，置于lmmol/L的氯金酸(含有0.1m〇l/L KC1)中，繼續(xù)以其為工作 電極，采用CV法對(duì)溶液中的金還原，從而在電極表面形成金納米粒子(Au NPs)，得到金納米 粒子電極。參數(shù)設(shè)置如下：電勢范圍-1.2~-0.2V，掃速50mV/s，掃描圈數(shù)10圈。得到Au NPs 電極，如圖1所示。
[0044] (2)在lOymol/L的MC-LR核酸適配體的溶液中，加入濃度為0? lmg/mL的石墨稀水溶 液，將其置于冰水浴中，超聲三小時(shí)，得到黑色分散懸浮液。之后將懸浮液離心5分鐘后，取 上清液，得到石墨烯-適配體復(fù)合物。將制備好的石墨烯-適配體復(fù)合物放入4 °C冰箱冷藏備 用。
[0045] (3)將（1)步驟中制備好的Au NPs電極浸入30mmol/L的MCH的乙醇溶液中，密封后 常溫下培養(yǎng)24小時(shí)，使Au NPs電極表面形成致密的MCH分子層。之后將電極取出，分別用乙 醇和水輕輕的淋洗后，得到MCH/Au NPs/Au電極，在氮?dú)鈿夥障赂稍飩溆谩?br>[0046] (4)將制備好的MCH/Au NPs/Au電極取出，在電極表面滴加9yL核酸內(nèi)切酶(DNase I)反應(yīng)緩沖液(pH = 7.0，含有濃度為100mm〇l/L的NaCl)，4yL石墨烯-適配體復(fù)合物，2yL的 待測濃度的MC-LR，1此的DNase I溶液（1000U/mL)，將電極置于25°C的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 小時(shí)后取出。用乙醇和超純水輕輕淋洗電極表面，以去除結(jié)合較弱的石墨烯。隨后將電極在 氮?dú)鈿夥障逻M(jìn)行干燥，取出后進(jìn)行DPV檢測。電化學(xué)檢測均在含5mmol/L二茂鐵甲酸及 0. lmo 1/L的高氯酸鈉的10-30mmo 1/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.0)中進(jìn)行。
[0047] 電流的變化和MC-LR的濃度在一定范圍內(nèi)成良好線性關(guān)系，可以得到足以檢測水 體中微量存在的MC-LR的檢測限。
[0048] 實(shí)施例5
[0049] (1)按實(shí)施例1的處理方式對(duì)金電極進(jìn)行預(yù)處理，將預(yù)處理好的金電極用超純水淋 洗干凈，氮?dú)飧稍锖笕〕?，置?mmol/L的氯金酸(含有0. lmol/L KC1)中，繼續(xù)以其為工作 電極，采用CV法對(duì)溶液中的金還原，從而在電極表面形成金納米粒子(Au NPs)，得到金納米 粒子電極。參數(shù)設(shè)置如下：電勢范圍-1.2~-0.2V，掃速50mV/s，掃描圈數(shù)25圈。得到Au NPs 電極，如圖1所示。
[0050] (2)在20_〇1/L的MC-LR核酸適配體的溶液中，加入濃度為0.3mg/mL的石墨烯水溶 液，將其置于冰水浴中，超聲三小時(shí)，得到黑色分散懸浮液。之后將懸浮液離心10分鐘后，取 上清液，得到石墨烯-適配體復(fù)合物。將制備好的石墨烯-適配體復(fù)合物放入4 °C冰箱冷藏備 用。
[0051 ] (3)將（1)步驟中制備好的Au NPs電極浸入30mmol/L的MCH的乙醇溶液中，密封后 常溫下培養(yǎng)24小時(shí)，使Au NPs電極表面形成致密的MCH分子層。之后將電極取出，分別用乙 醇和水輕輕的淋洗后，得到MCH/Au NPs/Au電極，在氮?dú)鈿夥障赂稍飩溆谩?br>[0052] (4)將制備好的MCH/Au NPs/Au電極取出，在電極表面滴加IlyL核酸內(nèi)切酶(DNase I)反應(yīng)緩沖液(pH = 7.0，含有濃度為100mm〇l/L的NaCl)，6yL石墨烯-適配體復(fù)合物，4yL的 待測濃度的MC-LR，3yL的DNase I溶液（1000U/mL)，將電極置于35°C的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 小時(shí)后取出。用乙醇和超純水輕輕淋洗電極表面，以去除結(jié)合較弱的石墨烯。隨后將電極在 氮?dú)鈿夥障逻M(jìn)行干燥，取出后進(jìn)行DPV檢測。電化學(xué)檢測均在含5mmol/L二茂鐵甲酸及 0. lmo 1/L的高氯酸鈉的10-30mmo 1/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.0)中進(jìn)行。
[0053] 電流的變化和MC-LR的濃度在一定范圍內(nèi)成良好線性關(guān)系，可以得到足以檢測水 體中微量存在的MC-LR的檢測限。
[0054] 實(shí)施例6
[0055] (1)按實(shí)施例1的處理方式對(duì)金電極進(jìn)行預(yù)處理，將預(yù)處理好的金電極用超純水淋 洗干凈，氮?dú)飧稍锖笕〕?，置?mmol/L的氯金酸(含有0.1m 〇l/L KC1)中，繼續(xù)以其為工作 電極，采用CV法對(duì)溶液中的金還原，從而在電極表面形成金納米粒子(Au NPs)，得到金納米 粒子電極。參數(shù)設(shè)置如下：電勢范圍-1.2~-0.2V，掃速50mV/s，掃描圈數(shù)20圈。得到Au NPs 電極，如圖1所示。
[0056] (2)在15_ol/L的MC-LR核酸適配體的溶液中，加入濃度為0.3mg/mL的石墨烯水溶 液，將其置于冰水浴中，超聲三小時(shí)，得到黑色分散懸浮液。之后將懸浮液離心7分鐘后，取 上清液，得到石墨烯-適配體復(fù)合物。將制備好的石墨烯-適配體復(fù)合物放入4 °C冰箱冷藏備 用。
[0057] (3)將（1)步驟中制備好的Au NPs電極浸入20mmol/L的MCH的乙醇溶液中，密封后 常溫下培養(yǎng)24小時(shí)，使Au NPs電極表面形成致密的MCH分子層。之后將電極取出，分別用乙 醇和水輕輕的淋洗后，得到MCH/Au NPs/Au電極，在氮?dú)鈿夥障赂稍飩溆谩?br>[0058] (4)將制備好的MCH/Au NPs/Au電極取出，在電極表面滴加10yL核酸內(nèi)切酶(DNase I)反應(yīng)緩沖液(pH = 7.0，含有濃度為100mm〇l/L的NaCl)，5yL石墨烯-適配體復(fù)合物，3yL的 待測濃度的MC-LR，2yL的DNase I溶液（1000U/mL)，將電極置于30°C的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 1.5小時(shí)后取出。用乙醇和超純水輕輕淋洗電極表面，以去除結(jié)合較弱的石墨烯。隨后將電 極在氮?dú)鈿夥障逻M(jìn)行干燥，取出后進(jìn)行DPV檢測。電化學(xué)檢測均在含5mmol/L二茂鐵甲酸及 0. lmo 1/L的高氯酸鈉的10-30mmo 1/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.0)中進(jìn)行。
[0059] 電流的變化和MC-LR的濃度在一定范圍內(nèi)成良好線性關(guān)系，可以得到足以檢測水 體中微量存在的MC-LR的檢測限。
[0060] 上述的對(duì)實(shí)施例的描述是為了便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和應(yīng)用本 發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對(duì)這些實(shí)施例做出各種修改，并把在此說明 的一般原理應(yīng)用到其他實(shí)施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動(dòng)。因此，本發(fā)明不限于這里的實(shí) 施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，對(duì)于本發(fā)明做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明 的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0061]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種石墨烯信號(hào)放大的微囊藻毒素-LR電化學(xué)檢測方法，其特征在于，該方法包括以 下步驟： (1) 在MCH/Au NPs/Au電極的表面依次滴加體積比為(9-11): (4-6): (2-4): (1 -3)的核 酸內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液、石墨烯-適配體復(fù)合物、待測的微囊藻毒素-LR溶液和核酸內(nèi)切酶溶 液； (2) 將MCH/Au NPs/Au電極在25-35°C下培養(yǎng)1~2個(gè)小時(shí)，用乙醇和超純水淋洗電極表 面，去除結(jié)合較弱的石墨烯，隨后在氮?dú)庀赂稍?，取出后進(jìn)行電化學(xué)方法檢測，測定微囊藻 毒素-LR溶液的濃度。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種石墨烯信號(hào)放大的微囊藻毒素-LR電化學(xué)檢測方法，其特 征在于，所述的MCH/Au NPs/Au電極采用以下步驟制備： (1) 以金電極為工作電極，含有濃度為1~5mmol/L氯金酸的0.05-0.2111〇1/1的1((：1溶液 為電解液，米用二電極體系，在 _1.2_1.0V電位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安法掃描，掃描圈數(shù)為10-25圈，得到Au NPs/Au電極； (2) 將得到的Au NPs/Au電極浸入含30-60mmo 1 /L的6-巰基-1 -己醇的乙醇溶液中密封， 常溫下培養(yǎng)24小時(shí)后將電極取出，分別用乙醇和水淋洗，得到MCH/Au NPs/Au電極，在氮?dú)?中干燥備用。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種石墨烯信號(hào)放大的微囊藻毒素-LR電化學(xué)檢測方法，其特 征在于，所述的石墨烯-適配體復(fù)合物采用以下步驟制備： (1) 在10~20ymol/L的微囊藻毒素-LR核酸適配體的溶液中，加入濃度為0 · 1~0 · 3mg/ mL的石墨烯水溶液，將其置于冰水浴中，超聲三小時(shí)，得到黑色分散懸浮液； (2) 將得到的黑色分散懸浮液離心5-10分鐘后，取上清液，得到石墨烯-適配體復(fù)合物， 在4°C下冷藏備用。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種石墨烯信號(hào)放大的微囊藻毒素-LR電化學(xué)檢測方法，其特 征在于，所述的微囊藻毒素-LR的核酸適配體的堿基序列為： 5 '-GGCGC-CAAAC-AGGAC-CACCA-TGACA-ATTAC-CCATA-CCACC-TCAT T-ATGCC-CCATC-TCCGC-3'。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種石墨烯信號(hào)放大的微囊藻毒素-LR電化學(xué)檢測方法，其特 征在于，所述的核酸內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液為Tris-HCl緩沖液反應(yīng)緩沖液。（50-200mM，含12_ 50mM MgCl2,0.5-2mM CaCl2,PH=7.5,25-35〇C) 〇6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種石墨烯信號(hào)放大的微囊藻毒素_LR電化學(xué)檢測方法，其特 征在于，所述的核酸內(nèi)切酶溶液的酶的活力單位為500-1500U/mL。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種石墨烯信號(hào)放大的微囊藻毒素-LR電化學(xué)檢測方法，其特 征在于，所述的電化學(xué)方法為差分脈沖伏安法，根據(jù)峰電流值與微囊藻毒素-LR濃度之間的 線性關(guān)系建立工作曲線。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種石墨烯信號(hào)放大的微囊藻毒素-LR電化學(xué)檢測方法，其特 征在于，所述的電化學(xué)方法采用的電解液為pH = 7.0，含3-10mmol/L的二茂鐵甲酸及0. Οδ-Ο. 3mo 1 /L 高氯 酸鈉的 10-30mmo 1 /L 的磷酸鹽緩沖 溶液。
【文檔編號(hào)】G01N27/48GK106053570SQ201610308016
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年5月11日
【發(fā)明人】劉梅川, 王國強(qiáng), 趙國華
【申請(qǐng)人】同濟(jì)大學(xué)