專利名稱：一種血紅蛋白類攜氧載體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種血紅蛋白類攜氧載體。
背景技術(shù)：
輸血在現(xiàn)代醫(yī)療中發(fā)揮了重要作用，是臨床手術(shù)、抗災(zāi)和戰(zhàn)場救治不可缺少的醫(yī)療手段。但是，傳統(tǒng)輸血有很多弊端，如，血源單一，主要靠獻血，而且人類血型復(fù)雜，需要進行嚴(yán)格的配型后才能使用，限制了其對急重癥病人的救治和在緊急突發(fā)事件環(huán)境下的應(yīng)用。更為嚴(yán)重的是血液易于受到肝炎，艾滋病等病毒的污染，以及現(xiàn)在越來越關(guān)注的新舊血問題，使得輸血安全受到威脅。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，血液的需求量不斷增高，而安全有效 的血源卻日益緊缺。人體血液由血漿、紅細胞、白細胞和血小板組成，成分非常復(fù)雜，要制造出一種可完全代替血液的溶液非常困難，或者說幾乎不可能；但研制一種臨時替代品，在急需情況下短時間內(nèi)代替血液中某種組分的作用卻具有可行性。作為血液的重要組成部分，血紅蛋白(Hemoglobin，Hb)位于紅細胞內(nèi)，是機體運輸氧的主要媒介。但是，單純的血紅蛋白溶液并不能直接輸注，因為脫離紅細胞的血紅蛋白失去2，3- 二磷酸甘油酸(2，3-DPG)的調(diào)節(jié)，氧親和力急劇升高，不能向組織有效供氧，且游離血紅蛋白在各種酶的作用下也會迅速解聚為二聚體和單體，經(jīng)腎排泄或堵塞腎小管，產(chǎn)生強烈的腎毒性。為了克服前述缺陷，對血紅蛋白進行必要的修飾或處理，調(diào)整血紅蛋白的有效分子半徑，對黏滯度和攜氧釋氧能力等進行優(yōu)化，以減少上述血紅蛋白的不良反應(yīng)，增加氧輸送效果和在血漿中的存留時間，產(chǎn)生的一類制品統(tǒng)稱為血紅蛋白類攜氧載體(HBOCs)。近幾十年，HBOCs 一直是血液代用品研發(fā)的重點。HBOCs的研發(fā)過程主要分為三代。第一代是用小分子修飾血紅蛋白或用交聯(lián)劑聚合血紅蛋白。第二代為血紅蛋白分子與抗氧化酶如超氧化物岐化酶、過氧化氫酶等交聯(lián)形成多聚物。用于前兩代HBOCs較為成熟的化學(xué)修飾和交聯(lián)方法包括，聚乙二醇(PEG)修飾，開環(huán)棉籽糖交聯(lián)，雙阿司匹林交聯(lián)，戍二醒(GDA)交聯(lián)等，產(chǎn)品包括 HemAssist, Polyheme, HemoLink, Hemopure (HB0C-201),Hemospan (MP4) ,Gelenpol,HemoTech,Hemoximer等。前兩代產(chǎn)品在臨床實踐中，都出現(xiàn)了很多問題=HemAssist屬第I代產(chǎn)品，因在III期臨床試驗中發(fā)現(xiàn)受試者死亡率明顯增加而放棄；Polyheme也因為臨床試驗中出現(xiàn)嚴(yán)重心臟毒性而終止研究；美國Biopure公司研發(fā)的Hemopure (戍二醒交聯(lián)的聚合牛血紅蛋白)是目前唯一已經(jīng)獲準(zhǔn)在臨床應(yīng)用的產(chǎn)品，僅限于在南非上市，但因為III期臨床研究中暴露出心血管方面的安全性問題，也停止了進一步的研發(fā)。2008年，等在醫(yī)學(xué)雜志《JAMA》公開了 I篇有關(guān)HBOC臨床試驗的Meta分析，指出其增加了患者的死亡率并有潛在的引起心肌梗死的風(fēng)險，同時指出在明確HBOC制品潛在毒副作用及其機理之前，不應(yīng)再開展進一步的臨床試驗。該雜志的結(jié)論，間接導(dǎo)致2009年美國FDA拒絕了 Northfield公司HBOC產(chǎn)品(PolyHeme)的上市請求，影響了整個HBOC行業(yè)。關(guān)于HBOCs制品輸注后的毒副反應(yīng),普遍認為是其由于HBOC中存在游離/未聚合的血紅蛋白，其會透過內(nèi)皮屏障，消耗內(nèi)皮舒張因子一氧化氮(NO)，同時，血紅蛋白本身的氧化還原反應(yīng)生成的氧自由基造成機體氧化應(yīng)激反應(yīng)。
為了解決HBOC中存在游離/未聚合的血紅蛋白的問題，第三代HBOCs血紅蛋白外面用膜或高分子材料包裹，使之更加接近紅細胞的實際結(jié)構(gòu)，稱作包裹血紅蛋白。加拿大的TMS Chang報道了使用聚乙二醇-聚乳酸膠囊包裹的血紅蛋白，膠囊粒徑IOOnm左右。日本的 Tsuchida Eishun制備了細胞型血紅蛋白(Hemoglobin Vehicle,HbV),粒徑 250nm左右。中國也有類似報道，申請?zhí)?00810051615. 1，發(fā)明名稱可生物降解的載有血紅蛋白的聚肽囊泡及其制備方法的發(fā)明專利申請，公開了一種可生物降解載有血紅蛋白的兩親性嵌段聚肽囊泡，該囊泡的內(nèi)部水相中含有CO保護的血紅蛋白，囊泡的壁由可生物降解的聚賴氨酸-聚苯丙氨酸兩嵌段共聚肽構(gòu)成；申請?zhí)?00810050914. 3，發(fā)明名稱一種生物降解的鍵合了血紅蛋白分子的納米粒子及制法的發(fā)明專利申請，公開了一種生物降解的鍵合了血紅蛋白分子的納米粒子，其是模擬紅血球的細胞結(jié)構(gòu)，用乳酸類嵌段共聚物做血紅蛋白的載體，構(gòu)筑聚合物/血紅蛋白納米膠束或膠囊；申請?zhí)?01010246051. 4，發(fā)明名稱一種人工納米紅細胞的專利申請公開了一種人工納米紅細胞，其是在血紅蛋白外面通過納米自組裝包裹具有雙親性的改性淀粉，形成粒徑為20(T300nm的微囊化的人工納米紅細胞。但是，這類制品仍有缺陷，如包材，尤其是磷脂價格昂貴且不穩(wěn)定，物理包裹后的血紅蛋白可能突釋，仍然難以避免游離/未聚合的血紅蛋白的副作用，有潛在的輸注風(fēng)險。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的血紅蛋白類攜氧載體。本發(fā)明血紅蛋白類攜氧載體，包含血紅蛋白、結(jié)合珠蛋白和聚乙二醇一聚酯納米粒,血紅蛋白通過結(jié)合珠蛋白連接在聚乙二醇一聚酯納米粒表面。其粒徑為8(T400nm。優(yōu)選地，其粒徑為20(T300nm。所述聚乙二醇一聚酯納米粒為聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米?；蛘呔垡叶?聚乳酸納米粒。其中，血紅蛋白的含量為6 12% (w/w)，血紅蛋白與珠蛋白的摩爾比為I :1。所述聚乙二醇一聚酯納米粒與結(jié)合珠蛋白通過硫醚鍵或酰胺鍵連接。所述血紅蛋白類攜氧載體，氧親和力P5tl值為l(T36mmHg，Hill系數(shù)為I. 30 2· 90，pH 值為 7. 2^7. 5。所述血紅蛋白類攜氧載體還包括抗氧化劑，抗氧化劑包裹于聚乙二醇一聚酯納米粒中。所述抗氧化劑為抗壞血酸、超氧化物岐化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、維生素E、谷胱甘肽、連二亞硫酸鈉、N-乙酰半胱氨酸中的一種或一種以上的組合。本發(fā)明還提供了上述血紅蛋白類攜氧載體的制備方法，它包括如下步驟a、取結(jié)合珠蛋白、巰基化結(jié)合珠蛋白或者羧基活化的結(jié)合珠蛋白，以及帶有官能團的聚乙二醇一聚酯納米粒溶于磷酸鹽緩沖液中，結(jié)合珠蛋白與納米粒的重量比為1:5 10，41震蕩18 30小時，磷酸鹽緩沖液洗滌，1000(Tl4000g離心，得沉淀；b、將步驟a所得沉淀溶于磷酸鹽緩沖液中，加入血紅蛋白，血紅蛋白與結(jié)合珠蛋白的重量比為(2 4) :(f3)，4°C避光反應(yīng)2飛小時，分離純化，濃縮凍干，即得血紅蛋白類攜氧載體。步驟a所述官能團為單馬來酰亞胺、羧基或者氨基。其中，步驟a所述聚酯是聚乳酸或聚己內(nèi)酯。
其中，步驟a所述納米粒中包裹抗氧化劑。其中，所述步驟a中，結(jié)合珠蛋白和納米粒重量比為1:5或者1:10 ;震蕩24小時；12000g 離心。其中，所述步驟b中，血紅蛋白與結(jié)合珠蛋白的重量比為3 2 ;避光反應(yīng)2小時；分離純化方法為離心或凝膠色譜柱分離純化，至上清液或洗脫液在400-600nm無明顯吸收峰為止，收集沉淀或者洗脫液。帶有官能團的聚乙二醇一聚酯納米粒是由帶有官能團聚乙二醇一聚酯兩嵌段共聚物自組裝，或者其與聚乙二醇單甲醚一聚酯兩嵌段共聚物的混合物自組裝得到。自組裝采用的方法是有機溶劑法、透析法、乳化分散法或者復(fù)乳法。A，有機溶劑法將帶官能團的聚乙二醇一聚酯兩嵌段共聚物與聚乙二醇單甲醚一聚酯兩嵌段共聚物，質(zhì)量比1:0-40，與抗氧劑(抗氧化劑總共聚物質(zhì)量比=0-1 :10)共溶于乙酸乙酯，經(jīng)旋蒸去除有機溶劑后，加入40 70°C熱水中，振蕩分散，冷卻至室溫，凍干即得帶官能團且包裹抗氧化劑的納米 粒。B，透析法將帶官能團的聚乙二醇一聚酯兩嵌段共聚物與聚乙二醇單甲醚-聚酯兩嵌段共聚物，質(zhì)量比1:0-40，與抗氧劑(抗氧化劑總共聚物質(zhì)量比=0-1 :10)溶解在可與水混溶的有機溶劑DMSO中，然后加入到透析袋中，并在水中進行透析。透析過程中，兩嵌段共聚物自組裝成納米粒并將抗氧劑包在其內(nèi)部，同時去除了其中的有機溶劑，不需要使用表面活性劑和高速攪拌，將透析后的溶液凍干即得帶官能團且包裹抗氧化劑的納米粒。C，乳化分散法以含乳化劑的水溶液作為水相，先在乳化分散機上乳化，然后以一定速度滴加含有帶官能團的聚乙二醇一聚酯兩嵌段共聚物與聚乙二醇單甲醚一聚酯兩嵌段共聚物和抗氧劑的有機相，滴加完后繼續(xù)在乳化分散機上乳化10分鐘，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀抽去有機溶劑即得帶官能團的納米粒。D，復(fù)乳法(W/0/W法):先將抗氧劑(抗氧化劑總共聚物質(zhì)量比=0-1:
10)溶于水溶液形成內(nèi)水相，在超聲乳化的條件下，逐滴加入到帶官能團的聚乙二醇一聚酯兩嵌段共聚物與聚乙二醇單甲醚一聚酯兩嵌段共聚物(質(zhì)量比1:0-40)的有機相中，先形成W/0初乳，再將初乳在機械攪拌的條件下緩緩加入含有乳化劑的外水相中，形成W/0/W的復(fù)乳，揮去有機溶劑后凍干即得帶官能團的納米粒。本發(fā)明血紅蛋白類攜氧載體中，血紅蛋白可與結(jié)合珠蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物，SP使納米粒分解之后，也不會產(chǎn)生游離血紅蛋白，無高血壓反應(yīng)，且結(jié)合珠蛋白/血紅蛋白復(fù)合物經(jīng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，可大大減輕經(jīng)腎臟排泄可能造成的腎損傷，克服HBOCs類制品長期存在的缺陷。并且，本發(fā)明的HBOCs表面帶有數(shù)量可控的活性官能團，可實現(xiàn)血紅蛋白定點定量結(jié)合，得到質(zhì)量穩(wěn)定的終產(chǎn)物，具有極良好的臨床應(yīng)用前景。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。


圖I為本發(fā)明所涉新型血紅蛋白類攜氧納米粒的示意2為實施例3中Mal-PEG-PCL共聚物的1H-NMR圖譜
圖3為實施例3中MPEG-PCL共聚物的1H-NMR圖譜圖4為實施例3所制備的血紅蛋白類攜氧載體的透射電鏡(TEM)5為實施例3所制備的血紅蛋白類攜氧載體采用MALVERN粒徑儀檢測出的結(jié)果圖6為實施例3所制備的血紅蛋白類攜氧載體采用MTT法測定的細胞毒性結(jié)果圖7為實施例4所制備的血紅蛋白類攜氧載體的透射電鏡(TEM)8為實施例4所制備的血紅蛋白類攜氧載體采用MALVERN粒徑儀檢測出的結(jié)果圖9為實施例4所制備的血紅蛋白類攜氧載體采用MTT法測定的細胞毒性結(jié)果 圖10為實施例3和實施例4所制備的血紅蛋白類攜氧載體的凍干粉圖11為實施例3和實施例4所制備的血紅蛋白類攜氧載體對小鼠血管活性的檢測結(jié)果
具體實施例方式主要儀器及試劑核磁共振儀Varian400, Varian 公司，USA ;馬爾文激光衍射粒度儀Nano-ZS,Malvern Instrument, UK ；凝膠滲透色譜儀Agilent110, Agilent 公司，USA ;透射電鏡HitachiH-6009IV, Hitachi 公司，Japan ；血氣分析儀ABL800FLEX, Radiometer 公司；BC_3000PLUS，邁瑞公司，中國；ΗΕΜ0Χ 分析儀TCS Scientific, USA ；pH 電極Mettler Toledo 公司，USA ；無創(chuàng)血壓檢測系統(tǒng)BP-2000,Visitech Systems 公司，USA ;聚乙二醇單甲醚(MPEG),購自美國Aldrich公司，分析純；單馬來酰亞胺聚乙二醇(Mal-PEG)，單氨基聚乙二醇(NH2-PEG)和單羧基聚乙二醇(COOH-PEG)均購自北京鍵凱公司，分析純；己內(nèi)酯(Caprolactone,CL)、丙交酯(D, L-lactide)、辛酸亞錫(Stannousoctoate, Sn (oct) 2), 二甲基亞諷(DMSO),購自美國 Sigma 公司，分析純；疏基化試劑Traut’ s (2-Imi no thiol ane · HCl),購自美國ThermoScientific-Pierce公司；丙酮、二氯甲燒、石油醚、乙酸乙酯、乳酸、磷酸緩沖液(PBS，pH7. 4)均購于成都科龍化學(xué)試劑公司；MTT (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide)購自美國Sigma公司；細胞培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)基購自Gibico BRL公司；人胚腎細胞(HEK293)來自四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國家重點實驗室；實施例I本發(fā)明血紅蛋白類攜氧載體的制備I、制備方法(I) Mal-PEG-PCL 和 MPEG-PCL 的制備分別將5. Og己內(nèi)酯與5. Og分子量2000的單馬來酰亞胺聚乙二醇(Mal_PEG2000)或5. Og分子量2000的聚乙二醇單甲醚(MPEG2000)按質(zhì)量比I :1置于三口燒瓶中，加入催化劑辛酸亞錫以及適量甲苯，在機械攪拌和氮氣保護的條件下在140°C油浴中反應(yīng)4小時；
待反應(yīng)體系溫度降到室溫后，將聚合物倒入冷石油醚中沉淀，將沉淀過濾，并把沉淀放在通風(fēng)櫥中使溶劑揮發(fā)至聚合物固化，產(chǎn)物真空干燥后經(jīng)透析純化，再凍干即可得到Mal-PEG-PCL 和 MPEG-PCL。(2)含有馬來酰亞胺官能團的PEG-PCL納米粒凍干粉的制備然后，分別取Img Mal-PEG-PCL和40mg MPEG-PCL溶于5ml乙酸乙酯，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀抽去乙酸乙酯，然后加入IOml蒸餾水，于60度水浴加熱攪拌，即得到含有馬來酰亞胺官能團的PEG-PCL納米粒水溶液，凍干即得含有馬來酰亞胺官能團的PEG-PCL的納米粒凍干粉。(3)血紅蛋白類攜氧載體的制備結(jié)合珠蛋白與巰基化試劑Traut’ s,按照摩爾比I :40,通高純氮條件下避光攪拌反應(yīng)2小時，葡聚糖凝膠柱分離得到巰基化結(jié)合珠蛋白； 將5mg巰基化的人結(jié)合珠蛋白溶于IOml磷酸鹽緩沖液中，加入50mg含有馬來酰亞胺官能團的PEG-PCL納米粒凍干粉，4°C避光振蕩10小時，PBS溶液洗滌并在12000g下離心分離；收集下層納米粒,溶于5ml磷酸鹽緩沖液,加入8mg人臍帶血血紅蛋白，4°C避光攪拌反應(yīng)2小時，反應(yīng)液在12000g下離心分離，用磷酸鹽緩沖液洗滌至上層清液在400-600nm區(qū)域無吸收為止，即得本發(fā)明血紅蛋白類攜氧載體。2、理化性質(zhì)檢測檢測方法共聚物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和組成采用紅外光譜，核磁共振波譜鑒定和計算；共聚物的分子量和分子量分布使用凝膠滲透色譜裝置測定；納米粒子大小和分布使用MALVERN粒徑儀測定；納米粒子的形態(tài)采用透射電鏡來觀察和記錄；血紅蛋白的濃度(載藥率)通過Radiometer公司的ABL 800FLEX血氣分析儀和邁瑞公司的BC-3000PLUS分析儀測定；載有血紅蛋白的納米粒子的P50值和Hill系數(shù)值由TCS Scientific公司的ΗΕΜ0ΧΤΜ分析儀測定；血紅蛋白載藥率(％)通過終產(chǎn)品中血紅蛋白質(zhì)量占納米粒凍干粉總質(zhì)量的百分比表示；pH值由Mettler Toledo公司的pH電極測定；細胞毒性檢測方法將100 μ L (I X IO5個/mL) HEK293細胞接種到96孔板中，培養(yǎng)基為DMEM，待細胞生長至融合狀態(tài)時，加入不同濃度上述實施例得到的納米粒的生理鹽水溶液(終濃度分別為50、100、200、400、600、800和1000ug/ml)，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，在37°C、含5%C02的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。然后，向培養(yǎng)基中加入MTT，使終質(zhì)量濃度為0. 5g/L，于37°C、含5%C02的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，棄上清，加入DMSO (100 μ L/孔)，混勻lOmin，用酶標(biāo)儀檢測(測定波長570nm，參比波長630nm)吸光度(A)，以生理鹽水作為空白對照組。計算公式如下細胞活性(Cell Viability) = A不同濃度納米粒處理組/A空白對照組X 100%。檢測結(jié)果本發(fā)明血紅蛋白類攜氧載體的粒徑約為80nm，透射電鏡觀察納米粒形態(tài)較規(guī)則且呈球形，血紅蛋白載藥率8%，氧親和力P5tl值18mmHg，Hill系數(shù)1.47，pH值7. 2，MTT法檢測結(jié)果表明該納米粒對HEK293細胞無明顯毒性。實施例2本發(fā)明血紅蛋白類攜氧載體的制備I、制備方法(I) Mal-PEG-PCL 制備分別將8. 89g己內(nèi)酯與I. Ilg分子量3500的單馬來酰亞胺聚乙二醇(Mal-PEG3500)按質(zhì)量比8 1置于三口燒瓶中，加入催化劑辛酸亞錫以及適量甲苯，在機械攪拌和氮氣保護的條件下在137°C油浴中反應(yīng)6小時；待反應(yīng)體系溫度降到室溫后，將聚合物倒入冷石油醚中沉淀，將沉淀過濾，并把沉淀放在通風(fēng)櫥中使溶劑揮發(fā)至聚合物固化，產(chǎn)物真空干燥后經(jīng)透析純化，再凍干即可得到Mal-PEG-PCL。
(2)含有馬來酰亞胺官能團的PEG-PCL納米粒凍干粉的制備取5mg Mal-PEG-PCL溶于2ml 二氯甲烷中，再加入到5ml含有十二烷基磺酸鈉(SDS)的水溶液中(SDS濃度為O. 2mg/ml)，在IOOOOrpm轉(zhuǎn)速下高速攪拌10 15分鐘，將所得納米粒水乳液旋蒸除去有機溶劑，再凍干即得含有馬來酰亞胺官能團的PEG-PCL納米粒凍干粉。(3)血紅蛋白類攜氧載體的制備結(jié)合珠蛋白與巰基化試劑Traut’ S，按照摩爾比I :40，通高純氮、常溫常壓條件下攪拌反應(yīng)2小時，超濾濃縮分離得到巰基化結(jié)合珠蛋白；將IOmg巰基化的人結(jié)合珠蛋白溶于20ml磷酸鹽緩沖液中，加入50mg含有馬來酰亞胺官能團的PEG-PCL納米粒凍干粉，4°C避光振蕩10小時，PBS溶液洗滌并在12000g下離心分離；收集下層納米粒,溶于5ml磷酸鹽緩沖液,加入15mg牛血紅蛋白，4°C避光攪拌反應(yīng)2小時，反應(yīng)液在12000g下離心分離，用磷酸鹽緩沖液洗滌至上層清液在400-600nm區(qū)域無吸收為止。2、理化性質(zhì)檢測檢測方法同實施例I。檢測結(jié)果本發(fā)明血紅蛋白類攜氧載體的粒徑約為180nm，透射電鏡觀察納米粒形態(tài)較規(guī)則且呈球形，血紅蛋白載藥率12%，氧親和力P5tl值2 ImmHg，Hi 11系數(shù)2. 35，pH值7. 5，MTT法檢測結(jié)果表明該納米粒對HEK293細胞無明顯毒性。實施例3本發(fā)明血紅蛋白類攜氧載體的制備I、制備方法(I) Mal-PEG-PCL 和 MPEG-PCL 的制備分別將8. 33g己內(nèi)酯與I. 67g分子量5000的單馬來酰亞胺聚乙二醇(Mal-PEG5000)或I. 67g分子量5000的聚乙二醇單甲醚(MPEG5000)按質(zhì)量比5 1置于三口燒瓶中，加入催化劑辛酸亞錫以及適量甲苯，在機械攪拌和氮氣保護的條件下在137°C油浴中反應(yīng)6小時；待反應(yīng)體系溫度降到室溫后，將聚合物倒入冷石油醚中沉淀，將沉淀過濾，并把沉淀放在通風(fēng)櫥中使溶劑揮發(fā)至聚合物固化，產(chǎn)物真空干燥后經(jīng)透析純化，再凍干即可得到Mal-PEG-PCL (如圖 2)和 MPEG-PCL (如圖 3)。
(2)含有馬來酰亞胺官能團的PEG-PCL納米粒凍干粉的制備將5mg超氧化物岐化酶SOD，5mg過氧化氫酶CAT，溶于2ml PBS (pH7. 4)，以每分鐘
O.5ml的速度在超聲振蕩下滴入5ml含5mg Mal-PEG-PCL和95mg MPEG-PCL的二氯甲烷溶液，滴加完后將制得的初乳迅速倒入20ml0. 1%的PVA溶液中，在乳化分散機上乳化5分鐘，然后加入IOOml O. 1%的PVA溶液中稀釋攪拌30分鐘，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上揮去有機溶劑，凍干即得包裹超氧化物岐化酶和過氧化氫酶的含有馬來酰亞胺官能團的PEG-PCL納米粒凍干粉。(3)血紅蛋白類攜氧載體的制備結(jié)合珠蛋白與巰基化試劑Traut’s，按照摩爾比I :40，通高純氮條件下攪拌反應(yīng)2小時，葡聚糖凝膠柱分離得到巰基化結(jié)合珠蛋白； 將IOmg人結(jié)合珠蛋白溶于IOml磷酸鹽緩沖液中，加入IOOmg含有馬來酰亞胺官能團的PEG-PCL納米粒凍干粉，4°C避光振蕩24小時，PBS溶液洗滌并在12000g下離心分離；收集下層納米粒,溶于5ml磷酸鹽緩沖液,加入15mg人臍帶血血紅蛋白，4°C避光攪拌反應(yīng)2小時，反應(yīng)液經(jīng)凝膠色譜柱純化，收集在400-600nm區(qū)域有血紅蛋白特征吸收的洗脫液，經(jīng)超濾濃縮后凍干。2、理化性質(zhì)檢測檢測方法同實施例I。檢測結(jié)果本發(fā)明血紅蛋白類攜氧載體的粒徑約為224nm (如圖4)，透射電鏡觀察納米粒形態(tài)較規(guī)則且呈球形(如圖5 )，血紅蛋白載藥率8 %，氧親和力P5tl值36mmHg，Hi 11系數(shù)2. 90，pH值7. 3，MTT法檢測結(jié)果表明該納米粒對HEK293細胞無明顯毒性(如圖6)。實施例4本發(fā)明血紅蛋白類攜氧載體的制備I、制備方法(I) Mal-PEG-PCL 和 MPEG-PCL 的制備分別將8g己內(nèi)酯與2g分子量5000的單馬來酰亞胺聚乙二醇(Mal_PEG5000)或2g分子量5000的聚乙二醇單甲醚(MPEG5000)按質(zhì)量比4 1置于三口燒瓶中，加入催化劑辛酸亞錫以及適量甲苯，在機械攪拌和氮氣保護的條件下在137°C油浴中反應(yīng)6小時；待反應(yīng)體系溫度降到室溫后，將聚合物倒入冷石油醚中沉淀，將沉淀過濾，并把沉淀放在通風(fēng)櫥中使溶劑揮發(fā)至聚合物固化，產(chǎn)物真空干燥后經(jīng)透析純化，再凍干即可得到Mal-PEG-PCL 和 MPEG-PCL。(2)含有馬來酰亞胺官能團的PEG-PCL的納米粒凍干粉的制備將5mg超氧化物岐化酶SOD，5mg過氧化氫酶CAT，5mg過氧化物酶溶于2ml PBS (PH7. 4)，以每分鐘O. 5ml的速度在超聲振蕩下滴入20ml含20mgMal-PEG_PCL和180mgMPEG-PCL的二氯甲烷溶液，在乳化分散機上乳化5分鐘形成初乳，然后將初乳加入200ml
O.I %的PVA水溶液中攪拌過夜揮干有機溶劑，凍干即得含有馬來酰亞胺官能團的PEG-PCL納米粒凍干粉。(3)血紅蛋白類攜氧載體的制備結(jié)合珠蛋白與巰基化試劑Traut’ s,按照摩爾比I :40,通高純氮條件下避光攪拌反應(yīng)2小時，葡聚糖凝膠柱分離得到巰基化結(jié)合珠蛋白；
將IOmg人結(jié)合珠蛋白溶于IOml磷酸鹽緩沖液中，加入50mg含有馬來酰亞胺官能團的PEG-PCL納米粒凍干粉，4°C振蕩24小時，PBS溶液洗滌并在12000g下離心分離；收集下層納米粒,溶于 5ml磷酸鹽緩沖液,加入15mg人臍帶血血紅蛋白，4°C避光攪拌反應(yīng)6小時，反應(yīng)液經(jīng)凝膠色譜柱純化，收集在400-600nm區(qū)域有血紅蛋白特征吸收的洗脫液，經(jīng)超濾濃縮后凍干。2、理化性質(zhì)檢測檢測方法同實施例I。檢測結(jié)果本發(fā)明血紅蛋白類攜氧載體的粒徑約為254nm (如圖5)，透射電鏡觀察納米粒形態(tài)較規(guī)則且呈球形(如圖8 )，血紅蛋白載藥率9 %，氧親和力P5tl值lOmmHg，Hi 11系數(shù)I. 30，pH值7. 4，MTT法檢測結(jié)果表明該納米粒對HEK293細胞無明顯毒性(如圖9)。實施例5本發(fā)明血紅蛋白類攜氧載體的制備I、制備方法(I) Mal-PEG-PCL 和 MPEG-PCL 的制備分別將8. 33g己內(nèi)酯與I. 67g分子量3500的單馬來酰亞胺聚乙二醇(Mal-PEG3500)或I. 67g分子量3000的聚乙二醇單甲醚(MPEG3000)按質(zhì)量比5 :1置于三口燒瓶中，加入催化劑辛酸亞錫以及適量甲苯，在機械攪拌和氮氣保護的條件下在90 0C油浴中反應(yīng)24小時。然后將溫度升至180°C，并將反應(yīng)體系抽至真空。20分鐘后，終止反應(yīng)，待反應(yīng)體系溫度降到室溫后，將聚合物倒入冷石油醚中沉淀，將沉淀過濾，并把沉淀放在通風(fēng)櫥中使溶劑揮發(fā)至聚合物固化，產(chǎn)物真空干燥后經(jīng)透析純化，再凍干即可得到Mal-PEG-PCL和 MPEG-PCL。(2)含有馬來酰亞胺官能團的PEG-PCL的納米粒凍干粉的制備將IOmg抗壞血酸溶于2ml PBS (PH 7. 4)，以每分鐘O. 5ml的速度在超聲振蕩下滴入20ml含8mg Mal-PEG-PCL和192mg MPEG-PCL的二氯甲烷溶液，在乳化分散機上乳化5分鐘形成初乳，然后將初乳加入200ml O. I %的PVA水溶液中攪拌過夜揮干有機溶劑，凍干即得含有馬來酰亞胺官能團的PEG-PCL納米粒凍干粉。(3)血紅蛋白類攜氧載體的制備結(jié)合珠蛋白與巰基化試劑Traut’ s,按照摩爾比I :40,通高純氮條件下避光攪拌反應(yīng)2小時，葡聚糖凝膠柱分離得到巰基化結(jié)合珠蛋白；將IOmg人結(jié)合珠蛋白溶于IOml磷酸鹽緩沖液中，加入50mg含有馬來酰亞胺官能團的PEG-PCL納米粒凍干粉，4°C振蕩24小時，PBS溶液洗滌并在12000g下離心分離；收集下層納米粒,溶于5ml磷酸鹽緩沖液,加入15mg人臍帶血血紅蛋白，4°C避光攪拌反應(yīng)6小時，反應(yīng)液經(jīng)凝膠色譜柱純化，收集在400-600nm區(qū)域有血紅蛋白特征吸收的洗脫液，經(jīng)超濾濃縮后凍干。2、理化性質(zhì)檢測檢測方法同實施例I。檢測結(jié)果本發(fā)明血紅蛋白類攜氧載體的粒徑約為320nm，透射電鏡觀察納米粒形態(tài)較規(guī)則且呈球形，血紅蛋白載藥率6%，氧親和力P5tl值23mmHg，Hill系數(shù)2.41，pH值7. 3，MTT法檢測結(jié)果表明該納米粒對HEK293細胞無明顯毒性。實施例6本發(fā)明血紅蛋白類攜氧載體的制備
I、制備方法(I) Mal-PEG-PLA 和 MPEG-PLA 的制備5g丙交酯(D，L-lactide)與5g分子量5000的單馬來酰亞胺聚乙二醇(Mal-PEG5000)或5g分子量5000的聚乙二醇單甲醚(MPEG5000)按質(zhì)量比I :1置于三口燒瓶中，加入催化劑辛酸亞錫以及適量甲苯，在機械攪拌和氮氣保護的條件下在135°C油浴中反應(yīng)10小時,將溫度升至180°C，并將反應(yīng)體系抽至真空；30分鐘后，終止反應(yīng)，待反應(yīng)體系溫度降到室溫后，加入二氯甲烷溶解，再用冷石油醚沉淀洗滌2次。將聚合物倒入冷石油醚中沉淀，將沉淀過濾，并把沉淀放在通風(fēng)櫥中使溶劑揮發(fā)至聚合物固化，產(chǎn)物真空干燥后經(jīng)透析純化，再凍干即可得到Mal- PEG-PLA和MPEG-PLA。(2)含有馬來酰亞胺官能團的PEG-PLA的納米粒凍干粉的制備分別取5mg Mal-PEG-PLA和150mg MPEG-PLA溶于5ml丙酮，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀抽去丙酮，然后加入IOml蒸餾水，于60度水浴加熱攪拌，即得到含有馬來酰亞胺官能團的PEG-PLA粒水溶液，凍干即得含有馬來酰亞胺官能團的PEG-PLA的納米粒凍干粉。(3)血紅蛋白類攜氧載體的制備結(jié)合珠蛋白與巰基化試劑Traut’ s,按照摩爾比I :40,通高純氮條件下避光攪拌反應(yīng)2小時，葡聚糖凝膠柱分離得到巰基化結(jié)合珠蛋白；將IOmg巰基化的人結(jié)合珠蛋白溶于IOml磷酸鹽緩沖液中，加入IOOmg含有馬來酰亞胺官能團的PEG-PLA納米粒凍干粉，4°C避光振蕩10小時，PBS溶液洗滌并在12000g下離心分離；收集下層納米粒,溶于5ml磷酸鹽緩沖液,加入15mg人臍帶血血紅蛋白，4°C避光攪拌反應(yīng)2小時，反應(yīng)液在12000g下離心分離，用磷酸鹽緩沖液洗滌至上層清液在400-600nm區(qū)域無吸收為止。(2)理化性質(zhì)檢測檢測方法同實施例I。檢測結(jié)果本發(fā)明血紅蛋白類攜氧載體的粒徑約為120nm，透射電鏡觀察納米粒形態(tài)較規(guī)則且呈球形，血紅蛋白載藥率10%，氧親和力P5tl值27mmHg，Hill系數(shù)2. 58，pH值7. 2，MTT法檢測結(jié)果表明該納米粒對HEK293細胞無明顯毒性。實施例7本發(fā)明血紅蛋白類攜氧載體的制備I、制備方法(I) NH2-PEG-PCL 和 MPEG-PCL 的制備分別將8. 89g己內(nèi)酯與I. Ilg分子量3500的單氨基聚乙二醇(NH2_PEG3500)或I. Ilg分子量3000的聚乙二醇單甲醚(MPEG3000)按質(zhì)量比8 I置于三口燒瓶中，加入催化劑辛酸亞錫以及適量甲苯，在機械攪拌和氮氣保護的條件下在100°C油浴中反應(yīng)12小時。然后將溫度升至130°C，并將反應(yīng)體系抽至真空；30分鐘后，終止反應(yīng)，待反應(yīng)體系溫度降到室溫后，將聚合物倒入冷石油醚中沉淀，將沉淀過濾，并把沉淀放在通風(fēng)櫥中使溶劑揮發(fā)至聚合物固化，產(chǎn)物真空干燥后經(jīng)透析純化，再凍干即可得到NH2-PEG-PCL和MPEG-PCL。(2)含有氨基官能團的PEG-PCL的納米粒凍干粉的制備
以1%的PVA水溶液作為水相，先在乳化分散機上乳化2分鐘，然后以每分鐘O. 5ml的速度滴加5ml含有IOmg NH2-PEG-PCL和90mg MPEG-PCL的二氯甲烷溶液，滴加完后在乳化分散機上乳化10分鐘，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀抽去二氯甲烷，凍干即得含有氨基官能團的PEG-PCL的納米粒凍干粉。(3)血紅蛋白類攜氧載體的制備取上述制備好的納米粒凍干粉lOOmg，溶于IOml PBS緩沖液中；再將IOmg人結(jié)合珠蛋白溶于IOml PBS緩沖液(PH 7. 4)，加入EDC和NHS到溶液，活化蛋白的羧基。在室溫反應(yīng)2h后，在攪拌的條件下將該溶液滴加到納米粒的水溶液中，4°C避光振蕩24小時，PBS溶液洗滌并在12000g下離心分離；收集下層納米粒子，溶于5ml磷酸鹽緩沖液,加入15mg人臍帶血血紅蛋白，4°C 避光攪拌反應(yīng)4小時，反應(yīng)液在12000g下離心分離，用磷酸鹽緩沖液洗滌至上層清液在400-600nm區(qū)域無吸收為止。2、理化性質(zhì)檢測檢測方法同實施例I。檢測結(jié)果本發(fā)明血紅蛋白類攜氧載體的粒徑約為400nm，透射電鏡觀察納米粒形態(tài)較規(guī)則且呈球形，血紅蛋白載藥率7%，氧親和力P5tl值19mmHg，Hill系數(shù)I. 52，pH值7. 4，MTT法檢測結(jié)果表明該納米粒對HEK293細胞無明顯毒性。實施例8本發(fā)明血紅蛋白類攜氧載體的制備I、制備方法(I) C00H-PEG-PCL 和 MPEG-PCL 的制備分別將8. 89g己內(nèi)酯與I. Ilg分子量2000的單羧基聚乙二醇(C00H-PEG2000)或
I.Ilg分子量2000的聚乙二醇單甲醚(MPEG2000)按質(zhì)量比8 I置于三口燒瓶中，加入催化劑辛酸亞錫以及適量甲苯，在機械攪拌和氮氣保護的條件下在100°C油浴中反應(yīng)12小時。然后將溫度升至130°C，并將反應(yīng)體系抽至真空；30分鐘后，終止反應(yīng)，待反應(yīng)體系溫度降到室溫后，將聚合物倒入冷石油醚中沉淀，將沉淀過濾，并把沉淀放在通風(fēng)櫥中使溶劑揮發(fā)至聚合物固化，產(chǎn)物真空干燥后經(jīng)透析純化，再凍干即可得到C00H-PEG-PCL和MPEG-PCL。(2)含有羧基官能團的PEG-PCL的納米粒凍干粉的制備然后，以1%的PVA水溶液作為水相，先在乳化分散機上乳化2分鐘，然后以每分鐘O. 5ml的速度滴加5ml含有IOmg C00H-PEG-PCL和90mgMPEG_PCL的二氯甲烷溶液，滴加完后在乳化分散機上乳化10分鐘，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀抽去二氯甲烷，凍干即得含有氨基官能團的PEG-PCL的納米粒凍干粉。(3)血紅蛋白類攜氧載體的制備取上述制備好的納米粒凍干粉lOOmg，溶于10ml PBS緩沖液中，加入EDC和NHS到溶液，室溫反應(yīng)2h后活化納米粒表面的羧基；再將IOmg人結(jié)合珠蛋白溶于10ml PBS緩沖液(PH 7. 4)，滴加到上述納米粒的反應(yīng)液中，4°C避光振蕩24小時，PBS溶液洗滌并在12000g下離心分離；收集下層納米粒子，溶于5ml磷酸鹽緩沖液,加入15mg人臍帶血血紅蛋白，4°C避光攪拌反應(yīng)4小時，反應(yīng)液在12000g下離心分離，用磷酸鹽緩沖液洗滌至上層清液在400-600nm區(qū)域無吸收為止。2、理化性質(zhì)檢測檢測方法同實施例I。檢測結(jié)果本發(fā)明血紅蛋白類攜氧載體的粒徑約為320nm，透射電鏡觀察納米粒形態(tài)較規(guī)則且呈球形，血紅蛋白載藥率8%，氧親和力P5tl值21mmHg，Hill系數(shù)2. 29，pH值7. 5，MTT法檢測結(jié)果表明該納米粒對HEK293細胞無明顯毒性。實驗例I本發(fā)明血紅蛋白類攜氧載體的血管活性檢測I、按照實施例3和實施例4分別制備得到攜氧載體I和2 (如圖10)。2、血管活性檢測雄性昆明小鼠9只，22_25g，隨機分為純化人臍帶血血紅蛋白組，攜氧載體I組，攜氧載體2組，每組3只。清醒動物稱重后，置于BP-2000無創(chuàng)血壓檢測系統(tǒng)，尾部測壓，測定得到基礎(chǔ)血壓，然后按照分組分別從尾靜脈推注16%血容量(理論最 大耐受量，約O. 3ml/25g小鼠)的人臍帶血血紅蛋白溶液，攜氧載體I溶液和攜氧載體2溶液，檢測每組推注后60分鐘內(nèi)血壓的變化情況。推注前，分別用生理鹽水將人臍帶血血紅蛋白，攜氧載體I凍干粉和攜氧載體2凍干粉稀釋到終濃度8g/dl。結(jié)果以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，* P<0. 05,**P<0. Olvs 基礎(chǔ)血壓。檢測結(jié)果如圖11所示純化人臍帶血血紅蛋白輸注后，會引起動物血壓明顯提高，表明有顯著的血管收縮活性；而推注兩種血紅蛋白類攜氧載體后，均未發(fā)現(xiàn)動物血壓的明顯變化，與基礎(chǔ)狀態(tài)基本一致，表明本發(fā)明的血紅蛋白類攜氧載體無明顯血管副作用。實驗結(jié)果說明，本發(fā)明血紅蛋白類攜氧載體注入體內(nèi)后無高血壓反應(yīng)，證明其是安全的，不會產(chǎn)生游離的血紅蛋白。綜上，本發(fā)明血紅蛋白類攜氧載體在體內(nèi)不會產(chǎn)生游離血紅蛋白，克服了 HBOCs類制品固有的缺陷，并且，其表面帶有數(shù)量可控的活性官能團，可定量結(jié)合血紅蛋白，得到的產(chǎn)物質(zhì)量穩(wěn)定，安全性和可控性都顯著提高，具有極其良好的臨床應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.一種血紅蛋白類攜氧載體，其特征在于包含血紅蛋白、結(jié)合珠蛋白和聚乙二醇一聚酯納米粒，血紅蛋白通過結(jié)合珠蛋白連接在聚乙二醇一聚酯納米粒表面。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血紅蛋白類攜氧載體，其特征在于其粒徑為8(T400nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的血紅蛋白類攜氧載體，其特征在于其粒徑為20(T300nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血紅蛋白類攜氧載體，其特征在于血紅蛋白的含量為6 12%(w/w)，血紅蛋白與結(jié)合珠蛋白的摩爾比為I :1。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血紅蛋白類攜氧載體，其特征在于所述聚乙二醇一聚酯納米粒為聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米?；蛘呔垡叶?聚乳酸納米粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血紅蛋白類攜氧載體，其特征在于所述聚乙二醇一聚酯納米粒與結(jié)合珠蛋白通過硫醚鍵或酰胺鍵連接。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血紅蛋白類攜氧載體，其特征在于所述血紅蛋白類攜氧載體氧親和力P50值為10 36mmHg，Hill系數(shù)為I. 30 2· 90，pH值為7. 2 7. 5。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血紅蛋白類攜氧載體，其特征在于它還包括抗氧化劑，抗氧化劑包裹于聚乙二醇一聚酯納米粒中。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的血紅蛋白類攜氧載體，其特征在于所述抗氧化劑為抗壞血酸、超氧化物岐化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、維生素E、谷胱甘肽、連二亞硫酸鈉、N-乙酰半胱氨酸中的一種或一種以上的組合。
10.權(quán)利要求I所述血紅蛋白類攜氧載體的制備方法，其特征在于它包括如下步驟 a、取結(jié)合珠蛋白、巰基化結(jié)合珠蛋白或者羧基活化的結(jié)合珠蛋白，以及帶有官能團的聚乙二醇一聚酯納米粒溶于磷酸鹽緩沖液中，結(jié)合珠蛋白與納米粒的重量比為1:5 10，4°C震蕩18 30小時，磷酸鹽緩沖液洗滌，1000(Tl4000g離心，得沉淀； b、將步驟a所得沉淀溶于磷酸鹽緩沖液中，加入血紅蛋白，血紅蛋白與結(jié)合珠蛋白的重量比為(2 4) :(f3)，4°C避光反應(yīng)2飛小時，分離純化，濃縮凍干，即得血紅蛋白類攜氧載體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于步驟a所述官能團為單馬來酰亞胺、羧基或者氨基。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于步驟a所述聚酯是聚乳酸或聚己內(nèi)酯。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于步驟a所述納米粒中包裹抗氧化劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于所述步驟a中，結(jié)合珠蛋白和納米粒重量比為1:5或者1:10 ;震蕩24小時；12000g離心。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于所述步驟b中，血紅蛋白與結(jié)合珠蛋白的重量比為3 2 ;避光反應(yīng)2小時；分離純化方法為離心或凝膠色譜柱分離純化，至上清液或洗脫液在400-600nm無明顯吸收峰為止，收集沉淀或者洗脫液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種血紅蛋白類攜氧載體，包含血紅蛋白、結(jié)合珠蛋白和聚乙二醇－聚酯納米粒，血紅蛋白通過結(jié)合珠蛋白連接在聚乙二醇－聚酯納米粒表面。本發(fā)明血紅蛋白類攜氧載體對細胞無明顯毒性，輸注后血漿中無明顯游離血紅蛋白，無高血壓反應(yīng)，可克服傳統(tǒng)血紅蛋白類攜氧載體副作用強的缺陷，具有良好的應(yīng)用前景和經(jīng)濟效益。
文檔編號A61P7/08GK102861322SQ20121035563
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月9日
發(fā)明者李濤, 楊倩, 吳畏, 李茜, 劉進, 陳艷芳 申請人:四川大學(xué)華西醫(yī)院