專利名稱：：通過熱處理以部分氧合形式制備藥用血紅蛋白的方法
背景技術：
：用游離血紅蛋白治療各種否則即需要輸注全血的臨床疾病已有許多年嘗試。如欲回顧此中歷史，可參見溫斯路，《基于血紅蛋白的紅細胞替代品》，約翰·霍普金斯大學出版社(1992)(Winslow，Hemoglobin-basedRedCellSubstitutes，JohnsHopkinsU.Press(1992))。使用游離血紅蛋白存在的一些障礙包括在分解成亞單位后，天然血紅蛋白有毒性，而且游離血紅蛋白與氧有高度的結合親合力，從而限制氧在組織中的釋放能力。其它的障礙包括制備不含細胞基質、病毒和細菌病原體以及內毒素的血紅蛋白。利用各種交聯(lián)四聚體血紅蛋白的方法已在很大程度上消除了與血紅蛋白的不良分解有關的第一個障礙。這符合物理防止四聚體亞單位分解成α-β二聚體的目的。美國專利4061736(Bonson等)描述了分子內交聯(lián)的血紅蛋白，其中交聯(lián)劑是雜環(huán)三嗪或鹵代的芳香劑、環(huán)烷、二醛等。在美國專利4826811(Sehgal等)中，首先將血紅蛋白吡哆化(pyridoxylate)，然后用戊二醛進行分子內和分子間交聯(lián)。其它交聯(lián)策略利用低免疫原性的交聯(lián)劑而達到構型固定性、分子穩(wěn)定性與無抗原性的結合。例如美國專利4377512(Ajisaki等)公開了通過聚氧乙烯交聯(lián)基團進行交聯(lián)。美國專利5234903相似地公開了將血紅蛋白通過氨基甲酸酯鍵與聚氧乙烯鍵合。最后，按照美國專利4598064和4600531，還有一種使用雙阿斯匹林交聯(lián)的策略，既能達到上述所有目的，又能用廉價試劑得到高產率。得到可治療用血紅蛋白的另一障礙是純凈。產品純凈的概念部分是指除去內源污染物如紅細胞基質和從血紅蛋白溶液中除去的非血紅蛋白蛋白質。純凈還指不存在外源導入的污染物如病毒、細菌和內毒素。設計了許多純化方法來純化血紅蛋白。因細胞溶解而產生的較大的細胞組分通?？赏ㄟ^過濾除去。濾器可以是硅藻土(參見美國專利4001200，Bonson)或更常用的是小孔膜濾器(例如美國專利4001200、3991181和4473494)。通常在粗濾步驟后可進行超濾，如美國專利4598064和4401652中教導的通過血液透析濾筒超濾?；蛘撸ㄟ^連續(xù)流式離心可除去大碎片和顆粒物質。由于過濾領域的技術改進，早期的純化方法通常已得到改進并克服了過去存在的問題，這樣在藥物應用中目前常用的過濾技術足以除去顆粒物質。除去非血紅蛋白可溶性蛋白質和其它物質的其它純化方法通常是通過凝膠過濾或離子交換色譜進行的。通過選擇適宜的凝膠排阻色譜步驟，可除去非血紅蛋白可溶性蛋白質。例如，美國專利4136093(Bonhard)公開了通過G-150Sephadex凝膠過濾柱純化過濾的血紅蛋白的方法。為得到更高的純度，也就是說將內毒素水平降低到低于0.5EU/mL的藥理學可接受的水平，可利用在SephadexG-200上進行兩步色譜，然后還可用結合珠蛋白親和色譜步驟(參見美國專利5084558和5296465)。另一種純化方法是蛋白質的示差沉淀(differentiallyprecipitate)，這反映出在復雜混合物中，有些蛋白質對于強化條件比其它蛋白質更穩(wěn)定。在加熱蛋白質混合物時，已發(fā)現(xiàn)某些蛋白質會變性并在特征溫度從溶液中沉淀出來。除去含變性蛋白質的所得沉淀物就會產生部分純化。美國專利4861867公開了通過將脫氧血紅蛋白形式的血紅蛋白溶液加熱到45-85℃，而使所述溶液中的病毒差異失活。病毒比血紅蛋白對熱更不穩(wěn)定，熱處理后，很容易使病毒效價降低很多對數(shù)數(shù)量級，而同時不會明顯損失血紅蛋白的生物活性。美國專利4861867公開了熱處理方法，其中通過將溶液在45-85℃下加熱不同時間長度，可長達10小時，而從非血紅蛋白中純化脫氧血紅蛋白。由于限制血紅蛋白轉變成高鐵血紅蛋白很重要，因此，在存在還原劑如抗壞血酸的條件下，或通過利用膜氣體交換裝置以基本上完全脫氧合的脫氣方法來進行脫氧合。在通常的過程中，在60℃進行5小時的熱處理可使總血紅蛋白的回收率達93％。生產血紅蛋白基血液替代品的另一目的是制備該蛋白質的失活氧化態(tài)高鐵血紅蛋白形式含量低的物質。這通常是通過在低溫下進行制備來達到的，因為高鐵血紅蛋白的形成隨溫度的升高而大量增加。如美國專利4861867中所公開的，當需要暴露于高溫時，如在血紅蛋白與特定的修飾劑反應時，或進行熱處理以使病毒失活的過程中，可利用蛋白質的脫氧合作用來抑制高鐵血紅蛋白的形成?；谘t蛋白氧化作用有關的文獻，所應避免的條件是血紅蛋白暴露于部分氧化條件，因為當血紅蛋白被氧部分飽和時，高鐵血紅蛋白的形成率最高。參見BrooksProc.Rov.Soc.Lond.Ser.B.118560-577，1935，該文獻教導說在氧壓為20mmHg時，血紅蛋白的氧化率最高。發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供被交聯(lián)以保持最佳氧結合親合力的藥用血紅蛋白組合物，該組合物含有低于0.25EU/mL的內毒素以便不會產生有害的生理學反應，該組合物基本上不含非血紅蛋白蛋白質和非交聯(lián)的血紅蛋白，絕對不含色譜細粒或來自色譜基質的污染聚合物，基本上不含病毒污染物并且在產物釋放分布時，高鐵血紅蛋白的含量低于5％。另一目的是提供生產所述血紅蛋白的方法，該方法包括間歇的生產方法，所述方法不會涉及昂貴及笨重的固相色譜系統(tǒng)。在本發(fā)明中，在存在非化學計量氧，pH7.25-7.55的條件下，將含交聯(lián)和非交聯(lián)血紅蛋白的混合物溶液在約45-85℃下加熱30分鐘至10小時。除去沉淀的非血紅蛋白蛋白質和大量非交聯(lián)血紅蛋白后，所得的交聯(lián)血紅蛋白溶液含低于1％的非交聯(lián)物質。本發(fā)明的組合物是高度純化，含有低于1％殘留非交聯(lián)血紅蛋白的可藥用交聯(lián)的血紅蛋白溶液，含有痕量殘留的非血紅蛋白蛋白質(低于0.01％w/w)，低于0.25EU/mL內毒素，絕對沒有色譜細粒或從含基質的純化系統(tǒng)帶來的殘留物，而且在產物釋放分布時，高鐵血紅蛋白的含量低于5％。在本發(fā)明的方法中，將交聯(lián)和非交聯(lián)的脫氧合無基質血紅蛋白混合物放在氧不滲透的反應裝置中，與氧部分反應以得到11％-28％的氧合血紅蛋白，加熱到約45-85℃，示差或優(yōu)先沉淀非交聯(lián)的血紅蛋白，并除去沉淀的非交聯(lián)的血紅蛋白。同樣的，可達到本發(fā)明純化目的的部分氧合水平可方便地測量為占每百萬份中溶解氧的份數(shù)(ppm)。因此通過將脫氧合無基質的交聯(lián)血紅蛋白和非交聯(lián)的血紅蛋白混合物放在不透氧的反應裝置中，導入氧使溶解氧含量為0.7-1.7ppm，將血紅蛋白加熱到約45-85℃，然后除去沉淀的非血紅蛋白和非交聯(lián)的血紅蛋白即可得到藥用血紅蛋白而無需色譜純化步驟。圖1是生產藥用交聯(lián)血紅蛋白的交聯(lián)和熱處理步驟流程圖。圖2是表示交聯(lián)血紅蛋白產率隨制備方法的熱處理步驟中存在的氧合血紅蛋白百分比變化的直線圖。優(yōu)選實施方案的詳細描述長期以來就已知道從破裂紅細胞中釋放出的游離人血紅蛋白或其它種類的血紅蛋白與氧的結合親合力明顯高于紅細胞中相應天然血紅蛋白的相應的親合力。由于在組織中釋氧性能差，所以這種高度的親合力使血紅蛋白不太適于作為攜帶氧的分子。隨后發(fā)現(xiàn)與特定試劑的交聯(lián)促使血紅蛋白四聚體形成一種構型，使其與氧的結合親合力接近完整紅細胞的結合親合力。本發(fā)明交聯(lián)血紅蛋白的可接受的P50值(在血紅蛋白達到半飽和的氧分壓)為20-45mmHg(包括20和45)。交聯(lián)還穩(wěn)定了傾向于分解成二聚體的四聚體血紅蛋白。在本發(fā)明范圍內還包括進一步聚合產生分子量為120000-600000道爾頓的大分子交聯(lián)血紅蛋白。本發(fā)明所用的無細胞血紅蛋白可以是任何類型的，應是無基質并經(jīng)化學修飾的以防止亞單位分解并將氧結合親合力提高到P50值為約20-45mmHg的范圍，只要形成的化學鍵在下文所述的加熱條件下是穩(wěn)定的。修飾的血紅蛋白可以是結合的血紅蛋白、交聯(lián)的血紅蛋白、聚合的血紅蛋白。已在科學文獻中描述了多種血紅蛋白修飾技術，這些技術可用于本發(fā)明的實踐。例如參見溫斯路，《基于血紅蛋白的紅細胞替代品》，約翰·霍普金斯大學出版社(1992)(Winslow，R.M.，Hemoglobin-basedRedCellSubstitutes，JohnsHopkinsU.Press(1992))。更具體地說，下文列出制備化學修飾的血紅蛋白的方法。結合的血紅蛋白是指非蛋白質大分子與血紅蛋白共價結合。一個實例是用聚亞烷基二醇化學修飾的血紅蛋白，與其制備方法一起描述于WO9107190(Enzon)。在美國專利4301144、4412989和4670417以及日本專利59-104323和61-053223(Ajinomoto)中提供了與聚氧化烯結合的血紅蛋白和其制備方法的實例。在美國專利4377512(Ajinomoto)中提供了與胰島素結合的血紅蛋白。專利WO9107190、美國專利4301144、4670417、4377512和日本專利59-104323和61-053223引入本文作為參考。交聯(lián)的血紅蛋白含一分子間化學鍵。交聯(lián)的血紅蛋白和其制備方法的實例描述于美國專利4001401和4053590，所述專利公開了用化合物如鹵代環(huán)烷、雙環(huán)氧化合物和重氮聯(lián)苯胺(diazobenzidines)在血紅蛋白四聚體的α和β亞單位之間進行分子間交聯(lián)。在本發(fā)明的熱處理純化方法中，優(yōu)選的修飾的血紅蛋白是與富馬酸二(3，5-二溴水楊基)酯交聯(lián)以便在兩個α亞單位之間產生富馬酸交聯(lián)。在美國專利4598064、4600531、RE34271中更詳細地描述了這種交聯(lián)的血紅蛋白及其制備方法，省去了色譜步驟。優(yōu)選在美國專利5128452(Hai)公開的條件下制備以防止β鏈之間的交聯(lián)。美國專利4598064、4600531、RE34271和5128452引入本文作為參考。WO90/13309(StaatDerNederlandenDeMinisterVanDefeuric)公開了通過β-β鍵交聯(lián)血紅蛋白的方法。聚合的血紅蛋白是其中用血紅蛋白四聚體的分子間交聯(lián)來提高修飾的血紅蛋白之分子量的一種血紅蛋白。在美國未決申請系列08/149679、08/173882、08/480593和08/473459中描述了聚合血紅蛋白的和其制備方法的實例。美國專利4777244公開了與脂族二醛交聯(lián)和聚合的方法。前述專利均引入本文作為參考。下面舉例說明用組合方法修飾的血紅蛋白。在日本專利59-089629、59-103322和59-104323(Ajinomoto)中描述了為調整氧親合力而用吡哆醛-5’-磷酸酯修飾的血紅蛋白和通過聚乙二醇結合而修飾的血紅蛋白以及其制備方法。美國專利5248766公開了交聯(lián)聚合策略以及用環(huán)氧乙烷共價互連四聚體單位以形成分子量超過120000道爾頓的聚合血紅蛋白的方法。公開了聚合血紅蛋白的前述專利，美國專利5194590、5248766、日本專利59-103322、59-089629和59-104323均引入本文作為參考?？赏ㄟ^定點誘變修飾并在微生物或轉基因動物中表達血紅蛋白。美國專利5028588(Somatogen)中描述了重組突變體和人工血紅蛋白及其用細胞培養(yǎng)物或液體的生產方法。WO90/13645(Somatogen)描述了用于在細菌和酵母中生產血紅蛋白的二-α和二-β球蛋白樣多肽。WO93/09143(Somatogen)描述了非天然的多聚血紅蛋白樣蛋白質。通常，可以產生P50為20-45mmHg的游離四聚體的任何交聯(lián)、聚合、包膜或遺傳工程修飾方法或其組合形式在本發(fā)明中均是有效的。無需過多試驗即可調整制備所述各交聯(lián)四聚體或聚合物的條件。圖1是生產藥用雙阿斯匹林交聯(lián)的血紅蛋白的制備方法，下文稱為“DCLHbTM”。盡管用相似的方法可純化其它交聯(lián)的血紅蛋白，但本文詳細描述DCLHbTM的制備方法作為優(yōu)選實施方案。其優(yōu)選的狀態(tài)說明其在商業(yè)上容易大規(guī)模合成和純化，并在多種疾病中作為治療劑。通過如恒體積透濾和濃縮這樣的方法，收集紅細胞、洗滌以降低殘留血漿蛋白的水平。將洗滌的細胞溶解在3體積的低滲緩沖液中。用500K孔大小的纖維膜過濾所得的溶血產物以得到無基質的血紅蛋白溶液。超濾濃縮無基質的血紅蛋白。將該溶液通過0.2μm過濾器過濾。然后在存在三聚磷酸鈉(0.01M)的條件下將無基質血紅蛋白脫氧合。將溶液的氧合血紅蛋白含量降到3％以下。重要的是除去氧達到確立基線的低水平，因為氧的再加入(這對于本發(fā)明方法是很重要的)需要精確地確定。脫氧合后，將血紅蛋白與化學計量過量的富馬酸二(3，5-二溴水楊基)酯(DBBF)交聯(lián)。此時，將氧導入到反應器中，在一典型的運行中，在pH7.4，將濃度為約5-6g/dL的溶液在約76℃加熱90分鐘。可以使用的溫度和熱處理范圍分別為45℃-85℃，30分鐘-10小時。在該范圍內，優(yōu)選65℃-80℃，74℃-78℃最佳。血紅蛋白的濃度可為3g/dL-20g/dL。pH可以為7.25-7.55。在所述范圍內選擇條件時，要求有些試驗產率達到最佳并保持高純度。例如，如果需要較短的加工時間，則熱處理可以在76℃以上完成；但需調整濃度或pH。在所說明的各范圍內，只需要進行幾個生產循環(huán)就可得到具體的最佳生產條件。根據(jù)兩個參數(shù)來測量氧含量。加入氧直到總氧合血紅蛋白含量達到約11-28％，優(yōu)選約13-18％?；蛘?，測量在血紅蛋白溶液中溶解氧的百分比。溶解氧的含量應保持在約0,7-1.7ppm。圖1說明了交聯(lián)和熱處理血紅蛋白的典型步驟順序。該圖給出了優(yōu)選實施方案中的參數(shù)。但是，處理時間和溫度是可以改變的?？傊?，處理溫度越高，完成方法所需的時間越短。但在這些條件下，對于任何特定修飾的血紅蛋白，必須將溫度保持在待熱處理蛋白質的變性溫度下。由此可見，在這些條件下，85℃對于DCLHb太高，但對其它衍生物是可接受的。在熱處理步驟中，過程控制非常重要。盡管不需要建造特殊設備，但就空氣和溶解氣體的控制而言，必須保持系統(tǒng)的完整性。重要的是反應容器必需是不透氣的，而且必須謹慎以便不會發(fā)生滲漏。應使用精密的閥門以防止墊圈滲漏并確保氧氣的精確測量。在熱處理步驟中必須將溶解氧的水平小心控制在0.7-1.7ppm范圍(11-28％氧合血紅蛋白)內。在這些條件下，熱處理后氧合血紅蛋白的水平不少于1％，而且在包裝和產物釋放時仍保持很低(＜5％)。在制備過程中使這些氧合血紅蛋白保持低水平，使得任何批次產物在釋放分布時都不大可能超過5％的限制。實驗確定非交聯(lián)的血紅蛋白優(yōu)先沉淀，特別是在部分氧合時。由于非交聯(lián)血紅蛋白與氧的結合比交聯(lián)分子的更緊密，因此，可預期非交聯(lián)物質將優(yōu)先氧合。但是，申請人無法解釋，盡管非交聯(lián)的血紅蛋白占總血紅蛋白的30％或更多，而氧合血紅蛋白含量的可操作范圍是11-28％。因此氧含量是非化學計量的，而且加入更多的氧會使產率急劇降低。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，從上文Brooks的教導來看，在升高溫度熱處理前，通過部分再氧合反應混合物可得到高度純化的交聯(lián)血紅蛋白制劑。部分再氧合后經(jīng)熱處理得到的溶液含有不到2％不需要的非交聯(lián)血紅蛋白，但可溶的交聯(lián)蛋白并未被高度氧化。這表明就化學純度而言，比因熱處理反應混合物而得到的物質(脫氧合更完全)有顯著的改善，后者含有數(shù)個百分點或更高的非交聯(lián)血紅蛋白。從下列事實看，結果更令人驚奇，在開始熱處理前，溶液中的最佳氧含量不足以完全飽和存在的非交聯(lián)血紅蛋白。因此本發(fā)明能夠從反應混合物(含有大量非交聯(lián)血紅蛋白)中更好地純化交聯(lián)的血紅蛋白而不會增加最終交聯(lián)產物中氧合血紅蛋白的水平。圖2表示不同的氧合血紅蛋白含量對產物產率的影響。隨著氧含量的增加，交聯(lián)百分比增加，但如果超過特定的范圍，產率就開始下降?？刹僮鞣秶羌s11-28％，優(yōu)選13-18％的氧合血紅蛋白，相當于0.7-1.7ppm溶解氧。熱處理可在45-85℃的溫度范圍內完成，而且在總共30分鐘到10小時的處理時間內，溫度可以在該范圍內變化。時間與溫度之間通常有相互作用的關系。在較高的溫度處理，只需要較少的時間。實驗已表明在76℃加熱約90分鐘對于大規(guī)模的制備而言是特別好的。熱處理應持續(xù)一段時間以便在45-85℃內所選的溫度下，非交聯(lián)血紅蛋白能夠有最佳的沉淀效果。在熱處理后，通過一系列常規(guī)過濾步驟，或通過離心除去沉淀。通過透濾(用Millipore30K螺旋超濾器過濾)有利于DCLHbTM的濃縮。用本文上述方法生產的交聯(lián)血紅蛋白在組成上與眾不同。所得的純度使得無需進行色譜步驟。因為基質床不易重建，在制備過程中的制備性色譜所用的樹脂和凝膠非常昂貴而且浪費嚴重，所以這在降低成本方面是非常有效的。另外色譜細粉會出現(xiàn)在最終產物中，而且即使其實際存在量不足以令產品摻雜，亦可能在陽性質量確保試驗，如用LAL試驗檢測內毒素的試驗中，出現(xiàn)模糊或錯誤結果。除了非交聯(lián)血紅蛋白和非血紅蛋白蛋白質的百分含量極低并絕對不含色譜細粉外，本發(fā)明交聯(lián)血紅蛋白中的內毒素低于0.25EU/mL(用USP85章所述試驗測量的)，而且在產物釋放時，氧合血紅蛋白的含量低于5％。在制備過程中，嚴格排除內毒素源，使用超純水和超純試劑。從藥物學上看，裝置設計堅固并便于徹底清洗。此類裝置的設計是藥物工程領域專業(yè)人員已知的。從下列實施例中，本發(fā)明的其它優(yōu)點將是顯而易見的。實施例對反應混合物進行熱處理過程，所述反應混合物是通過在不同條件下，將DBBF與人無基質血紅蛋白反應而得到的。表1說明在熱處理過程中，改變氧含量對產率和最終產物中交聯(lián)血紅蛋白百分比的影響。在所有情況下，在交聯(lián)前，將無基質血紅蛋白徹底脫氧合，然后在熱處理前再氧合到不同的程度。結果表明，氧合血紅蛋白水平高于28％，產率從77-83％降到僅有59％，從殘留的非交聯(lián)血紅蛋白看，最終產物的純度僅有很小的增加(99.6％-99.9％)。從這些數(shù)據(jù)清楚地表明通入氧以得到約11-18％的氧合血紅蛋白對于得到最大產率和高純度并保持低水平的高鐵血紅蛋白是有利的。表1存在一些氧的條件下熱處理的效果D.O.D.O.D.O.D.O.D.O.D.O.實驗參數(shù)很低低中等高很高超高氧ppm熱處理前(O2)*0.080.20.81.11.6-％氧合血紅蛋白1.64.07.311.118.228.9總血紅蛋白(g/dL)6.36.46.36.36.44.6％高鐵血紅蛋白00000.40.537℃pH7.357.407.387.477.357.48％交聯(lián)727272727273溫度Ramp時間熱處理過程中(分)64666462666576℃pH6.816.896.856.896.85-冷卻時間(分)646764606570熱處理后％回收的體積767475727782總血紅蛋白(g/dL)5.25.25.15.24.62.4％高鐵血紅蛋白2.23.13.52.40.22.0％產率(回收的DCLHb)838083827759％交聯(lián)95.496.498.899.499.699.9*不能獲得準確數(shù)據(jù)A.用Bio-SilTMTSK250柱和1MMgCl2的BisTris緩沖液，pH7.2作為流動相，在過程進行當中測定未加熱反應混合物交聯(lián)百分比。B.用下式計算產率百分比C.用SuperoseTM12柱，0.75MMgCl2BisTris緩沖液，pH6.5為流動相，確定熱處理溶液中的交聯(lián)百分比。表2A和2B比較了產物釋放時的高鐵血紅蛋白值，表2A是在微氧合步驟前的值，表2B是在微氧合作用后的相應值。微氧合前，平均值為4.09％，完成微氧合后僅為1.6％。表2A在完成微氧合步驟前，生產過程中的高鐵血紅蛋白值</tables></tables>n.d.-未檢測對于后者，注意到大量滅菌批次低于1％并且所有釋放批次均低于5％。統(tǒng)計學表明，在95％的置信度下，根據(jù)本發(fā)明方法生產的所有批次中，有99％的高鐵血紅蛋白釋放值低于預期的5％。熱處理后，低于1％的高鐵血紅蛋白有力地證明了(盡管不一定存在因果關系)在產物釋放時，高鐵血紅蛋白水平可以低于5％的標準。表2B在完成微氧合步驟后，生產過程中的高鐵血紅蛋白值批次釋放時MetHb％HBXR-94-2301.0PBS-2-94-0232.1HBXR-94-3141.8HBXR-94-3421.5HBXR-95-0262.4HBXR-95-0611.5HBXR-95-0961.1平均1.6n.d.-未檢測權利要求1.制備藥用交聯(lián)血紅蛋白的方法，該方法包括；將氧與含化學修飾和化學未修飾的血紅蛋白的血紅蛋白混合物反應以形成含約11-28％氧合血紅蛋白的反應混合物；加熱反應混合物以沉淀化學未修飾的血紅蛋白；和除去沉淀的化學未修飾的血紅蛋白。2.制備藥用血紅蛋白的方法，該方法包括將氧加到含化學修飾和化學未修飾的血紅蛋白的血紅蛋白混合物中以形成溶解氧含量為0.7-1.7ppm的反應混合物；加熱反應混合物以沉淀化學修飾的血紅蛋白；和除去沉淀的化學未修飾的血紅蛋白。3.根據(jù)權利要求1或2的方法，其中化學修飾的血紅蛋白主要是脫氧合血紅蛋白。4.根據(jù)權利要求3的方法，其中所述血紅蛋白混合物含有低于3％的氧合血紅蛋白。5.根據(jù)權利要求1、2、3或4的方法，其中化學修飾的血紅蛋白是無基質的。6.根據(jù)權利要求5的方法，其中化學修飾的、無基質血紅蛋白是交聯(lián)的、聚合的或結合的血紅蛋白并且在加熱反應混合物時是穩(wěn)定的。7.根據(jù)權利要求6的方法，其中化學修飾的、無基質血紅蛋白是雙阿斯匹林交聯(lián)的血紅蛋白。8.根據(jù)權利要求1、2、3、4、5、6或7的方法，其中化學未修飾的血紅蛋白被示差沉淀(differentiallyprecipitated)。9.根據(jù)權利要求1、2、3、4、5、6或7的方法，其中化學未修飾的血紅蛋白被優(yōu)先沉淀。10.根據(jù)權利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9的方法，其中將反應混合物加熱到約45℃-約85℃。11.根據(jù)權利要求10的方法，其中將反應混合物加熱到65℃-80℃。12.根據(jù)權利要求11的方法，其中將反應混合物加熱到74℃-78℃。13.根據(jù)權利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12的方法，其中將反應混合物加熱30分鐘到10小時。14.根據(jù)權利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13的方法，其中反應混合物的pH為7.25-7.55，且血紅蛋白的濃度為3-20g/dl。15.化學修飾的血紅蛋白溶液，含有低于5％的血紅蛋白、低于0.25內毒素單位/ml內毒素，并不含色譜殘留物。16.根據(jù)權利要求15的血紅蛋白溶液，其中化學修飾的血紅蛋白溶液含有交聯(lián)的、聚合的或結合的血紅蛋白。17.根據(jù)權利要求16的血紅蛋白溶液，其中化學修飾的血紅蛋白是交聯(lián)的血紅蛋白。18.根據(jù)權利要求17的血紅蛋白溶液，其中交聯(lián)的血紅蛋白是雙阿斯匹林交聯(lián)的血紅蛋白。19.權利要求17的血紅蛋白溶液，含有低于2％的非交聯(lián)四聚體。20.權利要求15、16、17、18或19的血紅蛋白溶液，無基質并基本上不含非血紅蛋白蛋白質和病毒污染物。21.權利要求15、16、17、18、19或20的血紅蛋白溶液，其P50為約20-約45mmHg。全文摘要在純化藥用交聯(lián)血紅蛋白的過程中,在存在非化學計量氧的條件下加熱交聯(lián)的和非交聯(lián)的血紅蛋白混合物,這樣選擇性地沉淀非交聯(lián)的血紅蛋白。分離出沉淀的非交聯(lián)四聚體后,可純化仍在上清液中的交聯(lián)血紅蛋白而無需進一步的色譜純化步驟。所述血紅蛋白是高度交聯(lián)的,絕對不含色譜細粒,并含有低含量的高鐵血紅蛋白。文檔編號A61K35/14GK1197392SQ96197144公開日1998年10月28日申請日期1996年8月20日優(yōu)先權日1995年9月22日發(fā)明者M·R·阿扎里,A·A·艾貝玲,J·E·皮肯,T·N·艾斯特申請人:巴克斯特國際有限公司