紫外輻照滅活血紅蛋白及血紅蛋白氧載體中病毒的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種人源或動(dòng)物源的血紅蛋白及血紅蛋白氧載體的病毒滅活方法，從而將其可能含有的病毒部分或全部去除。待處理的血紅蛋白或血紅蛋白氧載體為溶液形態(tài)；該方法包括以下步驟：先用性質(zhì)較為惰性的氣體將氧合血紅蛋白進(jìn)行脫氧，使之轉(zhuǎn)化為脫氧血紅蛋白，防止亞鐵血紅蛋白的氧化，再用紫外燈對(duì)脫氧血紅蛋白溶液進(jìn)行照射，設(shè)置照射至液面時(shí)的紫外線強(qiáng)度為50—110μw/cm2，并根據(jù)照射面積及溶液體積調(diào)整照射時(shí)間，照射完成后即完成了病毒滅活的過程。
【專利說明】紫外輻照滅活血紅蛋白及血紅蛋白氧載體中病毒的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】,具體涉及以血紅蛋白(hemoglobin, Hb)為原料制備生物制品時(shí)病毒滅活的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]用人或者動(dòng)物的血紅蛋白制備生物制品，為防止病毒的交叉感染，其生產(chǎn)工藝須具備一定的去除/滅活部分病毒能力，將其可能含有的病毒部分或全部去除。
[0003]由于不同生物制品潛在的病毒種類不同，所選擇病毒去除/滅活方法的側(cè)重點(diǎn)也應(yīng)有所不同，故而有多種去除/滅活的方法。根據(jù)生物我國生物制品《血液制品去除/滅活病毒技術(shù)方法及驗(yàn)證指導(dǎo)原則》，常用的方法有:(1)巴斯德消毒法(巴氏消毒法)#)干熱法(凍干制品)；⑶有機(jī)溶劑/去污劑(S/D)處理法；⑷膜過濾法；(5)低pH孵放法；(6)化學(xué)滅活方法。
[0004]無基質(zhì)血紅蛋白(stroma-free hemoglobin, SFH)具有攜氧釋氧的能力，一直以來被作為氧載體制劑進(jìn)行研究代替紅細(xì)胞的功能，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，由人或動(dòng)物血紅蛋白開發(fā)出來的代替紅細(xì)胞攜氧釋氧功能的制劑被稱為血紅蛋白氧載體(Hemoglobin-based oxygen carriers, HBOCs)。這種制劑主要通過穩(wěn)定血紅蛋白四聚體并增加分子量或是分子半徑的手段來克服天然血紅蛋白的缺陷。目前開發(fā)的產(chǎn)品主要有四類:(I)聚合血紅蛋白；(2)共軛血紅蛋白；(3)分子內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白；(4)重組人血紅蛋白。
[0005]在哺乳動(dòng)物中，血紅蛋白在天然狀態(tài)下，它由兩對(duì)亞基組成(2α β)，是一個(gè)四聚體的蛋白結(jié)構(gòu)，分子量約為 64，000道爾頓，每個(gè)亞基上有一個(gè)鐵卟啉，當(dāng)鐵元素處于II價(jià)時(shí)，血紅蛋白具有攜氧釋氧的能力，稱為亞鐵血紅蛋白，結(jié)合了氧的血紅蛋白稱為氧合血紅蛋白，未結(jié)合氧的亞鐵血紅蛋白稱為脫氧血紅蛋白；當(dāng)鐵元素處于III價(jià)時(shí)，鐵元素被氧化，血紅蛋白不具有攜氧釋氧的能力，稱為高鐵血紅蛋白。血紅蛋白氧載體必須使血紅蛋白處于亞鐵血紅蛋白蛋白時(shí)才具有攜氧釋氧的功能。
[0006]亞鐵血紅蛋白非常容易被氧化成高鐵血紅蛋白，特別在氧合狀態(tài)下會(huì)被紫外線快速氧化，因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員從未考慮直接用紫外線照射的方式對(duì)血紅蛋白及由其為原料的血紅蛋白氧載體進(jìn)行病毒滅活。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種人源或動(dòng)物源的血紅蛋白及血紅蛋白氧載體的病毒滅活方法，從而將其可能含有的病毒部分或全部去除。
[0008]本發(fā)明的基本解決方案如下:
[0009]待處理的血紅蛋白或血紅蛋白氧載體為溶液形態(tài)；該方法是先用性質(zhì)較為惰性的氣體(常溫常壓下不溶于水且不與血紅蛋白反應(yīng)的氣體)將氧合血紅蛋白進(jìn)行脫氧，使之轉(zhuǎn)化為脫氧血紅蛋白，防止亞鐵血紅蛋白的氧化，再用紫外燈對(duì)脫氧血紅蛋白溶液進(jìn)行照射，設(shè)置照射至液面時(shí)的紫外線強(qiáng)度為50 —110 μ w/cm2,并根據(jù)照射面積及溶液體積調(diào)整照射時(shí)間，照射完成后即完成了病毒滅活的過程。
[0010]具體的方案如下:
[0011]步驟1:取一密閉容器，在該容器中加入血紅蛋白或者血紅蛋白氧載體溶液并進(jìn)行攪拌，將容器連接氣體交換膜，液相一側(cè)接通溶液，氣相一側(cè)連接惰性的氣體，對(duì)血紅蛋白或血紅蛋白氧載體進(jìn)行脫氧，在溶液上方同時(shí)也通入惰性的氣體，將溶液上方的空氣排出，或者僅在溶液上方連續(xù)通入惰性的氣體以降低氧分壓使血紅蛋白脫氧；直至脫氧血紅蛋白大于90%時(shí)，撤去氣體交換膜，并在溶液上方繼續(xù)通入惰性的氣體，或停止通入惰性的氣體但需封閉容器通氣口以阻止與外界大氣交換；上述惰性的氣體可以是氮?dú)?、氦氣、氖氣、IS氣、氣氣、氡氣、氫氣等；
[0012]步驟2:該容器裝有石英玻璃窗口，將紫外燈置于石英玻璃窗口前，打開紫外燈調(diào)整距離，使紫外線透過該石英玻璃窗口照射于液面時(shí)的強(qiáng)度為50 —110 μ w/cm2，照射時(shí)間根據(jù)液體厚度調(diào)整，每1.0cm厚度增加大于1.4天照射時(shí)間，總厚度不超過20cm ;照射完畢后收集得到的溶液即為滅活病毒后的血紅蛋白或者血紅蛋白氧載體溶液。
[0013]以上具體方案中，應(yīng)當(dāng)注意兩點(diǎn):
[0014]一、紫外線照射強(qiáng)度需在50 —110 μ w/cm2的范圍內(nèi)，高于該強(qiáng)度即使是脫氧血紅蛋白也會(huì)造成亞鐵血紅蛋白的氧化，低于該強(qiáng)度范圍則對(duì)病毒滅活能力相對(duì)較小，難于達(dá)到理想的效果。
[0015]二、照射時(shí)最好采用石英玻璃作為照射窗口，因?yàn)槭⒉Ａ軌蛲高^紫外線進(jìn)行照射，而普通玻璃不能透過紫外線。
[0016]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0017]①在基本不引起亞鐵血紅蛋白氧化的條件下有效、簡單地實(shí)現(xiàn)了對(duì)血紅蛋白或血紅蛋白氧載體進(jìn)行病毒滅活。
`[0018]②不引入外來物質(zhì)，照射前后溶液組分未發(fā)生變化，不需要后續(xù)處理。
【具體實(shí)施方式】
[0019]以下給出三例病毒滅活驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，并相應(yīng)限定了較佳的具體操作環(huán)節(jié)和參數(shù)；但以下示例不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明權(quán)利要求的限制。
[0020]實(shí)施例一:
[0021]步驟1:在一可密閉容器中加入10mg/mL的豬血紅蛋白90mL，蛋白溶液厚度為6cm,容器上下兩側(cè)設(shè)兩個(gè)面的石英玻璃窗口，再加入IOml豬細(xì)小病毒(PPV)，攪拌，在溶液上方通入氮?dú)猓瑢嗚F血紅蛋白轉(zhuǎn)化成脫氧血紅蛋白，待轉(zhuǎn)化率大于90%時(shí)，停止通入氮?dú)?，但是密閉容器，阻止與外界大氣交換；
[0022]步驟2:將兩個(gè)紫外燈分別置于石英玻璃窗口前，打開紫外燈調(diào)整距離，使照射于液面時(shí)的強(qiáng)度為70 μ w/cm2,照射4.5天，照射完畢后收集得到的溶液即為滅活病毒后的溶液。
[0023]分別在滅活前、滅活后第1、2、3、4.5天取樣，用細(xì)胞感染法檢測(cè)滅活過程中病毒殘余的滴度，細(xì)胞PK-15，檢驗(yàn)結(jié)果病毒滴度降大于41og值，通過盲傳三代實(shí)驗(yàn)，也未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞異常，無病毒毒性。
[0024]實(shí)施例二:[0025]步驟1:在一可密閉容器中加入8mg/mL的豬血紅蛋白IOOmL,其中豬偽狂犬病毒(PRV)滴度大于61og值；攪拌，蛋白溶液厚度為5cm，容器上下兩側(cè)設(shè)兩個(gè)面的石英玻璃窗口，在溶液上方通入氬氣，將亞鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)化成脫氧血紅蛋白，待轉(zhuǎn)化率大于90%時(shí)，停止通入氬氣，但是密閉容器，阻止與外界大氣交換；
[0026]步驟2:將兩個(gè)紫外燈分別置于石英玻璃窗口前，打開紫外燈調(diào)整距離，使照射于液面時(shí)的強(qiáng)度為80 μ w/cm2,照射4天，照射完畢后收集得到的溶液即為滅活病毒后的溶液。
[0027]分別在滅活前、滅活后第1、2、3、4天取樣，用細(xì)胞感染法檢測(cè)滅活過程中病毒殘余的滴度，細(xì)胞PK-15，檢驗(yàn)結(jié)果病毒滴度降大于41og值，通過盲傳三代實(shí)驗(yàn)，也未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞異常，無病毒毒性。
[0028]實(shí)施例三
[0029]步驟1:在一可密閉容器中加入4mg/mL的聚合豬血紅蛋白溶液(血紅蛋白氧載體)IOOmL,其中PPV病毒滴度大于61og值，攪拌，蛋白溶液厚度為8cm，容器上下兩側(cè)設(shè)兩個(gè)面的石英玻璃窗口，在溶液上方通入氫氣，將容器連接氣體交換膜，液相一側(cè)接通溶液，氣相一側(cè)連接氫氣，對(duì)血紅蛋白或血紅蛋白氧載體進(jìn)行脫氧，將亞鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)化成脫氧血紅蛋白，待轉(zhuǎn)化率大于90%時(shí)，撤去氣體交換膜，但是在溶液上方繼續(xù)通入氫氣，阻止與外界大氣交換；
[0030]步驟2:將兩個(gè)紫外燈分別置于石英玻璃窗口前，打開紫外燈調(diào)整距離，使照射于液面時(shí)的強(qiáng)度為60 μ w/cm2，照射6天，照射完畢后收集得到的溶液即為滅活病毒后的溶液。
[0031]分別在滅活前、滅活后第1、2、4.5、6天取樣，用細(xì)胞感染法檢測(cè)滅活過程中病毒殘余的滴度，細(xì)胞為PK-15細(xì)胞，檢驗(yàn)結(jié)果病毒滴度降大于41og值，通過盲傳三代實(shí)驗(yàn)，也未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞異常，無病毒毒性。
【權(quán)利要求】
1.紫外輻照滅活血紅蛋白及血紅蛋白氧載體中病毒的方法，待處理的血紅蛋白或血紅蛋白氧載體為溶液形態(tài)；該方法包括以下步驟: 先用性質(zhì)較為惰性的氣體將氧合血紅蛋白進(jìn)行脫氧，使之轉(zhuǎn)化為脫氧血紅蛋白，防止亞鐵血紅蛋白的氧化，再用紫外燈對(duì)脫氧血紅蛋白溶液進(jìn)行照射，設(shè)置照射至液面時(shí)的紫外線強(qiáng)度為50 —110 μ w/cm2，并根據(jù)照射面積及溶液體積調(diào)整照射時(shí)間，照射完成后即完成了病毒滅活的過程。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫外輻照滅活血紅蛋白及血紅蛋白氧載體中病毒的方法，其特征在于，具體步驟如 下: 步驟(1):取一密閉容器，在該容器中加入血紅蛋白或者血紅蛋白氧載體溶液并進(jìn)行攪拌，將容器連接氣體交換膜，液相一側(cè)接通溶液，氣相一側(cè)連接惰性的氣體，對(duì)血紅蛋白或血紅蛋白氧載體進(jìn)行脫氧，在溶液上方同時(shí)也通入惰性的氣體，將溶液上方的空氣排出，或者僅在溶液上方連續(xù)通入惰性的氣體以降低氧分壓使血紅蛋白脫氧；直至脫氧血紅蛋白大于90%時(shí)，撤去氣體交換膜，并在溶液上方繼續(xù)通入惰性的氣體,或停止通入惰性的氣體但需封閉容器通氣口以阻止與外界大氣交換；所述惰性的氣體為氮?dú)狻⒑?、氖氣、氬氣、氙氣、氡氣或氫氣? 步驟(2):該容器裝有石英玻璃窗口，將紫外燈置于石英玻璃窗口前，打開紫外燈調(diào)整距離，使紫外線透過該石英玻璃窗口照射于液面時(shí)的強(qiáng)度為50 —110 μ w/cm2，照射時(shí)間根據(jù)液體厚度調(diào)整，每1.0cm厚度增加大于1.4天照射時(shí)間，總厚度不超過20cm ;照射完畢后收集得到的溶液即為滅活病毒后的血紅蛋白或者血紅蛋白氧載體溶液。
【文檔編號(hào)】A61L2/20GK103705959SQ201310712556
【公開日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月19日
【發(fā)明者】嚴(yán)坤平, 陳超, 朱宏莉, 謝于斗, 楊鵬飛 申請(qǐng)人:陜西佰美基因股份有限公司