專利名稱：：Abo血型基因檢測試劑及定型方法ABO血型基因檢測試劑及定型方法[
技術領域：
]本發(fā)明涉及一種新的分子生物學檢測試劑及方法；尤其涉及一種用于ABO血型抗原和特異性A2抗原同步基因分型的檢測試劑及定型方法。[
背景技術：
]ABO血型系是人類血型系中抗原免疫原性最強的一個血型系統(tǒng)。人類的ABO血型系統(tǒng)是由由第9號染色體(9q34.1q34.2)上的A、B和O三個等位基因來控制的，基因通過決定生成的轉糖基酶的種類而決定催化何種糖基連接在前驅物質的哪個位置上。A、B抗原都是在H抗原(前驅物質半乳糖末端連接巖藻糖)的基礎上形成的，細胞合成的A酶能使一個乙酰半乳糖胺基連接到H抗原上，形成A抗原；B抗原是一個半乳糖基連接到H抗原上。根據(jù)人類紅細胞表面有無抗原A、B和H，可分為A型、B型、AB型和O型四型，組成ABO血型系統(tǒng)。A型紅細胞上有A抗原，B型者有B抗原，AB型者有A和B兩種抗原，而O型者兩種抗原均無但有H抗原。目前人類ABO血型檢測方法有二種一是經典的血清學方法，二是基因方法。血清學方法的缺點是需要新鮮紅細胞，需要抽血檢驗；而基因方法可以彌補這方面的缺陷，因此基因定型方法已逐步運用于臨床血型檢測中。ABO基因定型方法原理如下鑒于ABO基因產物是糖基轉移酶，這些酶控制ABO血型抗原的生物合成。ABO抗原的化學結構是糖蛋白，其血清學特異性取決于糖鏈末端3個糖基的結構。ABO基因包含長度大小從28-688bp不等的7個外顯子和長度約為19514bp的6個內含子,它大約總長為18-20Kb。多數(shù)編碼序列(1062bp中823bp)位于第6和第7外顯子上，它們編碼了糖基轉移酶的催化區(qū)域。ABO血型的其它等位基因的DNA序列高度保守，與A101—致序列的DNA序列緊密相關，僅有幾個堿基替換或單個堿基缺失。A102等位基因與A101等位基因相比只是在467位的單個堿基替換(C/T，Pro/Leu)，兩者翻譯的糖基轉移酶活力沒有顯著性差異。B1基因僅在297、526、657、703、796、803、930和1096位堿基8個位置與A101基因有改變，導致糖基轉移酶多肽鏈上有4個氨基酸替代C526G(Arg/Gly)、G703A(Gly/Ser)、C796A(Leu/Met)、G803C(Gly/Ala)。01基因與A101的差異是第261位核苷酸G缺失，引起了閱讀框移動，在351至354位置產生終止密碼子，肽鏈合成在117位氨基酸終止，產生一條無催化能力的短肽鏈。ABO基因定型方法克服了以往血型血清學方法的限制，可作為一種獨立的鑒定手段，為臨床解決ABO亞型的鑒定、血型抗原減弱反應、Cis-AB(順式AB型)、類孟買型、血型嵌合體、正反定型不符等疑難問題，在臨床輸血醫(yī)學和遺傳學等領域將具有廣泛的應用。但鑒于不同民族不同人種的基因構成存在明顯差異，采用什么樣的檢測試劑進行基因檢測，有不同的檢測效果。研究表明(喻瓊,吳國光，鄧志輝，等.中國漢族人群A2亞型分子遺傳背景的研究.中國輸血雜志，2004,17(2):83~86):中國漢族人群與別的人種ABO血型基因分布相比有著自己的特點，中國人群中Al、B、01基因較常見，其中A102基因頻率高達0.2231，A101基因頻率僅為0.0096，無02基因；中國人群A2等位基因存在多樣性并有其自身特點，與國際報道的基因構成存在明顯差異，A2等位基因中除ntl061C缺失外，還存在nt4670T、ntl009A〉G等點突變，中國漢族人群A2亞型中以A205等位基因(nt467T、ntl009G)為主。有多個課題組的研究支持中國人群ABO常見血型基因的分布情況(YanL,ZhuF,FuQ,HeJ.ABO,Rh,廳S，Duffy,Kidd,Yt，Scianna,andColtonbloodgroupsystemsinindigenousChinese.Immunohematol.2005;21(1):4-10)Al等位基因(0.1890);A2等位基因(0.0045)，B等位基因(0.2340)，0-l等位基因(0.6380)，未檢出O02基因。當前，使用國外設計的ABO常規(guī)分型試劑盒并不適合中國人群ABO基因的鑒定。有研究表明(喻瓊,吳國光，鄧志輝，等.中國漢族人群A2亞型分子遺傳背景的研究.中國輸血雜志,2004,17(2):83~86)使用以國際報道的ABO基因結構特點為基礎、美國G&T公司研制的PCR-SSP法ABO基因定型試劑盒，對260例中國漢族的隨機個體進行了基因定型，但未檢出A2基因且對20例血清學檢出為"A2"亞型的樣本，使用美國G&T公司研制的PCR-SSP法ABO基因定型試劑盒，僅有5例能定為A2型，而絕大部分標本不能正確定型，只能定為Al型。表1國外試劑盒中ABO基因分型參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>目前國內沒有適合中國人群常見ABO血型抗原和特異性A2抗原同步基因分型的試劑盒。如果在基因檢測中沒有針對中國人A2亞型基因特異性的引物，會造成不正確定型，可能會誤定為A1型。A2亞型是ABO血型中常見的變異型，隨著臨床醫(yī)學的發(fā)展,人們對它的重要性認識越來越深刻。譬如近十年來，發(fā)現(xiàn)A2亞型的器官(心臟、肝、腎臟等)供者捐給非A型(包括B型、O型)的受者顯著延長存活率、加大了供體庫的數(shù)量；A2亞型的成分(血小板)血液可稱為"萬能"成分血。準確的定型具有重要的實際意義。[
發(fā)明內容]針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明構思了一種新的用于ABO血型抗原和特異性A2抗原同步基因分型的檢測試劑及定型方法，可以克服現(xiàn)有技術的缺陷。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的一種ABO血型基因檢測試劑，可以對中國人群常見的ABO血型抗原的血型基因進行同步擴增，包括2條內對照寡核苷酸引物HGH-A鏈序列5'-tgccttcccaaccatteccctta-3，，HGH-B鏈序列5，-ccaetcacggatttctgttgtgtttc-3，，其特征在于，還至少包括下述任意一組2條基因特異性寡核苷酸引物(1)Mix-A5'陽ggaaggatgtectegaggtg-3.5，-tgaggatgtggatgttgaat-3，(2)Mix-A1025，-acgtggctttectgatgctg-3，5，-gcggggcaccgcggcca-3，(3)Mix-B5，-ctgteagtgctggacgtgg-3，5，-tecacgcacaccaggtaatc-3，(4)Mix-05，-ggaaggatgtectectggta-3，5，-cttgatggcaaacacagttaac-3又一種ABO血型基因檢測試劑，可以對中國人群常見的ABO血型特異性A2亞型抗原的血型基因進行同步擴增，包括2條內對照寡核苷酸引物-HGH-A鏈序列5，-tgccttcccaaccatteccctta-3，，HGH-B鏈序列5，-ccaetcacggatttctgttgtgtttc-3，，其特征在于，還至少包括下述任意一組2條基因特異性寡核苷酸引物(1)Mix-15'陽acgtggctttectgatgctg-3'5，-gcggggcaccgcggcca-3，(2)Mix-25，-caggecaacggcategag-3，5，-ctggcagecgetcacggt-3'(3)Mix-35，-caggecaacggcategag-3"5，-agecgcteaegggttcca-3，(4)Mix-45'隱caggecaacggcategag-3，5，國agccgcteaegggttccc-3，(5)Mix-55，-gggggteggtgcaagaga-35;，-cgcagtgaacctcagcttc-35(6)Mix-6:，隱cagctgteagtgctggagg-3，國agaaatcgccctcgtgetta-3，(7)Mix-7'陽cagctgteagtgctggagg-3，，-ggctgcttccgtagaaget-3，(8)Mix-8，-caggecaacggcategag-3，，國gcagtgaacetcagettccc-3(9)Mix-9，國acgtggctttectgaagetg-3，，-gcggagcagcgcggccg-3，一種ABO血型基因檢測方法，其特征在于包括2條內對照寡核苷酸引物:HGH-A鏈序列5'陽tgccttcccaaccatteccctta-3，，HGH-B鏈序歹U:5，-ccaetcacggatttctgttgtgtttc-3，，以及至少包括下述任意一組2條基因特異性寡核苷酸引物(1)Mix-A5，-ggaaggatgtectegaggtg-3，5，-tgaggatgtggatgttgaat-3，(2)Mix-A1025'墨acgtggctttectgatgctg-3'5，-gcggggcaccgcggcca-3，(3)Mix-B5，-ctgteagtgctggacgtgg-3'5'-tecacgcacaccaggtaatc-3'(4)Mix-05，-ggaaggatgtectectggta-3，5'-cttgatggcaaacacagttaac-3其反應體系中還包括0.2mMDNTP2-20%1.5mMMgC124-25%進行PCR擴增反應。又一種ABO血型基因檢測方法，其特征在于包括2條內對照寡核苷酸引物HGH國A鏈序列5'陽tgccttcccaaccatteccctta-3，，HGH-B鏈序歹!j:5，-ccaetcacggatttctgttgtgtttc-3，，以及至少包括下述任意一組2條基因特異性寡核苷酸引物(1)Mix隱l5，-acgtggctttectgatgctg-3'5，-gcggggcaccgcggcca-3'(2)Mix-25，-caggeeaacggcategag隱3，5，-ctggcagecgetcacggt陽3，(3)Mix-35，-caggecaacggcategag-3，5，-agecgcteaegggttcca-3，(4)Mix-45，-caggecaacggcategag-3，5，-agecgcteaegggttccc-3，(5)Mix-55，-gggggteggtgcaagaga-3，5，-cgcagtgaacctcagcttc-3，(6)Mix-65,-cagctgteagtgctggagg-3，5，-agaaatcgccctcgtgetta隱3，(7)Mix-75，-cagctgteagtgctggagg-3，5'-ggctgcttccgtagaaget-3'(8)Mix-85'-caggccaacggcatcgag-3，5'-gcagtgaacetcagettccc隱3'(9)Mix-95'-acgtggctttcctgaagctg-3'5，-gcggagcagcgcggccg-3，其反應體系中還包括0.2rnMDNTP2-20%1.5mMMgC124-25%進行PCR擴增反應。通過采用本發(fā)明的技術方案，基于中國人群ABO血型基因和A2亞型遺傳學基礎，根據(jù)A2亞型的突變位點特異性，設計聚合酶鏈反應-序列特異性引物法(PCR-SSP)檢測試劑盒，通過設計ABO血型基因各自的特異性引物、摸索最佳退火溫度及調節(jié)Mg2+離子和引物濃度等條件，可以對中國人群常見的ABO血型抗原及特異性A2亞型抗原的血型基因進行同步擴增。基于這些引物的本發(fā)明的試劑盒及分型方法，可以對中國人群常見的ABO血型抗原及特異性A2亞型抗原的血型基因進行同步擴增。具有先進性，特異性和高準確性，而且該法簡便、直觀，適合中國漢族人ABO血型基因的鑒定以及用于人類ABO血型的研究。[]圖1為本發(fā)明檢測A102/B101、B101/001、A102/001、001/0014種基因型的電泳圖；圖2為本發(fā)明檢測A102、A201、A205基因型電泳結果圖。[具體實施方式]本發(fā)明基于中國人群ABO血型基因和A2亞型遺傳學基礎，根據(jù)己有的研究成果及所有已報道的A2亞型的突變位點特異性，發(fā)明人設計了聚合酶鏈反應-序列特異性引物法(PCR-SSP)檢測試劑盒，通過設計ABO血型基因各自的特異性引物、摸索最佳退火溫度及調節(jié)Mg2+離子和引物濃度等條件，可以對中國人群常見的ABO血型抗原及特異性A2亞型抗原的血型基因進行同步擴增。ABO特異性血型基因與X7W—致序列的DNA序列緊密相關，僅有幾個堿基替換或單個堿基缺失。^7M等位基因與等位基因相比只是在467位的單個堿基替換(C/T，Pro/Leu)，兩者翻譯的糖基轉移酶活力沒有顯著性差異。577基因僅在297、526、657、703、796、803、930和1096位堿基8個位置與爿"基因有改變，導致糖基轉移酶多肽鏈上有4個氨基酸替代C526G(Arg/Gly),G703A(Gly/Ser)，C796A(Leu/Met)，G803C(Gly/Ala)。W基因與J7W的差異是第261位核苷酸G缺失，引起了閱讀框移動，在351至354位置產生終止密碼。」207基因與J70/相比是在467位的單個堿基替換(C/T)和1059位1061位有一個C缺失，導致閱讀框增加了64個核苷酸，A2型糖基轉移酶在C端增加了21個氨基酸。是在的基礎上多了個1054OT,^20是在基礎上多了個1054OG突變，」204是B基因與O02的雜合，在基礎上多了297A>G、526C>G、657C>T、730G>A、771C>T、829G>]，占中國漢族人群大多數(shù)的A205基因與A101相比有467位的單個堿基替換和1009位的錯義突變(A>G)?；谏鲜鯝BO常見血型和A2亞型遺傳學基礎，發(fā)明人發(fā)明了PCR-SSP(Sequence-specificprimerPCR)檢測試劑盒，可檢測出ABO常見基因及所有已報道的A2等位基因，且是同步條件擴增，同步條件電泳、一次性就可獲得受檢者ABO血型的基因型。同步分型的關鍵在于摸索一個合適的退火溫度，可通過調節(jié)Mg2+濃度和序列特異性引物等來實現(xiàn)。實施例一對于ABO系統(tǒng)常見基因與A2亞型基因檢測與鑒定發(fā)明的DNA序列共設計特異性引物共13對，委托上海生工公司合成(見表l，2)，每個ABO血型基因檢測試劑，含4條引物，其中2條為序列特異性引物亞型基因與常見基因，另2條為內對照引物，內對照引物為人類生長激素(HGH)基因特異性引物，HGH-A鏈序列5，-tgccttcccaaccatteccctta-3，,HGH-B鏈序列5，-ccactcacggatttctgttgtgtttc-3，，擴增產物長度434bp。本試劑盒可檢測中國人群最為常見的AlOl、A102、BlOl、0014種等位基因與A201、A202、A203、A204、A205、A2066個所有的A2等位基因。表l常見ABO基因特異性引物序列及所檢測的等位基因l物名稱檢測的等位基因引物序列5'-3'受檢核苷酸位置產物長度(bp)Mix—AMix一A102Mix一BMix-0雄/,扁《j風掘么齒6譜《，？柳7,柳《A似5飾/歸/,婦《腳7,您似gg33gg3tgtcctcgaggtgtgaggatgtggatgttgaatacgtggctttcctgatgctggcggggcaccgcggccactgteagtgctggacgtggtccacgcacaccaggtaatcggaaggstgtcctcctggcttgatggcaaacacagttaacnt261G及nt297Ant396G,nt467T，nt526G及nt613Gnt261G缺失及nt351G75107125131表2A2亞型基因特異性引物序列引物名稱引物序列5'-3，引物所處位置受檢核苷酸位置產物長度(bp)Mix-l3CgtggctttcctgatgctgE7nt377-nt396nt467T107gcggggcaccgcggccaE7nt467-nt483Mix-2C3ggccaacggcategagE7nt874-nt891nt腿Gdel203CtggcagccgetC3CggtE7ntl059-nt翻Mix-3caggccaacggcateE7nt874-nt891ntl054T1983gCcgcteaegggttCC3E7ntl054-ntl071Mix-4caggccaacggcategagE7nt874-nt891ntl054G198cgcteaegggttcccE7ntl054-ntl071Mix-5gggggteggtgc卿agaE7nt812-nt829nt829A218<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注E7表示ABO基因的第7外顯子，nt表示核苷酸序列位置，從ABO基因cDNA的第1個核苷酸數(shù)起。ABO系統(tǒng)常見基因與A2亞型基因同步PCR擴增操作方法如下:(1)采用25-50yL反應體系，包括IOXPCR緩沖液2.5-5.0^10.2mMdNTP2-5^11.5mMMgCl23-6^1l.OnMABO序列特異性引物0.2mM內對照引物0,3UDNATaq酶0.1,1100ngDNA3-10|al加水至25-50pl采用Enpendorf基因擴增儀(德國)，多重PCR反應擴增條件:95°C5min預變性95°C0.5min變性，60-65°C50S退火72°C1.5min鏈延伸，共反應30個循環(huán)72°C5min延伸降溫至4。C，結束整個反應IOXPCR緩沖液配制100mmol/LTris-HCl(PH9.0)500mmol/LKC11%TritonX1000.1%明膠15mraol/LMgCl210%DMS02%Tween20取PCR擴增產物于含0.5Ug/mL溴乙淀2%瓊脂糖凝膠中電泳25min后，置紫外檢測儀上觀察特異性條帶，并記錄實驗結果。圖1為本發(fā)明檢測A102/B101、B101細、A102/001、001/0014種基因型的電泳圖;圖2為本發(fā)明檢測A102、A201、A205基因型電泳結果圖。和傳統(tǒng)的鑒別技術相比，本發(fā)明實施例中用于中國人群常見ABO血型抗原和特異性A2抗原同步基因分型的引物及試劑盒及定型方法，可以正確定出所有常見的中國人群的ABO血型基因和包括A205等位基因在內的所有A2亞型血型基因。并且此技術能夠使ABO系統(tǒng)等位基因在同一條件下進行同步擴增和擴增產物在同一凝膠中進行同步電泳；ABO基因分型方法適合中國人ABO基因常規(guī)鑒定與研究。此試劑盒可解決ABO疑難血型鑒定問題，保障了臨床血液的安全輸注。權利要求1、一種ABO血型基因檢測試劑，包括2條內對照寡核苷酸引物HGH-A鏈序列5’-tgccttcccaaccattcccctta-3’，HGH-B鏈序列5’-ccactcacggatttctgttgtgtttc-3’，其特征在于，還至少包括下述任意一組2條基因特異性寡核苷酸引物(1)Mix-A5’-ggaaggatgtcctcgaggtg-3’5’-tgaggatgtggatgttgaat-3’(2)Mix-A1025’-acgtggctttcctgatgctg-3’5’-gcggggcaccgcggcca-3’(3)Mix-B5’-ctgtcagtgctggacgtgg-3’5’-tccacgcacaccaggtaatc-3’(4)Mix-O5’-ggaaggatgtcctcctggta-3’5’-cttgatggcaaacacagttaac-3。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于ABO血型抗原和特異性A2抗原同步基因分型的檢測試劑及定型方法，含4條引物，其中2條為序列特異性引物，另2條為內對照引物，可以對中國人群常見的ABO血型抗原及特異性A2亞型抗原的血型基因進行同步擴增。檢測中國人群最為常見的A101、A102、B101、O014種等位基因與A201、A202、A203、A204、A205、A2066個所有的A2等位基因。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，本發(fā)明是一種快速、簡單、實用、特異和敏感的檢測方法。適合中國漢族人ABO血型基因的鑒定以及用于人類ABO血型的研究。文檔編號C12Q1/68GK101403007SQ20081021716公開日2009年4月8日申請日期2008年11月3日優(yōu)先權日2008年11月3日發(fā)明者瓊喻,鄧志輝申請人:深圳市血液中心