野菊花uplc指紋圖譜的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種野菊花UPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括如下步驟：粉碎野菊花藥材后精密稱定，加入甲醇，稱重后超聲，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；分別取綠原酸、木犀草苷、木犀草素和蒙花苷，精密稱定，用甲醇溶解，即得對照品溶液；超高效液相色譜系統(tǒng)分別測定供試品溶液、對照品溶液，生成供試品溶液、對照品溶液的色譜圖峰，進(jìn)而生成野菊花UPLC指紋圖譜。本發(fā)明涉及的野菊花UPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法簡單，易于操作，圖譜分析能力大大增強(qiáng)，提高了結(jié)果的準(zhǔn)確度，大大的提高了指紋圖譜檢測的穩(wěn)定性和靈敏度。
【專利說明】野菊花UPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及指紋圖譜的構(gòu)建領(lǐng)域，特別是涉及一種野菊花UPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，中草藥在中醫(yī)治療領(lǐng)域中發(fā)揮著巨大的作用，而中草藥特別是一些中藥顆粒在服用過程中即為方便。而野菊花為菊科多年生草本植物野菊的頭狀花序，外形與菊花相似，野生于山坡草地、田邊路旁。以色黃無梗、完整、氣香、花未全開者為佳。野菊花含可廣泛用于治療疔瘡癰腫、咽喉腫痛、風(fēng)火赤眼、頭痛眩暈等病癥，同時(shí)又有很好的降壓作用，可用于高血壓病的輔助治療，但是野菊花的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制卻參差不齊。指紋圖譜是作為控制中藥質(zhì)量均一性和穩(wěn)定性的檢測手段，但目前傳統(tǒng)的野菊花藥材HPLC指紋圖譜檢測所需時(shí)間太長，所需樣品量較大，檢測的精度及靈敏度不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]基于此，有必要提供一種靈敏度高、穩(wěn)定性好的野菊花UPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法。
[0004]一種野菊花UPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0005](I)供試品溶液的制備:取野菊花藥材，粉碎后精密稱定，加入甲醇，稱重后超聲，過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，所述野菊花與甲醇的質(zhì)量體積比為0.5:30-70 (g/mL)；
[0006](2)對照品溶液的制備:分別取綠原酸、木犀草苷、木犀草素和蒙花苷，精密稱定，用體積分?jǐn)?shù)為70-80%的甲醇溶液溶解，即得對照品溶液，所述綠原酸、木犀草苷、木犀草素、蒙花苷的濃度分別為 5-20 μ g/mL、10-30 μ g/mL,2-10 μ g/mL 和 20-45 μ g/mL ；
[0007](3)野菊花UPLC指紋圖譜的測定:用UPLC系統(tǒng)分別測定供試品溶液、對照品溶液，生成供試品溶液、對照品溶液的色譜圖峰，以對照品溶液的色譜圖峰為參照物，供試品溶液的色譜圖峰與參照物比照得出相對保留時(shí)間與相對保留面積，生成野菊花UPLC指紋圖譜；所述UPLC系統(tǒng)的條件為:
[0008]流速:0.3?0.5mL.min—1 ;檢測波長:220_380nm ;柱溫:20?40°C;線性梯度洗脫；流動(dòng)相為:流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)為0.02%的磷酸水溶液；線性梯度洗脫的條件為:0 — 27min，流動(dòng)相為8-12%乙腈一35-40%乙腈。
[0009]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(3)所述UPLC的條件為流速:0.4mL.mirT1 ;檢測波長:360nm ;柱溫:30°C。
[0010]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述線性梯度洗脫的條件為:0 — 27min，流動(dòng)相為10%乙腈一37%乙腈。
[0011]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(I)所述野菊花與甲醇的質(zhì)量體積比為0.5:45-55 (g/mL) ο
[0012]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(2)所述所述綠原酸、木犀草苷、木犀草素、蒙花苷的濃度分別為 10-15 μ g/mL、20_23 μ g/mL>4-6 μ g/mL 和 38-40 μ g/mL。
[0013]在其中一個(gè)實(shí)施例中，包括如下步驟:
[0014](I)供試品溶液的制備:取野菊花藥材，粉碎后精密稱定，加入甲醇，稱重后超聲，過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，所述野菊花與甲醇的質(zhì)量體積比為0.5:50 (g/mL)；
[0015](2)對照品溶液的制備:分別取綠原酸、木犀草苷、木犀草素和蒙花苷，精密稱定，用體積分?jǐn)?shù)為70-80%的甲醇溶液溶解，即得對照品溶液，所述綠原酸、木犀草苷、木犀草素、蒙花苷的濃度分別為12、22.6、5.6和39.3 μ g/mL ；
[0016](3)野菊花UPLC指紋圖譜的測定:用UPLC系統(tǒng)分別測定供試品溶液、對照品溶液，生成供試品溶液、對照品溶液的色譜圖峰，以對照品溶液的色譜圖峰為參照物，供試品溶液的色譜圖峰與參照物比照得出相對保留時(shí)間與相對保留面積，生成野菊花UPLC指紋圖譜；所述UPLC系統(tǒng)的條件為:
[0017]流速:0.—L.min—1 ;檢測波長:360nm ;柱溫:30°C ;線性梯度洗脫；流動(dòng)相為:流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)為0.02%的磷酸水溶液；線性梯度洗脫的條件為:
O—27min,流動(dòng)相為10%乙腈一37%乙腈。
[0018]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(I)所述的過濾使用微孔濾膜，所述微孔濾膜的尺寸為 0.2-0.25 μ m。
[0019]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(I)所述超聲的條件為功率150-170W，頻率55_60kHz。
[0020]本發(fā)明涉及的一種野菊花UPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法具有以下有益效果:
[0021](I)本發(fā)明采用UPLC (超高效液相色譜系統(tǒng))，首次將UPLC系統(tǒng)引進(jìn)指紋圖譜的測定領(lǐng)域，確定了制備供試品溶液和對照品溶液，及超高效液相色譜儀的色譜條件的最優(yōu)參數(shù)，使得圖譜分析能力大大增強(qiáng)，提高了結(jié)果的準(zhǔn)確度。
[0022](2)本發(fā)明經(jīng)發(fā)明人的大量實(shí)驗(yàn)和研究，得出野菊花指紋圖譜的檢測方法，并確定綠原酸、木犀草苷、木犀草素、蒙花苷作為對照品溶液，進(jìn)一步地確定出各對照品溶液的最優(yōu)選的濃度分別為12、22.6,5.6和39.3 μ g/mL ;同時(shí)確定出野菊花指紋圖譜的檢測所采用的UPLC系統(tǒng)的參數(shù)，并進(jìn)一步地確定出最優(yōu)參數(shù)。
[0023](3)本發(fā)明所述的野菊花UPLC指紋圖譜的檢測方法所需的樣品量較少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于現(xiàn)有技術(shù)要求的量，大大的提高了指紋圖譜檢測的穩(wěn)定性和靈敏度。
[0024](4)本發(fā)明所述的野菊花UPLC指紋圖譜的檢測方法簡單，UPLC的線性梯度洗脫的條件簡單，便于操作，也進(jìn)一步的節(jié)省檢測時(shí)間。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為實(shí)施例6中野菊花藥材共有峰色譜圖；
[0026]圖2為實(shí)施例6中11批野菊花藥材UPLC指紋圖譜；
[0027]圖3為實(shí)施例6中對照品的UPLC色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028]以下將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。且各實(shí)施例中使用到的試劑和器材如下:
[0029]1.儀器[0030]KQ-100B型超聲波清洗器購自昆山超聲儀器有限公司JA51002型電子分析天平購自島津公司；WatersAcquityUPLCH_Class超高效液相色譜系統(tǒng)、Empower工作站含四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測器均購自Waters公司，色譜柱為ACQUITYUPLCBEHC18 (2.1mmX 100mm, 1.7 μ m)。
[0031]試劑
[0032]甲醇(色譜純，TEDIA公司)，乙腈(色譜純，TEDIA公司)，水為哇哈哈純凈水，磷酸(色譜純,北京化工廠)。
[0033]3.對照品及樣品
[0034]對照品木犀草苷、木犀草素和芹菜素，購于成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司，供含量測定用，批號分別為 PCS0625-lotl20411、PCS0626_lotl20316 和 PCS0751_lotl20425 ；對照品綠原酸和蒙花苷購于中國食品藥品檢定研究院，批號分別為0753-200111和111528-200202。不同產(chǎn)地的野菊花藥材11批，均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室肖冰梅教授鑒定為菊料植物野菊(Chrysanthemum indicumL.)的干燥頭狀花序,具體信息見表1。
[0035]表1野菊花藥材來源
[0036]
【權(quán)利要求】
1.一種野菊花UPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)供試品溶液的制備:取野菊花藥材，粉碎后精密稱定，加入甲醇，稱重后超聲，過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，所述野菊花與甲醇的質(zhì)量體積比為0.5:30-70 (g/mL)； (2)對照品溶液的制備:分別取綠原酸、木犀草苷、木犀草素和蒙花苷，精密稱定，用體積分?jǐn)?shù)為70-80%的甲醇溶液溶解，即得對照品溶液，所述綠原酸、木犀草苷、木犀草素、蒙花苷的濃度分別為 5-20 μ g/mL、10-30 μ g/mL,2-10 μ g/mL 和 20-45 μ g/mL ； (3)野菊花UPLC指紋圖譜的測定:用UPLC系統(tǒng)分別測定供試品溶液、對照品溶液，生成供試品溶液、對照品溶液的色譜圖峰，以對照品溶液的色譜圖峰為參照物，供試品溶液的色譜圖峰與參照物比照得出相對保留時(shí)間與相對保留面積，生成野菊花UPLC指紋圖譜；所述UPLC系統(tǒng)的條件為: 流速:0.3~0.5mL.min—1 ;檢測波長:220-380nm ;柱溫:20~40°C ;線性梯度洗脫；流動(dòng)相為:流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)為0.02%的磷酸水溶液；線性梯度洗脫的條件為:0 — 27min,流動(dòng)相為5-15 乙臆一35-60 %乙臆。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的野菊花UPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(3)所述UPLC的條件為流速:0.4mL.min—1 ;檢測波長:360nm ;柱溫:30°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的野菊花UPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，所述線性梯度洗脫的條件為:0 — 27min，流動(dòng)相為10%乙腈一37%乙腈。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的野菊花UPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(1)所述野菊花與甲醇的質(zhì)量體積比為0.5:45-55 (g/mL)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的野菊花UPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(2)所述所述綠原酸、木犀草苷、木犀草素、蒙花苷的濃度分別為10-15yg/mL、20-23yg/mL、4-6 μ g/mL 和 38-40 μ g/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的野菊花UPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)供試品溶液的制備:取野菊花藥材，粉碎后精密稱定，加入甲醇，稱重后超聲，過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，所述野菊花與甲醇的質(zhì)量體積比為0.5:50 (g/mL)； (2)對照品溶液的制備:分別取綠原酸、木犀草苷、木犀草素和蒙花苷，精密稱定，用體積分?jǐn)?shù)為70-80%的甲醇溶液溶解，即得對照品溶液，所述綠原酸、木犀草苷、木犀草素、蒙花苷的濃度分別為12、22.6、5.6和39.3 μ g/mL ； (3)野菊花UPLC指紋圖譜的測定:用UPLC系統(tǒng)分別測定供試品溶液、對照品溶液，生成供試品溶液、對照品溶液的色譜圖峰，以對照品溶液的色譜圖峰為參照物，供試品溶液的色譜圖峰與參照物比照得出相對保留時(shí)間與相對保留面積，生成野菊花UPLC指紋圖譜；所述UPLC系統(tǒng)的條件為: 流速:0.4mL.HiirT1 ;檢測波長:360nm ;柱溫:30°C ;線性梯度洗脫；流動(dòng)相為:流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)為0.02%的磷酸水溶液；線性梯度洗脫的條件為:0 — 27min,流動(dòng)相為10%乙腈一37%乙腈。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的野菊花UPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(1)所述的過濾使用微孔濾膜，所述微孔濾膜的尺寸為0.2-0.25 μ m。
8.根據(jù)權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的野菊花UPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(1)所述 超聲的條件為功率150-170W，頻率55-60kHz。
【文檔編號】G01N30/86GK103926355SQ201410189404
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月6日
【發(fā)明者】姚江雄, 許招懂, 蔣莉娟, 方鐵錚, 黎志堅(jiān), 林麗美 申請人:廣州白云山星群(藥業(yè))股份有限公司