專利名稱：：一種檢測單純皰疹病毒Ⅰ型IgG抗體的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，提供了一種采用生物素-親和素包被技術(shù)和化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)檢測單純皰疹病毒I型IgG抗體(HSV-IIgG)的試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：單純皰疹是單純皰疹病毒所引起的一種急性皰疹性皮膚病，屬于DNA病毒，人是單純皰疹病毒唯一的自然宿主，傳播方式主要是直接接觸傳染，亦可通過被唾液污染的餐具而間接傳染。單純皰疹的抗體主要有兩種，一種是IgM抗體，一般在病毒繁殖的高發(fā)期出現(xiàn)，持續(xù)時間比較短；另一種抗體是IgG抗體，該抗體一旦產(chǎn)生，會長時間存在。只要感染了單純皰疹，IgG抗體就會在體內(nèi)存在。單純皰疹病毒分為I和II型兩種，一般認為單純皰疹病毒I型主要感染腰以上部位，如咽扁桃體炎、角結(jié)膜炎及口唇皰疹等。大多數(shù)成年人都可終生存在單純皰疹病毒的IgG抗體。單純皰疹病毒抗體的血清學(xué)診斷可作為臨床診斷皰疹的重要輔助手段，現(xiàn)今用于檢測單純皰疹病毒I型IgG抗體的方法主要有放射免疫分析法，免疫膠體金滲濾法，免疫印跡法和酶聯(lián)免疫分析方法等。放射免疫分析法涉及放射性同位素，檢測所需時間長，較少采用；免疫膠體金滲濾法和免疫印跡法操作過程相對復(fù)雜，且試劑需要低溫保存；酶聯(lián)免疫分析方法影響因素較多，靈敏度不高。現(xiàn)今化學(xué)發(fā)光免疫分析方法是一種較先進的免疫分析方法，自從Halman于1978年成功地建立了CLIA，許多新材料、新技術(shù)、新工藝以及新儀器的研制相繼取得成功，加速了CLIA的逐步完善，目前已廣泛應(yīng)用到基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)的各領(lǐng)域。從實用性、穩(wěn)定性、準確性等方面來看，化學(xué)發(fā)光免疫分析己經(jīng)達到并超過了放射免疫分析和熒光免疫分析等方法，具有良好的發(fā)展前景。生物素-親和素系統(tǒng)是70年代后期應(yīng)用于免疫學(xué)，并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。親和素可預(yù)包被在固相載體內(nèi)，再將生物素化抗原或抗體包被于孔內(nèi)，從而解決了一些抗原或抗體不易包被的難題，也提高了檢測靈敏度。在間接法中，將生物素化抗原，待測抗體和酶標記二抗進行反應(yīng)，在固相載體表面形成BA-抗原-待測抗體-酶標記二抗免疫復(fù)合物，再加入示蹤物，通過提高免疫復(fù)合物的量放大反應(yīng)信號，從而提高了免疫分析的靈敏度。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種將生物素-親和素包被技術(shù)與化學(xué)發(fā)光技術(shù)結(jié)合，用于檢測HSV-I型IgG的試劑盒及其制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案一種HSV-1型IgG化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒，其組成為親和素包被的固相載體；生物素化的單純皰疹病毒I型抗原；陰性對照品；陽性對照品；堿性磷酸酶標記的抗人IgG抗體；上述酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物液和濃縮洗滌液。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，所述固相載體為微孔板或塑料管；所述堿性磷酸酶的化學(xué)發(fā)光底物液的發(fā)光劑為1,2-二氧乙垸類衍生物，包括l，2-二氧乙垸類衍生物為(金剛烷)-l，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛垸)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star。本發(fā)明的單純皰疹病毒I型IgG抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒的制備方法，包括以下步驟1)親和素包被固相載體將親和素加至0.05mol/LpH為7.0-7.5的PBS中混勻配制成所需濃度，并將包被液負載于固相載體上；用生理鹽水洗滌上述固相載體后，用含有1%BSA，0.1%防腐劑，pH值為7.0-7.5的O.Olmol/LPBS作為封閉液封閉上述固相載體。在上述方法中，所述親和素的固相載體為微孔板或塑料管；2)生物素化單純皰疹病毒I型抗原用常規(guī)方法將生物素(BNHS)溶于N，N—二甲基甲酰胺(DMF)，用O.lmol/LNaHC03將純化的單純皰疹病毒I型抗原進行適當(dāng)稀釋，將二者混合室溫下攪拌反應(yīng)2-4h后用O.Olmol/LpH為7.0-7.5的PBS于4'C透析過夜，結(jié)合物加入等體積甘油，一2(TC以下保存?zhèn)溆谩?)配制陰陽性對照品；將多份高效價HSV-IIgG陽性人血清混合后，56。Clh滅活，除菌過濾，適當(dāng)稀釋后制成陽性對照品，稀釋液為10%新生牛血清，0.1%防腐劑，0.02MTris-HCl緩沖液，pH7.0-7.5。將多份HSV-IIgG陰性人血清混合，56'Clh滅活后除菌過濾，制成陰性對照a卯o4)制備堿性磷酸酶標記的抗人IgG抗體；采用戊二醛法將堿性磷酸酶與抗人IgG抗體偶聯(lián)，然后對0.01mol/LpH為7.0-7.5的PBS充分透析，加入等體積甘油，一20'C以下保存?zhèn)溆谩?)配制化學(xué)發(fā)光底物液；化學(xué)發(fā)光底物液中包含0.15-0.25mol/LTris-HCl，16%NaCl，0.4%KC1，0.1%防腐劑，1.5%-4.0%發(fā)光劑。在上述方法中，所述堿性磷酸酶的化學(xué)發(fā)光底物液的發(fā)光劑為1，2-二氧乙垸類衍生物，包括(金剛垸)-l,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛垸)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。6)配制濃縮洗滌液濃縮洗滌液中包含0.15-0.25mol/LTris-HCl，16%NaCl，1%Tween-20。使用時用蒸餾水稀釋20倍。將上述制備好的半成品分裝，組裝成成品試劑盒。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明中的試劑盒將化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)與生物素-親和素包被技術(shù)結(jié)合，采用抗體間接法測定單純皰疹病毒I型IgG抗體，提高了檢測的敏感性，為診斷單純皰疹感染提供更為可靠的依據(jù)。具體實施例方式實施例1制備本發(fā)明的單純皰疹病毒I型IgG抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒1)親和素固相微孔板的制備將親和素加入包被液中混勻配成2pg/mL，然后加入到微孔板各孔中，每孔ll(HiL，4。C放置24h，包被液的配制為2.2gNaH2P04-2H20，12.9gNa2HP04.12H20，9.0gNaCl，用蒸餾水定容至1000ml，pH為7.4。用生理鹽水洗三次，每孔分別加入封閉液30(HiL，室溫放置3小時，封閉液的配制為0.2gNaH2PO4-2H2O、2.9gNaH2P04'12H20、10gBSA禾卩l(xiāng)mL生物防腐劑，定容至1000ml，pH值為7.2。甩掉封閉液，在吸水紙上拍干。室溫除濕干燥24小時。立即進行封袋，貼簽后置28'C保存。2)酶標抗體的制備采用戊二醛法將堿性磷酸酶與抗人IgG抗體偶聯(lián)，然后對0.05mol/LpH為7.2的PBS充分透析，加入等體積甘油，—20'C以下保存?zhèn)溆谩?)生物素化抗原的制備用常規(guī)方法將生物素(BNHS)溶于N，N—二甲基甲酰胺(DMF)配成lmg/mL;用0.1mol/L的NaHC03將純化的單純皰疹病毒I型抗原稀釋為l-2mg/mL。按BNHS與抗體容積比為1:8或重量比1:7左右混合，室溫攪拌下反應(yīng)2-4h;裝入透析袋對0.05mol/LpH值為7.2的PBS4'C透析過夜，結(jié)合物加入等體積甘油，小量分裝，一20'C以下保存?zhèn)溆?。采用方陣法選擇生物素化抗原和酶標抗體的工作濃度分別為l:3500和1:5000，將生物素化抗原和酶標抗體用酶標抗體稀釋液稀釋，其組成成分為Tris12.120g，HC110mL,BSA5g,Proclin300lml，定容至1000mL。4)陰陽性對照品的制備將多份高效價HSV-IIgG陽性人血清混合后，56'Clh滅活，除菌過濾，用含10%新生牛血清，0.1%防腐劑，pH7.2的0.02MTris-HCl緩沖液稀釋制成陽性對照品，稀釋比例為1:100。將多份HSV-IIgG陰性人血清混合，56°Clh滅活后除菌過濾，制成陰性對照品。陰陽性對照品都于2-8'C保存。5)化學(xué)發(fā)光底物液的制備取Tris24g，HC115ml，NaCl160g，KC14g,proclin300lmL，AMPPD20mL，加入蒸餾水溶解后，定容至1000mL。6)濃縮洗滌液的制備取Tris24g，HC115mL，NaCl160g，Tween-2010mL，用蒸餾水定容至1000mL。使用時用蒸餾水稀釋20倍。將上述制備好的半成品分裝，組裝成成品試劑盒。實施例2制備本發(fā)明的單純皰疹病毒I型IgG抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒除以塑料管作為載體外，其余均以與實施例1相同的方法制備單純皰疹病毒I型IgG抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒。實施例3制備本發(fā)明的單純皰疹病毒I型IgG抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒化學(xué)發(fā)光底物液的制備取Tris30g，HC118.75mL，NaCl160g，KC14g，proclin300lmL，CSPD16mL，加入蒸餾水溶解后，定容至1000mL。其余與實施例l相同。實施例4制備本發(fā)明的單純皰疹病毒I型IgG抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒化學(xué)發(fā)光底物液的制備取Tris18g，HC111.25mL，NaCl160g,KC14g，NaN3lmL，CPD-Star32mL，加入蒸餾水溶解后，定容至1000mL。其余與實施例l相同。實施例5本發(fā)明的試劑盒的使用方法以上實施例1制備的單純皰疹病毒I型IgG抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒的具體操作如下-1)自4'C冰箱中取出試劑盒，室溫平衡15分鐘；取出包被板條，插入板架上。2)每次試驗設(shè)空白l孔，陰性對照孔和陽性對照孔各兩孔，除空白孔外，各孔加生物素化的抗原50pL，再加入陰陽性對照品和用生理鹽水1:100稀釋的樣本100nL，用微量震蕩器充分振蕩混勻，37'C溫育30分鐘；3)甩去反應(yīng)液，每孔加滿稀釋后的洗滌液，洗板5次，最后在干凈的吸水紙上扣干；4)每孔加入酶標記物100pL，用微量震蕩器充分振蕩混勻，37'C溫育30分鐘；5)甩去反應(yīng)液，每孔加滿稀釋后的洗滌液，洗板5次，最后在干凈的吸水紙上扣干；6)每孔加入50nL化學(xué)發(fā)光底物液，用微量震蕩器充分振蕩混合均勻，37'C溫育30分鐘，在化學(xué)發(fā)光測量儀上依序測量各孔的發(fā)光強度(RLU)，測量時間1秒/孔；7)CUTOFFz2.1X陰性對照品RLU,RLU大于Cutoff為陽性，否則為陰性。實施例6本發(fā)明的試劑盒的方法學(xué)檢定1)精密度對同一份陽性標本，按照實施例5所述操作方法進行3次重復(fù)測定，每次IO孔，計算RLU變異系數(shù)，結(jié)果CVc/。均小于15c/。，說明本發(fā)明的試劑盒精密性良好，符合要求。2)特異性用本發(fā)明的試劑盒檢測經(jīng)臨床確診的單純皰疹病毒I型感染者血清樣本112例，健康人血清樣本108例，檢測結(jié)果如表l。表l本發(fā)明的試劑盒特異性檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>本發(fā)明試劑盒于單純皰疹病毒感染者血清樣本中僅檢出1份陰性，而健康人血清樣本的檢測結(jié)果與臨床檢測結(jié)果完全相符，可見本發(fā)明的試劑盒特異性良好。3)靈敏度將一份高滴度陽性樣本以1:20，1:40，1:80，1:160，1:320的比例稀釋，用本發(fā)明的試劑盒檢測(見表2)。表2本發(fā)明的試劑盒靈敏度檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>由表2可知，當(dāng)高滴度陽性樣本1:20-1:160稀釋時，本發(fā)明試劑盒檢測仍為陽性，當(dāng)高滴度陽性樣本1:320稀釋時，本發(fā)明試劑盒檢測為陰性，。說明本試劑盒的靈敏度良好。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1.一種單純皰疹病毒I型IgG抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括親和素包被的固相載體；生物素化的單純皰疹病毒I型抗原；陰性對照品；陽性對照品；堿性磷酸酶標記的抗人IgG抗體；化學(xué)發(fā)光底物液和濃縮洗滌液。2、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述親和素化的固相載體為微孔板或塑料管。3、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述堿性磷酸酶化學(xué)發(fā)光底物液的發(fā)光劑為1，2-二氧乙垸類衍生物，包括(金剛烷)-l，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷、CSPD或CDP陽Star。4、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物液包含24gTris、160gNaCl、4gKCl、15mLHCl、20mL3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙垸、lmLProclin300、1000mL雙蒸水。5、一種單純皰疹病毒I型IgG抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒的制備方法，其特征在于1)親和素包被固相載體將親和素加至pH為7.0-7.5的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中混勻配制成所需濃度，并將包被液負載于固相載體上；用生理鹽水洗滌上述固相載體后，用含1%BSA，0.1%防腐劑，pH值為7.0-7.5的0.01mol/LPBS作為封閉液封閉上述固相載體。2)生物素化單純皰疹病毒I型抗原用常規(guī)方法將生物素(BNHS)溶于N，N—二甲基甲酰胺(DMF)，用0.1mol/LNaHC03將純化的單純皰疹病毒I型抗原進行適當(dāng)稀釋，將二者混合室溫下攪拌反應(yīng)2-4h后用0.01mol/LpH為7.0-7.5PBS于4'C透析過夜，結(jié)合物加入等體積甘油，一2(TC以下保存?zhèn)溆谩?)配制陰陽性對照品；將多份高效價HSV-IIgG陽性人血清混合后，56tMh滅活，除菌過濾，適當(dāng)稀釋后制成陽性對照品，稀釋液為10%新生牛血清，0.1%防腐劑，0.02mol/LTris-HCl緩沖液，pH7.0-7.5。將多份HSV-IIgG陰性人血清混合，56°Clh滅活后除菌過濾，制成陰性對照n4)堿性磷酸酶標記抗人IgG抗體；采用戊二醛法將堿性磷酸酶與抗人IgG抗體偶聯(lián)，然后對0.01mol/LpH為7.0-7.5的PBS充分透析，加入等體積甘油，一20'C以下保存?zhèn)溆谩?)配制化學(xué)發(fā)光底物液化學(xué)發(fā)光底物液中包含0.15-0.25mol/LTris-HCl，16%NaCl,0.4%KC1，0.1%防腐劑，1.5%-4.0%發(fā)光劑。6)配制濃縮洗滌液濃縮洗滌液中包含0.15-0.25mol/LTris-HCl，16%NaCl，1%Tween-20。使用時用蒸餾水稀釋20倍。將上述制備好的半成品分裝，組裝成成品試劑盒。6、如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述親和素包被的固相載體為微孔板或塑料管。7、如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述堿性磷酸酶化學(xué)發(fā)光底物液的發(fā)光劑為1,2-二氧乙烷類衍生物，包括(金剛垸)-l,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛垸)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l,2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。全文摘要本發(fā)明涉及一種檢測試劑盒及其制備方法，具體地，是一種間接法檢測單純皰疹病毒I型IgG抗體的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒及其制備方法。試劑盒的組分包括固相包被載體，生物素化抗原，陰陽性對照品，酶標抗體，化學(xué)發(fā)光底物液和濃縮洗滌液。試劑盒的制備過程包括親和素包被固相載體、生物素標記抗原、制備陰陽性對照品、酶標記抗人IgG抗體，以及配制化學(xué)發(fā)光底物液和濃縮洗滌液，分裝上述半成品制成試劑盒。本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，是一種靈敏的檢測單純皰疹病毒I型IgG抗體的方法。文檔編號G01N21/76GK101368956SQ20081010541公開日2009年2月18日申請日期2008年4月29日優(yōu)先權(quán)日2008年4月29日發(fā)明者于尚永,宋勝利,應(yīng)希堂,胡國茂,蔣冰飛,鄭金來申請人:北京科美東雅生物技術(shù)有限公司