專利名稱：一種檢測丙型肝炎病毒抗體的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測丙型肝炎病毒抗體的方法，具體地說涉及一種采用酶聯免疫技術檢測丙型肝炎病毒抗體的方法，還涉及該方法中所采用的丙型肝炎病毒多表位嵌合抗原與酶標記連接臂。
背景技術：
丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)是引起輸血后病毒性非甲非乙型肝炎的主要病原，主要通過輸血、靜脈吸毒傳播，也可通過密切接觸和母嬰傳播。目前全世界約有1.7億HCV感染者。受感染者中約有一半可發(fā)展為慢性肝炎，進而部分可發(fā)展成為肝硬化和肝細胞性肝癌。由于目前還沒有確實有效的治療方法和疫苗以防止其進一步傳播，因此危害極大。據最近報道，僅美國每年約有5萬HCV新感染病例發(fā)生，全球每年約有25120萬人新發(fā)肝癌病人，除HBV感染外，HCV是引起肝細胞肝癌的主要致病因素之一。
一般地，15～20％左右的HCV感染者為自限性感染，可以很快的康復。但是，也有80～85％的感染者發(fā)展為慢性丙型肝炎，其中又有20％的可發(fā)展為肝纖維化，最終有4～5％的肝纖維化患者發(fā)生肝細胞性肝癌，危害十分嚴重。
目前，慢性丙型肝炎除了干擾素有確切的療效外，尚無其它有效的治療藥物。國際上近來報道，PEG修飾的干擾素加利巴韋林聯合治療可在40～50％左右的患者獲得較好的反應，但也有療程長、價格昂貴、毒副作用大以及易反彈等缺點。此外，丙型肝炎疫苗的研制也因HCV高度變異而困難重重，短期內難有突破性進展。因此，盡早檢出HCV感染者，阻斷HCV的傳播是當務之急。
HCV檢測技術的現狀HCV一般通過被HCV污染的血液和血液制品傳播，現在常用的HCV檢測技術有兩種方式(1)間接檢測，主要檢測抗HCV抗體和抗原；(2)直接檢測，通過定性或定量檢測HCV病毒粒子的組成成分確定病毒的存在，例如HCVRNA。這兩種檢測方式在確診HCV感染，選擇HCV感染者的治療方案以及評價抗HCV治療的療效方面起到了關鍵作用。
上世紀九十年代初，利用重組HCV抗原開發(fā)出了抗HCV抗體檢測技術，即酶免疫分析(enzyme immunoassays，EIAs)技術，已經發(fā)展到第三代。該技術可檢測樣本中針對不同HCV抗原(如C區(qū)、NS3區(qū)、NS4區(qū)和NS5區(qū)等)的混合抗體，目前檢測的特異性已高達99％以上。
第一代試劑使用HCV-C100(511)為抗原，應用間接法原理檢測HCV抗體。第二代試劑使用基因工程表達重組或化學合成多肽(HCV-C，NS3 NS4)HCV抗原，應用間接ELISA法原理檢測HCV抗體，特異性和敏感性高于第一代試劑。第三代試劑使用基因工程表達重組HCV抗原(HCV-C，NS3，NS4，NS5)用間接ELISA法原理檢測HCV抗體。
1993年3月，國家衛(wèi)生部下發(fā)文件要求對獻血員HCV抗體的檢測，隨后有十幾家檢測HCV抗體的ELISA試劑上市，并進行批批檢定。但全是間接ELISA法，但由于間接法技術自身的缺陷及各生產廠家的產品存在一定的質量問題，導致了一些誤診和漏檢，從而造成了不良的社會影響和社會一定的危害。為此，應從根本上解決試劑本身的質量問題。
目前，雙抗原夾心法成功用于檢測抗HIV和Tp抗體，此類試劑的敏感性和特異性均優(yōu)于標記抗人免疫球蛋白的間接法。而丙型肝炎病毒抗體的檢測仍采用間接ELISA技術，主要由于過氧化物酶直接標記丙型肝炎病毒抗原，其靈敏度達不到要求，尤其是標記丙型肝炎病毒核心抗原后使抗原活性降低。但國內外有快速金標試劑采用雙抗原夾心法原理，通過免疫層析檢測抗HCV抗體。但靈敏度較低，不能用于獻血員的篩選。

發(fā)明內容
為解決目前對HCV抗體檢測中特異性和敏感性的問題，本發(fā)明公開了一種采用雙抗原夾心ELISA技術檢測抗HCV抗體的方法。本發(fā)明在多原表位HCV嵌合抗原的基礎上，以不同連接方式融合上4個賴氨酸(4K)，用于標記辣根過氧化物酶(HRP)的連接臂；本發(fā)明改進了抗原標記辣根過氧化物酶(HRP)工藝，并建立雙抗原夾心(ELISA)檢測丙型肝炎病毒抗體方法。
本發(fā)明的方法包括如下步驟一.丙型肝炎病毒多表抗位嵌合抗原與酶標記連接臂的制備首先制備丙型肝炎病毒多表抗位嵌合抗原用Goldkey計算機輔助軟件對HCV抗原表位進行分析。確定抗原性強的HCV不同區(qū)段抗原的氨基酸位置(分別為HCV-C10-53aa；NS31192-1457aa；NS41916-1947aa；)，分別合成基因，構建pBVIL-1載體，并將抗原連接成多表位嵌合抗原，在E.coli中以包涵體形式表達HCV多表位抗原(HCV-C、NS3、NS4)，通過離子交換層析純化，SDS-PAGE鑒定純度。
然后，在上述克隆表達的HCV融合抗原基礎上，分別在抗原的5’端、3’端及中間引入酶標記連接臂即4個賴氨酸(4K)。
首先合成引物，引物序列見序列表中序列1-6。然后以pILla-NS4CNS3質粒為模板，進行PCR擴增，獲得基因片段，酶切后分別插入到載體中，得到表達質粒。
以pIL1-HCV/C質粒為模板，用F3/R3引物進行PCR擴增，獲得基因片段，再以EcoR I、BamH I雙酶切后，插入到pIL1載體中，得到表達質粒pIL1-4K+HCV/C，利用pIL1可將多個目的基因方便連接的特點，把pIL1-HCV/NS4、pIL1-4K+HCV/C、pIL1-HCV/NS3連接，構建成pIL1-NS4-4KC-NS3表達質粒。
將以上獲得的三個表達質粒轉化到大腸桿菌受體菌中，進行高效表達，提取包涵體，用過Q-Sepharose-FF陰離子交接柱、S-Sepharose-FF陽離子交接柱、凝膠過濾柱等進行層析，SDS-PAGE鑒定，Lowy法測定蛋白含量，冰凍干燥，-25℃保存。
二、丙型肝炎病毒多表抗位嵌合抗原標記辣根過氧化物酶的制備(7)HRP活化辣根過氧化物酶(HRP)加SMPB輕微攪拌。
(8)抗原活化二硫蘇糖醇(DTT)活化丙型肝炎病毒多表抗位嵌合抗原(HCVAg)輕微攪拌。
(9)脫鹽對上述活化的抗原和HRP脫鹽。
(10)結合脫鹽后的抗原和HRP結合。
(11)終止加碘乙酰胺輕微攪拌。
(12)保存分裝，-20℃保存。
三、雙抗原夾心法檢測丙肝病毒抗體1、雙抗原夾心檢測丙型肝炎病毒抗體的基本原理丙型肝炎病毒抗體的酶聯檢測試劑(雙抗原夾心)用丙型肝炎病表位嵌合抗原包被酶聯板，加入待測樣品及酶標記的型肝炎病表位嵌合抗原，如樣品中存在抗體，形成抗原抗體復合物，洗滌后，酶底物顯色，測定光密度，根據光密度判斷結果。
2、檢測丙型肝炎病毒抗體方法的研究程序見附圖1。
3、檢測丙型肝炎病毒抗體試劑盒組成包括HCV抗原包被酶聯板；HCV抗體陽性對照血清；HCV抗體陰性對照血清；酶結合物；顯色劑A；顯色劑B；終止液；洗滌液等。
4、操作程序(1)取出干包酶聯板，每孔加待測樣品；加入酶標記抗原結合物，陰陽性對照加雙孔，空白孔不加任何試劑，混勻后水浴。
(2)用洗滌液洗板，最后一次拍干。
(3)洗板同2。
(4)先加入顯色劑A液，再加入顯色劑B液，避光顯色。
(5)每孔加終止液。
5、結果判定(1)儀器測定以酶聯儀450nm測定各孔OD值(減去空白對照計算)陽性對照OD＞0.8，陰性對照OD＜0.10試劑盒有效，終止后10分鐘以內測OD值。
(2)臨界值陰性對照平均OD值+0.05。若陰性對照OD值＜0.05時，按0.05計算；若＞0.05，按實際OD值計算。
按連接方式分為四組，其中A5’-KKKK-NS3-C-NS4；BNS3-C-NS4-KKKK-3’；C5’-KKKK-NS3-C-NS4-KKKK-3’；DNS3-KKKK-C-NS4
四種不同連接方式多表位嵌合抗原標記辣根過氧化物酶雙抗原夾心檢測丙型肝炎病毒抗體的活性測定結果表明四組不同連接方式與HCV血清反應性明顯差別，A組連接方式與HCV血清反應性好于B、C、D組。用A組標記HPR，用于雙抗原夾心檢測丙型肝炎病毒抗體。
HRP標記改構抗原雙抗原夾心法對國家第三代標準血清檢測結果表明雙抗原夾心ELISA技術檢測抗HCV抗體可大大提高檢測試劑的特異性和敏感性。
研制雙抗原夾心ELISA檢測抗HCV抗體比間接法有以下優(yōu)點(1)抗原夾心法可同時檢測HCV感染者的所有型別的IgG亞型和IgM，可早期診斷。間接法僅能捕獲IgG，不能捕獲IgM。并且二抗使用抗人IgG酶標記抗體，僅發(fā)生一次抗原抗體特異性反應，對有些IgG的亞型或IgM常造成漏檢；(2)雙抗原夾心對抗體進行二次特異性反應，降低間接法的僅一次特異性反應的酶標抗體引起的假陽性。
本發(fā)明的方法特異性強、敏感性高，重復性好、早期檢測、可檢測IgG亞型和IgM亞型，用于檢測丙肝病毒抗體可獲得滿意的結果，可廣泛用于獻血員篩選和臨床診斷。


圖1為檢測丙型肝炎病毒抗體方法的研究程序示意圖。
具體實施例方式
實施例一 丙型肝炎病毒多表抗位嵌合抗原與酶標記連接臂的制備一.材料
pIL1載體及pIL1a-NS4CNS3質粒已經申請中國專利并獲得授權，專利號ZL00100695.9，專利名稱“表達載體PBVIL1及其構建方法和用途”，并已經進行保藏，保藏號CGMCC No0437。
pIL1-HCV/C質粒E.coli HB101Q-Sepharose-FF陰離子交換柱S-Sepharose-FF陽離子交換柱辣根過氧化物酶(HRP)SMPB二硫蘇糖醇(DTT)HCV-Ag碘乙酰胺酶聯儀EcoR I、BamH I酶二、方法結果1.丙型肝炎病毒多表抗位嵌合抗原的研制用Goldkey計算機輔助軟件對HCV抗原表位進行分析。確定了抗原性強的HCV不同區(qū)段抗原的氨基酸位置(分別為HCV-C10-53aa；NS31192-1457aa；NS41916-1947aa；)，分別合成基因，構建pBVIL-1載體，并將抗原連接成多表位嵌合抗原，在E.coli中以包涵體形式表達HCV多表位抗原(HCV-C、NS3、NS4)，通過離子交換層析純化，SDS-PAGE鑒定純度。具體操作過程參見文獻(1).宋曉國，凌世淦，張賀秋，陳坤.重組丙型肝炎病毒抗原的研究.軍事醫(yī)學科學院院刊；2001；25(2)91-95.(2).宋曉國，凌世淦，張賀秋，陳坤.高效原核融合表達載體(pBVIL1)的構建及在HCV表達中的應用.細胞與分子免疫學雜志；2001；17(3)231-233.)。
在上述克隆表達的HCV融合抗原基礎上，分別在抗原的5’端、3’端及中間引入酶標記連接臂即4個賴氨酸(4K)，首先合成下列引物1、F1GCGAATTCATGAAAAAAAAAAAAGCACCTGTACGATCACTGEcoR I 4K IL15’端2、R1GCGGATCCTTAACACGTATTGCAGTCTATBamH I 止NS3 3’端3、F25’GCGAATTC ATGGCA CCT GTA CGA TCEcoR I IL1 5’端4、R2GCGGATCCTTACTTCTTCTTCTTACACGTATTGCAGTCTATBamH I 止 4K NS35、F35’GC ACT AGTAAA AAA AAA AAAGAG GGT GGA TCTSpe I KKKK 通用連接臂6、R35’CGCGGA TCCTTAGGA AGA CAC AAABamH I IL1以pIL1a-NS4CNS3質粒為模板(由軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所疫苗工程研究室構建與保存)，分別用F1/R1、F2/R2、F3/R3引物進行PCR擴增，獲得三個基因片段，再以EcoR I、BamH I雙酶切后，分別插入到pIL1載體中，得到三個表達質粒pIL1a/4K-NS4-CNS3、pIL1a/NS4-C-NS3-4K、pIL1a/4K -NS4-C-NS3-4K。
以pIL1-HCV/C質粒為模板，用F3/R3引物進行PCR擴增，獲得基因片段，再以EcoR I、BamH I雙酶切后，插入到pIL1載體中，得到表達質粒pIL1-4K+HCV/C，利用pIL1可將多個目的基因方便連接的特點，把pIL1-HCV/NS4、pIL1-4K+HCV/C、pIL1-HCV/NS3連接，構建成pIL1-NS4-4KC-NS3表達質粒，
將以上獲得的三個表達質粒轉化到E.coli HB101受體菌中，進行高效表達，提取包涵體，用過Q-Sepharose-FF陰離子交換柱、S-Sepharose-FF陽離子交換柱、凝膠過濾柱進行層析，SDS-PAGE鑒定，Lowy法測定蛋白含量，冰凍干燥，-25℃保存。
實施例二 丙型肝炎病毒多表抗位嵌合抗原標記辣根過氧化物酶的制備一、材料同實施例一。
二、方法結果(1)HRP活化1ml(10mg HRP+1mlPBS PH7.6)辣根過氧化物酶(HRP)，加100μl SMPB 18-20℃輕微攪拌20分鐘。
(2)抗原活化DTT活化丙型肝炎病毒多表抗位嵌合抗原(HCVAg)5mgHCVAg加115μl(30.9mg/ml)二硫蘇糖醇(DTT)18-20℃輕微攪拌20分鐘。
(3)脫鹽用PD-10脫鹽拄分別對上述活化的抗原和HRP脫鹽，收集的體積各1.5ml。
(4)結合脫鹽后的抗原和HRP結合18-20℃輕微攪拌45分鐘。
(5)終止加40μl 0.1M碘乙酰胺37℃輕微攪拌30分鐘。
(6)保存分裝100μl/支，-20℃保存。
實施例三 雙抗原夾心法檢測丙肝病毒抗體一、材料同實施例一。
二、方法結果1、將純化的丙型肝炎病毒多表位融合抗原，用0.05M pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋到0.33μg/ml，100μl/孔包被酶聯測定板，用緩沖液洗板2次，3％BSA封閉2小時，室溫晾干備用。酶標記4種不同連接臂的丙型肝炎病毒多表位融合抗原，用特殊專用的酶標記抗原稀釋液將標記抗原分別稀釋成1∶2000倍4℃?zhèn)溆?。?份丙型肝炎病毒抗體陽性和4份陰血清分別進行測定。
2、檢測丙型肝炎病毒抗體方法的研究程序見附圖1。
3、試劑盒組成(1)HCV抗原包被酶聯板1塊(2)HCV抗體陽性對照血清2ml 1瓶(3)HCV抗體陰性對照血清2ml 1瓶(4)酶結合物12ml 1瓶(5)顯色劑A 6ml 1瓶(6)顯色劑B 6ml 1瓶(7)終止液 6ml 1瓶(8)洗滌液50ml 1瓶(20×濃縮)4、操作程序(1)取出干包酶聯板，每孔加50μl待測樣品；加入100μl酶標記抗原結合物，陰陽性對照加雙孔，各加100μl，空白孔不加任何試劑，混勻后37℃水浴60分鐘。
(2)用1∶20稀釋后的洗滌液洗板5次，最后一次拍干。
(3)洗板同2。
(4)先加入顯色劑A液50μl，再加入顯色劑B液50μl，37℃水浴避光顯色20+2分鐘。
(5)每孔加50μl終止液。
5、結果判定(1)儀器測定以酶聯儀450nm測定各孔OD值(減去空白對照計算)陽性對照OD＞0.8，陰性對照OD＜0.10試劑盒有效，終止后10分鐘以內測OD值。
(2)臨界值陰性對照平均OD值+0.05。若陰性對照OD值＜0.05時，按0.05計算；若＞0.05，按實際OD值計算。
表1 四種不同連接方式多表位嵌合抗原標記辣根過氧化物酶雙抗原夾心檢測丙型肝炎病毒抗體的活性測定結果

A5’-KKKK-NS3-C-NS4；BNS3-C-NS4-KKKK-3’；C5’-KKKK-NS3-C-NS4-KKKK-3’；DNS3-KKKK-C-NS4結果證實四組不同連接方式與HCV血清反應性明顯差別，A組連接方式與HCV血清反應性好于B、C、D組。用A組標記HPR，用于雙抗原夾心檢測丙型肝炎病毒抗體。
表2 HRP標記改構抗原雙抗原夾心對國家第三代標準血清檢測結果

●A1、B1、E1、F1為空白孔，C1、D1為陰性對照，G1、H1為陽性對照；●A2、B2-H6為1～40號陰性標準血清；A7、B7-H11為1～40號陽性標準血清。Cutoff＝0.102
序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所<120>一種檢測丙型肝炎病毒抗體的方法<130>
<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>41<212>DNA<213>
<400>1gcgaattcat gaaaaaaaaa aaagcacctg tacgatcact g 41<210>2<211>29<212>DNA<213>
<400>2gcggatcctt aacacgtatt gcagtctat 29<210>3<211>25<212>DNA<213>
<400>3gcgaattcat ggcacctgta cgatc 25<210>4<211>41<212>DNA<213>
<400>4gcggatcctt acttcttctt cttacacgta ttgcagtcta t 41<210>5<211>32<212>DNA<213>
<400>5gcactagtaa aaaaaaaaaa gagggtggat ct 32<210>6
<211>24<212>DNA<213>
<400>6cgcggatcct taggaagaca caaa 2權利要求
1.一種檢測丙型肝炎病毒抗體的方法，包括如下步驟(1)丙型肝炎病毒多表位嵌合抗原的制備；(2)丙型肝炎病毒多表位嵌合抗原與酶標記連接臂的制備；(3)丙型肝炎病毒多表抗位嵌合抗原標記辣根過氧化物酶；(4)用丙型肝炎病毒多表位嵌合抗原包被酶聯免疫檢測板；(5)加入待測抗體和(3)所制備的酶標抗原；(6)加入顯色劑，酶底物顯色；(7)終止顯色反應，測定光密度，根據光密度判斷結果。
2.根據權利要求1所述方法，其特征在于所述丙型肝炎病毒多表位嵌合抗原的制備包括如下步驟(1)確定抗原性強的HCV不同區(qū)段抗原的氨基酸位置；(2)分別合成基因，構建pBVIL-1載體，并將抗原連接成多表位嵌合抗原；(3)在E.coli中以包涵體形式表達HCV多表位抗原；(4)通過離子交換層析純化，SDS-PAGE鑒定純度。
3.根據權利要求2所述的方法，其中抗原性強的HCV不同區(qū)段抗原的氨基酸位置為HCV-C10-53aa；NS31192-1457aa；NS41916-1947aa。
4.根據權利要求1所述方法，其特征在于丙型肝炎病毒多表位嵌合抗原與酶標記連接臂的制備包括如下步驟(1)合成引物，進行PCR擴增，獲得基因片段；(2)酶切基因片段，插入到載體中，制備表達質粒；(3)轉化大腸桿菌，進行表達，提取包涵體，進行純化。
5.根據權利要求4所述方法，其中所合成的引物的核苷酸序列如序列表中序列1-6所示。
6.根據權利要求4所述方法，其中的載體為pIL1。
7.根據權利要求1所述方法，其中丙型肝炎病毒多表抗位嵌合抗原標記辣根過氧化物酶包括如下步驟(1)辣根過氧化物酶(HRP)活化；(2)丙型肝炎病毒多表抗位嵌合抗原(HCVAg)活化；(3)脫鹽；(4)結合；(5)終止；(6)保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種采用酶聯免疫技術檢測丙型肝炎病毒抗體的方法，還公開了該方法中采用的丙型肝炎病毒多表抗位嵌合抗原與酶標記連接臂。本發(fā)明的檢測方法包括丙型肝炎病毒多表位嵌合抗原的制備，嵌合抗原與酶標記連接臂的制備，嵌合抗原標記辣根過氧化物酶復合物的制備，嵌合抗原包被酶聯板檢測板，加入待測抗體及酶標記抗原復合物等步驟。本發(fā)明的方法特異性強、敏感性高，重復性好、早期檢測，用于檢測丙肝病毒抗體可獲得滿意的結果，可廣泛用于獻血員篩選和臨床診斷。
文檔編號G01N21/77GK1755365SQ20051007180
公開日2006年4月5日 申請日期2005年5月24日 優(yōu)先權日2004年9月29日
發(fā)明者張賀秋, 宋曉國, 陳坤, 王國華, 凌世淦 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所