專利名稱：用于測定抗egfr抗體在癌癥治療中的功效的生物標(biāo)記和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于基因或基因表達(dá)產(chǎn)物的生物標(biāo)記和方法，用于測定抗EGFR抗體在EGFR表達(dá)性癌癥的治療中的功效。本發(fā)明進(jìn)一步涉及預(yù)測患有EGFR表達(dá)性癌癥的患者對用特定抗EGFR抗體進(jìn)行的治療的敏感性或抵抗性。本發(fā)明優(yōu)選涉及相應(yīng)生物標(biāo)記的鑒定，該生物標(biāo)記允許更好地預(yù)測在具有KRAS野生型腫瘤的患者中用抗EGFR抗體治療的臨床結(jié)果。在本文中，本發(fā)明特別涉及抗EGFR抗體C225/西妥昔單抗(Erbitux )及其在患有特別是結(jié)腸直腸癌(CRC)的患者中的用途。
背景技術(shù)：
單克隆抗體廣泛地用于癌癥的治療中。因為抗體是由國家衛(wèi)生保健機(jī)構(gòu)付費的昂貴藥物，并且常導(dǎo)致不期望的副作用從而對患有嚴(yán)重和通常晚期疾病的患者造成額外的負(fù)擔(dān)和壓力，所以非常希望預(yù)先了解用特定抗體藥物治療特定患者是否可以真正改善或甚至治愈患者的狀況。已存在幾個臨床和組織學(xué)參數(shù)可以用于預(yù)后特定藥物和/或治療方案是否可以成功用于治療疾病。然而，已顯示腫瘤極為常常地引發(fā)多種多樣的遺傳模式，該模式可隨個體而改變。因此，可以改善第一患者的臨床狀況的特定藥物或特定治療在患有相同癌癥的第二患者中可能會功效不高或無效。例如，患有結(jié)腸直腸癌的患者可能對某一特定抗體藥物表現(xiàn)出不同的反應(yīng)。在最糟的情況下，取決于不同遺傳腫瘤模式和素質(zhì)，一個特定患者組完全不響應(yīng)藥物，而另一個患者組引發(fā)令人滿意的治療應(yīng)答。盡管現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物化學(xué)已揭示數(shù)百個基因的活性影響腫瘤細(xì)胞的行為、 其分化狀態(tài)、及其對某些治療藥物例如抗體的敏感性或抵抗性，但這些基因的狀態(tài)通常不用于對藥物療法例行做出臨床決定的目的。一個例外是在乳腺癌中使用ErbB2(Her2)蛋白質(zhì)表達(dá)來選擇施用Her2拮抗劑藥物Herceptin (Genentech)的患者。另一個例外是發(fā)現(xiàn)——EGFR表達(dá)腫瘤的KRAS基因突變與缺乏針對抗EGFR抗體的敏感性或應(yīng)答相關(guān) (Allegra等人2009，J Clin Oncol [印刷前的電子版])。需要可以利于選擇用于治療的患者的新預(yù)后和預(yù)測標(biāo)記，以在臨床中更佳地預(yù)測患者對于治療例如小分子或生物分子藥物的反應(yīng)。患者樣品的分類是癌癥診斷和治療的關(guān)鍵方面。患者對于治療的反應(yīng)與分子和遺傳標(biāo)記的聯(lián)系可以開啟在非應(yīng)答患者上獲得治療發(fā)展的新機(jī)會，或基于更高的功效可靠性而從其他治療選擇中區(qū)分出治療的適應(yīng)癥。進(jìn)一步地，預(yù)先選擇可能良好響應(yīng)藥物或藥物聯(lián)合或特定方案的患者，可以減少臨床研究中需要的患者數(shù)目或加速完成臨床開發(fā)計劃需要的時間。表皮生長因子受體(EGFR)及其下游信號效應(yīng)物，主要是Ras/Raf/MAP激酶途徑的成員，在正常和惡性上皮細(xì)胞生物學(xué)中均起重要作用(Normarmo等人，Gene 366， 2-16Q006))，并且因此成為用于治療開發(fā)的已確立的靶點。已開發(fā)了識別且抑制EGFR的幾種單克隆嵌合、人源化或全人單克隆抗體。此時已推向市場的2個抗體例子是西妥昔單抗(cetuximab，ERBITUX )和帕尼單抗 (panitumumab，VECTIBIX )。
已經(jīng)證實在體外抑制EGF介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞生長且在體內(nèi)抑制人結(jié)腸直腸腫瘤生長的抗EGFR抗體c225 (西妥昔單抗)，嵌合IgGl，在2003年獲得市場批準(zhǔn)。它的序列首次公開于WO 96/40210中。該抗體以及一般地所有抗EGFR抗體看起來首要的是與某些化學(xué)治療劑(即多柔比星、阿霉素、紫杉醇和順鉬)協(xié)同作用，從而在異種移植物小鼠模型中體內(nèi)根除人腫瘤(例如EP 0667165)。此外，可以證實，抗EGFR抗體c225與第二人源化抗EGFR 抗體馬妥珠單抗(matuzumabjab h425)的組合在體外模型中顯示協(xié)同作用，說明這2種抗體盡管針對相同受體但與受體上的不同表位結(jié)合(W0 2004/032960) 0過去證實，在用抗EGFR抗體，包括西妥昔單抗，或相應(yīng)的小分子抑制劑治療的患者中約75%在開始治療后非?？焖侔l(fā)展或多或少嚴(yán)重的皮疹。盡管時常這是可耐受和可處理的，但約10%的患者由于嚴(yán)重癥狀而需要劑量中斷和/或劑量減少，并且少數(shù)患者中止治療。EGFR抑制劑的皮膚毒性與有利臨床結(jié)果之間越來越明顯的關(guān)聯(lián)性使得皮疹的“達(dá)成”在治療受益患者中成為一個期望的但又潛在令人討厭的毒性，有時限制這些藥物的應(yīng)用。然而，在抗EGFR抗體治療過程中皮疹的出現(xiàn)可以視為對所述抗體例如西妥昔單抗治療的治療應(yīng)答的一個可靠替代標(biāo)記。然而，選擇皮疹出現(xiàn)作為替代標(biāo)記，因為在將藥物施用于患者較長時間前鑒定一般不響應(yīng)抗EGFR抗體治療的癌癥患者是不可能的，故該選擇不是最佳的。因此，發(fā)現(xiàn)在EGFR表達(dá)腫瘤中KRAS基因(密碼子12/13)和基因產(chǎn)物的突變對 EGFR抑制劑治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌的不敏感性負(fù)責(zé)，可以被認(rèn)為是在預(yù)測治療成功與否方面的進(jìn)步。WO 2008/112269報道帕尼單抗，人抗EGFR抗體，僅在KRAS野生型腫瘤患者中是有效的。Khambata-Ford等人(2007，J. Clin. Oncol. 25,3230)描述了帶有表皮調(diào)節(jié)素 (epiregulin)和雙調(diào)蛋白高水平基因表達(dá)的腫瘤的轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌患者以及具有野生型KRAS腫瘤的患者更可能以西妥昔單抗治療進(jìn)行疾病控制。盡管上述近期進(jìn)展，癌癥治療中的一個主要挑戰(zhàn)仍是，針對具體的治療方案，基于病理遺傳學(xué)和/或遺傳學(xué)標(biāo)記，選擇患者以優(yōu)化結(jié)果。在用抑制這些腫瘤生長的抗EGFR抗體治療EGFR表達(dá)腫瘤的情況下，了解且更好地理解哪些患者能夠響應(yīng)用這些抗體進(jìn)行的預(yù)期治療，將會是有幫助的，特別是考慮到最近的發(fā)現(xiàn)——即使在KRAS野生型腫瘤組中，也并非所有患者(約40% )都良好響應(yīng)抗EGFR抗體和其他EGFR抑制劑的治療。因此，存在對使用生物標(biāo)記的診斷試驗、方法和工具的需要，所述生物標(biāo)記(包括個體差異的腫瘤基因型)可以同時提供患者對多種治療選項的反應(yīng)的預(yù)測信息。發(fā)明概述本發(fā)明公開了用于確定抗EGFR抗體在癌癥治療中的功效的預(yù)測性生物標(biāo)記。在本發(fā)明的一個實施方案中，描述了特定生物標(biāo)記，其可以用于在KRAS野生型患者或具有KRAS基因突變的患者中在將抗EGFR抗體施用給所述患者前預(yù)測抗EGFR抗體在腫瘤治療中的功效。在本發(fā)明的再一實施方案中，公開了特定生物標(biāo)記，其可以用于更確切地預(yù)測抗 EGFR抗體在KRAS基因無突變(KRAS野生型)的患者中進(jìn)行腫瘤治療的功效或功效程度，所述KRAS基因無突變的患者通常在統(tǒng)計學(xué)上(但不一定在單個體上)對抗EGFR抗體治療具有陽性反應(yīng)。本發(fā)明的另一個實施方案涉及生物標(biāo)記，其在患有結(jié)腸直腸癌(CRC)，優(yōu)選轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌(mCRC)、鱗狀細(xì)胞頭頸癌(SCCHN)或非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的患者中指示對于抗EGFR抗體治療產(chǎn)生好的(陽性生物標(biāo)記)或壞的(負(fù)生物標(biāo)記)應(yīng)答的高可能性。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，公開了預(yù)測用抗EGFR抗體西妥昔單抗 (Erbitux )的腫瘤相關(guān)(實體或轉(zhuǎn)移性腫瘤)治療的功效或無功效的生物標(biāo)記。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，公開了預(yù)測用抗EGFR抗體西妥昔單抗 (Erbitux )的腫瘤相關(guān)(實體或轉(zhuǎn)移性腫瘤)治療的功效或無功效的生物標(biāo)記，其中所述腫瘤是 CRC、mCRC、SCCHN 或 NSCLC。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，公開了預(yù)測用抗EGFR抗體西妥昔單抗 (Erbitux )的腫瘤相關(guān)(實體或轉(zhuǎn)移性腫瘤)治療的功效或無功效的生物標(biāo)記，其中所述腫瘤是CRC、mCRC、SCCHN或NSCLC，并且患有所述癌癥的患者優(yōu)選顯示個體KRAS野生型基因模式。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及通過診斷工具和/或診斷裝置用于預(yù)測患有 KRAS野生型EGFR表達(dá)腫瘤的患者將響應(yīng)或不響應(yīng)所述EGFR抗體治療的可能性的體外方法，其中所述患者是用EGFR抗體治療的候選者。根據(jù)本發(fā)明，該方法包括測定得自所述患者的組織樣品中一種或多種預(yù)后基因或其基因表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平，其中與臨床相關(guān)參考值比較，基因/基因產(chǎn)物的高或低表達(dá)指示患者可能響應(yīng)所述治療或可能i響應(yīng)治療。在對抗EGFR抗體優(yōu)選西妥昔單抗治療具有高響應(yīng)可能性或確實產(chǎn)生響應(yīng)的腫瘤患者的樣品中高表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物，根據(jù)本發(fā)明，選自由以下基因組成的組 ADAMDEC1、BSDCl、CIorfl44、CAPZB、CDC42、DHCR7、DNAJC8、ECSIT、EX0SC10、FADSl、GBA、 GLT25D1、G0SR2、IMPDHl、KLHL21、KPNA6、KPNBl、LSMl2、MANlB 1、MIDN、PPAN、SH3BP2、SQLE、 SSH3、TNFRSF1B、URM1、ZFYVE26、RGMB, SPIRE2、ABCC5、ACSL5、AOAH、AXIN2、CD24、CEACAM5、 CEACAM6、ETS2、FMNL2、GPSM2、HDAC2、了UN、ME3、MED17、MYB、MYC、NEBL，NOSIP、PITX2、POF1B、 PPARG、PPP1R14C、PRR15、PSMG1、RAB15、RAB40B、RNF43、RPS23、SLC44A3、S0X4、THEM2、VAV3、 ZNF337、EPDRl、KCNK5、KHDRBS3、PGM2L1、STK38 和 SHR00M2。在對抗EGFR抗體優(yōu)選西妥昔單抗治療具有低響應(yīng)可能性或不產(chǎn)生響應(yīng)的腫瘤患者的樣品中高表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物，根據(jù)本發(fā)明，選自由以下基因組成的組C7orf46、 CAST、DCP2、DIP2B、ERAPU INSIG2、KIF21A、KLK6、NGRN, NRIPU PHGDH、PPP1R9A、QPCT, RABEPl、RPAl，RPL22L1、SKPl、SLC25A27、SLC25A46、S0CS6、TPD52、ZDHHC2、ZNF654、ASB6、 ATM、BMI1、CDC42EP2、EDEM3、PLLP, RALBPl、SLC4A11、TNFSFl5, TPKl、Cllorf9、C1QC、 CABLES1、CDK6、EHBP1、EX0C6、EXT1、FLRT3、GCNT2、MTHFS、PIK3AP1、ST3GAL1、TK2、ZDHHC14、 ARFGAP3、AXUDl、CAPZB, CHSYl、DNAJB9、GOLTIB, HSPA5、LEPR0TL1、LIMSl、MAPK6、MY06、 PROSC, RAB8B、RAP2B、RWDD2B、SERTAD2、S0CS5、TERF2IP、TIALl、TIPARP, TRIM8, TSC22D2、 TGFA, VAPA和UBE2K，與參考值比較，指示患者可能響應(yīng)所述治療。在本發(fā)明的另一個實施方案中，高于平均表達(dá)且指示患者可能響應(yīng)或可能優(yōu)良響應(yīng)相應(yīng)抗EGFR抗體(例如西妥昔單抗)治療的優(yōu)選生物標(biāo)記選自下組EPDRl、KCNK5、 KHDRBS3、PGM2L1、SHR00M2、STK38、RGMB, SPIRE2 和 VAV3 或所述組的相應(yīng)基因表達(dá)產(chǎn)物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，高于平均表達(dá)且指示患者可能不響應(yīng)或可能不優(yōu)良響應(yīng)相應(yīng)抗EGFR抗體(例如西妥昔單抗)治療的優(yōu)選生物標(biāo)記選自下組ASB6、ATM、BMI1、CDC42EP2、EDEM3、PLLP、RALBP1、SLC4A11、TNFSFl5、TPK1、ARFGAP3、AXUD1、CAPZB、 CHSY1、DNAJB9、GOLT IB、HSPA5、LEPROTL ULIMSU MAPK6、MY06、PROSC、RAB8B、RAP2B、RWDD2B、 SERTAD2、S0CS5、TERF2IP、TIALU TIPARP, TRIM8、TSC22D2、TGFA, VAPA 和 UBE2K、或所述組
的相應(yīng)基因表達(dá)產(chǎn)物。在再一實施方案中，根據(jù)本發(fā)明用于預(yù)測患者對于抗EGFR抗體的陽性應(yīng)答的優(yōu)選生物標(biāo)記是VAV3，根據(jù)本發(fā)明用于預(yù)測患者對于抗EGFR抗體的負(fù)應(yīng)答或可忽略不計應(yīng)答的優(yōu)選生物標(biāo)記是TGFa。在另一個實施方案中，應(yīng)用相應(yīng)方法，其中使用如上文和權(quán)利要求中所述的至少一種相當(dāng)大的或高度表達(dá)的第一生物標(biāo)記，其指示患者將可能良好地或格外好地或優(yōu)良地響應(yīng)用抗EGFR抗體優(yōu)選西妥昔單抗的治療(與臨床平均或標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)和/或由相應(yīng)的平均患者群組(cohort)計算的表達(dá)值比較)；并且使用如上文和權(quán)利要求中所述的至少一種相當(dāng)大的或高度表達(dá)的第二生物標(biāo)記，其指示患者將可能王金良好或格外好或優(yōu)良地響應(yīng)用抗EGFR抗體(優(yōu)選西妥昔單抗)的治療(與臨床平均或標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)和/或由相應(yīng)的平均患者群組計算的表達(dá)值比較)。在另一個實施方案中，在體外方法中應(yīng)用相應(yīng)方法，以預(yù)測患者響應(yīng)所述抗EGFR 抗體治療的可能性，其中所述患者患有KRAS野生型EGFR表達(dá)腫瘤且是用EGFR抗體治療的候選者，其中在用抗EGFR抗體優(yōu)選西妥昔單抗治療腫瘤患者的情況中，對AREG和/或EREG 與一種或多種上文和下文述及的生物標(biāo)記的表達(dá)水平進(jìn)行組合測定。優(yōu)選地，應(yīng)用相應(yīng)方法，其中在用抗EGFR抗體優(yōu)選西妥昔單抗治療腫瘤患者優(yōu)選 CRC或mCRC腫瘤患者的情況中，測定VAV3以及ARAG或EREG的基因或基因產(chǎn)物表達(dá)水平。在再一具體的實施方案中，應(yīng)用相應(yīng)方法，其中在用抗EGFR抗體優(yōu)選西妥昔單抗治療腫瘤患者優(yōu)選CRC或mCRC腫瘤患者的情況中，測定VAV3和ARAG或EREG的基因或基因產(chǎn)物表達(dá)水平。在根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，應(yīng)用相應(yīng)方法，其中在用抗EGFR抗體優(yōu)選西妥昔單抗治療腫瘤患者優(yōu)選CRC或mCRC腫瘤患者的情況中，測定TGFa和ARAG或EREG 的基因或基因產(chǎn)物表達(dá)水平。在根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，應(yīng)用相應(yīng)方法，其中在用抗EGFR抗體優(yōu)選西妥昔單抗治療腫瘤患者優(yōu)選CRC或mCRC腫瘤患者的情況中，測定VAV3和TGFa的基因或基因產(chǎn)物表達(dá)水平。在根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，應(yīng)用相應(yīng)方法，其中在用抗EGFR抗體優(yōu)選西妥昔單抗治療腫瘤患者優(yōu)選CRC或mCRC腫瘤患者的情況中，測定VAV3、TGFa、和ARAG 或EREG的基因或基因產(chǎn)物表達(dá)水平。在再一方面，本發(fā)明涉及體外方法，用于預(yù)測患有KRAS野生型EGFR表達(dá)癌癥的患者將在治療上響應(yīng)抗EGFR抗體(優(yōu)選西妥昔單抗)治療的可能性，該方法包括(a)通過診斷工具和/或診斷裝置在來自所述患者的腫瘤組織或血漿的活檢組織樣品中測量一種或多種生物標(biāo)記的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)記選自(i)由ADAMDEC1、BSDCl、Clorf 144、CAPZB, CDC42、DHCR7、DNAJC8、ECSIT、EXOSC10、FADS1、GBA、GLT25D1、G0SR2、IMPDHl、KLHL21、KPNA6、 KPNBl、LSMl2, MANlBl、MIDN、PPAN、SH3BP2、SQLE, SSH3、TNFRSF1B、URMl、ZFYVE26、RGMB, SPIRE2、ABCC5、ACSL5、AOAH、AXIN2、CD24、CEACAM5、CEACAM6、ETS2、FMNL2、GPSM2、HDAC2、JUN、ME3、MED17、MYB, MYC, NEBL, NOSIP、PITX2、P0F1B、PPARG, PPP1R14C、PRRl5, PSMGl、 RAB15、RAB40B、RNF43、RPS23、SLC44A3、S0X4、THEM2、VAV3、ZNF337、EPDRl、KCNK5、KHDRBS3、 PGM2L1、STK38、SHR00M2 組成的組，和 / 或(ii)由 C7orf46、CAST、DCP2、DIP2B、ERAPU INSIG2、KIF21A、KLK6、NGRN、NRIPU PHGDH, PPP1R9A、QPCT, RABEPU RPA1, RPL22L1、SKPU SLC25A27、SLC25A46、S0CS6、TPD52、ZDHHC2、ZNF654、ASB6、ATM、BMI1、CDC42EP2、EDEM3、 PLLP、RALBP1、SLC4A11、TNFSF15、TPK1、C11orf9、C1QC、CABLES1、CDK6、EHBP1、EX0C6、EXT1、 FLRT3、GCNT2、MTHFS, PIK3AP1、ST3GAL1、TK2、ZDHHCl4, ARFGAP3、AXUDl、CAPZB, CHSYl、 DNAJB9、GOLTIB, HSPA5、LEPR0TL1、LIMSU MAPK6、MY06、PROSC、RAB8B、RAP2B、RWDD2B、 SERTAD2、S0CS5、TERF2IP、TIALU TIPARP, TRIM8、TSC22D2、TGFA, VAPA 和 ΒΞ2Κ 組成的組，(b)使來自所述患者的腫瘤或血漿的組織樣品離體暴露于所述抗EGFR抗體，(c) 在步驟(b)的所述暴露的組織樣品中再次測量步驟(a)中所述的一種或多種生物標(biāo)記的表達(dá)水平，和(d)計算在步驟(b)和(c)中測量的表達(dá)水平的差異，其中與步驟(a)比較，在步驟(C)中獲得的組(i)的生物標(biāo)記的表達(dá)水平的增加指示所述患者在治療上響應(yīng)所述抗EGFR抗體治療的可能性增加，并且其中與步驟(a)比較，在步驟(c)中獲得的組(ii)的生物標(biāo)記的表達(dá)水平的增加指示所述患者在治療上響應(yīng)所述抗EGFR抗體治療的可能性降低。在另一個方面，本發(fā)明涉及如上文和下文公開的相應(yīng)體外方法，其中患者不僅患有KRAS野生型EGFR表達(dá)腫瘤，還另外顯示在腫瘤組織的EGFR基因中的突變。在一個具體實施方案中，這個突變負(fù)責(zé)與抗EGFR抗體優(yōu)選西妥昔單抗施用相關(guān)的皮疹。這個突變優(yōu)選引起EGFR中的R521K多態(tài)性。在另一個方面，本發(fā)明涉及如上文和下文公開的相應(yīng)體外方法，其中患者不僅患有KRAS野生型EGFR表達(dá)腫瘤，特別是CRC/mCRC，還另外顯示在腫瘤組織的BRAF基因中的突變。在再一方面，本發(fā)明涉及包含一種或多種下述基因所呈現(xiàn)的多核苷酸的排列或與一種或多種下述基因雜交的多核苷酸的排列的DNA或RNA陣列ADAMDEC1, BSDCLClorf 144, CAPZB，CDC42，DHCR7，DNAJC8，ECSIT，EXOSC10, FADSl, GBA, GLT25D1, G0SR2, IMPDHl，KLHL21, KPNA6, KPNBl，LSM12, MANlBl, MIDN, PPAN, SH3BP2, SQLE, SSH3, TNFRSF1B, URMl, ZFYVE26, RGMB, SPIRE2, ABCC5, ACSL5, AOAH, AXIN2, CD24, CEACAM5, CEACAM6, ETS2, FMNL2, GPSM2, HDAC2, JUN, ME3, MED17, MYB, MYC, NEBL, N0SIP, PITX2，P0F1B，PPARG,PPP1R14C,PRR15，PSMGl，RAB15，RAB40B,RNF43,RPS23,SLC44A3,S0X4, THEM2, VAV3, ZNF337, EPDRl， KCNK5, KHDRBS3, PGM2L1, STK38, SHR00M2, C7orf46, CAST, DCP2, DIP2B, ERAPl，INSIG2, KIF21A, KLK6, NGRN, NRIPl，PHGDH, PPP1R9A, QPCT, RABEP1, RPA1，RPL22L1，SKPl，SLC25A27, SLC25A46, S0CS6, TPD52, ZDHHC2, ZNF654, ASB6, ATM, BMI1， CDC42EP2, EDEM3, PLLP，RALBP1, SLC4A11, TNFSFl5，TPKl，Cllorf9, C1QC, CABLES 1，CDK6, EHBP1，EX0C6，EXT1，F(xiàn)LRT3，GCNT2，MTHFS，PIK3AP1，ST3GAL1，TK2，ZDHHC14，ARFGAP3，AXUD1， CAPZB, CHSYl，DNAJB9，GOLTIB, HSPA5, LEPR0TL1，LIMSl，MAPK6，MY06, PROSC, RAB8B, RAP2B, RWDD2B, SERTAD2, S0CS5, TERF2IP, TIALl，TIPARP, TRIM8, TSC22D2, TGFA, VAPAjP UBE2K， 其中所述基因或基因產(chǎn)物固定在固體表面上。在一個優(yōu)選實施方案中，DNA或RNA陣列包含一種或多種下述基因或與所述基因雜交TNFRSF1B、DNAJC8、ECSIT、G0SR2、PPP1R9A、KLK6、C7orf46、SSH3、SERTAD2、AXIN2、 C10orf99、ETS2、PITX2、PRR15、VAV3、編碼 IKK 相互作用蛋白質(zhì)的基因、EDEM3、LY6G6D，和任選地加上AREG和/或EREG和/或TGFA。在另一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的DNA或RNA陣列由以下多核苷酸的排列組成，其中所述多核苷酸由下述基因呈現(xiàn)或與下述基因雜交(a)TNFRSFlB、DNAJC8、ECSIT、 G0SR2、PPPlR9A、KLK6、C7orf46、SSH3、SERTAD2、AXIN2、C10orf99、ETS2、PITX2、PRR15、VAV3、 編碼IKK相互作用蛋白質(zhì)的基因、EDEM3、LY6G6D、AREG、EREG和TGFA ；或(b) TNFRSF1B、DNAJC8、VAV3、ARAG 或 EREG、TNFa ；或(c) VAV3 ；ARAG 或 EREG、TNFa ；或(d)VAV3、TNFa ；或(e) ARAG 或 EREG、TNFa。附圖簡述

圖1 在具有野生型KRAS基因的患者中，在基線樣品中的表達(dá)與在西妥昔單抗單一治療6周后的疾病控制顯著相關(guān)的基因(ρ < 0.002，調(diào)節(jié)性t檢驗(moderated t-test))?；谘芯縀MR 62202-045 (轉(zhuǎn)移性CRC的一線治療)。圖2 在基線樣品中的表達(dá)與在西妥昔單抗單一治療6周后的疾病控制顯著相關(guān)的基因(P < 0. 002，調(diào)節(jié)性t檢驗)?；谘芯縀MR 62202-045 (轉(zhuǎn)移性CRC的一線治療)。圖3 研究EMR 62202-502 (依立替康難治性轉(zhuǎn)移性CRC患者的西妥昔單抗加依立替康治療)，具有野生型KRAS基因的患者分析在基線樣品中的表達(dá)與最佳總體應(yīng)答顯著相關(guān)的基因(P < 0. 002，Welch t檢驗)。圖4 研究EMR 62202-502 (依立替康難治性轉(zhuǎn)移性CRC患者的西妥昔單抗加依立替康治療)在基線樣品中的表達(dá)與最佳總體應(yīng)答顯著相關(guān)的基因(p< 0.002，ffelCh t檢驗)。圖5 研究EMR 62202-502 (在依立替康難治性轉(zhuǎn)移性CRC患者中的西妥昔單抗加依立替康治療)，具有野生型KRAS基因的患者分析在基線樣品中的表達(dá)與總體生存時間顯著相關(guān)的基因(P < 0. 002，Cox比例風(fēng)險回歸)。圖6 研究EMR 62202-502 (在依立替康難治性轉(zhuǎn)移性CRC患者中的西妥昔單抗加依立替康治療)在基線樣品中的表達(dá)與總體生存時間顯著相關(guān)的基因(p< 0.002，Cox比例風(fēng)險回歸)。圖7 研究EMR 62202-502 (在依立替康難治性轉(zhuǎn)移性CRC患者中的西妥昔單抗加依立替康治療)在基線樣品中的表達(dá)與無進(jìn)展生存時間顯著相關(guān)的基因(ρ < 0.002，Cox 比例風(fēng)險回歸)。圖8 研究EMR 62202-502 (在依立替康難治性轉(zhuǎn)移性CRC患者中的西妥昔單抗加依立替康治療)，具有野生型KRAS基因的患者分析在基線樣品中的表達(dá)與無進(jìn)展生存時間顯著相關(guān)的基因(P < 0. 002，Cox比例風(fēng)險回歸)。圖9 用于評估腫瘤活檢組織的肝組織污染程度的Affymetrix探針組。圖10 在具有KRAS野生型腫瘤的患者中，基線表達(dá)數(shù)據(jù)與在第6周時的疾病控制的相關(guān)性具有ρ < . 002的57個探針組。Log比值是具有疾病控制的患者的平均log2表達(dá)水平減去具有進(jìn)展性疾病的患者的平均log2表達(dá)水平，針對樣品的肝污染程度進(jìn)行調(diào)離
iF. ο圖11 :47個探針組顯示從基線到第4周表達(dá)的治療中(on-treatment)變化與最佳總體應(yīng)答相關(guān)。Log比值代表具有部分應(yīng)答的患者的治療中變化的平均值減去具有穩(wěn)定或進(jìn)展性疾病的患者的治療中變化的平均值，針對樣品的肝污染程度進(jìn)行調(diào)整。圖12 從基線到第4周候選基因表達(dá)的治療中變化與最佳總體應(yīng)答的相關(guān)性。Log 比值代表具有部分應(yīng)答的患者的治療中變化的平均值減去具有穩(wěn)定或進(jìn)展性疾病的患者的治療中變化的平均值，針對樣品的肝污染程度進(jìn)行調(diào)整。圖13 在具有KRAS野生型狀態(tài)的腫瘤中，候選基因的基線表達(dá)與在第6周時的疾病控制的相關(guān)性。Log比值是具有疾病控制的患者的平均log2表達(dá)水平減去具有進(jìn)展性疾病的患者的平均log2表達(dá)水平，針對樣品的肝污染程度進(jìn)行調(diào)整。圖14 =Luminex血漿蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果。分析指的是，在所有患者中以及在具有KRAS野生型腫瘤的患者中，基線和第4周樣品之間的一般改變、治療中改變與在第6周時的應(yīng)答的相關(guān)性。對于這些分析之每一個，針對每一種測量的蛋白質(zhì)，給出 Iog2比值、ρ值和q值。Log2比值指的是在第4周和基線樣品之間log2濃度的平均差異 (一般改變)，或在應(yīng)答者和非應(yīng)答者之間的這些平均差異之間的差異(與應(yīng)答的相關(guān)性)。圖15 抗體試劑和免疫組織化學(xué)測定條件。圖16 基于在結(jié)腸直腸癌(藍(lán)色框)和正常肝(紫色框)中優(yōu)勢表達(dá)的基因的表達(dá)，鑒定具有高(綠色)、中(紅色)或低(黑色)肝污染的RNA樣品。色度反映在標(biāo)準(zhǔn)化后的絕對元素信號強(qiáng)度。圖17 從基線到第4周表達(dá)的治療中改變與最佳總體應(yīng)答的相關(guān)性(部分應(yīng)答與穩(wěn)定疾病加進(jìn)展性疾病比較)。顯示了具有P < 0.002的47個探針組。在圖右側(cè)上給出基因名稱，隨后為元素ID (element ID)。元素強(qiáng)度代表在第4周時的基因表達(dá)超過在基線時的基因表達(dá)的10 比?？s寫；PD，進(jìn)展性疾??；SD，穩(wěn)定疾??；PR，部分應(yīng)答。圖18 從基線到第4周候選基因表達(dá)的治療中改變與最佳總體應(yīng)答的相關(guān)性(部分應(yīng)答與穩(wěn)定疾病加進(jìn)展性疾病比較)。在圖右側(cè)上給出基因名稱，隨后為元素ID。元素強(qiáng)度代表在第4周時的基因表達(dá)超過在基線時的基因表達(dá)的10 比?？s寫；PD，進(jìn)展性疾?。籗D，穩(wěn)定疾??；PR，部分應(yīng)答。圖19 在具有KRAS野生型狀態(tài)的腫瘤中候選基因的基線表達(dá)與疾病控制的相關(guān)性(部分應(yīng)答加穩(wěn)定疾病與進(jìn)展性疾病比較)。在圖右側(cè)上給出基因名稱，隨后為元素ID。 強(qiáng)度程度反映，相對于每個探針組在所有樣品上的平均值，每種元素的10 比值?？s寫；PD， 進(jìn)展性疾??；SD，穩(wěn)定疾??；PR，部分應(yīng)答。圖20 在用西妥昔單抗(Erbitux)治療的mCRC患者中KRAS狀態(tài)與應(yīng)答率和無進(jìn)展生存的相關(guān)性。圖21.在皮膚㈧和腫瘤⑶樣品中所選EGFR信號途徑相關(guān)標(biāo)記的表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析在配對的第4周/基線樣品之間的改變。圖22.根據(jù)KRAS腫瘤突變狀態(tài)，相對于無進(jìn)展生存時間(以月表示)，無疾病進(jìn)展的患者的比例。圖23.在具有KRAS野生型腫瘤的患者中，基線基因表達(dá)數(shù)據(jù)與在第6周時的疾病控制的相關(guān)性(部分應(yīng)答加穩(wěn)定疾病與進(jìn)展性疾病比較)。顯示了具有P < 0. 002的57個探針組。在圖右側(cè)上給出基因名稱，隨后為元素ID。色度反映，相對于每個探針組在所有樣品上的平均值，每種元素的10 比值?？s寫；PD，進(jìn)展性疾?。籗D，穩(wěn)定疾??；PR，部分應(yīng)答。圖24.在所有患者中(分別為圖A、C和E)和在腫瘤具有野生型KRAS的患者中 (分別為圖B、D和F)，根據(jù)第6周時的應(yīng)答，在基線樣品中的AREG (element 205239_at)、 EREG(element 205767_at)禾口 TGFA(element 205016_at)的表達(dá)水平。P 值指與疾病控制的相關(guān)性(部分應(yīng)答I3R和穩(wěn)定疾病SD與進(jìn)展性疾病PD比較)。圖25.在意向治療(ITT)群體中的45個患者(圖A)中和在具有KRAS野生型腫瘤的M個ITT患者(圖B)中，從基線到第4周血漿蛋白質(zhì)濃度的治療中改變與在第6周時的應(yīng)答的相關(guān)性(部分應(yīng)答I3R與穩(wěn)定疾病SD加進(jìn)展性疾病PD比較)。顯示了具有P <.01的所有蛋白質(zhì)。元素強(qiáng)度代表在第4周時的蛋白質(zhì)濃度超過在基線時的蛋白質(zhì)濃度的Iog2比。圖沈盒圖(boxplot)顯示VAV3與應(yīng)答的相關(guān)性。PD 進(jìn)展性疾病，PR 部分應(yīng)答，SD 穩(wěn)定疾病。綠點具有KRAS和BRAF野生型腫瘤的患者，紅點具有KRAS突變的患者，黑點具有BRAF突變的患者，藍(lán)點突變狀態(tài)未知。P值基于Welch t檢驗。圖27 =Kaplan-Meier曲線顯示通過VAV3表達(dá)分層的估計的無進(jìn)展生存分布函數(shù)。 取決于患者的基線VAV3表達(dá)水平是高于還是低于全部患者的中值水平，已將患者分類為高或低VAV3表達(dá)者。ρ值衍生自Cox比例風(fēng)險模型。圖28 =Kaplan-Meier曲線顯示通過VAV3表達(dá)分層的估計的總體生存分布函數(shù)。 取決于患者的基線VAV3表達(dá)水平是高于還是低于全部患者的中值水平，已將患者分類為高或低VAV3表達(dá)者。ρ值衍生自Cox比例風(fēng)險模型。圖四=Kaplan-Meier曲線顯示通過VAV3表達(dá)和KRAS突變狀態(tài)分層的估計的無進(jìn)展生存分布函數(shù)?；颊咭逊譃?層，代表KRAS突變狀態(tài)和基線VAV3表達(dá)(高于或低于中值)的所有可能組合。圖30 :Vav3與活化的EGFR相互作用。在用VAV3和EGFR單獨地或組合地轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞后，使細(xì)胞裂解且實施免疫沉淀(IP)和蛋白質(zhì)印跡(WB)。發(fā)明詳述EGFR靶向免疫球蛋白(Ig)Gl單克隆抗體西妥昔單抗是批準(zhǔn)用于治療實體瘤的第一個單克隆抗體。已進(jìn)行了關(guān)于預(yù)測西妥昔單抗應(yīng)答的有用生物標(biāo)記的深入研究，以鑒定將從西妥昔單抗治療中最顯著獲益的那些患者。對于CRC中的EGFR靶向治療功效，通過免疫組織化學(xué)評價的腫瘤EGFR表達(dá)已被證明為是一個令人失望的生物標(biāo)記。對于KRAS基因突變， 已報道了更有希望的數(shù)據(jù)，所述KRAS基因編碼⑶P/GTP結(jié)合蛋白，其將EGFR信號級聯(lián)的配體依賴性受體激活與細(xì)胞內(nèi)途徑聯(lián)系在一起。在多個臨床研究中KRAS突變狀態(tài)的回顧性分析，包括在轉(zhuǎn)移性CRC (mCRC)中的一線治療的2個隨機(jī)化研究EMR 62202-047和EMR 62202-013，以及隨機(jī)化CO. 17研究(研究在先化療失敗的mCRC患者中的西妥昔單抗單一治療)，已證實KRAS密碼子12/13突變狀態(tài)對CRC中的西妥昔單抗活性具有預(yù)測性。在其腫瘤為KRAS野生型的患者亞組中主要觀察到腫瘤應(yīng)答，攜帶KRAS密碼子12/13突變的患者不獲益于西妥昔單抗治療。KRAS的突變狀態(tài)因此看起來是CRC中西妥昔單抗活性的一個有力預(yù)測生物標(biāo)記，允許從治療中排除不可能獲得顯著利益的亞群。
然而，具有KRAS野生型腫瘤的CRC患者中約60%，并非所有，獲益于西妥昔單抗治療。約40%的KRAS野生型腫瘤患者不響應(yīng)西妥昔單抗治療，并且在這些患者中一個相當(dāng)大的部分早期進(jìn)展且具有短的總體生存。因此，需要鑒定和使用進(jìn)一步的生物標(biāo)記，加上KRAS突變狀態(tài)，其可以用于更好地預(yù)測CRC患者中西妥昔單抗治療的臨床結(jié)果。還需要鑒定除KRAS突變狀態(tài)外允許更好地預(yù)測西妥昔單抗在CRC治療中的功效的生物標(biāo)記。在2個西妥昔單抗CRC研究EMR 62202-502和EMR 62202-045中，執(zhí)行了新鮮冷凍的肝轉(zhuǎn)移灶活檢組織的微陣列分析，以鑒定在一般患者群體或具有KRAS野生型腫瘤的患者中，其表達(dá)與應(yīng)答、無進(jìn)展生存或總體生存相關(guān)的基因。這些基因的表達(dá)可以用作西妥昔單抗在CRC中的治療功效的預(yù)測性生物標(biāo)記，和用于更好地鑒定將在CRC中從西妥昔單抗治療中獲得最大利益的那些患者。上述基因的表達(dá)被用作生物標(biāo)記，用于預(yù)測西妥昔單抗和其他抗EGFR定向治療抗體在具有CRC的患者中的功效、和用于促進(jìn)臨床中的治療決定，即患者是否將接受西妥昔單抗或其他抗EGFR定向治療抗體。臨床實踐中的應(yīng)用是1.自福爾馬林固定的石蠟包埋的(FFPE)或新鮮的腫瘤活檢組織(后者必須直接在液氮中冷凍或用RNA-Iater處理以保存RNA完整性)分析這些基因的mRNA表達(dá)。活檢組織可以得自原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移灶。mRNA表達(dá)的分析可以通過基于PCR的方法(例如實時 PCR, qPCR)使用基因特異性引物擴(kuò)增目的基因而執(zhí)行，或通過目的基因的mRNA與基因陣列上的基因特異性的固定化雜交探針雜交而執(zhí)行。2.自FFPE或新鮮腫瘤活檢組織(后者必須直接在液氮中冷凍或用RNA-Iater處理以保存RNA完整性)分析這些基因的蛋白質(zhì)表達(dá)。活檢組織可以得自原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移灶。蛋白質(zhì)表達(dá)的分析包括方法例如免疫組織化學(xué)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、Luminex、 在膜上的蛋白質(zhì)印跡和檢測、質(zhì)譜法。對于可溶性蛋白質(zhì)自血漿或血清分析蛋白質(zhì)表達(dá)，包括方法例如ELISA、 LuminexiiIH為了建立用于臨床實踐的診斷試驗，候選基因(一種或多種)或蛋白質(zhì)(一種或多種)的表達(dá)水平需要針對另一基因或蛋白質(zhì)(或多種基因或多種蛋白質(zhì)的組合)的表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，所述另一基因或蛋白質(zhì)用相同測定法從相同活檢組織中進(jìn)行評價。這些“標(biāo)準(zhǔn)化”基因或蛋白質(zhì)可以包括已知在患者之間展示極低變異的細(xì)胞持家基因。可替代地，可以測定來自“良好預(yù)后”(或不管最終使用的術(shù)語如何(例如“敏感性”))組的基因或蛋白質(zhì) (或多種基因或多種蛋白質(zhì)的組合)的表達(dá)水平和來自“不良預(yù)后”(或例如“抗性”)組的基因或蛋白質(zhì)(或多種基因或多種蛋白質(zhì)的組合)的表達(dá)水平的比值。后面一種方法提供了優(yōu)點——僅使用與抗EGFR療法的功效直接相關(guān)的基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。這種方法導(dǎo)致高動態(tài)范圍，不依賴于適宜的持家基因或蛋白質(zhì)。在實施診斷試驗前，必須定義閾值，其是為了觸發(fā)使用相應(yīng)抗EGFR療法治療患者的正決定，必須達(dá)到的所應(yīng)用標(biāo)記(如上所述)的表達(dá)水平的比值。這個閾值應(yīng)以最佳可能方式區(qū)分從抗EGFR治療中獲益的患者和不獲益的患者。此閾值必須源自用抗EGFR療法治療的患者的腫瘤樣品的“訓(xùn)練集”。隨后閾值必須在來自足夠數(shù)目的患者的一個不同腫瘤樣品集合中進(jìn)行前瞻性驗證，以證明其能夠選出將獲得最大利益的患者或能夠排除將不
1從治療中獲益的患者。在用西妥昔單抗治療CRC患者的2個獨立的臨床研究中(EMR62202-502和EMR 62202-045)，發(fā)現(xiàn)上文和下文描述的基因的表達(dá)與應(yīng)答和/或無進(jìn)展生存和/或總體生存相關(guān)?！?EGFR基因擴(kuò)增可以預(yù)測對于抗EGFR治療的有利結(jié)果·后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)EGFR基因擴(kuò)增的較低發(fā)生率?！し椒▽W(xué)/可比較性問題· K-Ras突變“壓倒” EGFR基因擴(kuò)增在患者中的益處·皮疹迄今為止可能是Erbitux活性(mCRC，NSCLC)的最佳預(yù)測性生物標(biāo)記.Erbitux的WiIII研究FLEX:皮疹的早期發(fā)作(前21天)與延長的總體生存 (OS)相關(guān) 在5%患者中發(fā)現(xiàn)BRAF突變· BRAF和KRAS突變是相互排斥的· BRAF突變看起來是一個不良預(yù)后標(biāo)記，而非Erbitux功效的預(yù)測標(biāo)記· mCRC中的AREG和EREG表達(dá)不依賴于KRAS突變狀態(tài)·通過組合AREG和EREG表達(dá)狀態(tài)與KRAS突變狀態(tài)的額外預(yù)測力根據(jù)本發(fā)明的實驗，西妥昔單抗處理與基底角質(zhì)化細(xì)胞(basal keratinocytes) 中p-EGFR、p-MAPK和增殖的實質(zhì)性下調(diào)以及p27Kipl和p_STAT3水平的實質(zhì)性上調(diào)相關(guān)。 對于不同的施用方案和劑量水平，未注意到在這些效應(yīng)中的顯著差異。在西妥昔單抗單一治療階段中，僅在其腫瘤是KRAS野生型的患者中實現(xiàn)了應(yīng)答(8/ 與KRAS突變型腫瘤的 0/19相比；P = . 015)。與KRAS突變型腫瘤比較，無進(jìn)展生存對于KRAS野生型的患者更長 (logrank, P = . 048)。基因組學(xué)/蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定了與應(yīng)答相關(guān)的候選標(biāo)記。在西妥昔單抗單一治療的I期劑量遞增試驗中進(jìn)行的這個轉(zhuǎn)化研究 (translational study)，據(jù)我們所知，是使用藥理基因組學(xué)和藥理蛋白質(zhì)組學(xué)分析在一線背景中鑒定西妥昔單抗應(yīng)答性mCRC的預(yù)測性治療前生物標(biāo)記的首次嘗試。此臨床研究(在其他地方報道)證實西妥昔單抗可以作為第一線療法每兩周以 400-700mg/m2的劑量安全地施用于具有mCRC的患者。以此最高劑量水平未達(dá)到MTD，并且以不同劑量水平在不良事件的發(fā)生率或嚴(yán)重性或西妥昔單抗的活性上不存在顯著差異。使用皮膚測量靶影響，藥效生物標(biāo)記評估中的IHC數(shù)據(jù)顯示在所有這些劑量遞增組中EGFR途經(jīng)內(nèi)信號蛋白質(zhì)的一致抑制。這些數(shù)據(jù)提供了支持每周和每兩周給藥方案在功能上等價的生物學(xué)基礎(chǔ)。單臂和隨機(jī)化mCRC研究的回顧分析已證實，腫瘤中KRAS在密碼子12和13上的突變狀態(tài)是西妥昔單抗活性的強(qiáng)預(yù)測物，其中治療益處與野生型狀態(tài)緊密聯(lián)系4’7—13。本研究首次解決了在mCRC患者的第一線治療中KRAS突變狀態(tài)對西妥昔單抗單一治療的影響。 與來自用西妥昔單抗治療(作為單一活性劑或與化學(xué)療法組合)的先前一系列化療難治性患者的數(shù)據(jù)一致8’"’13，在研究的單一治療部分中的客觀應(yīng)答僅在具有KRAS野生型腫瘤的那些患者中觀察到( 個患者中的8個，觀％ )，在具有該基因攜帶突變的腫瘤的患者中未見到應(yīng)答(19中的0個)(P = . 015)。在具有KRAS野生型腫瘤(55% )和KRAS突變腫瘤 (32% )的患者中最佳的總體應(yīng)答率(包括在加入F0LFIRI后的應(yīng)答)與CRYSTAL和OPUS研究(其中西妥昔單抗分別與F0LFIRI和FOLFOX組合作為第一線治療4’12)中獲得的結(jié)果相當(dāng)。在本研究中，在接受與化學(xué)療法組合的西妥昔單抗作為第一線治療的具有KRAS突變腫瘤的mCRC患者中觀察到的應(yīng)答十分可能歸因于化學(xué)療法的效應(yīng)?？傮wPFS對于其腫瘤為KRAS野生型的患者明顯更長，證實KRAS腫瘤突變狀態(tài)作為與西妥昔單抗治療相關(guān)的預(yù)測性生物標(biāo)記的臨床意義。具有KRAS野生型腫瘤的一個患者亞集看起來不獲益于西妥昔單抗治療。因此可以鑒定進(jìn)一步的預(yù)測生物標(biāo)記，以便于使治療更準(zhǔn)確地針對將響應(yīng)西妥昔單抗的那些患者。近來，已初步描述了 BRAFn^P PII19J突變以及PTEN去調(diào)節(jié)19_21的負(fù)向預(yù)測價值。已推定與西妥昔單抗的臨床活性相關(guān)的其他分子標(biāo)記包括VEGF、IL8、EGFR和PTGS2 (C0X2) 的腫瘤表達(dá)水平22 ；在治療過程中VEGF的循環(huán)水平M ；PTGS2和EGFR的組成多態(tài)性 (constitutional polymorphisms)24 禾口 TP53 月中瘤突變狀態(tài) 25。對于一系列抗癌劑，高通量基因組學(xué)技術(shù)越來越多地被用于預(yù)測性生物標(biāo)記的搜索中％#。在西妥昔單抗的情況下，通過微陣列1(1’3°(未選擇的群體和具有KRAS野生型腫瘤的群體)和定量逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR31 (接受西妥昔單抗加依立替康的患者)方法，已經(jīng)證實， 在腫瘤中編碼EGFR配體AREG (雙調(diào)蛋白)和EREG (表皮調(diào)節(jié)素)的基因的高水平表達(dá)與 mCRC患者中的臨床活性相關(guān)。類似地，在本申請的一線研究中，在總?cè)后w和KRAS野生型腫瘤亞組中，AREG和EREG表達(dá)看起來在無疾病進(jìn)展的患者的腫瘤中是升高的。相比之下， TGFa (編碼TGF-α)在無疾病進(jìn)展的患者中顯示更低水平的表達(dá)。KRAS野生型腫瘤的此全面基因表達(dá)分析鑒定到推定與在第6周時的疾病控制相關(guān)的57種基因(P < . 002)。在這些候選物中，發(fā)現(xiàn) 6 種基因(TNFRSF1B、DNAJC8、ECSIT、G0SR2、PPP1R9A 和 KLK6)具有< 0. 1 假發(fā)現(xiàn)率。用于改善KRAS野生型mCRC中西妥昔單抗功效預(yù)測的這些推定生物標(biāo)記的價值需要進(jìn)一步研究。血漿蛋白質(zhì)的Luminex分析揭示，在西妥昔單抗單一療法的治療過程中雙調(diào)蛋白和TGF-α水平的強(qiáng)增加，對于EGF也觀察到了此趨勢。這些EGFR配體的上調(diào)可能是對于 EGFR抑制的補(bǔ)償反應(yīng)。有趣的是，雙調(diào)蛋白水平的增加在響應(yīng)西妥昔單抗治療的患者中明顯更低。在應(yīng)答者中在西妥昔單抗單一治療下觀察到癌胚抗原和癌抗原125和19-9的明顯降低。還值得注意的是，IL-8水平的降低與所有腫瘤以及KRAS野生型腫瘤中的應(yīng)答明顯相關(guān)。IL-8是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和生存且對腫瘤微環(huán)境具有深遠(yuǎn)作用的促炎細(xì)胞因子32。 IL-8看起來是西妥昔單抗功效的預(yù)測生物標(biāo)記。此外，根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)EGFR和VAV3在HEK 293細(xì)胞中表達(dá)時，可以檢測到EGFR和 VAV3的直接相互作用。這說明VAV3在EGFR信號中的直接和顯著作用以及在觀察到的高 VAV3表達(dá)水平和西妥昔單抗的抗EGFR治療活性的調(diào)節(jié)之間的直接聯(lián)系。本發(fā)明首次證實，在第一線情況中用抗EGFR抗體優(yōu)選西妥昔單抗(每兩周和每周施用)作為單一活性劑進(jìn)行治療，將有益于具有KRAS野生型腫瘤的mCRC患者。此外，在此早期研究中的全面基因表達(dá)分析已產(chǎn)生了與某些基因的表達(dá)和西妥昔單抗的臨床活性相關(guān)的許多有意義的結(jié)果。這些觀察促使可以使用不同方法學(xué)在更大的患者系列上進(jìn)行驗證。這些研究的結(jié)果，為優(yōu)化在患有不同癌癥特別是CRC或mCRC的患者中用西妥昔單抗或具有類似活性的抗EGFR抗體進(jìn)行的治療，提供了合理的基礎(chǔ)。EGFR途徑組分的免疫組織化學(xué)分析
從多達(dá)35個患者中獲得可評估的配對基線/第4周皮膚活檢組織，以分析所評價的標(biāo)記的藥效學(xué)改變。與基線樣品比較，在第4周中觀察到p-EGFR、p-MAPK和增殖的實質(zhì)性下調(diào)(如通過Ki67染色評價的)。平行地，觀察到p27Kipl和P-STAT3的實質(zhì)性上調(diào)。在不同的施用方案和劑量水平的分析中，對于基線到治療中時間點，患者組間在這些標(biāo)記的水平的改變上不存在相關(guān)差異(圖21A)。從高達(dá)17個患者中獲得可評估的配對基線/第4周腫瘤活檢組織。在治療后在腫瘤細(xì)胞中觀察到增殖的減少以及P-EGFR和p-MAPK的顯著下調(diào)(圖21B)。然而，p27KiP1、 P-STAT3和ρ-ΑΚΤ水平通過西妥昔單抗治療未發(fā)生顯著改變(數(shù)據(jù)未顯示)。此小數(shù)目的可得配對腫瘤活檢組織不允許將劑量組和應(yīng)答變量與生物標(biāo)記水平的改變進(jìn)行比較。KRAS突變分析KRAS密碼子12或13突變在19/48 (40%)患者樣品中檢測到(G12V，9個患者； G13D，5個患者；G12D，4個患者；G12A，1個患者)。在西妥昔單抗單一治療階段中，在此48個患者中存在8個部分應(yīng)答O3Rs)。所有均在其腫瘤為KRAS野生型的患者中(8/29 ；28%). 在其腫瘤攜帶KRAS突變的19個患者中未報道應(yīng)答(P = . 015)(表1)。在總體研究(單一治療和聯(lián)合治療階段)中，應(yīng)答在具有KRAS野生型的16/29(55%)患者和具有KRAS突變型腫瘤的6/19(32%)患者中見到(P = .144)。與其腫瘤攜帶突變的那些患者比較，PFS在其腫瘤為KRAS野生型的患者中明顯更長(圖22 ；中值9. 4對5. 6個月，風(fēng)險比0. 47 ；Iogrank P = .048)。基因表達(dá)的微陣列分析來自基線和第4周時間點的總共106個腫瘤來源樣品與Affymetrix GeneChip HG-U133Plus 2. 0陣列雜交。基于一般的質(zhì)量控制參數(shù)，4個陣列從進(jìn)一步分析中排除，并且由于正常肝組織污染的存在，M個樣品被排除(圖16 ；補(bǔ)充材料)并且未進(jìn)一步分析。 在此成對排除后，來自42個ITT患者(36個基線，沈個第4周20對)的62個陣列數(shù)據(jù)集保留用于分析。對于分析的腫瘤樣品，基于變異性、信號強(qiáng)度和探針組注釋(參見補(bǔ)充方法)，預(yù)過濾來自54，675個探針組的數(shù)據(jù)。此方法使腫瘤表達(dá)分析局限于15，230個探針組，代表 10，538個基因。根據(jù)應(yīng)答進(jìn)展性疾病(PD ；η = 12)相對于在第6周時的疾病控制(n = 23 ； 1個患者不可評估)，以及針對最佳總體應(yīng)答PD和穩(wěn)定疾病(SD) (n = 19)相對于I3R (η =14 ;3個患者不可評估)，全局比較基線預(yù)過濾后的數(shù)據(jù)，在此全局比較中，P值的分布 (數(shù)據(jù)未顯示)基本上與偶然預(yù)期的一樣，提示對于全體群體未鑒定到預(yù)測應(yīng)答的基因表達(dá)譜。然而，使分析局限于KRAS野生型腫瘤(具有PD的8個患者相對于具有疾病控制的11 個患者)，鑒定到57個探針組，其表達(dá)模式推定與在第6周時的疾病控制相關(guān)(P < . 002 ； 圖23)。利用0. 1的假發(fā)現(xiàn)率(FDR)閾值(關(guān)于FDR定義，參見補(bǔ)充方法部分)，發(fā)現(xiàn)6種基因與疾病控制顯著相關(guān)(TNFRSF1B, P = 6. 90Ε-07 ；DNAJC8, P=L 60Ε-06 ；ECSIT, P = 6. 80Ε-06 ；G0SR2, P = 3. 90Ε-05，在顯示疾病控制的患者中具有更高表達(dá)；以及PPP1R9A，P =8. 90Ε-07和KLK6，P = 3. 00Ε-05，在具有PD的患者中具有更高表達(dá))。使用從具有來自基線和第4周時間點的可用樣品的患者得到的數(shù)據(jù)，檢查與應(yīng)答相關(guān)的治療中改變。與PD(n = 8)比較，未鑒定到看起來與在第6周時的疾病控制(η = 12)緊密相關(guān)的表達(dá)改變?？紤]與化學(xué)療法的組合，PR(n = 7)相對于SD/PD(n = 13)在表達(dá)譜上的比較揭示了 47個探針組顯示出在治療中改變上的差異(P < . 002，調(diào)節(jié)性t檢驗， 參見圖17)。在具有KRAS野生型腫瘤的患者中，以及在所分析患者的全集中，基線EREG(表皮調(diào)節(jié)素)和AREG(雙調(diào)蛋白)表達(dá)水平在響應(yīng)西妥昔單抗的那些腫瘤中更高(圖對；圖 18)。這些發(fā)現(xiàn)與Khambata-Ford等人報道的結(jié)果一致10。有趣的是，TGFA (TGF-α )表現(xiàn)出了相反表達(dá)模式(圖M ；圖18)。在已知直接或間接參與EGFR信號傳導(dǎo)的其他基因中， 例如ERBB受體以及配體ERBB3 (HER3)和ERBB2 (HER2)顯示出在具有I3R作為最佳總體應(yīng)答的腫瘤中更強(qiáng)下調(diào)的趨勢(圖19)。血漿蛋白質(zhì)組學(xué)使用Luminex技術(shù)在血漿樣品中分析了 97種不同蛋白質(zhì)的濃度。該組蛋白質(zhì)包括 EGFR配體、其他生長因子、白細(xì)胞介素和各種其他候選蛋白質(zhì)。在西妥昔單抗單一治療階段中，在基線和第4周之間白細(xì)胞介素(IL)-8、巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP)-Ia以及腫瘤標(biāo)記癌胚抗原、癌抗原125和19-9的血漿水平降低與在第6周時的應(yīng)答顯著地相關(guān)(P < . 01) (圖25A)。雙調(diào)蛋白血漿濃度的一般性強(qiáng)增加在對于西妥昔單抗單一治療具有部分應(yīng)答的患者中顯著更弱(P < . 01)(圖25A)。當(dāng)分析局限于具有KRAS野生型腫瘤的患者時，也在癌胚抗原、癌抗原19-9、IL-8和雙調(diào)蛋白上發(fā)現(xiàn)了與在第6周時的應(yīng)答的相關(guān)性(來自M 個患者的數(shù)據(jù)，圖25B)。此外，在西妥昔單抗單一治療治療的前4周過程中在血漿中觀察到 TGF- α和EGF水平的一般性增加(不依賴于應(yīng)答)和可溶性EGFR的降低。在所研究的基因和候選物(顯示出表達(dá)水平和接受西妥昔單抗的轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌(mCRC)患者中的治療成功性相關(guān))中，VAV3是特別有意義的。在研究EMR 62202-502 中，高腫瘤VAV3mRNA表達(dá)水平不僅與對西妥昔單抗與依立替康的組合的更佳應(yīng)答強(qiáng)相關(guān) (圖26)，還與無進(jìn)展生存(PFS)(圖27)和總體生存(OS)(圖28)強(qiáng)相關(guān)。此外，發(fā)現(xiàn)高腫瘤VAV3表達(dá)水平與具有KRAS野生型腫瘤的患者中的應(yīng)答和延長的PFS尤其相關(guān)(參見圖 1和圖29)。因此，VAV3表達(dá)看起來是用于在具有KRAS野生型腫瘤的患者中預(yù)測西妥昔單抗療法在CRC中的臨床結(jié)果的良好生物標(biāo)記候選物，其將幫助進(jìn)一步優(yōu)化對如下患者的選擇，所述患者將從西妥昔單抗治療中獲得最大利益。有趣的是，當(dāng)EGFR和VAV3在HEK 293細(xì)胞中表達(dá)時，可以檢測到EGFR和VAV3的直接相互作用(圖30)。這提示VAV3在EGFR信號傳導(dǎo)中的直接作用、以及VAV3表達(dá)水平和抗EGFR治療的活性變化之間的直接聯(lián)系。
實施例臨床研究EMR 62202-502 該隨機(jī)化研究在具有EGFR表達(dá)性mCRC (包括依立替康的治療失敗)的患者(Pts)中調(diào)查西妥昔單抗的劑量遞增?；颊咴陂_始西妥昔單抗G00mg/m2初始劑量，隨后250mg/m2/周[w])和I (180mg/m2q 2w)后22天，如果他們未經(jīng)歷> 1度(G)皮膚反應(yīng)、任何其他> G2西妥昔單抗相關(guān)不良事件并且對于I耐受，則進(jìn)行隨機(jī)化分組。隨機(jī)化分入標(biāo)準(zhǔn)西妥昔單抗劑量組(A組；250mg/m2/w)或劑量遞增組(B組；西妥昔單抗劑量以50mg/m2q 2w增加，直至> G2毒性、腫瘤應(yīng)答或劑量=500mg/m2)。未隨機(jī)化的患者(C 組)繼續(xù)用標(biāo)準(zhǔn)西妥昔單抗劑量。主要終點是在治療前和治療過程中采集的皮膚和腫瘤
19活檢組織中，與標(biāo)準(zhǔn)西妥昔單抗方案比較劑量遞增對EGFR和下游信號標(biāo)記的影響。次要終點是PK、功效、安全性、耐受性、在腫瘤活檢組織和血漿樣品上的生物標(biāo)記分析。從腫瘤活檢組織分析KRAS突變狀態(tài)。EMR 62202-045 此研究調(diào)查在具有轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌的患者中西妥昔單抗的每兩周施用的安全性和藥物代謝動力學(xué)。第二目的包括藥效學(xué)生物標(biāo)記分析?；颊呓邮芪魍孜魡慰箚我恢委?周，隨后為西妥昔單抗加F0LFIRI直至疾病進(jìn)展?；颊咴趯φ战M中以 400mg/m2初始劑量隨后250mg/m2/周接受西妥昔單抗，在劑量遞增組中以400-700mg/m2， 每兩周，接受西妥昔單抗。從腫瘤活檢組織分析KRAS突變狀態(tài)。用于基因表汰(微陣列)分析的腫瘤材料EMR 62202-502 在基線時(治療前)、在第22天時、以及可能的話在劑量遞增組 (B組)中在患者的疾病進(jìn)展時，通過開放手術(shù)、內(nèi)窺鏡術(shù)或Core針/細(xì)針活檢，獲得腫瘤材料。樣品在液氮中進(jìn)行速凍。EMR 62202-045 在基線時、在第4周時、以及可能的話在疾病進(jìn)展時，通過開放手術(shù)、內(nèi)窺鏡術(shù)或Core針/細(xì)針活檢，獲得腫瘤材料。樣品在液氮中進(jìn)行速凍。RNA表汰譜分析在補(bǔ)充方法部分中詳述了與微陣列分析有關(guān)的實驗程序。簡言之，速凍的腫瘤活檢組織進(jìn)行勻漿化，并且使用RNeasy Micro KW Oliagen，Hilden)提取總RNA。根據(jù) Affymetrix Two-Cycle Eukaryotic Target標(biāo)記方案，從所有樣品中制備用于陣列雜交實驗的生物素化的靶cRNAs。對于分析的每一腫瘤，在此cRNA擴(kuò)增/標(biāo)記法的第一 cDNA合成反應(yīng)中包括了起始50ng總RNA。標(biāo)記的cRNA隨后與Affymetrix GeneChip HG_U133Plus 2. 0基因表達(dá)陣列在45°C以60rpm雜交16小時。在雜交后，在Affymetrix Fluidics Station 450上染色陣列，并且使用GeneChip Manner定量信號。使用Affymetrix GCOS 專利軟件和Bioconductor包，affyPLM，執(zhí)行原始表達(dá)數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制和預(yù)處理。EMR 62202-502 在已執(zhí)行所有質(zhì)量控制檢查和預(yù)處理步驟后，來自意向治療 (ITT)群體的47個受試者的總共68個陣列數(shù)據(jù)集對于進(jìn)一步分析是合格的。基線樣品從 35個受試者獲得。EMR 62202-045 在已執(zhí)行所有質(zhì)量控制檢查和預(yù)處理步驟后，來自42個ITT患者的總共62個陣列數(shù)據(jù)集對于進(jìn)一步分析是合格的?；€樣品從36個受試者獲得。對于在2個研究的至少一個中基于變異性和信號強(qiáng)度通過了初始過濾的具有可靠基因注釋的所有Affymetrix探針組(代表10785種基因的16414個Affymetrix探針組)，進(jìn)行了統(tǒng)計分析。在應(yīng)答者和非應(yīng)答者之間(EMR 62202-502)比較，或在西妥昔單抗單一治療6周后具有疾病控制的患者與具有進(jìn)展性疾病的患者之間(EMR62202-045)比較，用Welch t檢驗鑒定了其表達(dá)與臨床應(yīng)答相關(guān)的基因。使用Cox比例風(fēng)險回歸，鑒定了其表達(dá)與無進(jìn)展生存或總體生存相關(guān)的基因(EMR 62202-502)。針對患者全集以及僅針對具有KRAS野生型腫瘤的患者，執(zhí)行了這些分析。使用單研究單側(cè)ρ值的乘積作為檢驗統(tǒng)計量和來自這些乘積的零分布(null distribution)的衍生ρ值，進(jìn)行了跨此2個研究的元分析(meta-analysis)以鑒定應(yīng)答相
關(guān)基因。
在低于0. 01和0. 0001的范圍中的P值，特別是低于0. 01，優(yōu)選0. 005、更優(yōu)選 0. 002、最優(yōu)選0. 0005或0. 0001 (來自與臨床應(yīng)答的相關(guān)性的元分析，和來自與無進(jìn)展生存和總體生存的相關(guān)性的EMR 62202-502分析)，視為統(tǒng)計上顯著的。對于代表179種已知基因的200個Affymetrix探針組，在至少一個比較中滿足了這個標(biāo)準(zhǔn)?；颊吆细裥院脱芯吭O(shè)計在分開的手稿中已全面地報道了合格性標(biāo)準(zhǔn)和研究設(shè)計。簡言之，研究分成2個部分；持續(xù)6周的西妥昔單抗單一治療階段和聯(lián)合治療階段，在聯(lián)合治療階段中患者接受與單一治療階段相同劑量/方案的西妥昔單抗和方案基于依立替康的F0LHRI?；颊唔槾伪环值綐?biāo)準(zhǔn)每周方案和劑量的西妥昔單抗組GOOmg/m2，隨后為250mg/m2的每周劑量)，或每兩周方案的西妥昔單抗劑量遞增組(具有從400到700mg/m2的不同群組)。在西妥昔單抗單一治療6周后，作為最佳總體應(yīng)答(單一治療和聯(lián)合治療階段)，報道了臨床應(yīng)答?；颊卟牧系氖占唾A存在基線時和在第沈-觀天(第4周)時獲得皮膚活檢組織。如果出現(xiàn)皮疹，那么從無疹區(qū)域中獲得樣品。將活檢組織立即浸入20倍其體積的中性緩沖甲醛溶液內(nèi)， 并且在室溫保持8-16小時。使用梯度乙醇系列使固定的樣品脫水至二甲苯，并且在真空下在60°C縱向包埋到石蠟中。在基線時、在第4周時和可能的話在疾病進(jìn)展時，通過開放手術(shù)、內(nèi)窺鏡術(shù)或Core針/細(xì)針活檢，獲得腫瘤材料。如先前所述13a，1個樣品/時間點進(jìn)行甲醛固定和石蠟包埋，3個樣品在液氮中速凍。為了提供正常DNA，在基線時從每個患者中獲得IOml全血，并且貯存于-20°C或更低直至使用。對于Luminex分析，在基線和第4周時收集血漿(2. 5ml)，并且貯存于-80°C。免疫組織化學(xué)甲醛固定石蠟包埋的(FFPE)組織的免疫組織化學(xué)(IHC)分析用于研究下述蛋白質(zhì)的表達(dá)EGFR、磷酸(ρ) -EGFR、p-MAPK、Ki67 (MIBl)、p27KiP1 (CDKNlB)和 p_STAT3 (皮膚和腫瘤活檢組織)；HER2、p-HER2和p-AKT(腫瘤活檢組織)。如先前描述的執(zhí)行免疫組織化學(xué)分析。13a使用的抗體和方法的細(xì)節(jié)在補(bǔ)充方法部分中提供。KRAS突變分析FFPE患者來源的存檔腫瘤組織從意向治療(ITT)群體的48個患者中獲得。提取DNA且就KRAS密碼子12和13突變的存在進(jìn)行篩選，其中使用由Chen等人， 200414(LightMix, k-ras Glyl2, TIB MOLB10L, Berlin，德國)改良的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 發(fā)夾和熔解曲線技術(shù)(PCRclamping and melting curve，如先前描述的12)。RNA表達(dá)譜分析在補(bǔ)充方法部分中詳述了與微陣列分析有關(guān)的實驗程序。簡言之，速凍的腫瘤活檢組織進(jìn)行勻漿化，并且使用RNeasy Micro KW Oliagen，Hilden)提取總RNA。根據(jù) Affymetrix Two-Cycle Eukaryotic Target標(biāo)記方案，從所有樣品中制備用于陣列雜交實驗的生物素化的靶cRNAs。對于分析的每一腫瘤，在此cRNA擴(kuò)增/標(biāo)記過程的第一 eDNA合成反應(yīng)中包括了起始50ng總RNA。標(biāo)記的cRNA隨后與Affymetrix GeneChip HG_U133Plus 2. 0基因表達(dá)陣列在45°C以60rpm雜交16小時。在雜交后，在Affymetrix Fluidics Station 450上染色陣列，并且使用GeneChip Manner定量信號。使用Affymetrix GCOS 專利軟件和Bioconductor包affyPLM，執(zhí)行原始表達(dá)數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制。15如果從樣品個體獲得重復(fù)陣列，那么選擇具有最佳質(zhì)量控制評價的數(shù)據(jù)集用于分析。使用GCRMA算法執(zhí)行原始探針?biāo)綇?qiáng)度數(shù)據(jù)的預(yù)處理。w蛋白質(zhì)組學(xué)分析^fc Rules-Based Medicine (Austin, Texas, US)，Luminex χΜΑΡ ^^^ 臺(如補(bǔ)充方法部分中所述)，對來自血漿的97種蛋白質(zhì)(HumanMAP版本1.6加雙調(diào)蛋白、β-cellulin、EGFR、肝素結(jié)合(HB)-EGF、表皮調(diào)節(jié)素、白細(xì)胞介素-18、轉(zhuǎn)化生長因子 (TGF)-a和血小板反應(yīng)蛋白-1)的多重分析。在來自隨后入選試驗的患者的23個樣品中僅評價了 β -eelIulin、EGFR 和 HB-EGF。統(tǒng)計學(xué)分析對于腫瘤是KRAS野生型或突變型的患者，分別使用Fisher確切檢驗和Iogrank 檢驗，比較了應(yīng)答率和無進(jìn)展生存(PFQ——定義為從西妥昔單抗的第一次輸注直到在西妥昔單抗和F0LFIRI組合下首次放射學(xué)證實疾病進(jìn)展的持續(xù)時間。使用Bioconductor軟件15和SAS版本9. 1執(zhí)行IHC、微陣列和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的所有統(tǒng)計分析(參見補(bǔ)充方法)。這些探索性分析被認(rèn)為生成假設(shè)。參考文獻(xiàn)(相關(guān)的和/或在本說明書中使用的)1. 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權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)測患有KRAS野生型EGFR表達(dá)腫瘤的患者作為EGFR抗體治療的候選者將響應(yīng)以所述抗EGFR抗體進(jìn)行的治療的可能性的體外方法，所述方法包括在得自所述患者的組織樣品中，通過對來自所述患者的腫瘤組織的核酸樣品施用PCR或RNA或DNA陣列或相當(dāng)?shù)脑\斷工具或裝置，測定一種或多種預(yù)后基因或其基因表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平，其中(i)與參考值比較，選自下組基因的基因或基因產(chǎn)物的高表達(dá)指示所述患者可能響應(yīng)所述治療ADAMDEC1,BSDCl,Clorf144,CAPZB，CDC42,DHCR7，DNAJC8，ECSIT，EXOSC10,FADS1,GBA, GLT25D1, G0SR2, IMPDHl，KLHL21, KPNA6, KPNB1，LSMl2，MANlBl, MIDN, PPAN, SH3BP2, SQLE， SSH3, TNFRSF1B, URMl, ZFYVE26, RGMB, SPIRE2, ABCC5, ACSL5, AOAH, AXIN2, CD24, CEACAM5, CEACAM6, ETS2, FMNL2, GPSM2, HDAC2, JUN, ME3, MED17, MYB, MYC, NEBL, NOSIP, PITX2, P0F1B, PPARG, PPP1R14C, PRRl5, PSMGl，RAB15，RAB40B, RNF43, RPS23, SLC44A3, S0X4, THEM2, VAV3, ZNF337, EPDRl, KCNK5, KHDRBS3, PGM2L1, STK38，和 SHR00M2，禾口( )與參考值比較，選自下組基因的基因或基因產(chǎn)物的高表達(dá)指示所述患者可能不響應(yīng)所述治療C7orf46, CAST, DCP2, DIP2B, ERAPl， INSIG2, KIF21A, KLK6, NGRN, NRIPl， PHGDH, PPP1R9A, QPCT, RABEP1, RPAl，RPL22L1, SKPl，SLC25A27, SLC25A46, S0CS6, TPD52, ZDHHC2, ZNF654，ASB6，ATM，BMI1，CDC42EP2，EDEM3，PLLP，RALBP1，SLC4A11，TNFSF15，TPK1，C11orf9， C1QC, CABLES 1, CDK6, EHBPl，EX0C6, EXTl，F(xiàn)LRT3, GCNT2, MTHFS, PIK3AP1, ST3GAL1, TK2, ZDHHC14, ARFGAP3, AXUD1, CAPZB, CHSYl，DNAJB9，GOLTIB, HSPA5, LEPR0TL1, LIMSl, MAPK6, MY06, PROSC, RAB8B, RAP2B, RWDD2B, SERTAD2, S0CS5, TERF2IP, TIALl， TIPARP, TRIM8, TSC22D2, TGFA, VAPAjP UBE2K。
2.權(quán)利要求1的方法，其中用所述抗EGFR抗體的治療為一線治療，并且選自(i)基因組的基因或基因表達(dá)產(chǎn)物是 ADAMDEC1、BSDCl、Clorfl44、CAPZB, CDC42、DHCR7、DNAJC8、 ECSIT、EX0SC10、FADS1、GBA、GLT25D1、G0SR2、IMPDH1、KLHL21、KPNA6、KPNB1、LSM12、MAN1B1、 MIDN、PPAN、SH;3BP2、SQLE、SSH3、TNFRSF1B、URMl、VAV3 和 ZFYVE^ 中的一種或多種，選自組 (ii)的是 C7orf46、CAST、DCP2、DIP2B、ERAPU INSIG2、KIF21A、KLK6、NGRN、NRIPU PHGDH, PPP1R9A、QPCT, RABEPU RPAl，RPL22L1、SKPl、SLC25A27、SLC25A46、S0CS6、TPD52、TGFA, ZDHHC2和ZNF654中的一種或多種。
3.權(quán)利要求1的方法，其中用所述抗EGFR抗體的治療是在所述患者已發(fā)展了化療難治性腫瘤后與化學(xué)治療劑的聯(lián)合治療，并且選自組(i)的基因或基因表達(dá)產(chǎn)物是RGMB、 SPIRE2、ABCC5、ACSL5、AOAH、AXIN2、CD24、CEACAM5、CEACAM6、ETS2、FMNL2、GPSM2、HDAC2、 JUN、ME3、MED17、MYB、MYC、NEBL, NOSIP、PITX2、P0F1B、PPARG, PPP1R14C、PRRl5, PSMGl、 RAB15、RAB40B、RNF43、RPS23、SLC44A3、S0X4、THEM2，VAV3、ZNF337、EPDRl、KCNK5、KHDRBS3、 PGM2L1、STK38 和 SHR00M2 中的一種或多種，選自組(ii)的是 ASB6、ATM、BMI1、CDC42EP2、 EDEM3、PLLP、RALBP1、SLC4A11、TNFSF15、TPK1、C11orf9、C1QC、CABLES1、CDK6、EHBP1、EX0C6、 EXT1、FLRT3、GCNT2、MTHFS、PIK3AP1、ST3GAL1、TK2、ZDHHC14、ARFGAP3、AXUD1、CAPZB、CHSY1、 DNAJB9、G0LT1B、HSPA5、LEPR0TL1、LIMSl、MAPK6、MY06、PROSC、RAB8B、RAP2B、RWDD2B、 SERTAD2、S0CS5、TERF2IP、TIALl、TIPARP、TRIM8、TSC22D2、TGFA、VAPA 和 UBE2K 中的一種或多種。
4.權(quán)利要求3的方法，其中臨床應(yīng)答是總體生存時間(0S)，并且選自組(i)的基因或基因表達(dá)產(chǎn)物是 EPDRl、KCNK5、KHDRBS3、PGM2L1、SHR00M2、STK38 和 VAV3 中的一種或多種， 選自組(ii)的是 ASB6、ATM、BMIU CDC42EP2、EDEM3、PLLP, RALBPU SLC4A11、TNFSF15 禾口 TPKl中的一種或多種。
5.權(quán)利要求3的方法，其中臨床應(yīng)答是無進(jìn)展生存時間(PFS)，并且選自組⑴的基因或基因表達(dá)產(chǎn)物是 ACSL5、A0AH、AXIN2、CD24、CEACAM5、CEACAM6、ETS2、FMNL2、GPSM2、HDAC2、 JUN、ME3、MED17、MYB、MYC、NEBL, NOSIP、PITX2、P0F1B、PPARG, PPP1R14C、PRRl5, PSMGl、 RAB15、RAB40B、RNF43、RPS23、SLC44A3、S0X4、THEM2, VAV3 和 ZNF337 中的一種或多種，選自組(i i)的是 C11 orf9、C1QC、CABLES 1、CDK6、EHBP1、EX0C6、EXT1、FLRT3、GCNT2、MTHFS1、 PIK3AP1、ST3GAL1、TK2 和 ZDHHC14 中的一種或多種。
6.權(quán)利要求3的方法，其中臨床總體應(yīng)答(OR)按照部分應(yīng)答相對于穩(wěn)定或進(jìn)展性疾病進(jìn)行測量，并且選自組(i)的基因或基因表達(dá)產(chǎn)物是VAV3、RGMB和SPIRE2中的一種或多種，選自組(ii)的是 ARFGAP3、AXUD1、CAPZB、CHSY1、DNAJB9、GOLTIB、HSPA5、LEPR0TLU LIMS1、MAPK6、MY06、PROSC、RAB8B、RAP2B、RWDD2B、SERTAD2、S0CS5、TERF2IP、TIALUTIPARP、 TRIM8、TSC22D2、TGFA, VAPA 和 UBE2K 中的一種或多種。
7.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中參考值通過得自參考患者或參考患者組的特定功能或臨床特性、和/或特定表達(dá)譜中的一種或多種進(jìn)行定義。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述參考值得自不表達(dá)或幾乎不表達(dá)所述基因或基因產(chǎn)物的參考患者或患者組。
9.權(quán)利要求1-8中任一項的方法，其中參考值是對照基因的表達(dá)閾值或選自組(i)的基因的基因表達(dá)與選自組(ii)的基因的基因表達(dá)的比值，或參考值是由待測定的特定臨床應(yīng)答參數(shù)或由特定處理前或處理條件定義的表達(dá)閾值。
10.權(quán)利要求9的方法，其中臨床應(yīng)答參數(shù)是無進(jìn)展生存時間(PFS)、總體生存時間 (OS)、部分應(yīng)答(PR)、穩(wěn)定疾病(SD)、進(jìn)展性疾病(PD)或其組合。
11.權(quán)利要求1-10中任一項的方法，其中在用所述抗EGFR抗體治療前自所述患者獲得組織樣品。
12.權(quán)利要求11的方法，其中還在用所述抗EGFR抗體治療時從所述患者獲得組織樣
13.權(quán)利要求12的方法，其中將治療中獲得的所述基因或基因表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平與在所述患者開始治療前獲得的值比較。
14.權(quán)利要求1-13中任一項的方法，其中患者樣品源自腫瘤組織。
15.權(quán)利要求1-13中任一項的方法，其中患者樣品源自血漿。
16.權(quán)利要求1-15中任一項的方法，其中測定由所述基因編碼的表達(dá)蛋白質(zhì)的水平。
17.一種用于預(yù)測患有KRAS野生型EGFR表達(dá)癌癥的患者將在治療上響應(yīng)以抗EGFR抗體進(jìn)行的治療的可能性的體外方法，所述方法包括(a)通過診斷工具和/或診斷裝置在來自所述患者的腫瘤組織或血漿的活檢組織樣品中測量選自組⑴和/或選自組(ii)的一種或多種生物標(biāo)記的表達(dá)水平，其中組(i)由ADAMDEC1、BSDCl、Clorf 144、CAPZB, CDC42、 DHCR7、DNAJC8、ECSIT、EXOSC10、FADS1、GBA、GLT25D1、G0SR2、IMPDHl、KLHL21、KPNA6、KPNB1、 LSMl2, MANlBl、MIDN、PPAN、SH3BP2、SQLE, SSH3、TNFRSF1B、URMl、ZFYVE26、RGMB, SPIRE2、ABCC5、ACSL5、AOAH、AXIN2、CD24、CEACAM5、CEACAM6、ETS2、FMNL2、GPSM2、HDAC2、JUN、ME3、 MED17、MYB、MYC、NEBL，N0SIP、PITX2、P0F1B、PPARG、PPP1R14C、PRR15、PSMG1、RAB15、RAB40B、 RNF43、RPS23、SLC44A3、S0X4、THEM2、VAV3、ZNF337、EPDRl、KCNK5、KHDRBS3、PGM2L1、STK38、 SHR00M2 組成，且組(ii)由 C7orf46、CAST、DCP2、DIP2B、ERAPl、INSIG2、KIF21A、KLK6、NGRN、 NRIPl、PHGDH、PPP1R9A、QPCT, RABEPU RPAl，RPL22L1、SKPl、SLC25A27、SLC25A46、S0CS6、 TPD52、ZDHHC2、ZNF654、ASB6、ATM、BMI1、CDC42EP2、EDEM3、PLLP、RALBP1、SLC4A11、TNFSF15、 TPKl、Cllorf9、C1QC、CABLES 1、CDK6、EHBP1、EX0C6、EXTl、FLRT3、GCNT2、MTHFS、PIK3AP1、 ST3GAL1、TK2、ZDHHC14、ARFGAP3、AXUD1、CAPZB、CHSY1、DNAJB9、GOLTIB、HSPA5、LEPR0TL1、 LIMS1、MAPK6、MY06、PROSC、RAB8B、RAP2B、RWDD2B、SERTAD2、S0CS5、TERF2 IP、TIALU TIPARP、 TRIM8、TSC22D2、TGFA, VAPA和UBEI組成，(b)使來自所述患者的腫瘤或血漿的組織樣品離體暴露于所述抗EGFR抗體，(c)在步驟(b)的所述暴露的組織樣品中再次測量步驟(a) 中所述的一種或多種生物標(biāo)記的表達(dá)水平，和(d)計算在步驟(b)和(c)中測量的表達(dá)水平的差異，其中與步驟(a)比較，在步驟(c)中獲得的組⑴的生物標(biāo)記的表達(dá)水平增加指示所述患者在治療上響應(yīng)用所述抗EGFR抗體的治療的可能性增加，并且其中與步驟(a)比較， 在步驟(c)中獲得的組(ii)的生物標(biāo)記的表達(dá)水平增加指示所述患者在治療上響應(yīng)用所述抗EGFR抗體的治療的可能性減少。
18.權(quán)利要求1-17中任一項的方法，其中所述基因或基因表達(dá)產(chǎn)物選自TNFRSF1B、 DNAJC8、ECSIT、G0SR2、PPP1R9A、VAV3 和 KLK6。
19.權(quán)利要求1-17中任一項的方法，其中來自組(i)的基因或基因表達(dá)產(chǎn)物之一是 TGFa0
20.權(quán)利要求19的方法，其中測定VAV3和TGi^i的表達(dá)水平。
21.權(quán)利要求1-17中任一項的方法，其中來自組(ii)的基因或基因表達(dá)產(chǎn)物之一是 AREG 或 EREG。
22.權(quán)利要求19-21中任一項的方法，其中測定TGFaJPAREG或EREG、及任選地VAV3 和/或EGF的表達(dá)水平。
23.權(quán)利要求1-22中任一項的方法，其中患有KRAS野生型EGFR表達(dá)腫瘤的所述患者還在腫瘤組織中具有EGFR突變。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述EGFR突變是R521K多態(tài)性。
25.權(quán)利要求I-M中任一項的方法，其中所述抗EGFR抗體是c225(西妥昔單抗)。
26.權(quán)利要求25的方法，其中患者患有的腫瘤是結(jié)腸直腸癌(CRC)或轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌(mCRC)。
27.權(quán)利要求沈的方法，其中另外還測定AREG和/或EREG或其表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平， 并且與組⑴和/或組(ii)的基因或基因表達(dá)產(chǎn)物中的一種或多種比較。
28.權(quán)利要求27的方法，其中測定AREG和/或EREG和至少TGFA和/或VAV3和/或 EGF或其基因表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平。
29.DNA或RNA陣列，其包含固定在固體表面上由下述基因呈現(xiàn)的或與下述基因雜交的多核苷酸的排列TNFRSF1B、DNAJC8、ECSIT、G0SR2、PPP1R9A、KLK6、C7orf46、SSH3。
30.權(quán)利要求四的基因陣列，其進(jìn)一步包含由下述基因呈現(xiàn)的或與下述基因雜交的多核苷酸的排列SERTAD2、AXIN2、C10orf99、ETS2、PITX2、PRR15、VAV3、編碼 IKK 相互作用蛋白質(zhì)的基因、EDEM3、LY6G6D。
31.權(quán)利要求四或30的基因陣列，其還包含與基因AREG和/或EREG和/或TGFA雜交的多核苷酸。
32.由多核苷酸的排列組成的DNA或RNA陣列，所述多核苷酸由下述基因呈現(xiàn)或與下述基因雜交TNFRSFIB、DNAJC8、ECSIT、G0SR2、PPP1R9A、KLK6、C7orf46、SSH3、SERTAD2、AXIN2、 C10orf99、ETS2、PITX2、PRRl5, VAV3、編碼 IKK 相互作用蛋白質(zhì)的基因、EDEM3、LY6G6D、 AREG、EREG 禾口 TGFA0
33.包含固定在固體表面上的多核苷酸的排列的DNA或RNA陣列，其中由基因呈現(xiàn)或與所述基因雜交的所述多核苷酸排列在陣列上，其中所述多核苷酸的排列選自(a)ADAMEC1，C7orf46，CAST,DHCR7，ERAPl，F(xiàn)ADSl，INSIG2,KLK6，MIDN，PHGDN,PPP1R9A, QPCT, RABEP1, RPL22L1, SLC25A27, S0CS6, SQLE, TNFRSF1B, TPD52, ZDHHC2,(b)GOLTIB, HSPA5, LEPR0TL1, MAPK6, PROSC, RGMB, RWDD2B, SERTAD2, SPIRE2,(c)ASB6,ATM, BMI1，CDC42EP2, EDEM3, KCNK5, PGM2L1, RALBP1, SHR00M2, TNFSF15；(d)ACSL5,C1QC,CBALES1, CDK6, EHBPl，ETS2, EX0C6, EXTl，F(xiàn)MNL2, HDAC2, JUN, MED17, MTHFS, PITX2, P0F1B, PRRl5, PSMGl，RAB15, RAB40B, RNF43, SLC44A3, S0X4, TK2, TNFSFl5, ZDHHC14,(e)ZDHHC14,TK2, PRR15, MTHFS, CABLES1, EHBP1, MED17, BMI1, CDC42EP2, EDEM3, PGM2L1, RGMB, ADAMEC1, ERAPl，F(xiàn)ADSl，KLK6, PHGDH, PPP1R9A, QPCT, SLC25A27, TNFRSF1B, ZDHHC2.
34.權(quán)利要求33的基因陣列，其還包含由基因AREG和/或EREG和/或TGFA呈現(xiàn)或與基因AREG和/或EREG和/或TGFA雜交的多核苷酸。
35.一種用于遺傳學(xué)抗EGFR抗體生物標(biāo)記的實時PCR擴(kuò)增的試劑盒，其包括包含如權(quán)利要求1中所述的組(i)和/或組(ii)的一種或多種基因的DNA或RNA的第一包裝、包含與所述第一包裝中的所述DNA/RNA分子特異性雜交的PCR引物的第二包裝、包含孔板的第三包裝、和包含用于使實時PCR擴(kuò)增能夠?qū)嵤┑脑\斷工具和溶劑的第四包裝。
36.權(quán)利要求35的試劑盒，其中所述第一包裝包含下述基因的DNA/RNA:TNFRSF1B、 DNAJC8、ECSIT、G0SR2、PPP1R9A、KLK6、C7orf46、SSH3、SERTAD2、AXIN2、C10orf99、ETS2、 PITX2、PRRl5, VAV3、編碼 IKK 相互作用蛋白質(zhì)的基因、EDEM3、LY6G6D、AREG, EREG 和 TGFA， 任選加上AREG或EREG。
37.一種或多種遺傳學(xué)生物標(biāo)記或基因陣列或用于遺傳學(xué)抗EGFR抗體生物標(biāo)記的實時PCR擴(kuò)增的試劑盒用于預(yù)測預(yù)期用于治療的抗EGFR抗體對于患有KRAS野生型EGFR表達(dá)癌癥的患者的藥學(xué)功效和/或臨床反應(yīng)的用途，其中，所述遺傳學(xué)生物標(biāo)記或基因陣列或試劑盒包含一種或多種生物標(biāo)志，選自ADAMDEC1,BSDCl,Clorf144,CAPZB，CDC42，DHCR7，DNAJC8，ECSIT，EXOSC10,FADS1,GBA, GLT25D1, G0SR2, IMPDHl，KLHL21, KPNA6, KPNB1，LSMl2，MANlBl，MIDN，PPAN, SH3BP2, SQLE， SSH3, TNFRSF1B, URMl, ZFYVE26, RGMB, SPIRE2, ABCC5, ACSL5, AOAH, AXIN2, CD24, CEACAM5, CEACAM6, ETS2, FMNL2, GPSM2, HDAC2, JUN, ME3, MED17, MYB, MYC, NEBL, NOSIP, PITX2, P0F1B, PPARG, PPP1R14C, PRRl5, PSMGl, RAB15, RAB40B, RNF43, RPS23, SLC44A3, S0X4, THEM2, VAV3,ZNF337, EPDRl，KCNK5, KHDRBS3, PGM2L1, STK38, SHR00M2 ；C7orf46, CAST, DCP2, DIP2B, ERAPl， INSIG2, KIF21A, KLK6, NGRN, NRIPl， PHGDH, PPP1R9A, QPCT, RABEP1, RPAl，RPL22L1, SKPl，SLC25A27, SLC25A46, S0CS6, TPD52, ZDHHC2, ZNF654，ASB6，ATM，BMI1，CDC42EP2，EDEM3，PLLP，RALBP1，SLC4A11，TNFSF15，TPK1，C11orf9， C1QC, CABLES 1, CDK6, EHBP1, EX0C6, EXT1, FLRT3, GCNT2, MTHFS, PIK3AP1, ST3GAL1, TK2, ZDHHC14, ARFGAP3, AXUD1, CAPZB, CHSYl，DNAJB9，GOLTIB, HSPA5, LEPR0TL1, LIMSl, MAPK6, MY06, PROSC, RAB8B, RAP2B, RWDD2B, SERTAD2, S0CS5, TERF2IP, TIALl， TIPARP, TRIM8, TSC22D2, TGFA, VAPAjP UBE2K，任選地加上AREG和/或EREG，或其相應(yīng)的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物，其中通過針對由基礎(chǔ)臨床測定參數(shù)確定的閾值計算表達(dá)水平的差異，而導(dǎo)致所述預(yù)測。
38.權(quán)利要求37的用途，其中使用下述生物標(biāo)記中的至少一種TNFRSF1B、DNAJC8、 ECSIT、G0SR2、PPP1R9A、KLK6、C7orf46、SSH3、SERTAD2、AXIN2、C10orf99、ETS2、PITX2、 PRRl5、VAV3、編碼IKK相互作用蛋白質(zhì)的基因、EDEM3、LY6G6D、TGFA、或其包括AREG和/或 EREG的組合。
39.一種或多種遺傳學(xué)生物標(biāo)記或基因陣列或用于遺傳學(xué)抗EGFR抗體生物標(biāo)記的實時PCR擴(kuò)增的試劑盒用于制備抗EGFR抗體藥物中的用途，其中，所述遺傳學(xué)生物標(biāo)記或基因陣列或試劑盒包含一種或多種生物標(biāo)記，選自TNFRSF1B、DNAJC8、ECSIT、G0SR2、 PPP1R9A、KLK6、C7orf46、SSH3、SERTAD2、AXIN2、C10orf99、ETS2、PITX2、PRRl5, VAV3、編碼 IKK相互作用蛋白質(zhì)的基因、EDEM3、LY6G6D、TGFA、或其還包括AREG和/或EREG的組合，其中當(dāng)所述基因或基因產(chǎn)物中的一種或多種在患者的腫瘤樣品中表達(dá)或過表達(dá)時，所述藥物用于在所述患者中治療KRAS野生型EGFR表達(dá)CRC或mCRC。
40.權(quán)利要求37-39中任一項的用途，其中從所述患者的體液，包括血漿，中測定所述蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物。
41.權(quán)利要求37-40中任一項的用途，其中所述預(yù)期潛在治療是一線治療。
42.權(quán)利要求37-41中任一項的用途，其中所述預(yù)期潛在治療是所述抗EGFR抗體與化學(xué)治療劑的聯(lián)合治療，并且所述患者已發(fā)展化療難治性癌癥。
43.根據(jù)權(quán)利要求37-42中任一項的用途，其中所述抗EGFR抗體是c225(西妥昔單抗)O
44.根據(jù)權(quán)利要求37-43中任一項的用途，其中所述癌癥是結(jié)腸直腸癌(CRC)或轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌(mCRC)。
45.單克隆或多克隆抗體用于在體外測定預(yù)期用于治療的抗EGFR抗體對于患有KRAS 野生型EGFR表達(dá)癌癥的患者的藥學(xué)功效和/或臨床反應(yīng)的用途，所述單克隆或多克隆抗體特異性結(jié)合權(quán)利要求37-39之任一項中描述的基因或基因產(chǎn)物的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于基因表達(dá)產(chǎn)物的生物標(biāo)記和方法，用于確定抗EGFR抗體在EGFR表達(dá)性癌癥的治療中的功效。本發(fā)明進(jìn)一步涉及預(yù)測患有EGFR表達(dá)性癌癥的患者對用特定抗EGFR抗體進(jìn)行的治療的敏感性或抵抗性。本發(fā)明優(yōu)選涉及相應(yīng)生物標(biāo)記的鑒定，該生物標(biāo)記允許更好地預(yù)測在具有KRAS野生型腫瘤的患者中用抗EGFR抗體治療的臨床結(jié)果。在本文中，本發(fā)明特別涉及抗EGFR抗體c225/西妥昔單抗及其在患有結(jié)腸直腸癌(CRC)的患者中的用途。
文檔編號G01N33/574GK102459638SQ201080027063
公開日2012年5月16日 申請日期2010年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月19日
發(fā)明者海德布雷克 A·范, C·斯特羅 申請人:默克專利有限公司