抗wt1抗體的測定方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種能夠更正確測定、評價被檢測體中該抗WT1抗體的測定方法。一種被檢測體中的抗WT1抗體的測定方法，其特征在于，使用選自由序列號1中第294～449號的氨基酸序列組成的多肽、該多肽的部分多肽、以及由在構(gòu)成這些多肽的氨基酸序列中1或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或者添加的氨基酸序列組成的多肽中的、對抗WT1抗體具有抗原性的多肽，和/或選自由序列號1中第181～324號的氨基酸序列組成的多肽、該多肽的部分多肽、以及由在構(gòu)成這些多肽的氨基酸序列中1或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或者添加的氨基酸序列組成的多肽中的、對抗WT1抗體具有抗原性的多肽。
【專利說明】抗WT1抗體的測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用WTl片段的、測定被檢測體中的抗WTl抗體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]WTl基因(Wilms tumor gene)是作為Wilms腎腫瘤的致病基因被分離的鋅指(zinc finger)型的轉(zhuǎn)錄因子。其后，在以急性骨髓系白血病為首的各種實(shí)體癌中也發(fā)現(xiàn)了WTl基因的異常的高表達(dá)(非專利文獻(xiàn)1-3)。因此，已經(jīng)開始嘗試將WTl蛋白質(zhì)作為肽疫苗進(jìn)行應(yīng)用。
[0003]另外，近年已明確WTl蛋白質(zhì)具有由抑制區(qū)域(repression domein)、活化區(qū)域(activation domein)以及屬于DNA結(jié)合區(qū)域的鋒指區(qū)域(Zinc finger domain)組成的結(jié)構(gòu)，其與EGR-1 (Early Growth Response Proteinl ;初期增殖應(yīng)答蛋白I)部位結(jié)合，進(jìn)行基因的表達(dá)調(diào)節(jié)，并且，還報道有其具有作為癌抑制基因的功能(非專利文獻(xiàn)4和5)。
[0004]另一方面，已表明也存在對WTl蛋白質(zhì)的自身抗體。已報道特別是在血液癌、肺癌(小細(xì)胞癌)中，患者血液中的對WTl蛋白質(zhì)的自身抗體值高(非專利文獻(xiàn)6-8)。另外，報道有對于WTlmRNA而言，表達(dá)越高越具有預(yù)后不良的傾向，與此相對，對于抗WTl抗體而言，血中濃度越高越顯示預(yù)后良好的傾向(非專利文獻(xiàn)7)。因此，被認(rèn)為正確測定患者血中的抗WTl抗體，對于治療法的選擇或者治療經(jīng)過的監(jiān)測是有用的，例如，已報道有將含有抑制區(qū)域和活化區(qū)域且缺少鋅指的WTl蛋白質(zhì)作為抗原來測定抗WTl抗體的技術(shù)(專利文獻(xiàn)I和2)。
[0005]但是，將生物體內(nèi)蛋白質(zhì)作為異物進(jìn)行識別，形成自身抗體的機(jī)制尚不明確，而且其抗體量微少，還未確立以高靈敏度檢測自身抗體的方法。關(guān)于抗WTl抗體，目前為止的使用WTl蛋白質(zhì)抗原的方法中，檢測抗體的抗體值的分布狹窄，存在未必能正確進(jìn)行評價的問題。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0007]專利文獻(xiàn)
[0008]專利文獻(xiàn)1:日本特開2002-48793號公報
[0009]專利文獻(xiàn)2:日本特開2006-267124號公報
[0010]非專利文獻(xiàn)
[0011]非專利文獻(xiàn)l:1noue K, Sugiyama H, Ogawa H, et al.WTlas a new prognosticfactor and new marker for the detection of minimal residual disease in acuteleukemia.Bloodl994;84:3071-9
[0012]非專利文獻(xiàn)2:0ji Y，Miyoshi S，Maeda H，et al.0verexpression of theWilms’tumor gene WTlin de novo lung cancers.1nt J Cancer2002;100:297-303
[0013]非專利文獻(xiàn)3:Miyoshi Y，Ando A，Egawa C，et al.High expression ofWilms’tumor suppressor gene predicts poor prognosis in breast cancer patients.Clin Cancer Res2002;8:1167-71[0014]非專利文獻(xiàn)4:Haber DA, Sohn RL, Buckler AJ, et al.Alternative splicingand genomic structure of the Wilms’tumor gene WTl.Proc Natl Acad SciUSA88;9618:1991
[0015]非專利文獻(xiàn)5:Madden SL, Cook DM, Morris JF, et al.Transcriptionalrepression mediated by the WTI Wilms tumor gene product.Science2.53;1550:1991
[0016]非專利文獻(xiàn)6:01ga AEl, Oka Y, Tsuboi A, et al.Humoral immune responsesagainstffilms tumor gene WTlproduct in patients with hematopoietic malignancies.Blood2002;99:3272-3279
[0017]非專利文獻(xiàn)7:0ji Y,Kitamura Y,Kamino K, et al.WTlIgG antibody for earlydetection of nonsmall cell lung cancer and as its prognostic factor.1nt JCancer2009;125:381-7
[0018]非專利文獻(xiàn)8:Tamura H, Dan K, Yokose N, et al.Prognostic significanceof WTlmRNA and ant1-ffTlantibody levels in peripheral blood in patients withmyelodysplastic syndromes.Leukemia Res2010;34:986—990

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019]本發(fā)明涉及一種能夠更正確測定、評價WTl關(guān)聯(lián)疾病患者的抗WTl抗體的、該抗WTl抗體的測定方法及其應(yīng)用的發(fā)明。
[0020]本發(fā)明人等，在進(jìn)行與WTl關(guān)聯(lián)疾病患者的血中抗WTl抗體的檢測的研究的過程中，發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)的自身抗體在自身抗體識別抗原的立體結(jié)構(gòu)上帶來變化而表位部分在表面露出的情況下，將作為異物被識別、形成。而且，在WTl的情況下，主要表位位于構(gòu)成人WTl蛋白質(zhì)的氨基酸序列(序列號I)的中央?yún)^(qū)域(氨基酸號:第181-324位)以及C末端區(qū)域(氨基酸號:第294-449位)，特別是將與屬于WTl的DNA結(jié)合區(qū)域的C末端區(qū)域(鋅指區(qū)域)相當(dāng)?shù)亩嚯钠巫鳛榭乖褂枚鴾y定抗WTl抗體的情況下，其抗體值顯示與將全長的WTl作為抗原使用而測定的情況的高度相關(guān)性。而且進(jìn)一步比較健康人和癌患者的抗體值的分布，發(fā)現(xiàn)癌患者的抗體值的分布與健康人的分布相比更寬，其差異顯著，能夠確切靈敏度良好地進(jìn)行癌患者這樣的抗WTl抗體值高值組。
[0021]S卩，本發(fā)明涉及以下的I)?9)的發(fā)明。
[0022]I)一種被檢測體中的抗WTl抗體的測定方法，其特征在于，使用選自由序列號I中第294?449號的氨基酸序列組成的多肽、該多肽的部分多肽、以及由在構(gòu)成這些多肽的氨基酸序列中I或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或者添加的氨基酸序列組成的多肽中的、對抗WTl抗體具有抗原性的多肽，和/或選自由序列號I中第181?324號的氨基酸序列組成的多肽、該多肽的部分多肽、以及由在構(gòu)成這些多肽的氨基酸序列中I或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或者添加的氨基酸序列組成的多肽中的、對抗WTl抗體具有抗原性的多肽。
[0023]2)上述I)的測定方法，其中，將所述多肽的至少I種固定在固相上，通過檢測該固定的多肽與被檢測體中存在的抗WTl抗體的反應(yīng)產(chǎn)物來測定抗體量。
[0024]3) 一種WTl關(guān)聯(lián)疾病的檢查方法,其特征在于，使用選自由序列號I中第294?449號的氨基酸序列組成的多肽、該多肽的部分多肽、
[0025]以及由在構(gòu)成這些多肽的氨基酸序列中I或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或者添加的氨基酸序列組成的多肽中的、對抗WTl抗體具有抗原性的多肽，和/或選自由序列號I中第181?324號的氨基酸序列組成的多肽、該多肽的部分多肽、以及由在構(gòu)成這些多肽的氨基酸序列中I或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或者添加的氨基酸序列組成的多肽中的、對抗WTl抗體具有抗原性的多肽。
[0026]4)上述3)的檢查方法，其中，該方法是判定白血病預(yù)后的方法。
[0027]5) 一種癌的WTl疫苗療法中奏效者的預(yù)測或治療監(jiān)測方法，其特征在于，使用選自由序列號I中第294?449號的氨基酸序列組成的多肽、該多肽的部分多肽、以及由在構(gòu)成這些多肽的氨基酸序列中I或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或者添加的氨基酸序列組成的多肽中的、對抗WTl抗體具有抗原性的多肽，和/或序列號I中第181?324號的氨基酸序列組成的多肽、該多肽的部分多肽、以及由在構(gòu)成這些多肽的氨基酸序列中I或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或者添加的氨基酸序列組成的多肽中的、對抗WTl抗體具有抗原性的多肽。
[0028]6)上述5)的方法，其中癌是腦腫瘤或大腸癌。
[0029]7) 一種被檢測體中的抗WTl抗體的測定試劑，其含有選自由序列號I中第294?449號的氨基酸序列組成的多肽、該多肽的部分多肽、以及由在構(gòu)成這些多肽的氨基酸序列中I或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或者添加的氨基酸序列組成的多肽中的、對抗WTl抗體具有抗原性的多肽，和/或序列號I中第181?324號的氨基酸序列組成的多肽、該多肽的部分多肽、以及由在構(gòu)成這些多肽的氨基酸序列中I或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或者添加的氨基酸序列組成的多肽中的、對抗WTl抗體具有抗原性的多肽。
[0030]8 ) 一種WTI關(guān)聯(lián)疾病的檢查用試劑，其含有選自由序列號I中第294?449號的氨基酸序列組成的多肽、該多肽的部分多肽、以及由在構(gòu)成這些多肽的氨基酸序列中I或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或者添加的氨基酸序列組成的多肽中的、對抗WTl抗體具有抗原性的多肽，和/或序列號I中第181?324號的氨基酸序列組成的多肽、該多肽的部分多肽、以及由在構(gòu)成這些多肽的氨基酸序列中I或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或者添加的氨基酸序列組成的多肽中的、對抗WTl抗體具有抗原性的多肽。
[0031]9) 一種自身抗體的檢測方法，其特征在于，對生物體內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行改性以使表位部分在表面露出，將該改性蛋白質(zhì)作為自身抗體識別抗原進(jìn)行使用。
[0032]根據(jù)本發(fā)明的抗WTl抗體的測定方法，由于能夠更確切靈敏度良好地測定存在于WTl關(guān)聯(lián)疾病患者的抗WTl抗體，能夠良好地把握抗WTl抗體值的變動，能夠容易且精度良好地進(jìn)行WTl關(guān)聯(lián)疾病的診斷、治療高效的監(jiān)測、預(yù)后的判定、疫苗療法施行前的奏效者的預(yù)測、疫苗療法施行后的奏效監(jiān)測等。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1是表示對于全長WTl抗原的癌患者血中抗體值的圖。
[0034]圖2是表示對于全長WTl抗原的抗體值和對于分割的WTl抗原的抗體值的比較的圖。(a)是對于Fr.1抗原的抗體值的比較,(b)是對于Fr.2抗原的抗體值的比較，以及(c)是對于Fr.3抗原的抗體值的比較的結(jié)果。縱軸表示對于分割WTl抗原的抗體值(unit)，橫軸表示對于全長WTl抗原的抗體值(WRU)。
[0035]圖3是表示對于Fr.2抗原的抗體值和對于Fr.3抗原的抗體值的比較的圖?？v軸表示對于Fr.3抗原的抗體值(unit),橫軸表示對于Fr.2抗原的抗體值(WRU)。
[0036]圖4是表不對于分割WTl抗原的抗體值的分布的圖。表不對于分割WTl抗原的健康人的抗體值分布和癌患者的抗體值分布。N是健康人54例的分布，C是癌患者20例的分布。(a)是Fr.1抗原，(b)是Fr.2抗原，(c)是Fr.3抗原的結(jié)果。
[0037]圖5是表不對于Fr.3抗原的抗原抑制試驗(yàn)的結(jié)果的圖。表不由Fr.1和Fr.2抑制對Fr.3的抗體反應(yīng)性的結(jié)果。C-19是對Fr.3的PoAb，N0.3，N0.7，N0.9是對Fr.1和Fr.2的抗體值降低、對Fr.3的抗體值高的患者血清。白色條是Fr.1抗原添加，黑色條是Fr.2抗原添加的結(jié)果。
[0038]圖6是表示對于各抗原的IgG抗體值的推移的圖。黑色條是對于Fr.1的抗體值，白色條是對于Fr.2的抗體值，橫線條是對于Fr.3的抗體值，斜線條是對于全長WTl抗原的抗體值的推移。黑圓棒線表示通過MRI進(jìn)行測定的腫瘤徑的變化。
[0039]圖7是疫苗給藥前的IgG抗體值的比較圖。
[0040]圖8是疫苗給藥后的IgG抗體值的比較圖。
[0041]圖9是表示疫苗給藥前的IgM抗體值的圖。A是對于Fr.2的IgM抗體值，B是對于Fr.3的IgM抗體值。
[0042]圖10是表示疫苗給藥前的IgM和IgG抗體值的圖。
[0043]圖11是表示腦腫瘤患者的IgM和gG抗體值的圖?？v軸是IgM抗體值，橫軸是IgG抗體值，〇表示SD患者、?表示F1D患者。點(diǎn)線表示假設(shè)的基準(zhǔn)值。
[0044]圖12是表示大腸癌`患者的IgM和IgG抗體值的圖。縱軸是IgM抗體值，橫軸是IgG抗體值，〇表示SD患者、?表示F1D患者。點(diǎn)線表示假設(shè)的基準(zhǔn)值。
【具體實(shí)施方式】
[0045]本發(fā)明中，抗WTl抗體是指作為Wilms腎腫瘤的致病基因(Wilms tumor gene)被分離的鋅指型的轉(zhuǎn)錄因子WTl的基因產(chǎn)物，具體的是指對于由449個氨基酸組成的人WTl蛋白質(zhì)(序列號I)的抗體。所述抗體中包括IgG抗體、IgA抗體、Ig M抗體等各種免疫球蛋白，本發(fā)明中包含該抗體的全部。
[0046]生物體內(nèi)蛋白因原來的免疫系統(tǒng)不會將其作為異物識別。因此，通常不會發(fā)生抗體形成。本發(fā)明人等考慮自身抗體在自身抗體識別抗原在立體結(jié)構(gòu)上帶來變化而表位部分在表面露出的情況下將會作為異物被識別、形成。由此，認(rèn)為自身抗體識別抗原的配制中，需要例如將表面部分的一部缺失的蛋白質(zhì)進(jìn)行基因工學(xué)表達(dá)或切斷蛋白酶等肽鍵，或者，利用酸、堿、表面活性劑、熱變性等各種處理、尿素和鹽酸胍等離液試劑來進(jìn)行處理等，從而進(jìn)行蛋白質(zhì)改性，將分子內(nèi)隱藏的表位部分露出到表面。
[0047]如后面的實(shí)施例所示，本發(fā)明人等研究了 WTl蛋白質(zhì)中能成為自身抗體識別抗原的分子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過將主要表位位于構(gòu)成人WTl蛋白質(zhì)的氨基酸序列(序列號I)的中央?yún)^(qū)域(氨基酸號--第181-324位)以及C末端區(qū)域(氨基酸編號:第294-449位)，特別是C末端區(qū)域的肽作為抗體檢測抗原，能使抗體檢測靈敏度提高到比使用全長WTl抗原還高(實(shí)施例1)，并且，C末端側(cè)區(qū)域中的抗體反應(yīng)性，被N末端側(cè)區(qū)域(氨基酸號:第1-182位)以及中央?yún)^(qū)域的抗原所抑制(實(shí)施例2)，從而證明了上述觀點(diǎn)。
[0048]本發(fā)明的抗WTl抗體的測定方法中所用的對抗WTl抗體具有抗原性的多肽，是選自由序列號I中第294?449位的氨基酸序列組成的多肽、由序列號I中第181?324位的氨基酸序列組成的多肽、由在構(gòu)成該多肽的氨基酸序列中I或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或者添加的氨基酸序列組成的多肽、以及這些多肽的部分多肽。
[0049]由序列號I中第294?449位的氨基酸序列組成的多肽，相當(dāng)于WTl蛋白質(zhì)中作為DNA結(jié)合區(qū)域的鋅指區(qū)域(Zinc finger domain)。本發(fā)明中也稱為C末端區(qū)域。
[0050]由序列號I中第181?324位的氨基酸序列組成的多肽，是位于WTl蛋白質(zhì)中N末端側(cè)區(qū)域(氨基酸號:第1-182位)和上述的C末端區(qū)域之間的區(qū)域，也稱為中央?yún)^(qū)域。
[0051]作為抗原多肽，優(yōu)選使用由該序列號I中第294?449位的氨基酸序列組成的多肽、由第181?324位的氨基酸序列組成的多肽，只要對于抗WTl抗體具有抗原性，能夠檢測抗WTl抗體，也可使用該多肽的部分多肽以及由在構(gòu)成這些多肽的氨基酸序列中I或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或者添加的氨基酸序列組成的多肽。
[0052]作為上述多肽的部分多肽，可舉出以由序列號I中第294?449位的氨基酸序列組成的多肽或由第181?324位的氨基酸序列組成的多肽中的、連續(xù)的6?8個，優(yōu)選10?20個組成的肽，具體的可舉出由序列號I中第294?449位的氨基酸序列組成的多肽、序列號I中第348?449位的氨基酸序列組成的多肽、序列號I中第181?324位的氨基酸序列組成的多肽等。
[0053]上述的由序列號I中第294?449位的氨基酸序列組成的多肽、第181?324位的氨基酸序列組成的多肽或其部分多肽，只要對于抗WTl抗體具有抗原性，也可以在構(gòu)成這些多肽的氨基酸序列中I或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或者添加。
[0054]此處，缺失、添加或取代的氨基酸的數(shù)量是I個以上，對其數(shù)量無特別限制，是通過位點(diǎn)特異性突變導(dǎo)入法等周知的技術(shù)可進(jìn)行缺失、添加或取代的程度的數(shù)，例如是I?數(shù)十個，優(yōu)選I?20個,更優(yōu)選I?10個,進(jìn)一步優(yōu)選I?5個。
[0055]此處，氨基酸序列中I個以上的氨基酸殘基發(fā)生缺失、添加或取代意指同一序列中的任意一個或者多個氨基酸序列中有I個或多個氨基酸殘基的缺失、添加或取代，缺失、添加或取代可同時發(fā)生，缺失、添加或取代的氨基酸殘基可以是天然型也可以是非天然型。
[0056]此外，“對抗WTl抗體具有抗原性”意指對識別WTl蛋白質(zhì)的抗體具有反應(yīng)性。由于WTl關(guān)聯(lián)疾病患者能產(chǎn)生的自身抗體是多克隆抗體，本發(fā)明的抗原多肽也可以是其自身具有多個反應(yīng)位(表位)的多肽。
[0057]本發(fā)明的方法中所用的多肽是選自上述的多肽的至少I種的多肽。為了提高特異性和測定靈敏度，也可以將多種的多肽組合使用。
[0058]上述多肽可通過利用已知的WTl基因的基因工學(xué)手法，例如，利用后述的實(shí)施例記載的方法以及以其為基準(zhǔn)的方法進(jìn)行制造，另外，也可通過化學(xué)合成進(jìn)行制造。
[0059]基于利用WTl基因的基因工學(xué)的手法的上述多肽的制造，可按照現(xiàn)有公知的一般的基因重組技術(shù)進(jìn)行。更詳細(xì)而言，制成所需的WTl基因在宿主細(xì)胞中能夠表達(dá)的重組DNA，將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通過培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化子，在轉(zhuǎn)化子的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外，生產(chǎn)作為表達(dá)產(chǎn)物的所需的多肽。
[0060]此處，所采用的各種操作，例如，以部分基因的化學(xué)合成、其切斷、刪除、添加或結(jié)合為目的的酶處理、其分離、精制、選擇等，以及將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞以及轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)等均可按照常規(guī)方法進(jìn)行(例如，參見“分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)法”，共立出版株式會社1993年發(fā)行；“PCR技術(shù)”，寶酒造株式會社1990年發(fā)行，Science，224，1431 (1984)；Biochem.Biophys.Res.Comm., 130, 692 (1985 ) ; Proc.Natl.Acad.Sc1., USA., 80, 5990(1983) ;Moplecular Cloning, by T.Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory(1982)等)。
[0061]另外，根據(jù)所需，多肽也可按照利用其物理化學(xué)性質(zhì)等的各種分離操作(例如，參照“生化學(xué)數(shù)據(jù)手冊II ”，1175-1259頁，第I版第I次印刷，1980年6月23日，株式會社東京化學(xué)同人發(fā)行等)，將其從上述表達(dá)產(chǎn)物等進(jìn)行分離、精制。
[0062]本發(fā)明中，作為被檢測體(試樣)是源自WTl關(guān)聯(lián)疾病患者或其治療后患者的被檢測體，例如，可無限制地例示已知通常存在抗體的血液、尿等各種體液。
[0063]作為WTl關(guān)聯(lián)疾病，例如，可舉出作為白血病、實(shí)體癌、骨髓增生異常綜合征等WTl關(guān)聯(lián)疾病而已知的各種疾患。另外，也包括將來發(fā)現(xiàn)的WTl關(guān)聯(lián)疾病。
[0064]本發(fā)明的抗WTl抗體的測定方法中，抗WTl抗體(抗體量)的測定，可按照免疫學(xué)的測定法使用上述的多肽實(shí)施。作為免疫學(xué)的測定法，可舉出任意的公知的免疫學(xué)的測定方法，例如，可舉出放射免疫測定法(RIA)、酶免疫測定法(EIA或ELISA)、熒光免疫測定法(FIA)、間接突光抗體法(Indirect Fluorescence assay)、發(fā)光免疫測定法(Luminescentimmunoassay)、物理化學(xué)測定法(TIA、LAPIA、PCIA)、Western印跡法等,優(yōu)選使用ELISA法。
[0065]ELISA法是使固定于固相的抗原和抗體反應(yīng)，進(jìn)一步地將結(jié)合于抗原的抗體與實(shí)施過氧化酶、堿磷酸酶等酶標(biāo)記等的二次抗體反應(yīng)，然后，通過適當(dāng)?shù)姆椒y定酶標(biāo)記的方法，例如，可舉出競爭法、夾心法，其中優(yōu)選例示夾心法(固相化夾心法)。
[0066]固相化夾心法，例如，可按照如下進(jìn)行實(shí)施。即，首先將本發(fā)明的多肽固相化，向其加入作為被檢試樣的被檢測體。其結(jié)果，固相化抗原和試樣中的抗體之間發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，被檢測體中存在的抗WTl抗體與固相化抗原結(jié)合。其次對該結(jié)合的抗體，使用抗體檢測試劑進(jìn)行檢測，測定被檢試樣中存在的抗WTl抗體。
[0067]上述中，還可以將抗體檢測試劑固相化，通過其捕捉被檢測體中的抗體，然后加入本發(fā)明的多肽，使其與被捕捉的抗體中的抗WTl抗體結(jié)合，進(jìn)而使該抗原的特異抗體的標(biāo)識體結(jié)合，從而檢測.測定被檢試樣中存在的目標(biāo)抗WTl抗體。
[0068]這些測定手法中各種手段的選擇、其改變等均是本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的技術(shù)，本發(fā)明中無特別限制，可采用這些各手法的任意一個(參見“臨床檢查法提要”金原出版、1995年等)。
[0069]例如，作為上述固相法中的固相，可廣泛利用通常使用的不溶性、惰性的載體。其中，例如包括由玻璃、纖維素粉末、葡聚糖凝膠、瓊脂糖、聚苯乙烯、濾紙、羧甲基纖維素、離子交換樹脂、葡聚糖、塑料薄膜、塑料管、尼龍、玻璃珠、絲、聚胺-甲基乙烯基醚-馬來酸共聚物、氨基酸共聚物、乙烯-馬來酸共聚物等各種素材構(gòu)成的棒、珠、微孔板、試管等。
[0070]抗原或者抗體的固定化方法也沒有特別限制，可利用物理結(jié)合和化學(xué)結(jié)合的任意一個。代表性的例如可例示出作為共價鍵法的重氮法、肽法(羧酸酰胺衍生物法、羧基氯樹脂法、碳二亞胺樹脂法、馬來酸酐衍生物法、異氰酸酯衍生物法、溴化氰活性多糖法、纖維素碳酸鹽衍生物法、使用縮聚試劑的方法等)、烷基化法、利用交聯(lián)試劑的載體結(jié)合法(作為交聯(lián)試劑使用戊二醛、六亞甲基異氰酸酯等)、基于Ugi反應(yīng)的載體結(jié)合法等利用化學(xué)反應(yīng)的方法、使用離子交換樹脂這樣的載體的離子結(jié)合法、使用玻璃珠等多孔玻璃作為載體的物理吸附法等。
[0071]作為各測定系中標(biāo)識劑，無特別是限制，可使用現(xiàn)有公知的標(biāo)識劑或?qū)砜赡苁褂玫臉?biāo)識劑的任意一個。作為具體例，可無限制地例示免疫測定法中慣用的各種放射性同位素類、堿磷酸酶(ALP)、過氧化酶(POX)等酶類、異硫氰酸熒光素(FITC)、四甲基異硫氰酸羅丹明(RITC)等熒光物質(zhì)類，此外，IN- (2，2，6，6-四甲基-1-氧基-4-哌啶基)-5N-(天門冬氨酸)-2,4- 二硝基苯(TOPA)等。
[0072]此外，作為用于酶標(biāo)記的酶標(biāo)記物質(zhì)，例如，在上述例示的物質(zhì)的基礎(chǔ)上，可例示出微過氧化酶、胰凝乳蛋白酶原、羧肽酶原、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、淀粉酶、磷酸化酶、D-Nase,P-Nase等。利用這些標(biāo)識物質(zhì)的標(biāo)識方法，可按照公知的方法實(shí)施(例如，參見“單克隆抗體”，巖崎辰夫等著、講談社Scientific，1984年；“酶免疫測定法”第2版、石川榮治等著、醫(yī)學(xué)書院，1982年等)。
[0073]另外，酶活性的測定也可以根據(jù)使用的酶的種類按照公知的方法實(shí)施。例如，作為標(biāo)識酶使用過氧化酶時，作為底物使用ABTSJ(2，2’ -聯(lián)苯-雙(3’ -乙基苯并噻唑啉磺酸))，另外，利用堿磷酸酶時，作為底物使用對硝基苯磷酸，各底物的分解可通過使用分光光度計等來測定的方法等(參見“酶免疫測定法”第2版、石川榮治等著、醫(yī)學(xué)書院，1982年等)。
[0074]此外，代替上述酶標(biāo)記，使用放射性同位素、熒光物質(zhì)等標(biāo)識體時,該標(biāo)識體的測定，可按照公知的方法進(jìn)行實(shí)施。
[0075]作為上述測定系中使用的溶劑，只要是對反應(yīng)不產(chǎn)生壞的影響，可使用通常使用的任意溶劑，具體而言可很好地利用檸檬酸緩沖液、磷酸緩沖液、Tris鹽緩沖液、乙酸緩沖液等PH約5-9左右的緩沖液。
[0076]免疫反應(yīng)(結(jié)合)條件也沒有特別限制，一般采用可在這種測定法中所用的通常條件。一般為45°C以下，優(yōu)選約4-40°C左右的溫度條件下，需要約1-40小時左右進(jìn)行反應(yīng)。
[0077]這樣，根據(jù)使用本發(fā)明的多肽作為抗原的測定方法，能夠更確切靈敏度好地測定WTl關(guān)聯(lián)疾病患者中存在的抗WTl抗體，能夠良好地把握抗WTl抗體值的變動。
[0078]與健康人的抗WTl抗體的抗體量相比，WTl關(guān)聯(lián)疾病患者的抗WTl抗體的抗體量顯著添加，并且，伴隨該患者的治療降低。因此，該WTl抗體量優(yōu)選其經(jīng)時變化，可作為臨床指標(biāo)判定WTl關(guān)聯(lián)疾病的存在、治療經(jīng)過以及預(yù)后。例如，如果白血病等WTl關(guān)聯(lián)疾病完全緩解，抗WTl抗體消失，通過經(jīng)時考察該抗體消失情況，能夠確認(rèn)完全緩解狀態(tài)的維持。
[0079]另外，WTl關(guān)聯(lián)疾病患者的抗WTl抗體的檢出，即，WTl抗體陽性患者的確認(rèn)意指確認(rèn)該患者對WTl發(fā)生體液免疫應(yīng)答。因此，抗WTl抗體的檢測本身在判定或診斷對WTl關(guān)聯(lián)疾病的該患者的免疫應(yīng)答能力方面是有用的。而對WTl發(fā)生免疫應(yīng)答的患者而言，與未發(fā)生的患者相比，其免疫應(yīng)答高出的部分對應(yīng)地具有預(yù)后良好的可能性，因此，這樣的判定或診斷能夠成為WTl關(guān)聯(lián)疾病的預(yù)后判斷的指標(biāo)。
[0080]因此，本發(fā)明的抗WTl抗體的測定方法，對于WTl關(guān)聯(lián)疾病的存在、治療經(jīng)過以及預(yù)后的判定、特別是各種癌患者的(對癌的)免疫應(yīng)答能力的檢查、診斷等有用。
[0081]另外，本發(fā)明的抗WTl抗體的測定方法，在癌的WTl疫苗療法中，能夠在其施行前預(yù)先預(yù)測奏效者，并能夠應(yīng)用于施行后的奏效監(jiān)測。例如，腦腫瘤、大腸癌等的癌WTl疫苗的給藥前，對于C末端側(cè)區(qū)域的肽(由序列號I中第294?449位的氨基酸序列組成的多肽等)的IgG抗體值或者Ig M抗體值、對于中央?yún)^(qū)域的肽(由序列號I中第181?324位的氨基酸序列組成的多肽等)的Ig M抗體值高的患者，能夠預(yù)測WTl疫苗具有高的治療效果。另一方面，WTl疫苗給藥后，奏效者的對于中央?yún)^(qū)域的IgG抗體值上升。另外，盡管微少但能夠確認(rèn)對于C末端側(cè)區(qū)域的IgG抗體值有上升的傾向。根據(jù)這些事實(shí)，能夠?qū)τ谥醒雲(yún)^(qū)域和C末端側(cè)區(qū)域的IgG抗體值的推移作為指標(biāo)進(jìn)行治療奏效監(jiān)測。
[0082]在實(shí)施本發(fā)明的抗WTl抗體的測定方法或者應(yīng)用其的各種檢查方法之際，將本發(fā)明的多肽作為測定試劑使用是簡便的，本發(fā)明也提供了該測定試劑等。該測定試劑能夠作為用于判定WTI關(guān)聯(lián)疾病的存在、治療經(jīng)過或者預(yù)后的檢查用試劑(試劑盒)。
[0083]本發(fā)明的測定試劑或者檢查用試劑含有本發(fā)明的抗原多肽作為有效成分，該測定試劑等中，除了被利用于該測定系的抗體檢測試劑等任意試劑之外，還可以含有實(shí)施測定所必要的試劑類，例如抗體稀釋液、反應(yīng)稀釋液、緩沖液、洗凈液、標(biāo)識體檢測試劑等。
[0084]實(shí)施例
[0085]以下示出本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明并不局限于此。
[0086]實(shí)施例1
[0087]1.材料和方法
[0088]1-1.血清被檢測體
[0089]癌患者血清使用在大阪大學(xué)采取的20例。健康人血清使用市售的血清被檢測體54例。另外，WTl疫苗治療患者血清是在大阪大學(xué)給藥前和給藥后的數(shù)個點(diǎn)采血得到。
[0090]1-2.對于全長WTl抗原的抗體值測定
[0091]對于癌患者血清的全長WTl抗原的抗體值，通過由Oji等確立的ELISA進(jìn)行測定(上述非專利文獻(xiàn) 7:0ji Y, Kitamura Y, Kamino K, et al.WTlIgG antibody for earlydetection of nonsmall cell lung cancer and as its prognostic factor.1nt JCancer2009;125:381-7)。
[0092]1-3.分割WTl抗原表達(dá)載體的構(gòu)筑
[0093]將全長WTIcDNA分割為WTl (序列號I)的N末端區(qū)域第1-182位(Fr.1 )、中央?yún)^(qū)域181-324 (Fr.2)、C末端區(qū)域294-449 (Fr.3)，利用Fr.1擴(kuò)增用引物(序列號2和序列號3)、Fr.2擴(kuò)增用引物(序列號4和序列號5)'Fr.3擴(kuò)增用引物(序列號6和序列號7)，通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。將Fr.1和Fr.2克隆于表達(dá)用載體pET_42a ( + ) (Merck公司)，將Fr.3克隆于表達(dá)載體PQE-80L (QIAGEN公司)。
[0094]序列號2:ATGCGCGGTACCATGGGCTCCGACGTGCGGGACCTG
[0095]序列號3:ATGCGCGCGGCCGCCATGGGATCCTCATGCTTGAAT
[0096]序列號4:ATGCGCGGTACCCCCATGGGCCAGCAGGGCTCGC
[0097]序列號5:ATGCGCGCGGCCGCCATGAAGGGGCGTTTCTCACTGG
[0098]序列號6:ATGCGCGGATCCTTCAGAGGCATTCAGGATGTGC
[0099]序列號7:ATGCGCAAGCTTCAAAGCGCCAGCTGGAGTTTGGTC
[0100]1-4.Fr.1抗原的制作
[0101]將Fr.1表達(dá)載體轉(zhuǎn)化于大腸菌BL21 (DE3)之后，在ImM IPTG、16°C、16小時的條件下進(jìn)行重組hWTlFr.1的表達(dá)誘導(dǎo)。通過離心收集細(xì)菌后，混懸于含有0.2%TritonX-100的D-PBS (_)，超聲破碎，通過離心操作回收可溶部分。將可溶部分由D-PBS (-)稀釋2倍，向經(jīng)平衡化用緩沖液Bl-1 (含有0.l%Triton X-100的D-PBS (-))平衡化處理的GST融合蛋白質(zhì)精制用柱(Glutatione Sepharose HP, GEHealthcare公司)結(jié)合,使用平衡化用緩沖液洗凈后，由洗脫用緩沖液Bl-1 (50mM Tris-HCl，0.2%Triton X_1001,10mM還原型 Glutathione，pH8.0)洗脫。進(jìn)一步由平衡化用緩沖液 Bl_2 (20mM NaPi,0.5M NaCl,0.2%Triton X-100, ρΗ7.4)稀釋3倍，向經(jīng)平衡化用緩沖液Β1-2平衡化處理后的His Tag精制用柱(Ni Sepharose HP, GE Healthcare公司)結(jié)合，由平衡化用緩沖液Β1-2、洗凈用緩沖液 Bl-2 (20mM NaPi, 0.5MNaCl,0.2%Triton X-100,250mM Imidazole, ρΗ7.4)依次洗凈后，由洗脫用緩沖液 1-2 (20mM NaPi,0.5M NaCl,0.2%Triton X-100,500mM Imidaole,pH7.4)洗脫。精制后的Fr.1抗原可通過Bradford法進(jìn)行蛋白定量。
[0102]1-5.Fr.2抗原的調(diào)制
[0103]將hWTlFr.2表達(dá)載體轉(zhuǎn)化于大腸菌BL21 (DE3)后，在lmMIPTG、37°C、3小時的條件下，進(jìn)行Fr.2抗原的表達(dá)誘導(dǎo)。通過離心收集細(xì)菌后，混懸于含有0.2%Triton X-100的D-PBS (_)，超聲破碎，通過離心操作回收不溶成分。進(jìn)一步由D-PBS (_)混懸，通過離心操作回收不溶成分，重復(fù)2次該操作而將其洗凈。將洗凈的不溶成分混懸于含有2M urea的D-PBS (-)中，在4°C、16小時的條件下培育，通過離心操作回收不溶成分后，進(jìn)一步混懸于含有6M urea的D-PBS (_)，4°C、16小時的條件下培育，得到可溶部分。由平衡化用緩沖液 B2 (20mMNaPi,0.5M NaCl, 6M urea, 5mM2-mercaptoethanol, ρΗ7.4)稀釋 3 倍，向經(jīng)平衡化用緩沖液Β2平衡化處理的His Tag精制用柱(NiS印harose HP, GE Healthcare公司)結(jié)合，由平衡化用緩沖液B2、洗凈用緩沖液B2 (20mM NaPi,0.5M NaCl,6M urea,5mM2-mercaptoethanol, 200mM Imidazole, ρΗ7.4)依次洗凈后，由洗脫用緩沖液 B2 (20mMNaPi, 0.5M NaCl, 6M urea, 5mM2-mercaptoethanol, 500mM Imidazole, ρΗ7.4)洗脫。精制后的Fr.2抗原通過Bradford法進(jìn)行蛋白定量。
[0104]1-6.Fr.3抗原的調(diào)制
[0105]將Fr.3抗原表達(dá)載體轉(zhuǎn)化于大腸菌BL21 (DE3)后，在ImM IPTG、16°C、16小時的條件下進(jìn)行Fr.3抗原的表達(dá)誘導(dǎo)。通過離心收集細(xì)菌后，混懸于含有30 μ M ZnCl2,
0.2%Triton X-1OO的D-PBS (_)，超聲破碎，通過離心操作回收可溶部分。由平衡化用緩沖液 B5 (20mMTri s-HCl, IM NaCl, 0.l%Triton Χ_100，30μΜ ZnCl2, ρΗ8.0)稀釋 2 倍，與經(jīng)過平衡化用緩沖液平衡化處理的His Tag精制用柱(TALON superflow, Clontech公司)結(jié)合，由平衡化用緩沖液 5、洗凈用緩沖液 B5( IOmM Tris-HCl, IM NaCl, 30 μ M ZnCl2,0.l%TritonX-100, 25mMImidazole, pH8.0)依次洗凈后，由洗脫用緩沖液 B (IOmM Tris-HCl,0.72MNaCl,30yM ZnCl2,0.l%Triton X-100,200mM Imidazole，ρΗ8.0)洗脫。精制后的 Fr.3 抗原通過Bradford法進(jìn)行蛋白定量。
[0106]1-7.抗原固相板制作
[0107]將精制的Fr.1抗原、Fr.2抗原或Fr.3抗原分別由D-PBS (-)調(diào)整為10 μ g/ml的濃度，向 96 孔微孔板(96-Well EIA/RIA Stripwel Plate，CORNING 公司)添加 ΙΟΟμ L,4°C培育16小時，將其固相化。
[0108]由洗凈液(含有0.05%Tween20的D-PBS (-))洗凈I次后，添加板封閉液(含有1%牛血清白蛋白(BSA)的D-PBS (_))300μ L，4°C培育16小時進(jìn)行封閉。除去板封閉液，25°C培育箱中干燥，使用為止在4 °C進(jìn)行保存。
[0109]1-8.使用Fr.1抗原的IgG測定ELISA法[0110]對于由洗凈液洗凈I次后的抗原固相板，添加由被檢測體稀釋液I (20mM NaPi,0.65M NaCl,0.05%Tween20,0.05%ProClin300,1%BSA, ρΗ8.0)適當(dāng)梯度稀釋的市售抗體(hffTlH-290, SANTA CRUZ公司)或稀釋的血清100 μ L，25°C振蕩反應(yīng)I小時。接下來，將板由洗凈液洗凈3次后，添加由2次反應(yīng)液稀釋液(含有0.05%Tween20,0.05%ProClin300,0.5%BSA的D-PBS (-))稀釋50000倍的辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)識Protein G (Acris公司)100 μ L，25°C振蕩反應(yīng)I小時。最后，將板由洗凈液洗凈3次后，添加3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB) ΙΟΟμ L，室溫下顯色10分鐘，添加IN硫酸ΙΟΟμ L停止反應(yīng)。通過微孔酶標(biāo)儀測定450mn (參考波長650nm)的吸光度。
[0111]1-9.使用Fr.2抗原的IgG測定ELISA法
[0112]向由被檢測體稀釋液I適宜梯度稀釋的市售抗體(hWTlH-290)或稀釋的血清中添加GST表達(dá)大腸菌提取液使其成為5 μ g/ml，25°C振蕩反應(yīng)I小時。將其作為Fr.2被檢測體液。對由洗凈液洗凈I次的抗原固相板，添加上述調(diào)整的Fr.2被檢測體液100 μ L，25°C振蕩反應(yīng)I小時。接下來將板由洗凈液洗凈3次后，由2次反應(yīng)液稀釋液稀釋50000倍的HRP標(biāo)識Protein G100 μ L，25°C振蕩反應(yīng)I小時。最后，將板由洗凈液洗凈3次后，添加TMB100 μ L，室溫下顯色10分鐘，添加IN硫酸100 μ L停止反應(yīng)。通過微孔酶標(biāo)儀測定450mn(參照波長650nm)的吸光度。
[0113]1-10.使用Fr.3抗原的IgG測定ELISA法
[0114]對由洗凈液洗凈I次后的抗原固相板，添加由被檢測體稀釋液2 (20mM NaPi,0.05%Tween20,0.05%ProClin300,1%BSA, pH8.0)適宜梯度稀釋的市售抗體(hWTlH-290)或稀釋的血清100μ L，25°C振蕩反應(yīng)I小時。接下來,將板由洗凈液洗凈3次后，添加由2次反應(yīng)液稀釋液稀釋50000倍的HRP標(biāo)識Protein G100 μ L，25°C振蕩反應(yīng)I小時。最后，將板由洗凈液洗凈3次后，添加TMB100 μ L，室溫下顯色10分鐘，添加IN硫酸100 μ L停止反應(yīng)。通過微孔酶標(biāo)儀測定450mn (參照波長650nm)的吸光度。
[0115]1-11.使用各抗原的IgM測定ELISA法
[0116]IgM抗體的測定按照IgG抗體的測定進(jìn)行。檢測是將HRP標(biāo)識抗人IgM特異性抗體稀釋50000倍后進(jìn)行反應(yīng)。
[0117]2.結(jié)果
[0118]2-1.對于全長WTl抗原的抗體值
[0119]將通過Oji等的方法測定的癌患者血清被檢測體的血中抗WTl抗體值在表I和圖1示出。從Oji等的報道可知對于全長WTl抗原的健康人抗體值的分布是10-3664WRU，其中心值是392WRU (上述非專利文獻(xiàn)7)。本次使用的癌患者血清20例的抗體值的分布是7-1682WRU，全部被檢測體都在健康人的范圍。
[0120][表I]
【權(quán)利要求】
1.一種被檢測體中的抗WTl抗體的測定方法，其特征在于，使用選自由序列號I中第294?449號的氨基酸序列組成的多肽、該多肽的部分多肽、以及由在構(gòu)成這些多肽的氨基酸序列中I或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或者添加的氨基酸序列組成的多肽中的、對抗WTl抗體具有抗原性的多肽，和/或選自由序列號I中第181?324號的氨基酸序列組成的多肽、該多肽的部分多肽、以及由在構(gòu)成這些多肽的氨基酸序列中I或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或者添加的氨基酸序列組成的多肽中的、對抗WTl抗體具有抗原性的多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其中，將所述多肽的至少I種固定在固相上，通過檢測該固定的多肽與被檢測體中存在的抗WTl抗體的反應(yīng)產(chǎn)物來測定抗體量。
3.—種WTl關(guān)聯(lián)疾病的檢查方法,其特征在于，使用選自由序列號I中第294?449號的氨基酸序列組成的多肽、該多肽的部分多肽、以及由在構(gòu)成這些多肽的氨基酸序列中I或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或者添加的氨基酸序列組成的多肽中的、對抗WTl抗體具有抗原性的多肽，和/或選自由序列號I中第181?324號的氨基酸序列組成的多肽、該多肽的部分多肽、以及由在構(gòu)成這些多肽的氨基酸序列中I或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或者添加的氨基酸序列組成的多肽中的、對抗WTl抗體具有抗原性的多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢查方法，其中，該方法是判定白血病預(yù)后的方法。
5.一種癌的WTl疫苗療法中奏效者的預(yù)測或治療監(jiān)測方法，其特征在于，使用選自由序列號I中第294?449號的氨基酸序列組成的多肽、該多肽的部分多肽、以及由在構(gòu)成這些多肽的氨基酸序列中I或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或者添加的氨基酸序列組成的多肽中的、對抗WTl抗體具有抗原性的多肽，和/或選自由序列號I中第181?324號的氨基酸序列組成的多肽、該多肽的部分多肽、以及由在構(gòu)成這些多肽的氨基酸序列中I或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或者添加的氨基酸序列組成的多肽中的、對抗WTl抗體具有抗原性的多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，癌是腦腫瘤或大腸癌。
7.一種被檢測體中的抗WTl抗體的測定試劑，其含有選自由序列號I中第294?449號的氨基酸序列組成的多肽、該多肽的部分多肽、 以及由在構(gòu)成這些多肽的氨基酸序列中I或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或者添加的氨基酸序列組成的多肽中的、對抗WTl抗體具有抗原性的多肽，和/或選自由序列號I中第181?324號的氨基酸序列組成的多肽、該多肽的部分多肽、以及由在構(gòu)成這些多肽的氨基酸序列中I或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或者添加的氨基酸序列組成的多肽中的、對抗WTl抗體具有抗原性的多肽。
8.—種WTl關(guān)聯(lián)疾病的檢查用試劑,其含有選自由序列號I中第294?449號的氨基酸序列組成的多肽、該多肽的部分多肽、以及由在構(gòu)成這些多肽的氨基酸序列中I或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或者添加的氨基酸序列組成的多肽中的、對抗WTl抗體具有抗原性的多肽，和/或選自由序列號I中第181?324號的氨基酸序列組成的多肽、該多肽的部分多肽、以及由在構(gòu)成這些多肽的氨基酸序列中I或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或者添加的氨基酸序列組成的多肽中的、對抗WTl抗體具有抗原性的多肽。
9.一種自身抗體的檢測方法，其特征在于，對生物體內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行改性以使表位部分在表面露出，將該改性蛋白質(zhì)作為自身抗體識別抗原使用。
【文檔編號】C12N15/09GK103797369SQ201280044353
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年9月13日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月14日
【發(fā)明者】杉山治夫, 尾路祐介, 葛城肅典, 田中秀明, 十河真司, 后藤義博, 大本安一, 巖田房子 申請人:株式會社癌免疫研究所, 大塚制藥株式會社