專利名稱：阪崎腸桿菌噬菌體效價快速測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種阪崎腸桿菌噬菌體效價的快速測定方法。
背景技術(shù)：
阪崎腸桿菌是一種有周生鞭毛，能運動，無芽孢，兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌，可引發(fā)腦膜炎、小腸結(jié)腸炎、菌血癥等，尤其對于嬰幼兒和免疫力低下人群具有較強的致病性，死亡率高達(dá)50%_75%。阪崎腸桿菌在自然環(huán)境中廣泛存在，并且由于其生長溫度范圍寬、耐高溫、耐干燥、具有菌膜保護(hù)層等優(yōu)勢，所以，該菌一旦污染了食品生產(chǎn)環(huán)境，容易造成整個生產(chǎn)過程的污染，且不容易根除。目前，主要采用消毒試劑、高溫或紫外等物理和化學(xué)的方式殺菌。但是這些方式，容易對環(huán)境造成污染，在食品加工環(huán)境中應(yīng)用有一定局限性，且對于阪崎腸桿菌這種具有菌膜保護(hù)的細(xì)菌，有些化學(xué)試劑，殺菌效果并不理想。在這種情況下，包括噬菌體在內(nèi)的生物控制，因其對環(huán)境影響小，針對性強而得到越來越廣泛的應(yīng)用。 噬菌體是一類病毒，體積微小，只有在電子顯微鏡下才能看見，是一種非細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生命，只有進(jìn)入宿主細(xì)胞才具有生命特征，并具有寄主專一性。阪崎腸桿菌噬菌體，為烈性噬菌體，感染宿主細(xì)胞時，借用寄主的代謝機器復(fù)制噬菌體的DNA和合成噬菌體的蛋白質(zhì)，組裝成新的噬菌體，并通過宿主細(xì)胞的裂解而釋放出來，進(jìn)而再去感染附近細(xì)菌，并將它們裂解，如此反復(fù)，從而徹底殺滅細(xì)菌。而要評價其殺滅細(xì)菌的效果，就必須測定噬菌體的效價。
目前噬菌體效價的測定方法通常是采用雙層平板法進(jìn)行。該方法，操作步驟多，且在阪崎腸桿菌噬菌體效價測定時，無法得出區(qū)域明顯的噬菌斑，從而無法得出準(zhǔn)確的效價。
因此，本領(lǐng)域需要一種快速、高效、操作簡便的方法，進(jìn)行阪崎腸桿菌噬菌體效價檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測阪崎腸桿菌噬菌體效價的方法，應(yīng)用這種方法，可快速地測定阪崎腸桿菌噬菌體的效價，從而進(jìn)一步用于生物控制食品生產(chǎn)環(huán)境中阪崎腸桿菌污染。 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了一種快速檢測阪崎腸桿菌噬菌體效價的方法，所述方法包括利用酶標(biāo)儀使用動力學(xué)測定模式對加入不同濃度噬菌體的阪崎腸桿菌培養(yǎng)液進(jìn)行實時掃描，以測定阪崎腸桿菌的生長曲線。 在一個實施方案中，本發(fā)明的快速檢測阪崎腸桿菌噬菌體效價的方法包括如下步驟 A.配制噬菌體濃度梯度懸液；
B.配制阪崎腸桿菌菌懸液； C.將阪崎腸桿菌培養(yǎng)液、步驟B中的阪崎腸桿菌菌懸液和步驟A中的噬菌體梯度
3懸液依次加入微孔板中； D.實時掃描測定，利用酶標(biāo)儀，使用動力學(xué)測定模式進(jìn)行實時掃描測定阪崎腸桿 菌的生長曲線。 根據(jù)阪崎腸桿菌的生長曲線和噬菌體的濃度確定噬菌體的效價。 上述方法中的實時掃描測定在一定的培養(yǎng)溫度和波長下進(jìn)行。 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述方法中的實時掃描測定在25°C 4(TC的溫度下，
更優(yōu)選在36 ± rc的溫度下進(jìn)行。 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述方法中的實時掃描測定在600±50nm，更優(yōu)選 600nm的掃描波長下進(jìn)行。 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，在本發(fā)明的方法中，所述實時掃描測定在一定的培 養(yǎng)溫度和波長下，使用動力學(xué)測定模式進(jìn)行測定，其中所述培養(yǎng)溫度為25°C 4(TC，更優(yōu) 選為36士rC，且所述掃描波長為600士50nm，更優(yōu)選為600nm ; 在一個實施方案中，在本發(fā)明的方法中，噬菌體稀釋梯度懸液以IO倍梯度進(jìn)行稀 釋。 在一個實施方案中，在本發(fā)明的方法中，培養(yǎng)阪崎腸桿菌至對數(shù)生長期，配制對數(shù) 生長期的阪崎腸桿菌菌懸液。在本發(fā)明的上述方法的步驟C中，阪崎腸桿菌培養(yǎng)液可以是 任何適合培養(yǎng)阪崎腸桿菌的培養(yǎng)液。在一個實施方案中，在本發(fā)明的方法中，阪崎腸桿菌培 養(yǎng)液為腦心浸液培養(yǎng)液。 在一個實施方案中，在本發(fā)明的上述方法的步驟C中，阪崎腸桿菌培養(yǎng)液為含有 阪崎腸桿菌顯色底物的腦心浸液培養(yǎng)液。優(yōu)選地，所述阪崎腸桿菌顯色底物為X- a -D-吡 喃葡萄糖苷。 在一個實施方案中，在本發(fā)明的上述方法的步驟C中，以測定時間為X軸，以吸收 值為Y軸來制作生長曲線，并根據(jù)出現(xiàn)陡峭型生長曲線的噬菌體濃度梯度情況，確定噬菌 體的效價。 在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述快速檢測阪崎腸桿菌噬菌體效價的方法包 括如下步驟 A.十倍稀釋噬菌體溶液，得到噬菌體濃度梯度懸液； B.將阪崎腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，將阪崎腸桿菌接種至腦心浸液培養(yǎng)液中，培 養(yǎng)6 8小時； C.將含有阪崎腸桿菌顯色底物X- a -D-吡喃葡萄糖苷的腦心浸液培養(yǎng)液加入微 孔板；將步驟B中的對數(shù)生長期的阪崎腸桿菌菌懸液加入微孔板；然后將步驟A中的噬菌 體梯度懸液加入微孔板； D.實時掃描測定，利用酶標(biāo)儀，在一定的培養(yǎng)溫度和波長下，使用動力學(xué)測定模式
進(jìn)行測定，所述培養(yǎng)溫度為36 ± 1°C ，所述掃描波長為600nm ; 根據(jù)出現(xiàn)陡峭型阪崎桿菌生長曲線的噬菌體的濃度，確定噬菌體的效價。 本發(fā)明的測定方法的步驟B中，將阪崎腸桿菌培養(yǎng)到對數(shù)生長期，在該生長期，阪
崎腸桿菌對噬菌體敏感度高，實驗效果明顯。 一般而言，阪崎腸桿菌被接種至腦心浸液培養(yǎng)
液中，36t:培養(yǎng)，2 10小時為對數(shù)生長期，其中6 8小時為更優(yōu)選。 本發(fā)明的測定方法的步驟C中，阪崎腸桿菌顯色底物為X-a -D-吡喃葡萄糖苷
4(X-a -D-glucopyranoside)，因阪崎腸桿菌具有特異性的a _D_葡萄糖苷酶活性，因此，在
阪崎腸桿菌生長過程中，該活性能使得顯色底物分解產(chǎn)生藍(lán)綠色產(chǎn)物，從而使得培養(yǎng)液由
無色變?yōu)樗{(lán)綠色，并且藍(lán)綠色的深淺與阪崎腸桿菌的數(shù)量在一定范圍內(nèi)呈正比。 在一個優(yōu)選實施方案中，在步驟C中，使用的對照包括陽性對照、空白對照。陽性
對照為以無菌水代替噬菌體；空白對照為以無菌水代替阪崎腸桿菌菌懸液。 在本發(fā)明的方法的步驟D中，生長曲線以測定時間為X軸，以吸收值為Y軸。在本
發(fā)明的一個實施方案中，采用了 Termo公司的Multiskanspectrum酶標(biāo)儀的Skanltso軟件
的動力學(xué)分析功能制作生長曲線。生長曲線可分為三種類型陡峭型、中間型、平緩型。陡峭
型延滯期短，對數(shù)期基本上呈直線上升，穩(wěn)定期維持在高吸收值，且持續(xù)時間長；中間型
延滯期長，對數(shù)期緩慢上升，穩(wěn)定期維持在較低的吸收值；平緩型整個曲線貼近X軸呈直
線型或拋物線型，一直維持較低的吸收值。陽性對照和不含有噬菌體的測試孔為陡峭型生
長曲線，因為陽性對照和不含噬菌體的測試孔中阪崎腸桿菌不會受到噬菌體裂解，從而隨
著時間的增長，菌體不斷繁殖，其葡萄糖苷酶活性不斷作用顯色底物，從而使得培養(yǎng)液顏色
不斷加深，測得的吸收值不斷升高，呈陡峭型生長曲線。含有噬菌體的測試孔為中間型或平
緩型生長曲線。噬菌體量多時，大量噬菌體及時裂解了阪崎腸桿菌，從而使得阪崎腸桿菌根
本無法繁殖，不足以產(chǎn)生足夠的葡萄糖苷酶活性作用顯色底物使培養(yǎng)液變色，所以測得的
吸收值無法升高，因此生長曲線為平緩型。噬菌體量少時，噬菌體能裂解一些阪崎腸桿菌，
但是仍然有一些阪崎腸桿菌得以繁殖，所以能夠產(chǎn)生一定的葡萄糖苷酶活性作用顯色底物
使得培養(yǎng)液緩慢地顏色變化，所以測得的吸收值緩慢上升，因此生長曲線為中間型生長曲
線。空白對照，因為未加入阪崎腸桿菌，所以應(yīng)該為一基線。
本發(fā)明的測定方法中，計算效價的原理如下。當(dāng)將噬菌體梯度稀釋后加入測試孔
中，最初的幾個測試孔中噬菌體濃度高，因此其生長曲線為平緩型；隨著測試管中噬菌體濃
度不斷減少，因此其生長曲線逐漸變?yōu)橹虚g型；當(dāng)噬菌體稀釋到濃度很低時，測試管中已無
噬菌體，因此其生長曲線逐漸成為陡峭型。在梯度稀釋的測試孔中，出現(xiàn)陡峭型生長曲線之
前的測試孔的稀釋度，是噬菌體對寄主產(chǎn)生作用的最低稀釋度，則該測試孔中噬菌體數(shù)至
少為l個，其濃度約為l個/300i!L。據(jù)此可計算出噬菌體原液的效價。 本發(fā)明提供了一種阪崎腸桿菌噬菌體效價的快速檢測方法，其是通過噬菌體抑制
阪崎腸桿菌在腦心浸液培養(yǎng)液中的生長情況，定量阪崎腸桿菌噬菌體的效價。 本發(fā)明適宜于阪崎腸桿菌噬菌體效價的快速測定，如發(fā)現(xiàn)噬菌體效價低，則需要
恢復(fù)噬菌體的活性，從而更好地用于食品，特別是乳制品生產(chǎn)加工環(huán)境的生物控制。 按照本發(fā)明所述的阪崎腸桿菌噬菌體效價的測定方法，可以將該方法簡述為噬
菌體濃度梯度懸液配制——對數(shù)生長期阪崎腸桿菌培養(yǎng)——噬菌體和阪崎腸桿菌加入微
孔板——實時掃描測定——確定阪崎腸桿菌噬菌體效價。如發(fā)現(xiàn)噬菌體效價低，則需要恢
復(fù)噬菌體的活性，從而更好地用于食品，特別是乳制品生產(chǎn)加工環(huán)境的生物控制。當(dāng)將噬菌
體梯度稀釋后加入測試孔中，最初的幾個測試孔中噬菌體濃度高，因此其生長曲線為平緩
型；隨著測試管中噬菌體濃度不斷減少，因此其生長曲線逐漸變?yōu)橹虚g型；當(dāng)噬菌體稀釋
到濃度很低時，測試管中已無噬菌體，因此其生長曲線逐漸成為陡峭型。在梯度稀釋的測試
孔中，出現(xiàn)陡峭型生長曲線之前的測試孔的稀釋度，是噬菌體對寄主產(chǎn)生作用的最低稀釋
度，則該測試孔中噬菌體數(shù)至少為l個，其濃度約為l個/300i!L。據(jù)此可計算出噬菌體原液的效價。 根據(jù)本發(fā)明的一個特定實施方案，本發(fā)明的測定方法包括以下步驟 A.濃度梯度懸液配制，將阪崎腸桿菌噬菌體病毒株進(jìn)行活性恢復(fù)，配制噬菌體稀
釋梯度懸液。將阪崎腸桿菌噬菌體加入到阪崎腸桿菌菌懸液中培養(yǎng)16 24小時，觀察菌
懸液澄清，說明噬菌體活性恢復(fù)。使用細(xì)菌濾器過濾培養(yǎng)混合液，去除阪崎腸桿菌細(xì)胞，得
到噬菌體溶液。使用生理鹽水，十倍稀釋噬菌體溶液，得到噬菌體濃度梯度懸液。 B.培養(yǎng)，將阪崎腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期。將阪崎腸桿菌接種至腦心浸液培養(yǎng)液
中，培養(yǎng)2 10小時。后續(xù)試驗中，阪崎腸桿菌對噬菌體最敏感的培養(yǎng)時間為6 8小時。 C.加樣，配制含有阪崎腸桿菌顯色底物的腦心浸液培養(yǎng)液，加入微孔板；然后對
數(shù)生長期的阪崎腸桿菌菌懸液到微孔板；最后分別加入一定濃度梯度的噬菌體梯度懸液至
微孔板；每種處理2 5次重復(fù)；每次檢測需要設(shè)定對照； D.實時掃描測定，利用酶標(biāo)儀，在一定的培養(yǎng)溫度和波長下，使用動力學(xué)測定模式 進(jìn)行測定；實時掃描測定將微孔板放入酶標(biāo)儀中，在預(yù)定的培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)后，于一定的 波長下，使用動力學(xué)測定模式進(jìn)行掃描測定阪崎腸桿菌在噬菌體存在情況下的生長曲線；
根據(jù)出現(xiàn)陡峭型生長曲線的噬菌體濃度梯度情況，確定噬菌體的效價，在梯度稀 釋的測試孔中，出現(xiàn)陡峭型生長曲線之前的測試孔的稀釋度，是噬菌體對寄主產(chǎn)生作用的 最低稀釋度，則該測試孔中噬菌體數(shù)至少為l個，其濃度約為l個/300iiL。據(jù)此可計算出 噬菌體原液的效價。 使用本檢測方法，能夠簡單、快速、高效地測定阪崎腸桿菌噬菌體的效價。


圖1為阪崎腸桿菌噬菌體效價測定結(jié)果圖。
具體實施例方式
通過實施例的方式對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但是本發(fā)明并不僅僅局限于以下實 施例。 實施例 本實施例提供本發(fā)明的快速測定阪崎腸桿菌噬菌體效價的方法的典型實例。
該方法包括以下步驟
1.噬菌體的制備: 阪崎腸桿菌的菌懸液的制備將阪崎腸桿菌(來自中國檢科院食品安全微生物菌 種保藏管理中心)接種至10mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液(營養(yǎng)肉湯購自北京陸橋技術(shù)有限公司產(chǎn) 品，中國，按產(chǎn)品說明書配制營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液)中，在36t: 士rC下，培養(yǎng)8 12小時。通 過分光光度儀測定0D6。。，0D6。。大于0. 5表明阪崎腸桿菌處于對數(shù)生長期，停止培養(yǎng)，此時阪 崎桿菌對噬菌體敏感性最高。吸取阪崎腸桿菌菌懸液lmL，加入99mL雙倍濃度的營養(yǎng)肉湯 培養(yǎng)液中。 噬菌體的制備從適合噬菌體生長地采集樣本。在本實施例中，從污染嚴(yán)重的北京 市朝陽區(qū)高碑店污水處理廠附近的河水采樣，經(jīng)脫脂棉過濾除去雜質(zhì)，取100mL加入前一 步驟中100mL含阪崎腸桿菌的雙倍濃度的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中，36t: 士rC培養(yǎng)24 36小時。吸取培養(yǎng)混合液lmL，經(jīng)無菌濾器(0. 22 ii m微孔濾膜)過濾除菌。取濾液0. lmL，制備 阪崎腸桿菌和噬菌體的雙層平板，36°C ± rC培養(yǎng)，4 8小時后觀察噬菌斑，可增加平板數(shù) (5 10塊)，從而提高獲得噬菌斑的幾率。取雙層平板上單個噬菌斑的瓊脂塊加入5mL營 養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中，室溫放置1 2小時后fC過夜。吸取lmL泡有噬菌斑瓊脂塊的營養(yǎng)肉湯 培養(yǎng)液，加入按照前述方法制備的含有對數(shù)生長期阪崎腸桿菌的菌懸液0. lmL，加入營養(yǎng)肉 湯培養(yǎng)液9mL，36t: 士rC培養(yǎng)24 36小時。觀察培養(yǎng)液由渾濁而變澄清，將培養(yǎng)混合液 按照前述方法過濾除菌。重復(fù)上述步驟2次，即得到純化的噬菌體。分裝4t:保存?zhèn)溆谩?
如果，保存一段時間后，噬菌體活性下降，可將阪崎腸桿菌噬菌體加入到阪崎腸桿 菌菌懸液中培養(yǎng)16 24小時，觀察菌懸液澄清，說明噬菌體活性恢復(fù)。按照前述方法過濾 除菌，得到活性恢復(fù)的純化噬菌體溶液。
2.噬菌體濃度梯度溶液配制: 吸取lmL噬菌體溶液至9mL滅菌生理鹽水中，配制10—1稀釋度的噬菌體溶液；吸取 lmL10—1稀釋度的噬菌體溶液至9mL滅菌生理鹽水中，配制10—2稀釋度的噬菌體溶液；重復(fù) 上述步驟，可配制一系列的相差十倍稀釋度的噬菌體梯度稀釋溶液。
3.鍾被其月阪墨木干舗雄白儘ll : 按照前述方法制備阪崎腸桿菌菌株，隨機選取4株，按中國檢科院食品安全微 生物菌種保藏管理中心(IQCC)編號規(guī)則編號為IQCC10403. 7、 10403. 14、 10403. 17和 10403. 18，其為阪崎腸桿菌代表性菌株，具有阪崎腸桿菌的所有功能，制備它們的對數(shù)生長
期菌懸液。 4.加樣; 配制含有0. 1 % (W/W)阪崎腸桿菌顯色底物(X- a _D_吡喃葡萄糖苷，購買于北京
路橋技術(shù)有限責(zé)任公司)的腦心浸液培養(yǎng)液，每個微孔中加入240 i！ L。將步驟3中的阪崎腸桿菌菌株IQCC10403. 7、 10403. 14、 10403. 17和10403. 18進(jìn)
行濃度稀釋為約100 1000CFU/mL，每個微孔中加入30y L。 分別加入步驟2中的噬菌體梯度懸液30 ii L至微孔。 每種處理2次重復(fù)。每次檢測設(shè)定陽性對照和空白對照；陽性對照，采用30yL無 菌水替代噬菌體；空白對照采用無菌水替代阪崎腸桿菌。
4.實時掃描測定 加完樣后，蓋上微孔板蓋。放入掃描儀中。將掃描儀培養(yǎng)溫度設(shè)為36t:，打開動力 學(xué)研究軟件，每隔10分鐘在600nm處檢測1次，檢測時間為8小時。作每孔的吸收與時間 曲線圖。 確定阪崎腸桿菌噬菌體效價根據(jù)出現(xiàn)陡峭型生長曲線的噬菌體濃度梯度情況，
確定噬菌體的效價。
結(jié)果: 如圖1所示，Al Hl為空白對照，A12 H12為陽性對照，其余為噬菌體加入到 4株阪崎腸桿菌中培養(yǎng)的結(jié)果。A2、 B2為噬菌體原液抑制阪崎腸桿菌IQCC10403. 7生長情 況，A3、 B3為10—1噬菌體溶液抑制阪崎腸桿菌IQCC10403. 7生長情況，依次類推，A4、 B4 All、 Bll分別為10—2 10—9噬菌體溶液抑制阪崎腸桿菌IQCC10403. 7生長情況；C2、 D2 C11、D11分別為原液 10—9噬菌體溶液抑制阪崎腸桿菌IQCC10403. 14生長情況；E2、F2 E11、F11分別為原液 10—9噬菌體溶液抑制阪崎腸桿菌IQCC10403. 17生長情況；G2、H2 Gll、 Hll分別為原液 10—9噬菌體溶液抑制阪崎腸桿菌IQCC10403. 18生長情況。噬菌體 原液經(jīng)過梯度稀釋，直至10—4 10—6稀釋度，阪崎腸桿菌均為平緩型生長曲線，說明在噬菌 體濃度較高時，4株阪崎腸桿菌的生長均受到了抑制。當(dāng)噬菌體稀釋至10—5 10—7時，阪崎 腸桿菌出現(xiàn)陡峭型生長曲線。10—4 10—6是噬菌體對寄主產(chǎn)生作用的最低稀釋度，該測試孔 中噬菌體數(shù)至少為1個，其濃度約為1個/300 ii L，及3. 33個/mL ;據(jù)此類推，加入噬菌體原 液的測試孔中噬菌體濃度為3. 33X 104 106個/mL ;由于30 y L噬菌體加入測試孔，最終 體積達(dá)300 ii L，被稀釋了 10倍，因此，噬菌體原液的濃度應(yīng)為3. 33X 105 107個/mL?？?見，分離到的該株噬菌體對4株阪崎腸桿菌均有較好的抑制生長作用，其效價數(shù)量級可達(dá) 到105 107個/ml。由于，噬菌體的效價是根據(jù)其對寄主的裂解效果測定的，其裂解效果 也與寄主的特性有關(guān)，因此，給出的效價為一個范圍值。 以上所使用的分離的4株阪崎腸桿菌IQCC10403. 7、 10403. 14、 10403. 17、 10403. 18并不是完成本發(fā)明所必須使用的生物材料，使用所有的阪崎腸桿菌均可以實現(xiàn)本 發(fā)明的效果。
比較例 本發(fā)明的發(fā)明人還使用雙層平板法測定了以上制備的噬菌體對以上制備的阪崎 腸桿菌的噬菌體效價，以與本發(fā)明的方法進(jìn)行比較。
所采用的雙層平板法具體操作如下 在5 10ml LB培養(yǎng)基中接種阪崎腸桿菌，培養(yǎng)8 12小時，直至對數(shù)生長中期 (0D6。。大于0. 5)。 配制腦心浸液培養(yǎng)基，滅菌后倒平板，配制底層培養(yǎng)基。每個平板約10 15ml培 養(yǎng)基(太少，不利于細(xì)菌生長；太多影響噬菌斑觀察)。 配制頂層腦心浸液培養(yǎng)基，分裝至無菌培養(yǎng)管內(nèi)，每管2700ml，45t:水浴備用(溫 度太高，影響噬菌體和細(xì)菌活性；溫度太低培養(yǎng)基凝固太快，易不均勻，影響結(jié)果觀察)。
以腦心浸液培養(yǎng)液10倍比稀釋噬菌體。每次稀釋都換用新的加樣槍頭，使用氣溶 膠阻隔槍頭以避免交叉污染。 將對數(shù)生長期的阪崎腸桿菌菌懸液分裝至小指管中，每管200 iU。將倍比稀釋 的噬菌體加入含離心管中，一支離心管中僅加入一種稀釋液100iU，快速渦旋，室溫孵育 lmin 5min。 將共計300 ii 1混合液轉(zhuǎn)移至45t:水浴的頂層腦心浸液培養(yǎng)基中，快速渦旋混勻， 立即傾倒至底層平板，輕緩搖動平板使頂層培養(yǎng)基均勻分布。
冷卻平板5min， 37。C倒置培養(yǎng)過夜。 噬菌斑計數(shù)以噬菌斑數(shù)為100左右的平皿為準(zhǔn)，噬菌斑數(shù)乘以稀釋度即可獲得每 噬菌體效價，單位pfu。 以上進(jìn)行的雙層平板法，每個實驗重復(fù)3次以上。 雙層平板法獲得的結(jié)果差異較大，多次實驗沒有觀察到噬菌斑，而觀察到噬菌斑 的實驗結(jié)果也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于本發(fā)明所使用的利用酶標(biāo)儀的方法測定的噬菌體對阪崎桿菌的效 價數(shù)量級。 雙層平板法對操作有較高要求，無經(jīng)驗、不熟練的操作人員很難得到理性的實驗結(jié)果。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點為可簡單、快速、高效地測定阪崎腸桿菌噬 菌體效價。 雖然已經(jīng)對本發(fā)明的具體實施方案進(jìn)行了描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到， 在不偏離本發(fā)明的范圍或精神的前提下可以對本發(fā)明進(jìn)行多種改變與修飾。因而，本發(fā)明 意欲涵蓋落在附屬權(quán)利要求書及其同等物范圍內(nèi)的所有這些改變與修飾。
權(quán)利要求
一種快速測定阪崎腸桿菌噬菌體效價的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟A.配制噬菌體濃度梯度懸液；B.配制阪崎腸桿菌菌懸液；C.將阪崎腸桿菌培養(yǎng)液、步驟B中的阪崎腸桿菌菌懸液和步驟A中的噬菌體梯度懸液依次加入微孔板中；D.實時掃描測定，利用酶標(biāo)儀，使用動力學(xué)測定模式進(jìn)行實時掃描測定生長曲線。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟D中的實時掃描測定在25°C 4(TC的溫度下進(jìn)行。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟D中的實時掃描測定在36± 1°C的溫度下進(jìn)行。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步驟D中的實時掃描測定在600±50nm的掃描波長下進(jìn)行。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟D中的實時掃描測定在600nm的掃描波長下進(jìn)行。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述步驟B中的阪崎腸桿菌為培養(yǎng)至對數(shù)生長期的阪崎腸桿菌。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟C中的阪崎腸桿菌培養(yǎng)液為腦心浸液培養(yǎng)液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟C中的阪崎腸桿菌培養(yǎng)液為含有阪崎腸桿菌顯色底物的腦心浸液培養(yǎng)液。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述阪崎腸桿菌顯色底物為X-a -D-妣喃葡萄糖苷。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟A. 十倍稀釋噬菌體溶液，得到噬菌體濃度梯度懸液；B. 將阪崎腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，將阪崎腸桿菌接種至腦心浸液培養(yǎng)液中，培養(yǎng)6 8小時；C. 將含有阪崎腸桿菌顯色底物X-a -D-吡喃葡萄糖苷的腦心浸液培養(yǎng)液加入微孔板；將步驟B中的對數(shù)生長期的阪崎腸桿菌菌懸液加入微孔板；然后將步驟A中的噬菌體梯度懸液加入微孔板；D. 實時掃描測定，利用酶標(biāo)儀，在一定的培養(yǎng)溫度和波長下，使用動力學(xué)測定模式進(jìn)行測定，所述培養(yǎng)溫度為36士rC，所述掃描波長為600nm ;根據(jù)出現(xiàn)陡峭型阪崎腸桿菌生長曲線的噬菌體的濃度，確定噬菌體的效價。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速測定阪崎腸桿菌噬菌體效價的方法，其包括如下步驟A.配制噬菌體濃度梯度懸液；B.配制阪崎腸桿菌菌懸液；C.將阪崎腸桿菌培養(yǎng)液、步驟B中的阪崎腸桿菌菌懸液和步驟A中的噬菌體梯度懸液依次加入微孔板中；D.實時掃描測定，利用酶標(biāo)儀，在一定的培養(yǎng)溫度和波長下，使用動力學(xué)測定模式進(jìn)行實時掃描測定生長曲線。使用本發(fā)明的測定方法，能夠簡單、快速、高效地確定阪崎腸桿菌噬菌體效價。
文檔編號C12Q1/70GK101775444SQ20101011805
公開日2010年7月14日 申請日期2010年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月5日
發(fā)明者袁飛 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院;袁飛