專利名稱：檢測抗p53抗體的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測能與p53蛋白，特別是人的p53蛋白，結(jié)合的抗體的方法。
背景野生型p53基因是一種編碼細胞的野生型p53蛋白的腫瘤抑制基因。內(nèi)源性野生型p53蛋白在多種癌細胞內(nèi)，如乳腺癌細胞和肺癌細胞內(nèi)，是缺乏的(或缺如或突變)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)給缺乏內(nèi)源性野生型p53蛋白的癌細胞施予野生型p53基因能通過抑制其腫瘤的表型用以治療癌癥。見美國專利5,532,220。
在實行p53基因治療中，極希望在曝露于外源p53基因之前及后監(jiān)測患者的血清樣品，以確定應(yīng)此種曝露的免疫原性反應(yīng)是否增高。這可通過利用在血清樣品中篩選能夠結(jié)合p53的抗體的試驗來完成。而且，由于有些癌癥患者對他們生成的突變p53產(chǎn)生抗體，很需要有一種診斷試驗來測定血清樣品中存在的能結(jié)合p53的抗體。
在PCT專利出版物WO94/10306中Soussi等披露了一種試驗方法，用生物素化的肽以酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的形式檢測患者血清樣品中的p53抗體。然而，仍極期望提供一種新的、改進的檢測p53抗體的試驗方法。需要改進的主要方面如下首先，急需一種更適于檢測低親和力抗體的試驗方法。采用ELISA方法在這方面有困難，因為ELISA需要多次的溫育步驟及隨后的洗滌循環(huán)，在此過程中低親和力抗體會被洗掉。其次，需要一種比使用ELISA方式的麻煩程度低的方法。第三，需要顯著地縮短分析時間，最好是每樣品少于10分鐘，以便能進行高流通量的分析。如上所述，ELISA需要多次的溫育步驟及隨后的洗滌循環(huán)，因此試驗中所使用的材料不能再生用于其后樣品的分析。
發(fā)明概述本發(fā)明能滿足前述的需要，提供一種測定能與p53蛋白結(jié)合的抗體的方法，包括A)將一種肽直接固定在生物傳感器中的傳感芯片的流動池上，該肽能特異性地與抗p53的抗體相結(jié)合，B)從待測患者獲得血清樣品并將此血清樣品稀釋在適當?shù)木彌_液中，C)使稀釋的血清樣品與固定化的肽接觸，以及D)用生物傳感器測定抗體與固定化肽的結(jié)合。
在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選使用多數(shù)的選擇的免疫原性肽，每一種肽直接固定在各自分別的流動池上。優(yōu)選地，第一種肽選自p53蛋白的氨基端區(qū)域，第2種肽選自p53蛋白的羧基端區(qū)域。更優(yōu)選地，本發(fā)明使用以下4種肽中的一種或多種(或與之具有基本序列同一性的肽)a)包含序列1(C11-35，相當于人p53蛋白殘基11-35；H-CEPPLSQETFSDLWKLLPENVLSPL-酰胺)的一種肽，或與之具有基本序列同一性的一種肽；b)包含序列2(C40-65，相當于人p53蛋白殘基40-65H-CMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPR-酰胺)的一種肽，或具有基本序列同一性的一種肽；c)包含序列3(C346-370，相當于人p53蛋白殘基346-370H-EALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLK-酰胺)的一種肽，或具有基本序列同一性的一種肽；以及d)包含序列4(C371-390，相當于人p53蛋白殘基371-390H-CSKKGQSTSRHKKLMFKTEGP-酰胺)的一種肽，或具有基本序列同一性的一種肽，(以上列舉序列采用標準的單字母氨基酸符號；見，如，Lehninger，Principles of Biochemistry，Worth Publishers，Inc第6版，1998，p.96)。
附圖簡述

圖1以響應(yīng)單位對稀釋倍數(shù)作圖，表示上述4種肽對正常人血清中抗體的相對靈敏度。
圖2以響應(yīng)單位對稀釋倍數(shù)作圖，表示上述4種肽對正常豬血清中抗體的相對靈敏度。
圖3A及3B以圖形描述正常人血清樣品中抗體(對上述4種肽)的結(jié)合。圖中縮寫NHS＝混合的正常人血清。POS＝羊多克隆抗體以1∶200稀釋于混合正常人血清中。對于肽C11-35，均值為41.1，標準差(SD)為29.8；對于肽C40-65，均值為30.6，標準差為27.0；對于肽C346-370，均值為38.9；標準差為30.9；對于肽C371-390，均值為38.0，標準差為18.7。
圖4A及4B以圖形描述正常豬血清樣品中抗體(對上述4種肽)的結(jié)合。圖中，NPS＝混合正常豬血清，1∶40稀釋，POS＝羊多克隆抗體以1∶200稀釋于混合正常豬血清中。對于肽C11-35，均值為50.9，標準差17.7；對于肽C40-65，均值為52.9，標準差15.6；對于肽C346-370，均值為35.0，標準差16.6，對于肽C371-390，均值為38.8，標準差14.8。
發(fā)明詳述此處引用的一切參考文獻均全文引入以供參考。
本發(fā)明方法中，選用的免疫原性肽直接固定在生物傳感器的傳感芯片的流動池上。以往的試驗，例如Soussi等的試驗所采用的ELISA方式利用固定化的鏈親和素去捕獲生物素化的肽，因此，肽的固定是間接的。此處例子(下文詳述)中描述的優(yōu)選實施方案中，直接固定技術(shù)包括使用胺及/或巰基化學(xué)法直接固定N-標記的半胱氨酸肽。
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)直接固定法具有數(shù)種關(guān)鍵性的優(yōu)勢，包括對低親和力抗體的檢測要好得多(得到顯著奪更加精確的分析)。此外，本發(fā)明顯著地縮短分析時間，得以進行高流通量的分析。與以往的測定不同，本發(fā)明的測定法具有直接固定的特征，藉以下事實得以實現(xiàn)高流通量，即在分析了一個樣品后，在此測定中所用過的材料能迅速再生用于以后樣品的分析。本發(fā)明的直接固定技術(shù)允許用試劑，如HCl-SDS溶液(優(yōu)選25mM HCl-0.25％SDS)進行快速而容易的洗滌。
本發(fā)明還提供一種測定方法只需要少量的血清，例如少于5μl，來進行一次分析。過去的測定采用ELISA型式的微量滴定板可能需要病人更多的血清，例如當需要鑒定病人生成的抗體特性時。在這方面，發(fā)明人也已發(fā)現(xiàn)他們的新方法能對測出的抗體進行同種型鑒定而不需要另外的樣品。(Soussi等的測定方法為確定同種型需要多次使用樣品)。
本發(fā)明方法中采用的優(yōu)選肽選自以下a)肽C11-35，相當于人p53蛋白殘基11-35；H-CEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPL-酰胺；b)肽C40-65，相當于人p53蛋白殘基40-65H-CMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPR-酰胺；c)肽C346-370，相當于人p53蛋白殘基346-370H-CEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLK-酰安；以及d)肽C371-390，相當于人p53蛋白殘基371-390H-CSKKGQSTSRHKKLMFKTEGP-酰胺，與上述肽具有基本序列同一性的肽也能在優(yōu)選實施方案中使用。此外，“基本序列同一性”的含義是當兩種肽序列，進行最優(yōu)方式對比時，譬如藉使用“缺失間隔加權(quán)”的GAP或BESTFIT程序，具有至少80％序列同一性，優(yōu)選地至少90％序列同一性，更優(yōu)選地至少95％序列同一性或更高。優(yōu)選地，不同一的殘基位置的差異是保守性氨基酸替換。例如，具有相似化學(xué)性質(zhì)如電荷或極性的氨基酸的替換不大可能影響蛋白質(zhì)的性質(zhì)。這類例子包括谷氨酰胺替代天冬酰胺或谷氨酸替代天冬氨酸。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中多種被選擇的免疫原性肽能得到直接固定，每種固定在各自分隔的流動池上。例如，第一個肽可選自p53蛋白的氨基端區(qū)，第二個肽可選自p53蛋白的羧基端區(qū)。在一個更為具體的例子中，第一個肽包含序列1(H-CEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPL-酰胺)，第二個肽包含序列4(H-CSKKGQSTSRHKKLMFKTEGP-酰胺)。此外，還可使用第三個肽，其包含序列2(H-CMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPR-酰胺)，第四個肽，其包含序列3(H-CEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLK-酰胺)。
本發(fā)明方法中也可使用磷酸化肽。特別是，絲氨酸殘基可被磷酸絲氨酸殘基替換，蘇氨酸殘基可被磷酸蘇氨酸殘基替換。作為例子，成功地應(yīng)用于本發(fā)明方法的肽選自以下a)一種包含序列1的肽，或一種與之具有基本序列同一性的肽，其中肽內(nèi)的所有絲氨酸殘基被替換為磷酸絲氨酸殘基；以及
b)一種包含序列3的肽，或一種與之具有基本序列同一性的肽，其中肽內(nèi)的所有絲氨酸殘基被替換為磷酸絲氨酸殘基。
本發(fā)明所采用的生物傳感器優(yōu)選為BIAcore(Uppsalla，瑞典)的BIAcore 2000TM(以前可從Pharmacia獲得)。BIAcore 2000TM以表面等離子體振子共振原理操作并可作高流通量分析，(見如，Hodgson，Bio/Technology vol.12 Jan，1994，生物傳感器的綜述)其它生物傳感器，如BIAcore的BIA core X或Fisons的IAsys生物傳感器可與本發(fā)明結(jié)合使用。在分析測定結(jié)果時，優(yōu)選與每種肽結(jié)合的抗體量與生物傳感器的信號成正比(如，BIAcore 2000TM生物傳感器報告的響應(yīng)單位)。
在執(zhí)行本發(fā)明方法中，在將血清樣品與固定化肽同時接觸的步驟之前，優(yōu)選用含有去垢劑P-20及羧甲基葡聚糖的HEPES緩沖鹽溶液將待分析血清樣品稀釋為1∶2～1∶500 (更優(yōu)選為1∶2～1∶500，更加優(yōu)選稀釋為1∶40)。
參考以下實例可以了解本發(fā)明的較寬范圍，這個實例并不意味著此發(fā)明局限于特定的實施方案。
實例此處敘述的特定實例中，每一種肽直接固定在BIAcore 2000TM(BIAcore，Uppsalla，瑞典)的傳感器芯片分隔流動池的表面。血清樣品進行稀釋(在本例中，1∶40稀釋于含去垢劑P-20及羧甲基葡聚糖的HEPES緩沖鹽溶液)，并使之同時與每個固定肽進行結(jié)合。與每種肽結(jié)合的抗體量與儀器報告的響應(yīng)單位成正比。這些流動池同時用25mMHCl-0.25％SDS再生，以除去結(jié)合的抗體，然后分析下一個樣品。
以下數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明測定法能精確地測出人和豬血清樣品中的p53抗體，而且測定以自動化的形式進行，實現(xiàn)高流通量的樣品的分析。一個傳感器芯片可用以分析多個人員在藥利前及藥劑后的樣品，并在每次測定的超始及終末同時分析一個陽性對照(如，來自O(shè)ncogene Sciences或相當者的羊多克隆抗p53抗體)和陰性對照(混合血清)。
判斷樣品存在抗人p53抗體“陽性”的起始標準為1)對任一固定肽的結(jié)合超過閾值，2)證實這種結(jié)合是由于免疫球蛋白。或者，同種型試劑抗人IgGl，抗人IgG2，抗人IgG3，抗人IgG4，抗人IgA及抗人IgM(來自ICN或相當者可被加在序列中并監(jiān)測其結(jié)合。一個人如果將其在給與含p53基因的遞送運載體(如，載體)后所采樣品與其本人在給藥前的樣品相比較，結(jié)合超過了閾值，后響應(yīng)單位增高至少2倍，就可以認為他已產(chǎn)生了抗p53的抗體。(關(guān)于載體，Wills等描述了一種腺病毒p53基因治療載體的構(gòu)建，Human Gene Therapy 51079(1994))。II.合成肽的選擇以下合成肽(每一個用-N-末端半胱氨酸殘基合成以促進偶聯(lián))選用于本例中的測定。
a)肽C11-35，相當于人p53蛋白殘基11-35；H-CEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPL-酰胺(序列1)。
b)肽C40-65，相當于人p53蛋白殘基40-65H-CMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPR-酰胺(序列2)。
c)肽C346-370，相當于人p53蛋白殘基346-370H-CEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLK-酰胺(序列3)。
d)肽C371-390，相當于人p53蛋白殘基371-390H-CSKKGQSTSRHKKLMFKTEGP-酰胺(序列4)。III.合成肽的固定及再生穩(wěn)定性肽C371-390用氨基偶聯(lián)固定。為此固定化，將肽在20mM硼酸緩沖液pH8中稀釋至100μg/ml。其余三個肽用巰基偶聯(lián)固定。肽C11-35在10mM醋酸鈉緩沖液pH4中稀釋至700μg/ml，肽C40-65在10mM醋酸鈉緩沖液pH4中稀釋至1mg/ml；肽C346-370在10mMMES緩沖液pH5中稀釋至500μg/ml。
肽的固定化總結(jié)于表1。(表1～7一起放在節(jié)X之后)。表1的數(shù)據(jù)表明肽的固定化有變異性。這種變異并不影響測定的精確性(在下文節(jié)V中討論)。這些數(shù)據(jù)提示很重要的是要核實所固定的肽量是以結(jié)合1∶200稀釋的陽性對照抗體。以25mM HCl和0.25％SDS再生中的穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)(表1)說明固定肽表面至少在147個再生循環(huán)中是穩(wěn)定的，因為在經(jīng)過多個再生循環(huán)后陽性對照平行測定的結(jié)合，對所有肽來說，都在20.4％變異系數(shù)(“CV”)內(nèi)。IV.線性/靈敏度藉測定不同稀釋度的羊陽性對照抗體，并將響應(yīng)單位對樣品稀釋倍數(shù)作圖測定了本試驗方法的線性。(BIAcore 2000TM生物傳感器的1000響應(yīng)單位(或共振單位)相當于1ng/mm2，見，如，BIAcore方法手冊)。如圖1所示，稀釋于混合正常人血清中的陽性對照的響應(yīng)在1∶10的起始稀釋度直至1∶2560稀釋度依賴于抗體濃度。C346-370肽被陽性對照的識別不象其它三種肽那樣強。這些數(shù)據(jù)表明測定方法在將近2-10g濃度的范圍內(nèi)是靈敏的。圖2的數(shù)據(jù)顯示羊陽性對照稀釋于混合正常豬血清中的靈敏度是相似的。在兩種血清中，陽性對照與C11-35肽的反應(yīng)最強，按其反應(yīng)性依次為C40-65肽，C371-390肽，最后是識別較弱的C346-370肽。
此處需要指出，低親和力抗體比高親和力抗體特征性地具有更迅速的解離速率，按照本發(fā)明這種速率能在生物傳感器上監(jiān)測。(與之相反，ELISA只能測出在最后測定相中存在的抗體量而不能監(jiān)測解離的發(fā)生)。V.精確度測定人和豬血清樣品試驗的精確度，是將羊抗p53陽性對照抗體(Oncogene Sciences)以三種稀釋度(1∶50，1∶100和1∶200)稀釋于2.5％混合正常人血清和混合正常豬血清(稀釋于含去垢劑P-20及可溶性羧甲基葡聚糖的HEPES緩沖鹽溶液中)。然后在同一次測定中檢測多份樣品(測定內(nèi)精確度)并在多次測定中進行檢測(測定間精確度)。每一稀釋度每天至少測4份樣品，共5天。人血清樣品的測定內(nèi)精確度的結(jié)果見表2，測定間精確度的結(jié)果見表3。豬血清樣品的測定內(nèi)和測定間精確度的結(jié)果分別見表4及5。
人血清測定內(nèi)精確度分析的樣品中每一稀釋度的陽性對照與每一種肽結(jié)合所得結(jié)果的變異系數(shù)在2％范圍內(nèi)。人血清測定間精確度分析的樣品，對于能被陽性對照完全識別的各種稀釋度的三種肽，變異系數(shù)在16.3％的范圍內(nèi)。對肽C346-370的變異系數(shù)的范圍為22.6％～37.7％，因此此測定法對這種肽來說，由于多克隆羊抗體對此肽的低結(jié)合力，精確度較低。
豬血清測定內(nèi)精確度分析的樣品分析的變異系數(shù)為2.6％～16.1％。測定間精確度分析樣品的變異系數(shù)均在3.6％-17.0％的范圍內(nèi)。
總起來看，這些結(jié)果說明本測定法對豬和人兩種血清樣品都是精確的。而且，與肽的固定相關(guān)連的變異對本測定法的測定間精確度沒有明顯影響，因為這些結(jié)果是用表1所述的多次固定而獲得的。VI.閾值的測定為測定與合成肽結(jié)合的閾值(對一個稀釋樣品判定為存在能結(jié)合p53的抗體陽性)，對正常人志愿者和正常豬血清樣品進行了分析。例如，上述例子中的樣品用含有羧甲基萄聚糖和去垢劑P-20的HEPES緩沖鹽溶液進行1∶40稀釋以減少非特異性結(jié)合。正常人血清樣品的結(jié)合情況見圖3A及3B。陽性樣品與每種肽的結(jié)合閾值如下，C11-35＝131.5；C40-65＝130.4；C346-370＝111.6；C371-390＝94.1。閾值的定義為正常人血清樣品的結(jié)合(在一特定的血清樣品的稀釋度)的均值+3×標準差。任一樣器對任一固定肽的結(jié)合超過閾值便可判定為具有抗人p53抗體活性。
正常豬血清樣品的結(jié)合見圖4A及4B。對于每種肽的閾值如下C11-35＝104.1；C40-65＝99.6；C346-370＝84.9；以及C371-390＝83.1。閾值的定義同樣為從正常豬樣品觀察到的結(jié)合的均值+3×標準差。
如果符合以下條件則判定樣品中能結(jié)合人p53的抗體是陽性的1)對任一固定肽的結(jié)合高于閾值，以及2)這種結(jié)合是因免疫球蛋白引起的(藉將抗-種屬免疫球蛋白加到捕獲的抗-p53抗體中引起結(jié)合的增加可以確證)。
此外，如果發(fā)生以下情況，可以判定個體已對含p53的載體的處理生成了抗體1)對任一固定肽的結(jié)合超過閾值，2)運種結(jié)合是因免疫球蛋白引起的(藉將抗-種屬免疫球蛋白加到捕獲的血清組分中引起結(jié)合的增加可以確證)，以及3)在施與載體后所得樣品與施與前樣品相比，其結(jié)合至少增加2倍。
(總之，人或豬的血清樣品若能與4種合成肽中的任一種結(jié)合超過閾值，而且這種結(jié)合可用抗-種屬特異免疫球蛋白增加結(jié)合的方法證實是由免疫球蛋白引起的，便可判定為陽性)。VII.特異性本測定法的特異性是用加入一系列抗體和細胞因子于2.5％混合豬血清中并監(jiān)測其對4種固定肽中每一種的結(jié)合來測定的。除了羊抗p53陽性對照抗體外，沒有一種測試化合物顯示對任一種固定肽有任何結(jié)合。這些結(jié)果表明本測定法對于抗人p53抗體是特異的。VIII.凍融的影響為測定樣品經(jīng)多次凍融循環(huán)后是否還能用于再測定，用100％混合正常人血清制備的多份羊陽性對照抗體稀釋物在分析抗p53抗體之前經(jīng)受1～5次凍融循環(huán)。分析結(jié)果見表6，說明抗體樣品經(jīng)過至少5次凍融循環(huán)是穩(wěn)定的。這些數(shù)據(jù)說明樣品可以重新分析至少4次而不影響所得結(jié)果。IX.選擇的癌癥患者血清的反應(yīng)性測試了一些癌癥患者的血清樣品。如表7所示，2/7樣品被檢定出含有能與人p53結(jié)合的抗體。檢定方法是重新測試最初為陽性的樣品，并測試對合成肽的結(jié)合是否能被重復(fù)以及在加入抗人IgG/IgA/IgM(Kirkegaard與Perry，Gaithersburg，MD)(或相應(yīng)物)后結(jié)合是否增加。X.總結(jié)此處包含的數(shù)據(jù)表明本發(fā)明測定法是精確的，靈敏的，特異的，且不受多次凍融循環(huán)的影響。
表1肽固定化的重復(fù)性和穩(wěn)定性固定化肽量，響應(yīng)單位固化日期 C11-35 C40-65 C346-370 C371-390第1天 1175 871 1006 1051第14天 515 415 682 1607第18天 833 528 866 1072第19天 514 286 838 1593第22天 529 638 655 1493均值 713.2 547.6809.41363.2標準值 291.8 223.1143.8 279.0變異系數(shù) 40.9 40.717.8 20.5再生后肽的穩(wěn)定性再生循環(huán)數(shù)C11-35 C40-65 C346-370 C371-3902 3715.8 1519.2 68.6 712.253 4866.5 1671.1 77.9 838.1147 4147.7 2189.9 51.4 745.6均值4243.3 1791.4 66.0 765.3標準差 581.3 354.0 13.4 65.2變異系數(shù) 13.719.8 20.4 8.5穩(wěn)定性的測定是在用25mM HCl及0.25％SDS多次再生循環(huán)后，將羊抗p53抗體以1∶50稀釋于2.5％正?；旌先搜暹M行多等份測定。表2正常人血清的測定內(nèi)精確度對每種肽的結(jié)合，響應(yīng)單位C11-35 C40-65 C346-370 C371-390陽性對照1∶505131.4 1819.3 126.4 1114.75049.6 1836.2 124.5 1126.85152.1 1870.3 125.3 1152.25054.7 1860.2 124.9 1148.3均值 5097.0 1846.5 125.3 1135.5標準差 52.523.1 0.8 17.8變異系數(shù)％ 1.0 1.3 0.7 1.6均值 2606.3 983.865.9555.8標準差 35.514.3 0.4 5.1變異系數(shù)％ 1.4 1.5 0.6 0.9陽性對照 1295.4 488.9 36275.11∶2001292.4 486.4 36274.41305.9 483.435.6274.9均值 1290.6 490.935.8276.3標準差 15.7 9.5 0.3 3.1變異系數(shù)％ 1.2 1.9 0.8 1.1表3正常人血清的測定間精確度對每種肽的結(jié)合，響應(yīng)單位C11-35C40-65 C346-370 C371-390陽性對照1∶50第1天 4345.91708.9 71.2 782.4第2天 4674.31856.7 72.6 805.4第3天 3204.01928.7 AA989.0第4天 4284.82027.5 89.7 1001.5第5天 5097.01846.5125.3 1135.5均值4321.21873.7 89.7 942.8標準差 702.9 117.1 25.2 147.8變異系數(shù) 16.3 6.3 28.115.7陽性對照1∶100第1天 2518.7 991.1 44.0 452.1第2天 2251.9 918.3 43.6 441.0第3天 1907.5 842.6 AA479.8第4天 2148.9 854.5 43.4 480.7第5天 2606.3 983.8 65.9 555.8均值2286.7 918.1 49.2 481.9標準差 282.8 69.6 11.144.8變異系數(shù) 12.4 7.6 22.6 9.3陽性對照1∶200第1天 1285.6 588.1 27.1 257.0第2天 1272.9 587.3 23.6 243.5第3天 975.3 511.1 AA240.2第4天 941.5 496.2 13.1 232.9第5天 1290.6 490.9 35.8 276.3均值1153.2 534.7 24.9 250.0標準差 178.3 48.9 9.417.1變異系數(shù) 15.5 9.2 37.76.8AA＝分析錯誤，數(shù)據(jù)未采用表中列舉的均值代表每天4個平行樣共5天的平均值。表4正常豬血清測定內(nèi)精確度C11-35C40-65 C346-370 C371-390陽性對照1∶503948.92342.9 140.11435.13603.72323.8 135.51395.13639.92472.0 129.11395.33693.52377.7 128.61360.93277.12096.1 121.51264.62574.51741.4 113.01148.1均值 3456.32225.7 128.01333.2標準差482.5 267.8 9.7 107.5變異系數(shù) 14.0 12.0 7.6 8.1陽性對照1∶100 1901.01168.1 77.3 691.51722.61079.6 74.6 662.21921.71175.2 71.6 673.71755.31154.9 69.5 665.51948.91094.4 69.1 653.31949.01073.0 68.2 642.1均值 1866.41124.2 71.7 664.7標準差100.9 46.8 3.6 17.0變異系數(shù)5.4 4.2 5.0 2.6陽性對照1∶200922.9 579.3 48.1 349.3958.0 552.8 46.9 337.4872.8 572.4 42.7 335.2916.1 544.4 42.7 330.3742.7 412.4 39.2 287.2615.6 397.5 35.9 270.9均值 838.0 509.8 42.6 318.4標準差132.3 82.3 4.6 31.5變異系數(shù) 15.8 16.1 10.8 9.9表5正常豬血清測定間精確度C11-35C40-65 C346-370 C371-390陽性對照1∶50第1天3456.32225.7128.0 1333.2第2天4724.42809.9144.2 1369.6第3天4675.31766.7134.2 1093.5第4天4167.32473.8132.3 1282.4第5天4090.32517.8136.1 1351.4均值 4222.72358.8134.9 1286.0標準差 515.9 390.6 6.0 112.4變異系數(shù)12.2 16.6 4.48.7陽性對照1∶100第1天 1866.41124.2 71.7 664.7第2天 2284.71301.6 77.7 706.9第3天 2115.9 916.5 71.0 530.1第4天 2117.51175.3 73.2 612.9第5天 2075.61212.9 74.7 685.8均值 2092.01146.1 73.7 640.1標準差 149.6 143.8 2.7 70.7變異系數(shù) 7.2 12.5 3.6 11.0陽性對照1∶200第1天838.0 509.8 42.6 318.4第2天 1119.5 619.6 43.7 344.0第3天 1078.1 476.9 42.6 281.5第4天 1083.7 619.8 60.7 306.5第5天 1118.1 573.5 43.3 296.6均值 1047.5 559.9 46.6 309.4標準差 118.6 64.7 7.9 23.6變異系數(shù)11.3 11.6 17.07.6表6凍融循環(huán)對樣品穩(wěn)定性的影響對特定肽的結(jié)合，響應(yīng)單位凍融循環(huán)數(shù)C11-35 C40-65 C346-370 C371-390循環(huán)1 808.0236.310.0 850.9循環(huán)2 898.3251.411.9 930.4循環(huán)3 1016.7281.713.1 1063.8循環(huán)4 915.1254.211.2 943.1循環(huán)5 910.9239.810.6 911.5變異系數(shù) 8.1 7.110.8 8.3變動百分率 12.7 1.5 6.0 7.1均值 909.8252.711.3 939.9標準差 74.1 17.9 1.277.7變異系數(shù) 8.1 7.110.8 8.3表7癌癥患者血清樣品的篩查與固定肽的結(jié)合，響應(yīng)單位與抗人IgG/IgM/IgA的結(jié)合，響應(yīng)單位患者編號C11-35C40-65C346-370 C371-390C11-35 C40-65 C346-370 C371-3901 0 31.9 0 13.92 771.0 203.6 16.4 442.22(重復(fù)) 814.0 157.3 10.8 438.2 222.356.414.0131.73 56.1 83.4 27.4 135.23(重復(fù)) 0 70.3 11.3 92.7 37.712.4 8.904 203.5 218.9 3.304(重復(fù)) 192.0 180.3 0 11.9 74.174.8 0 2.65 34.8 155.3 1.159.65(重復(fù)) 37.9 133.4 0 70.0 73.715.410.1 22.76 113.8 118.9 49.4 62.27 32.3 22.1 16.5 7.2患者編號結(jié)果1陰性(對任一肽的起始活性不超過閾值)2陽性(與3/4肽起反應(yīng)，確定為抗體)3陰性(對肽4的起始活性不能被肯定為抗體)4陽性(對2/4肽起反應(yīng)，確定為抗體)5陰性(對肽2的起始活性不能被肯定為抗體)6陰性(對任一肽的起始活性不超過閾值)7陰性(對任一肽的起始活性不超過閾值)注陽性樣品指與任一肽的結(jié)合超過閾值，且結(jié)合是由抗體引起的閾值C11-35＝1315；C40-65＝130.4；C346-370＝111.6；C371-390＝94.1Any RU＜0時寫作0I. 按本發(fā)明優(yōu)選實施方案固定p53肽的具體方法材料1. BIAcore 2000生物傳感器@25℃2. 符合以下人p53蛋白氨基酸序列并加有N-末端半胱氨酸殘基的四種肽(a)C11-35A.A.H-CEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPL-酰胺(分子量＝2969.42)儲存液制備于20mM NaOAc pH4中1-2mg/ml；加以等分，儲存于-20℃。
工作溶液將儲存液以20mM NaOAc pH4稀釋成700μg/ml。
(b)C40-65A.A.H-CMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPR-酰胺(分子量＝3121.4)儲存液制備新鮮的2mg/ml于去離子水中，激烈渦旋；以20mMNaOAc pH4將儲存液1∶2篩釋；渦旋。
工作溶液將新鮮儲存液用20mM NaOAc pH4稀釋至1mg/ml；渦旋。
(c)C346-370A.A.H-CEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLK-酰胺(分子量＝2719.02)儲存液以20mM MES pH6.5，制備2-3mg/ml的儲存液，渦旋；加以等分，儲存于-20℃。
工作溶液將儲存液以20mM MES pH5稀釋至500μg/ml；渦旋。
(d)C371-390A.A.H-CSKKGQSTSRHKKLMFKTEGP-酰胺(分子量＝2376.8)儲存液以20mM MES pH6.5制備1-2mg/ml，渦旋，等分并儲存于-20℃。
工作溶液將儲存液用20mM硼酸鹽pH8稀釋至100μg/ml，渦旋。3. 傳感芯片CM5-(研究級或經(jīng)認證的)-BIAcore4. 氨基偶聯(lián)試劑包括氨基偶聯(lián)試劑盒-BIAcore(編碼BR-1000-50)，組成為NHSN-羥琥珀酰亞胺，11.5mg/mlEDCN-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺，75mg/ml
1M乙醇胺-HCl pH85. 巰基偶聯(lián)試劑NHS及EDC見上文氨基偶聯(lián)試劑盒(Pharmacia Biosensor)100mM硼酸鈉pH8.5Fisher或相當者PDEAPharmacia Biosenser(編號BR-1000-58)。將0.036克溶于2.0ml 0.1M硼酸鹽pH8.5，配成80mM PDEA(注必須在使用前現(xiàn)配，并于配成后2小時棄去)(又注可以使用其它相當試劑(PDEA之外的試劑將活性二硫化物基團導(dǎo)入氨基)。
甲酸Aldrich或相當者甲酸鈉Aldrich或相當者，制備100mM甲酸鹽溶液，將0.061克甲酸鈉溶于25ml去離子水，用甲酸調(diào)pH至4.3氯化鈉(NaCl)Fisher或相當者；半胱氨酸Sigma Chemical或相當者；配制50mM半胱氨酸/1M氯化鈉溶液，將0.061克半胱氨酸及0.5844克NaCl溶于10.0ml 0.1M甲酸鹽pH4.3(注必須在用前即刻配制-配后2小時棄去)6. BlAcore流動緩沖液(HBSw/P-20)含P-20表面活性劑的HEPES緩沖鹽溶液(每升)2.38克HEPES(Fisher或相當者)8.77克NaCl(Fisher或相當者)1.27克EDTA(Sigma或相當者)0.5ml P-20(BIAcore-Cat#BR-1000-54)調(diào)pH至pH7.4，用NaOH0.2μm濾膜過濾脫氣15分鐘必要時重測pH并調(diào)至7.47. 再生溶液(25mM HCl/0.25％SDS)50mM HCl，由1M HCl濃溶液配制(Anachemia或相當者)0.5％SDS(BIAcore-BIAdesorb溶液1Cat#BR-1002-22)將1份50mM HCl以1份0.5％SDS稀釋。
方法1. 使用BIA2000用巰基偶聯(lián)化學(xué)法及以下條件，將C11-35肽固定在FCl上，C40-65肽在FC2以及C346-370肽在FC3上；-流速＝10μl/分-NHS/EDC＝20μl-PDEA＝40μl-肽＝50μl(C40-65肽注入100μl)-半胱氨酸/1M NaCl＝40μl-25mM HCl/0.25％SDS＝10μl2. 使用BIA2000，用NHS/EDC氨基偶聯(lián)化學(xué)法及以下條件，將C371-390肽固定在FC4上-流速＝5μl/分-NHS/EDC＝10μl-C371-390肽＝35μl-乙醇胺＝35μl-25mM HCl/0.25％SDS＝10μlII. 檢測血清中p53抗體的方法材料1. 樣品稀釋劑HBSw/P-20及CM-D；HEPES緩沖鹽溶液含有1mg/ml羧甲基葡聚糖(Fluka或相當者)2. 再生溶液-25mM HCl/0.25％SDS；每日新鮮配制3. Micro-fuge濾膜，消毒，0.2μm(MSI-Cat#CFA02015sm或相當者)4. 陰性對照與分析樣品矩陣配對的血清，0.2μ過濾。5. 陽性對照羊多克隆抗p53抗體(Oncogene Sci-Cat#AB-7)1∶100稀釋于陰性對照。6. 血清樣品1∶40稀釋于樣品稀釋劑，0.2μm過濾。
流程1. 制備陰性對照，將與待分析樣品稀釋物配對的血清稀釋于樣品稀釋劑中(如，上例以1∶40稀釋)。2. 制備陽性對照，將羊抗p53抗體1∶100稀釋于陰性對照血清。3. 將未知樣品稀釋于樣品稀釋劑，0.2μm過濾(如，上例為1∶40稀釋)。4. 用BIAcore 2000按以下方法分析樣品與對照流速10μl/分流動池1，2，3，4
流動徑FC1，2，3，4未知樣品體積40μl報告點距基線4.5分。
再生溶液10μl5. 運行自動化方法，數(shù)據(jù)以每個樣品及對照測得的響應(yīng)單位(RU)的形式收集。
數(shù)據(jù)分析對每種肽測得的樣品響應(yīng)單位(RU)根據(jù)以下標準定為“陽性”1-如果此特定樣品稀釋度的樣品RU低于4種肽中每種肽的閾值，則此樣品判定為“陰性”。
2-如果此特定樣品稀釋度的樣品RU大于或等于該肽的RU閾值，則此樣品進行重復(fù)測定。
3-在加入抗種屬特異性抗體證實測得的RU增高是由于抗體后，復(fù)測樣品得到肯定。
4-如果抗種屬特異性抗體的RU大于50RU，樣品判定為p53抗體“陽性”。
(或者，如樣品有限，肯定抗種屬特異性抗體或同種型試劑可在起始血清樣品已結(jié)合后加入(在加入再生溶液之前))。
對于熟練技術(shù)者，本發(fā)明的修飾和變動會是很明白的。此處描述的特定實施方案只提供為一種例子，本發(fā)明不應(yīng)當解釋為局限于此。
序列表(1)一般信息(i)申請人Schering Corporation(ii)發(fā)明名稱檢測抗p53抗體的測定方法(iii)序列數(shù)4(iv)通訊地址(A)收件人Schering-Ploush Corporation(B)街道2000 Galloping Hill Road(C)城市Kenilworth(D)州New Jersey(E)國家USA(F)編碼07033(v)計算機可讀形式(A)介質(zhì)形式軟盤(B)計算機Macintosh(C)操作系統(tǒng)75.3(vi)現(xiàn)申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(vii)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S 60/028,533(B)申請日1996，10，7(viii)律師代理人信息(A)姓名Gould，James M(B)注冊號33，702(C)參考/文檔號JB0672(ix)電信信息(A)電話908-298-5024(B)傳真908-298-5388(2)序列1的信息(i)序列特征(A)長度26個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓撲學(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述序列1Cys Glu Pro Pro Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu1 5 10 15Leu Pro Glu Asn Ash Val Leu Ser Pro Leu20 25(2)序列2的信息(i)序列特征
(A)長度27個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓撲學(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述序列2Cys Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp lle Glu Gln Trp Phe1 5 10 15Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro Arg20 25(2)序列3的信息(i)序列特征(A)長度26個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓撲學(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述序列3Cys Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly1 5 10 15Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys20 25(2)序列4的信息(i)序列特征(A)長度21個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓撲學(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述序列4Cys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met Phe1 5 10 15Lys Thr Glu Gly Pro20
權(quán)利要求
1. 一種檢測能與p53蛋白結(jié)合的抗體的方法，包括A)將肽直接固定在生物傳感器的傳感芯片的流動池上，所述肽能與抗p53抗體特異結(jié)合，B)從待查患者取得血清樣品，并將血清樣品稀釋于適宜的緩沖液中，C)使稀釋的血清樣品與固定化肽接觸，以及D)用生物傳感器測量抗體與固定化肽的結(jié)合。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中在步驟A中，多種所選擇的免疫原性肽每個直接固定在各自分隔的流動池上。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中第一個肽選自p53蛋白的氨基端區(qū)，第二個肽選自p53蛋白的羧基端區(qū)。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中肽選自a)一種包含序列1的肽，或一種與之具有基本序列同一性的肽；b)一種包含序列2的肽，或一種與之具有基本序列同一性的肽；c)一種包含序列3的肽，或一種與之具有基本序列同一性的肽；以及d)一種包含序列4的肽，或一種與之具有基本序列同一性的肽。
5. 權(quán)利要求3的方法，其中第一種肽包含序列1，第二種肽包含序列4。
6. 權(quán)利要求5的方法，更進一步包含第三種含序列2的肽，及第四種含序列3的肽。
7. 權(quán)利要求1的方法，其中肽具有磷酸絲氨酸殘基。
8. 權(quán)利要求1的方法，其中肽具有磷酸蘇氨酸殘基。
9. 權(quán)利要求5的方法，其中第一種肽用巰基偶聯(lián)固定。
10. 權(quán)利要求5的方法，其中第二種肽用氨基偶聯(lián)固定。
11. 權(quán)利要求6的方法，其中第一、三及四種肽用巰基偶聯(lián)固定，第二種肽用氨基偶聯(lián)固定。
12. 權(quán)利要求1的方法，其中血清樣品同時與多種固定肽接觸。
13. 權(quán)利要求1的方法，其中在將稀釋的血清樣品與4種固定肽同時接觸之前，將血清樣品用含有P-20及羧甲基葡聚糖的HEPES緩沖鹽溶液稀釋1∶2～1∶50。
14. 權(quán)利要求2的方法，其中與每種肽結(jié)合的抗體量與生物傳感器報告的響應(yīng)單位成正比。
15. 權(quán)利要求1的方法，其中固定在流動池上的肽用HCl-SDS溶液除去已結(jié)合的抗體而再生，用于分析以后的血清樣品。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測能結(jié)合p53蛋白的抗體的方法，該方法使用固定有p53肽的、表面等離子體振子共振生物傳感器。
文檔編號C07K16/32GK1240028SQ97180373
公開日1999年12月29日 申請日期1997年10月1日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月7日
發(fā)明者D·T·梅泰奇, S·J·斯旺森 申請人:先靈公司