專利名稱：促進(jìn)抗原清除的與FcRn的親和力得到改進(jìn)的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及 用于促進(jìn)抗原結(jié)合分子介導(dǎo)的細(xì)胞對抗原攝入的方法；用于增加單個抗原結(jié)合分子可與之結(jié)合的抗原的數(shù)目的方法；用于通過給予抗原結(jié)合分子促進(jìn)血漿抗原濃度降低的方法；用于改進(jìn)抗原結(jié)合分子的藥代動力學(xué)的方法；用于降低血漿的總抗原濃度或游離抗原濃度的方法；提高細(xì)胞對抗原攝入的抗原結(jié)合分子；結(jié)合抗原的數(shù)目增加的抗原結(jié)合分子；通過給予所述分子能夠促進(jìn)血漿抗原濃度降低的抗原結(jié)合分子；具有改進(jìn)的藥代動力學(xué)的抗原結(jié)合分子；包含所述抗原結(jié)合分子的藥物組合物；用于產(chǎn)生上述這些的方法等。優(yōu)先權(quán)本發(fā)明要求2010年3月30日提交的日本專利申請?zhí)?010-079667和2010年11月9日提交的日本專利申請?zhí)?010-250830的權(quán)益，所述申請的整個內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
背景技術(shù)：
抗體作為藥物正引起注意，因為它們在血漿中十分穩(wěn)定，少有副作用。目前，市場上可獲得許多IgG型抗體藥物，且許多抗體藥物目前正在開發(fā)之中(NPL I和2)。同時，已報告了適用于第二代抗體藥物的各種技術(shù)，包括提高效應(yīng)子功能、抗原結(jié)合能力、藥代動力學(xué)和穩(wěn)定性的技術(shù)，以及降低免疫原性風(fēng)險的技術(shù)(NPL 3)。總的說來，抗體藥物的必需劑量很高。這又產(chǎn)生了問題，例如高生產(chǎn)成本以及生產(chǎn)皮下制劑的困難。理論上，可通過改進(jìn)抗體藥代動力學(xué)或改進(jìn)抗體與抗原之間的親和力來減少抗體藥物的劑量。文獻(xiàn)報告了在恒定區(qū)采用氨基酸的人工取代來改進(jìn)抗體藥代動力學(xué)的方法(NPL4和5)。同樣地，報告了親和力成熟作為提高抗原結(jié)合能力或抗原中和活性的技術(shù)(NPL
6)。該技術(shù)能夠通過將氨基酸突變引入可變區(qū)的CDR區(qū)或這樣的區(qū)來提高抗原結(jié)合活性?？乖Y(jié)合能力的提高能夠使體外生物活性提高或使劑量降低，還能夠使體內(nèi)功效提高(NPL7)。單個抗體分子的抗原中和能力取決于其親和力。通過提高親和力，抗原可被較少量的抗體中和?？刹捎枚喾N方法提高抗體親和力(NPL 6)。此外，如果可通過使抗體與抗原共價結(jié)合以使親和力無限，則單個抗體分子可中和一個抗原分子(二價抗體可中和兩個抗原分子)。然而，一個抗體針對一個抗原(一個二價抗體針對兩個抗原)的化學(xué)計算量中和是現(xiàn)有方法的極限值，因此不可能用比抗原的量少的抗體的量來完全中和抗原。換句話說，親和力提高作用具有極限值(NPL9)。為了延長中和抗體的中和作用持續(xù)一定時間，必須以比同期機體所產(chǎn)生的抗原的量高的劑量給予抗體。僅憑上述抗體藥代動力學(xué)或親和力成熟技術(shù)的改進(jìn)，在降低所需抗體劑量方面仍存在如此限制。因此，為了用比抗原量少的抗體量來保持抗體的抗原中和作用持續(xù)目標(biāo)時間，單個抗體必須中和多個抗原。已報告了以PH依賴性方式與抗原結(jié)合的抗體作為實現(xiàn)上述目的的新方法(PTL I)。在血漿中的中性條件下與抗原牢固結(jié)合且在內(nèi)體中的酸性條件下與抗原解離的PH依賴性抗原結(jié)合抗體，可在內(nèi)體中與抗原解離。當(dāng)與抗原解離的PH依賴性抗原結(jié)合抗體通過FcRn再循環(huán)至血漿時，它可再次與另一抗原結(jié)合。因此，單個PH依賴性抗原結(jié)合抗體可與許多抗原重復(fù)結(jié)合。此外，與通過FcRn結(jié)合再循環(huán)的抗體相比，抗原的血漿滯留非常短。當(dāng)具有這種長期血漿滯留的抗體與抗原結(jié)合時，抗原-抗體復(fù)合體的血漿滯留時間與抗體的血漿滯留時間一樣延長。因此，抗原的血漿滯留通過與抗體結(jié)合而延長，因此血漿抗原濃度增加。IgG抗體由于FcRn結(jié)合而具有較長的血漿滯留時間。只在酸性條件(pH 6. O)下 觀察到IgG與FcRn之間的結(jié)合。相比之下，在中性條件(pH 7. 4)下，幾乎未檢出結(jié)合。IgG抗體以非特異性方式被攝入細(xì)胞中?？贵w通過在內(nèi)體酸性條件下與內(nèi)體FcRn結(jié)合而返回細(xì)胞表面，然后在血漿中性條件下與FcRn解離。如果通過將突變引入IgG Fe結(jié)構(gòu)域以使在酸性條件下喪失FcRn結(jié)合，則從內(nèi)體再循環(huán)至血漿的抗體不存在，這明顯減少血漿中的抗體滯留時間。一種已報告的用于改進(jìn)IgG抗體血漿滯留的方法是提高酸性條件下的FcRn結(jié)合。將氨基酸突變引入IgG抗體的Fe結(jié)構(gòu)域以改進(jìn)酸性條件下的FcRn結(jié)合。這提高了從內(nèi)體再循環(huán)至血漿的效率，導(dǎo)致血漿滯留改進(jìn)。氨基酸取代的重要需求是不增加在中性條件下的FcRn結(jié)合。如果IgG抗體在中性條件下與FcRn結(jié)合，則通過在內(nèi)體酸性條件下與FcRn結(jié)合而返回細(xì)胞表面的抗體，在血漿中性條件下不與FcRn解離。在這種情況下，在一定程度上喪失血漿滯留，因為IgG抗體不再循環(huán)至血漿中。例如如J Immunol.(2002) 169(9) :5171-80所述，據(jù)報告，通過引入氨基酸取代使得所得抗體能夠在中性條件(pH 7. 4)下與小鼠FcRn結(jié)合的修飾IgGl抗體，當(dāng)給予小鼠時，具有非常差的血漿滯留。此外，如 J Immunol. (2009) 182(12) :7663-71 ;J Biol Chem. 2007 年 I 月 19 日；282(3)1709-17;以及J Immunol. 2002年11月I日；169(9) :5171-80中所述，通過引入氨基酸取代對IgGl抗體進(jìn)行修飾，使得所得抗體在酸性條件(pH 6.0)下具有改進(jìn)的人FcRn結(jié)合，同時變得能夠在中性條件(pH7. 4)下與人FcRn結(jié)合。據(jù)報告，當(dāng)給予食蟹猴(cynomolgusmonkey)時，所得抗體在血漿滯留方面既未顯示改進(jìn)，也未顯示變化。因此，用于改進(jìn)抗體功能的抗體工程技術(shù)只集中在通過提高在酸性條件下的人FcRn結(jié)合而非提高在中性條件(pH 7.4)下的結(jié)合而對抗體血漿滯留進(jìn)行改進(jìn)。迄今，沒有報告描述通過將氨基酸取代引入IgG抗體的Fe結(jié)構(gòu)域而改進(jìn)中性條件(pH 7. 4)下的人FcRn結(jié)合的優(yōu)勢。即使抗體的抗原親和力得到改進(jìn)，血漿中的抗原消除也不可提高。據(jù)報告，與典型的抗體相比，上述PH依賴性抗原結(jié)合抗體作為用于提高抗原從血漿中消除的方法更有效(PTL I)。因此，與典型的抗體相比，單個pH依賴性抗原結(jié)合抗體與許多抗原結(jié)合，并能夠促進(jìn)從血漿中消除抗原。因此，PH依賴性抗原結(jié)合抗體具有通過典型抗體無法實現(xiàn)的作用。然而，迄今，有關(guān)用于進(jìn)一步改進(jìn)PH依賴性抗原結(jié)合抗體與抗原重復(fù)結(jié)合的能力并提高抗原從血漿中消除的作用的抗體工程改造方法尚無報告。下面給出與本發(fā)明有關(guān)的現(xiàn)在技術(shù)文獻(xiàn)引用列表
專利文獻(xiàn)[PTL 1]W0 2009/125825， ANTIGEN-BINDING MOLECULECAPABLE OF BINDING TOTWO OR MORE ANTIGENMOLECULES REPEATEDLY(能夠與兩個或更多個抗原分子重復(fù)結(jié)合的抗原結(jié)合分子)非專利文獻(xiàn)[NPL l]Monoclonal antibody successes in the clinic (臨床中單克隆抗體的成功應(yīng)用)，Janice M Reichert，Clark J Rosensweig, Laura BFaden和Matthew C Dewitz,Nature Biotechnology 23，1073-1078 (2005)[NPL 2]Pavlou AK，Belsey MJ.，The therapeutic antibodies marketto2008 (2008 年的治療性抗體市場)，Eur J Pharm Biopharm. 2005 年 4 月；59(3) :389-96 [NPL 3]Kim SJ,Park Y，Hong HJ. , Antibody engineering for thedevelopmentof therapeutic antibodies (用于治療性抗體開發(fā)的抗體工程改造)，Mol Cells. 2005年8 月 31 日；20(1) :17-29.綜述[NPL 4]Hinton PR，Xiong JM,Johlfs MG，Tang MT,Keller S，Tsurushita N. ，Anengineered human IgG lantibody with longer serumhalf-life (具有較長血清半衰期的工程改造的人 IgGl 抗體)，J Immunol. 2006 年 I 月 I 日；176(1) :346-56[NPL 5]Ghetie V，Popov S，Borvak J，Radu C，Matesoi D，MedesanC, OberRJ, Ward ES. ， Increasing the serum persistence of an IgGfragment by randommutagenesis (通過隨機誘變增加IgG片段的血清存留)，Nat Biotechnol. 1997年7月；15(7) :637-40[NPL 6]Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 年 6 月 14 日；102(24) :8466-71. Epub2005年6月6 日.A general method for greatly improvingthe affinity of antibodiesby using combinatorial libraries (通過利用組合文庫大大改進(jìn)抗體親和力的通用方法).Rajpal A, Beyaz N，Haber L，Cappuccilli G，Yee H，Bhatt RR, Takeuchi T，LernerRA，Crea R[NPL 7]Wu H，Pfarr DS, Johnson S，Brewah YA, Woods RM, PatelNK，White WI,Young JF， Kiener PA.Development of Motavizumab, anUltra-potent Antibody forthe Prevention of Respiratory Syncytial VirusInfection in the Upper and LowerRespiratory Tract (預(yù)防上下呼吸道的呼吸道合胞體病毒感染的超效抗體莫他珠單抗的開發(fā)).J Mol Biol. (2007)368 :652-665[NPL 8]Hanson CV, Nishiyama Y， Paul S.Catalytic antibodies andtheirapplications (催化抗體及其應(yīng)用)· Curr Opin Biotechnol. 2005 年 12 月；16 (6) :631_6[NPL 9]Rathanaswami P，Roalstad S，Roskos L, Su QJ, Lackie S，BabcookJ. Demonstration of an in vivo generated sub—picomolar affinityfully humanmonoclonal antibody to interleukin-8 (體內(nèi)產(chǎn)生的對抗白介素_8的亞皮摩爾親和力完全人單克隆抗體的論證).Biochem BiophysRes Commun. 2005 年 9 月；334 (4) :1004-13發(fā)明概述技術(shù)問題鑒于上述情況實現(xiàn)了本發(fā)明。本發(fā)明的目的是提供用于通過使用抗原結(jié)合分子促進(jìn)細(xì)胞對抗原攝入的方法、用于增加單個抗原結(jié)合分子可與之結(jié)合的抗原的數(shù)目的方法、用于通過給予抗原結(jié)合分子促進(jìn)血漿抗原濃度降低的方法、用于改進(jìn)抗原結(jié)合分子的藥代動力學(xué)的方法、促進(jìn)細(xì)胞對抗原攝入的抗原結(jié)合分子、結(jié)合抗原的數(shù)目增加的抗原結(jié)合分子、通過給藥能夠促進(jìn)血漿抗原濃度降低的抗原結(jié)合分子、具有改進(jìn)的藥代動力學(xué)的抗原結(jié)合分子、包含所述抗原結(jié)合分子的藥物組合物和用于產(chǎn)生上述這些的方法。問題的解決方案本發(fā)明人對以下方法進(jìn)行了專心致志的研究用于通過抗原結(jié)合分子(具有抗原結(jié)合能力的分子，例如多肽)促進(jìn)細(xì)胞對抗原攝入的方法、用于讓抗原結(jié)合分子與抗原重復(fù)結(jié)合的方法、用于通過給予抗原結(jié)合分子促進(jìn)血漿抗原濃度降低的方法，和用于改進(jìn)抗原結(jié)合分子的血衆(zhòng)滯留的方法。因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在早期內(nèi)體pH(early endosomalpH)下具有人FcRn結(jié)合能力且在血漿pH下具有高于完整人IgG型免疫球蛋白活性的人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子可促進(jìn)細(xì)胞對抗原的攝入。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，通過使用與在血漿PH·下相比，在早期內(nèi)體PH下具有較弱抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子，可進(jìn)一步提高抗原結(jié)合分子介導(dǎo)的細(xì)胞對抗原的攝入，且可增加可與單個抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原數(shù)目；通過給予這類抗原結(jié)合分子，可促進(jìn)血漿抗原濃度的降低；且可改進(jìn)抗原結(jié)合分子的藥代動力學(xué)。具體地講，本發(fā)明涉及用于促進(jìn)抗原結(jié)合分子介導(dǎo)的細(xì)胞對抗原攝入的方法；用于增加單個抗原結(jié)合分子可與之結(jié)合的抗原的數(shù)目的方法；用于通過給予抗原結(jié)合分子促進(jìn)血漿抗原濃度降低的方法；用于改進(jìn)抗原結(jié)合分子的藥代動力學(xué)的方法；用于降低血漿的總抗原濃度或游離抗原濃度的方法；提高細(xì)胞對抗原攝入的抗原結(jié)合分子；結(jié)合抗原的數(shù)目增加的抗原結(jié)合分子；通過給予所述分子能夠促進(jìn)血漿抗原濃度降低的抗原結(jié)合分子；具有改進(jìn)的藥代動力學(xué)的抗原結(jié)合分子；包含所述抗原結(jié)合分子的藥物組合物；用于產(chǎn)生上述這些的方法等。更具體地講，本發(fā)明提供[I]包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，其在酸性和中性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性，其中在中性pH范圍內(nèi)人FcRn結(jié)合活性強于3. 2微摩爾；[2]包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，其在中性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性，其中在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性是完整人IgG的28倍；[3]包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，其在中性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性，其中在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性強于2. 3微摩爾；[4]包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，其在中性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性，其中在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性是完整人IgG的38倍；[5] [1]-[4]中任一個的抗原結(jié)合分子，其中中性pH范圍為ρΗ7· 0-8.0 ;[6]包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，其中將抗原結(jié)合分子給予非人動物后的血漿總抗原濃度低于將參比抗原結(jié)合分子給予非人動物后的血漿總抗原濃度，所述參比抗原結(jié)合分子包含相同的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和完整人IgG Fe結(jié)構(gòu)域作為人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域；[7]抗原結(jié)合分子，其中將抗原結(jié)合分子給予非人動物后的血漿抗原濃度低于自未被給予抗原結(jié)合分子的非人動物得到的血漿總抗原濃度；[8]包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，其中如下計算的所述抗原結(jié)合分子的抗原/抗原結(jié)合分子摩爾比率(C)C = A/B,
低于如下計算的抗原結(jié)合分子(其包含相同抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和完整人IgG Fe結(jié)構(gòu)域作為人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的抗原/抗原結(jié)合分子摩爾比率(C')；C' =A' /B'，其中；A為將抗原結(jié)合分子給予非人動物后血漿中的總抗原濃度，B為將抗原結(jié)合分子給予非人動物后抗原結(jié)合分子的血漿濃度，K'為將參比抗原結(jié)合分子給予非人動物后血漿中的總抗原濃度，B'為將參比抗原結(jié)合分子給予非人動物后抗原結(jié)合分子的血漿濃度；[9] [6]-[8]中任一個的抗原結(jié)合分子，其中非人動物是人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠；[10] [6]_[9]中任一個的抗原結(jié)合分子，其中血漿抗原濃度是長期血漿總抗原濃度；[11] [6]_[9]中任一個的抗原結(jié)合分子，其中血漿抗原濃度是短期血漿總抗原濃度；[12]包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，其在酸性和中性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性，其中在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性強于完整人IgG的結(jié)合活性；[13][1]-[11]中任一個的抗原結(jié)合分子，其中在酸性pH范圍內(nèi)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合活性低于在中性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性；[14] [12]或[13]的抗原結(jié)合分子，其中以KD (在酸性pH范圍內(nèi))/KD (在中性pH范圍內(nèi))的值計，酸性PH范圍和中性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性的比率至少為2 ；[15] [12]-[14]中任一個的抗原結(jié)合分子，其包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸突變，其包含用組氨酸取代抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的至少一個氨基酸或插入至少一個組氨酸；[16][12]-[14]中任一個的抗原結(jié)合分子，其中抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域獲自抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域文庫；[17] [1]-[16]中任一個的抗原結(jié)合分子，其包含因用不同氨基酸取代親本IgG的Fe結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸而產(chǎn)生的Fe結(jié)構(gòu)域作為人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域；[18][1]-[17]中任一個的抗原結(jié)合分子，其中人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域是這樣的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含用不同氨基酸取代選自親本IgG的Fe結(jié)構(gòu)域中的以下位置氨基酸中的至少一個氨基酸的氨基酸序列237、238、239、248、250、252、254、255、256、257、258、265、270、286、289、297、298、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、325、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434 和 436 (EU 編號)；[19] [I]-[18]中任一個的抗原結(jié)合分子，其包含在親本IgG的Fe結(jié)構(gòu)域中包含氨基酸取代的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含選自以下的至少一個氨基酸取代(EU編號)
237位上的Gly被取代為Met的氨基酸取代；238位上的Pro被取代為Ala的氨基酸取代；239位上的Ser被取代為Lys的氨基酸取代；248位上的Lys被取代為Ile的氨基酸取代；250 位上的 Thr 被取代為 Ala、Phe> lie、Met、Gin、Ser、Val、Trp 或 Tyr 的氨基酸取代； 252位上的Met被取代為Phe、Trp或Tyr的氨基酸取代；254位上的Ser被取代為Thr的氨基酸取代；255位上的Arg被取代為Glu的氨基酸取代；256位上的Thr被取代為Asp、Glu或Gln的氨基酸取代；257 位上的 Pro 被取代為 Ala、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Ser、Thr 或 Val 的氨基酸取代；258位上的Glu被取代為His的氨基酸取代；265位上的Asp被取代為Ala的氨基酸取代；270上的Asp被取代為Phe的氨基酸取代；286位上的Asn被取代為Ala或Glu的氨基酸取代；289位上的Thr被取代為His的氨基酸取代；297位上的Asn被取代為Ala的氨基酸取代；298上的Ser被取代為Gly的氨基酸取代；303位上的Val被取代為Ala的氨基酸取代；305位上的Val被取代為Ala的氨基酸取代；307 位上的 Thr 被取代為 Ala、Asp、Phe> Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Val、Trp 或 Tyr 的氨基酸取代；308 位上的 Val 被取代為 Ala、Phe、lie、Leu、Met、Pro、Gln 或 Thr 的氨基酸取代；309位上的Leu或Val被取代為Ala、Asp、Glu、Pro或Arg的氨基酸取代；311位上的Gln被取代為Ala、His或Ile的氨基酸取代；312位上的Asp被取代為Ala或His的氨基酸取代；314位上的Leu被取代為Lys或Arg的氨基酸取代；315位上的Asn被取代為Ala或His的氨基酸取代；317位上的Lys被取代為Ala的氨基酸取代；325位上的Asn被取代為Gly的氨基酸取代；332位上的Ile被取代為Val的氨基酸取代；334位上的Lys被取代為Leu的氨基酸取代；360位上的Lys被取代為His的氨基酸取代；376位上的Asp被取代為Ala的氨基酸取代；380位上的Glu被取代為Ala的氨基酸取代；382位上的Glu被取代為Ala的氨基酸取代；384位上的Asn或Ser被取代為Ala的氨基酸取代；385位上的Gly被取代為Asp或His的氨基酸取代；
386位上的Gln被取代為Pro的氨基酸取代；387位上的Pro被取代為Glu的氨基酸取代；
389位的Asn被取代為Ala或Ser的氨基酸取代；424位上的Ser被取代為Ala的氨基酸取代；428 位上的 Met 被取代為 Ala、Asp、Phe> Gly、His、lie、Lys> Leu、Asn、Pro、Gin、Ser> Thr、Val、Trp或Tyr的氨基酸取代；433位上的His被取代為Lys的氨基酸取代；434位上的Asn被取代為Ala、Phe、His、Ser、Trp或Tyr的氨基酸取代；和436位上的Tyr或Phe被取代為His的氨基酸取代；[20] [I]-[18]中任一個的抗原結(jié)合分子,其人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含選自親本IgG的Fe結(jié)構(gòu)域中的以下至少一個氨基酸(EU編號)氨基酸位置237上的Met ;氨基酸位置238上的Ala ；氨基酸位置239上的Lys ;氨基酸位置248上的Ile ;氨基酸位置250 上的 Ala、Phe、lie、Met、Gin、Ser、Val、Trp 或 Tyr ；氨基酸位置252上的Phe、Trp或Tyr ；氨基酸位置254上的Thr ；氨基酸位置255上的Glu ;氨基酸位置256上的Asp、Glu或Gln ;氨基酸位置257 上的 Ala、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Ser> Thr 或 Val ；氨基酸位置258上的Hi s ;氨基酸位置265上的Ala ；氨基酸位置270上的Phe ；氨基酸位置286上的Ala或Glu ;氨基酸位置289上的Hi s ;氨基酸位置297上的Ala ；氨基酸位置298上的Gly ；氨基酸位置303上的Ala ;氨基酸位置305上的Ala ；氨基酸位置307 上的 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Val、Trp 或 Tyr ；氨基酸位置308 上的 Ala、Phe、lie、Leu、Met、Pro、Gln 或 Thr ；氨基酸位置309 上的 Ala、Asp、Glu、Pro 或 Arg ；氨基酸位置311上的Ala、His或lie ;氨基酸位置312上的Ala或His ;氨基酸位置314上的Lys或Arg ；氨基酸位置315上的Ala或His ;氨基酸位置317上的Ala ；
氨基酸位置325上的Gly ;氨基酸位置332上的Val ；氨基酸位置334上的Leu ；氨基酸位置360上的Hi s ;氨基酸位置376上的Ala ；
氨基酸位置380上的Ala ；氨基酸位置382上的Ala ；氨基酸位置384上的Ala ；氨基酸位置385上的Asp或Hi s ;氨基酸位置386上的Pro ；氨基酸位置387上的Glu ;氨基酸位置389上的Ala或Ser ;氨基酸位置424上的Ala ;氛基酸位置428 上的 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Asn、Pro、Gin、Ser>Thr、Val、Trp 或 Tyr ；氨基酸位置433位置上的Lys ；氨基酸位置434 上的 Ala、Phe、His、Ser、Trp 或 Tyr ；和氨基酸位置436上的His ;[21] [18]-[20]中任一個的抗原結(jié)合分子，其中親本IgG選自獲自非人動物的IgG ；[22] [18]-[20]中任一個的抗原結(jié)合分子，其中親本IgG是人IgG ；[23] [1]-[22]中任一個的抗原結(jié)合分子，其具有拮抗活性；[24] [1]-[23]的抗原結(jié)合分子，其與膜抗原或可溶性抗原結(jié)合；[25] [1]-[24]中任一個的抗原結(jié)合分子，其中抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含與受體結(jié)合的人工配體；[26] [1]-[24]中任一個的抗原結(jié)合分子，其中抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含與配體結(jié)合的人工受體；[27] [1]-[24]中任一個的抗原結(jié)合分子，其是抗體；[28] [27]的抗原結(jié)合分子，其中抗體選自嵌合抗體、人源化抗體或人抗體；[29]藥物組合物，其包含[1]_[28]中任一個的抗原結(jié)合分子；[30]用于通過提高其在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性而促進(jìn)抗原結(jié)合分子介導(dǎo)的細(xì)胞對抗原攝入的方法，其中抗原結(jié)合分子包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并在酸性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性；[31]用于通過提高其在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性和降低其在酸性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性至小于在中性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性而促進(jìn)抗原結(jié)合分子介導(dǎo)的細(xì)胞對抗原攝入的方法，其中抗原結(jié)合分子包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并在酸性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性；[32]用于通過提高其在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性而增加單個抗原結(jié)合分子可與之結(jié)合的抗原的數(shù)目的方法，其中抗原結(jié)合分子包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并在酸性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性；[33]用于通過提高其在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性且降低其在酸性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性至小于在中性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性而增加單個抗原結(jié)合分子可與之結(jié)合的抗原的數(shù)目的方法，其中抗原結(jié)合分子包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并在酸性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性； [34]用于通過提高其在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性而提高抗原結(jié)合分子從血漿中消除抗原的能力的方法，其中抗原結(jié)合分子包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并在酸性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性；[35]用于通過提高其在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性并降低其在酸性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性至小于在中性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性而提高抗原結(jié)合分子從血漿中消除抗原的能力的方法，其中抗原結(jié)合分子包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并在酸性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性；·
[36]用于通過提高其在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性而改進(jìn)抗原結(jié)合分子的藥代動力學(xué)的方法，其中抗原結(jié)合分子包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并在酸性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性；[37]用于通過提高其在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性并降低其在酸性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性至小于在中性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性而改進(jìn)抗原結(jié)合分子的藥代動力學(xué)的方法，其中抗原結(jié)合分子包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并在酸性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性；[38]用于促進(jìn)抗原結(jié)合分子與在細(xì)胞外與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原胞內(nèi)解離的方法，這通過提高其在中性PH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性且降低其在酸性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性至小于在中性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性來進(jìn)行，其中抗原結(jié)合分子包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并在酸性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性；[39]用于促進(jìn)以抗原結(jié)合的形式攝入細(xì)胞的抗原結(jié)合分子以無抗原形式胞外釋放的方法，這通過提高其在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性且降低其在酸性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性至小于在中性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性來進(jìn)行，其中抗原結(jié)合分子包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并在酸性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性；[40]用于通過提高其在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性而降低血漿中總血漿抗原濃度或游離血漿抗原濃度的方法，其中抗原結(jié)合分子包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并在酸性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性；[41]用于降低血漿中總血漿抗原濃度或游離血漿抗原濃度的方法，這通過提高其在中性PH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性且降低其在酸性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性至小于在中性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性來進(jìn)行，其中抗原結(jié)合分子包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并在酸性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性；[42] [30]-[41]中任一個的方法，其中酸性pH范圍為pH 5. 5_pH6. 5，中性pH范圍為 pH 7. Ο-pH 8. O ；[43] [30]-[41]中任一個的方法，其中在中性pH范圍內(nèi)人FcRn結(jié)合活性的提高是通過用不同氨基酸取代人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親本IgG Fe結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸而引起的增加；
[44] [30]-[41]中任一個的方法，其中在中性pH范圍內(nèi)人FcRn結(jié)合活性的提高是通過用不同氨基酸取代選自人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親本IgG Fe結(jié)構(gòu)域中的以下位置氨基酸中的至少一個氨基酸而引起的增加237、238、239、248、250、252、254、255、256、257、258、265、270、286、289、297、298、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、325、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434 和 436 (EU 編號)；[45] [31]、[33]、[35]、[37]-[39]和[41]中任一個的方法，其中通過用組氨酸取代抗原結(jié)合分子的至少一個氨基酸或插入至少一個組氨酸，將酸性PH范圍內(nèi)抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性降低至低于在中性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性；[46] [31]、[33]、[35]、[37]-[39]和[41]中任一個的方法，其中抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域獲自抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域文庫；
[47] [31]、[33]、[35]、[37]-[39]和[41]中任一個的方法，其中抗原結(jié)合活性的降低通過KD (在酸性pH范圍內(nèi))/KD (在中性pH范圍內(nèi))的值的增加來表示，所述值是相對于組氨酸取代或插入之前酸性PH范圍和中性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性的比率；[48]用于產(chǎn)生抗原結(jié)合分子的方法，所述方法包括以下步驟(a)選擇通過改變抗原結(jié)合分子的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸獲得的具有在中性PH范圍內(nèi)強于3. 2微摩爾的人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子；(b)得到編碼抗原結(jié)合分子的基因，其中在(a)中制備的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域與抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接；和(C)使用(b)中制備的基因產(chǎn)生抗原結(jié)合分子；[49]用于產(chǎn)生抗原結(jié)合分子的方法，所述方法包括以下步驟(a)選擇與在改變在酸性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸之前相比，在中性pH范圍內(nèi)具有較強的人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子；(b)改變抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸，并選擇與在酸性PH范圍內(nèi)相比在中性pH范圍內(nèi)具有較強抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子；(c)獲得編碼抗原結(jié)合分子的基因，其中在(a)和(b)中制備的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域與抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接；和(d)使用在(C)中制備的基因產(chǎn)生抗原結(jié)合分子；和[50]用于產(chǎn)生抗原結(jié)合分子的方法，所述方法包括以下步驟(a)選擇與在改變在酸性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸之前相比，在中性pH范圍內(nèi)具有較強的人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子；(b)選擇與在酸性pH范圍內(nèi)相比在中性pH范圍內(nèi)具有較強抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子；(c)獲得編碼抗原結(jié)合分子的基因，其中在(a)和(b)中制備的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域與抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接；和(d)使用在(C)中制備的基因產(chǎn)生抗原結(jié)合分子；[51]通過[48]_[50]中任一個的生產(chǎn)方法產(chǎn)生的抗原結(jié)合分子；[52]用于篩選抗原結(jié)合分子的方法，所述方法包括以下步驟
(a)選擇通過改變抗原結(jié)合分子的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸獲得的具有在中性PH范圍內(nèi)強于3. 2微摩爾的人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子；(b)得到編碼抗原結(jié)合分子的基因，其中在(a)中制備的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域與抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接；和(C)使用(b)中制備的基因產(chǎn)生抗原結(jié)合分子；[53]用于篩選抗原結(jié)合分子的方法，所述方法包括以下步驟(a)選擇與在改變在酸性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸之前相比，在中性pH范圍內(nèi)具有較強的人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子；(b)改變抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸，并選擇與在酸性PH范圍內(nèi)相比在中性pH范圍內(nèi)具有較強抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子；·(c)獲得編碼抗原結(jié)合分子的基因，其中在(a)和(b)中制備的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域與抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接；和(d)使用在(C)中制備的基因產(chǎn)生抗原結(jié)合分子；[54]用于篩選抗原結(jié)合分子的方法，所述方法包括以下步驟(a)選擇與在改變在酸性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸之前相比，在中性pH范圍內(nèi)具有較強的人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子；(b)選擇與在酸性pH范圍內(nèi)相比在中性pH范圍內(nèi)具有較強抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子；(c)獲得編碼抗原結(jié)合分子的基因，其中在(a)和(b)中制備的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域與抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接；和(d)使用在(C)中制備的基因產(chǎn)生抗原結(jié)合分子；[55] [30]-[54]中任一個的方法，其中抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含與受體結(jié)合的人工配體；[56] [30]-[54]中任一個的方法，其中抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含與配體結(jié)合的人工受體；和[57] [30]-[54]中任一個的方法，其中抗原結(jié)合分子為抗體。發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供用于促進(jìn)抗原結(jié)合分子介導(dǎo)的細(xì)胞對抗原攝入的方法；用于增加單個抗原結(jié)合分子可與之結(jié)合的抗原的數(shù)目的方法；和用于通過給予抗原結(jié)合分子促進(jìn)血漿抗原濃度降低的方法。當(dāng)抗原結(jié)合分子介導(dǎo)的細(xì)胞對抗原的攝入受促進(jìn)時，可通過給予這類抗原結(jié)合分子來促進(jìn)血漿抗原濃度的降低，并且可改進(jìn)抗原結(jié)合分子的藥代動力學(xué)以增加單個抗原結(jié)合分子可與之結(jié)合的抗原的數(shù)目。因此，抗原結(jié)合分子可產(chǎn)生比普通抗原結(jié)合分子更優(yōu)良的體內(nèi)作用。附圖簡述圖I在圖中顯示將抗人IL-6受體抗體給予人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠(品系276)后可溶形式的人IL-6受體的血漿濃度的時程，其中可溶形式人IL-6受體的血漿濃度是恒定的(穩(wěn)態(tài)輸注模型)。圖2是顯示IgG抗體分子與內(nèi)體中可溶性抗原的解離引起抗原消除加強，導(dǎo)致與另一抗原新一輪結(jié)合的示意圖。圖3在圖中顯示人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠中血漿抗體濃度的時程。圖4在圖中顯示人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠中可溶形式的人IL_6受體的血漿濃度的時程。圖5在圖中顯示正常小鼠中血漿抗體濃度的時程。圖6在圖中顯示正常小鼠中可溶形式的人IL-6受體的血漿濃度的時程。
圖7在圖中顯示正常小鼠中人IL-6受體的未結(jié)合可溶形式的血漿濃度的時程。圖8在圖中顯示人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠中可溶形式的人IL_6受體的血漿濃度的時程。圖9在圖中顯示以低劑量(O. 01mg/kg)或lmg/kg給予Fv4_IgGl_F14后可溶形式的人IL-6受體的血漿濃度的時程。

圖10在圖中顯示以低劑量((X01mg/kg)或lmg/kg給予Fv4_IgGl_F14后血衆(zhòng)抗體濃度的時程。圖11在圖中顯示在將抗人IL-6受體抗體給予正常小鼠(其中可溶形式人IL-6受體的血漿濃度是恒定的)后，可溶形式的人IL-6受體的血漿濃度的時程。圖12在圖中顯示將hsIL_6R和抗人IL-6受體抗體共注射給人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠(品系276)后血漿抗體濃度的時程。圖13在圖中顯示將hsIL_6R和抗人IL-6受體抗體共注射給人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠(品系276)后，可溶形式的人IL-6受體的血漿濃度的時程。圖14描述了在pH 7. O下Fe變體與人FcRn的結(jié)合親和力之間的關(guān)系以及將hsIL-6R和抗人IL-6受體抗體共注射給人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠(品系276)后第I天的血漿hsIL_6R 濃度。圖15描述了在pH 7.0下Fe變體與人FcRn的結(jié)合親和力之間的關(guān)系以及將hsIL-6R和抗人IL-6受體抗體共注射給人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠(品系276)后第I天的血漿抗體濃度。圖16描述了將hsIL_6R和抗人IL-6受體抗體共注射給人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠(品系276)后，抗原/抗體摩爾比率(C值)的時程。圖17描述了在pH 7. O下Fe變體與人FcRn的結(jié)合親和力之間的關(guān)系以及將hsIL-6R和抗人IL-6受體抗體共注射給人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠(品系276)后第I天的抗原/抗體摩爾比率(C值)的時程。圖18在圖中顯示在以低劑量(O. 01或O. 2mg/kg)或lmg/kg將Fv4_IgGl_F14給予人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠(品系276)(其中hsIL_6R的血漿濃度是恒定的)(穩(wěn)態(tài)輸注模型)后hsIL-6R的血漿濃度的時程。圖19描述了在將hsIL_6R和抗人IL-6受體抗體共注射給人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠(品系276和32)后，人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠品系276和品系32中血漿hsIL_6R濃度的時程。圖20描述了在將hsIL_6R和抗人IL-6受體抗體共注射給人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠(品系276和32)后，人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠品系276和品系32中血漿抗體濃度的時程。
圖21在圖中顯示在將抗人IL-6受體抗體給予人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠(品系32)(其中hsIL-6R的血漿濃度是恒定的)(穩(wěn)態(tài)輸注模型)后，hsIL-6R的血漿濃度的時程。圖22在圖中顯示在將抗人IL-6受體抗體給予人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠(品系32)(其中hsIL-6R的血漿濃度是恒定的)(穩(wěn)態(tài)輸注模型)后，抗體血漿濃度的時程。圖23描述了在將抗人IL-6受體抗體給予人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠(品系32)(其中hsIL-6R的血漿濃度是恒定的)(穩(wěn)態(tài)輸注模型)后，抗原/抗體摩爾比率(C值)的時程。圖24描述了在pH7. O下Fe變體與人FcRn的結(jié)合親和力之間的關(guān)系以及在將抗人IL-6受體抗體給予人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠(品系32)(其中hsIL_6R的血漿濃度是恒定的)(穩(wěn)態(tài)輸注模型)后第I天抗原/抗體摩爾比率(C值)。圖25在圖中顯示在將具有FlI、F39、F48和F264的Fe變體的抗人IL-6受體抗體給予人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠(品系32)(其中hsIL_6R的血漿濃度是恒定的)(穩(wěn)態(tài)輸注模型)后血漿抗體濃度的時程。圖26在圖中顯示在將具有F11、F39、F48和F264的Fe變體的抗人IL_6受體抗體給予給予人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠(品系32)(其中hsIL_6R的血漿濃度是恒定的)(穩(wěn)態(tài)輸注模型)后hsIL-6R的血漿濃度的時程。圖27在圖中顯示在將具有F157、F196和F262的Fe變體的抗人IL_6受體抗體給予人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠(品系32)(其中hsIL_6R的血漿濃度是恒定的)(穩(wěn)態(tài)輸注模型)后血漿抗體濃度的時程。圖28在圖中顯示在將具有F157、F196和F262的Fe變體的抗人IL_6受體抗體給予人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠(品系32)(其中hsIL_6R的血漿濃度是恒定的)(穩(wěn)態(tài)輸注模型)后hsIL-6R的血漿濃度的時程。圖29描述了用于常規(guī)抗體和抗原消除性抗體的計算機模擬研究(in silicostudy)的藥代動力學(xué)模型。圖30在圖中顯示在給正常小鼠共注射人IL-6和抗人IL_6抗體后人IL_6的血漿濃度的時程。圖31在圖中顯示在給正常小鼠共注射人IL-6和抗人IL_6抗體后抗體的血漿濃度的時程。圖32示出了采用Biacore在pH 7. 4和pH 6. O下與CD89_Fc融合蛋白結(jié)合的人IgA的傳感圖。圖33在圖中顯示在給正常小鼠共注射人IgA和⑶89_Fc融合蛋白后人IgA的血漿濃度的時程。圖34在圖中顯示在給正常小鼠共注射人IgA和⑶89_Fc融合蛋白后抗體的血漿濃度的時程。圖35在圖中顯示在給正常小鼠共注射可溶性人叢蛋白Al和抗人叢蛋白Al抗體后7小時可溶性人叢蛋白Al的血漿濃度。實施方案的描述本發(fā)明提供用于促進(jìn)抗原結(jié)合分子介導(dǎo)的細(xì)胞對抗原攝入的方法。更具體地講，本發(fā)明提供通過在酸性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子促進(jìn)細(xì)胞對抗原攝入的方法，所述方法基于增加抗原結(jié)合分子在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性。本發(fā)明還提供通過在酸性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子提高細(xì)胞對抗原攝入的方法，其基于改變抗原結(jié)合分子的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸。本發(fā)明還提供通過在酸性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子促進(jìn)細(xì)胞對抗原攝入的方法，所述方法基于使用包含具有取代的氨基酸序列的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述取代為用不同氨基酸取代選自包含親本IgG的Fe結(jié)構(gòu)域的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親本IgGFc結(jié)構(gòu)域中的以下 位置氨基酸中的至少一個氨基酸237、238、239、248、250、252、254、255、256、257、258、265、270、286、289、297、298、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、325、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434 和436 (EU 編號)。本發(fā)明還提供用于促進(jìn)抗原結(jié)合分子介導(dǎo)的細(xì)胞對抗原攝入的方法，其通過降低上述抗原結(jié)合分子在酸性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性(結(jié)合能力)至小于其在中性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性來進(jìn)行；并且這促進(jìn)細(xì)胞對抗原的攝入。本發(fā)明還提供用于促進(jìn)抗原結(jié)合分子介導(dǎo)的細(xì)胞對抗原攝入的方法，所述方法基于改變上述抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸，其促進(jìn)細(xì)胞對抗原的攝入。本發(fā)明還提供用于促進(jìn)抗原結(jié)合分子介導(dǎo)的細(xì)胞對抗原攝入的方法，所述方法基于用組氨酸取代至少一個氨基酸或?qū)⒅辽僖粋€組氨酸插入上述抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其促進(jìn)細(xì)胞對抗原的攝入。在本文中，由抗原結(jié)合分子介導(dǎo)的“細(xì)胞對抗原的攝入”意指通過胞吞將抗原攝入細(xì)胞。同時，在本文中，“促進(jìn)攝入細(xì)胞”意指提高與血漿中抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子的胞內(nèi)攝取速率，和/或降低所攝取的抗原重新循環(huán)至血漿的量。這意味著與在提高在中性PH范圍內(nèi)抗原結(jié)合分子的人FcRn結(jié)合活性之前、或在增加在酸性pH范圍內(nèi)抗原結(jié)合分子的人FcRn結(jié)合活性和降低在酸性pH范圍內(nèi)抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性(結(jié)合能力)至小于其在中性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性之前的抗原結(jié)合分子相比，攝入細(xì)胞的速率得到促進(jìn)。優(yōu)選與完整人IgG相比，更優(yōu)選與完整人IgG相比，該速率得到改進(jìn)。因此，在本發(fā)明中，可根據(jù)細(xì)胞對抗原攝入的速率的增加，來評價抗原結(jié)合分子是否促進(jìn)細(xì)胞對抗原的攝入。可通過例如在將抗原和抗原結(jié)合分子加入培養(yǎng)基中后，監(jiān)測含有表達(dá)人FcRn的細(xì)胞的培養(yǎng)基中抗原濃度隨時間的降低，或監(jiān)測攝入表達(dá)人FcRn的細(xì)胞的隨時間推移的抗原量，來計算細(xì)胞對抗原攝入的速率。例如，可采用促進(jìn)抗原結(jié)合分子介導(dǎo)的細(xì)胞對抗原攝入的速率的本發(fā)明方法，通過給予抗原結(jié)合分子，提高抗原從血漿中消除的速率。因此，可通過例如通過給予抗原結(jié)合分子，測試抗原從血漿中消除的速率是否加快或血漿總抗原濃度是否降低，來評價是否促進(jìn)抗原結(jié)合分子介導(dǎo)的細(xì)胞對抗原攝入。在本文中，“血漿總抗原濃度”意指抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原濃度與未結(jié)合的抗原濃度即“血漿游離抗原濃度”的總和，所述血漿游離抗原濃度是抗原結(jié)合分子未結(jié)合的抗原濃度。測量“血漿總抗原濃度”或“血漿游離抗原濃度”的各種方法如下所述是本領(lǐng)域眾所周知的。本文所用的“完整人IgG”意指未修飾的人IgG，且不限于IgG的特定類別。這意味著人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4均可用作“完整人IgG”，只要在酸性pH范圍內(nèi)可與人FcRn結(jié)合。優(yōu)選“完整人IgG”可以是人IgGl。本發(fā)明還提供用于增加單個抗原結(jié)合分子可與之結(jié)合的抗原的數(shù)目的方法。更具體地講，本發(fā)明提供通過提高在中性pH范圍內(nèi)抗原結(jié)合分子的人FcRn結(jié)合活性，而提高在酸性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性的單一抗原結(jié)合分子可與之結(jié)合的抗原的數(shù)目的方法。本發(fā)明還提供通過改變抗原結(jié)合分子的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸，而提高在酸性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性的單一抗原結(jié)合分子可與之結(jié)合的抗原的數(shù)目的方法。本發(fā)明還提供增加在酸性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性的單一抗原結(jié)合分子可與之結(jié)合的抗原的數(shù)目的方法，所述方法通過使用包含這樣氨基酸序列的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域來進(jìn)行，在所述氨基酸序列中，選自包含親本IgG Fe結(jié)構(gòu)域的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親本IgG Fe結(jié)構(gòu)域中的以下位置氨基酸中的至少一個氨基酸被不同氨基酸取代237、238、239、248、250、252、254、255、256、257、258、265、270、286、289、297、298、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、325、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、 428,433,434和 436 (EU 編號)。本文所用的“親本IgG”意指未修飾的IgG，其隨后被修飾以產(chǎn)生變體，只要親本IgG的修飾變體可在酸性pH范圍內(nèi)與人FcRn結(jié)合(因此，在酸性條件下，親本IgG不必需要與人FcRn結(jié)合活性)。親本IgG可以是天然存在的IgG，或天然存在的IgG的變體或工程改造形式。親本IgG可指多肽本身、包含親本IgG的組合物或編碼親本IgG的氨基酸序列。應(yīng)注意，親本IgG”包括下文概述的已知市售的重組產(chǎn)生的IgG。“親本IgG”的來源不受限制，可獲自非人動物或人的任何生物。優(yōu)選生物選自小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、沙鼠(gerbi I)、貓、兔、狗、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝和非人靈長類動物。在另一個實施方案中，“親本IgG”也可獲自食蟹猴(cynomologous)、狨猴、獼猴、黑猩猩或人。優(yōu)選“親本IgG”獲自人IgGl，但不限于IgG的特定類別。這意味著人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4均可適當(dāng)?shù)赜米鳌坝H本IgG”。類似地，上述任何生物的IgG的任何類別或亞類可優(yōu)選用作“親本IgG”。天然存在的IgG的變體或工程改造形式的實例描述于Curr Opin Biotechnol. 2009年12月；20(6) :685_91 ；Curr Opin Immunol. 2008 年 8 月；20(4) 460-70 ；Protein Eng Des Sel. 2010 年 4 月；23(4) 195-202 ；W02009/086320,W0 2008/092117,WO 2007/041635 和 WO 2006/105338，但不限于這些。此外，本發(fā)明提供通過降低上述抗原結(jié)合分子(其抗原結(jié)合事件的數(shù)目增加)在酸性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性(結(jié)合能力)至小于其在中性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性，而增加單個抗原結(jié)合分子可與之結(jié)合的抗原的數(shù)目的方法。本發(fā)明還提供通過改變上述抗原結(jié)合分子(其抗原結(jié)合事件的數(shù)目增加)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的至少一個氨基酸，而增加單個抗原結(jié)合分子可與之結(jié)合的抗原的數(shù)目的方法。本發(fā)明還提供通過用組氨酸取代至少一個氨基酸或?qū)⒅辽僖粋€組氨酸插入具有上述抗原結(jié)合分子(其抗原結(jié)合事件的數(shù)目增加)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而增加單個抗原結(jié)合分子可與之結(jié)合的抗原的數(shù)目的方法。在本文中，“單個抗原結(jié)合分子可與之結(jié)合的抗原的數(shù)目”意指單個抗原結(jié)合分子可與之結(jié)合直到該分子因降解而被消除的抗原的數(shù)目。在本文中，“增加單個抗原結(jié)合分子可與之結(jié)合的抗原的數(shù)目”意指直到抗原結(jié)合分子因降解而被消除時所實現(xiàn)的循環(huán)數(shù)目增力口，其中每個循環(huán)由以下組成抗原與血漿中的抗原結(jié)合分子結(jié)合，胞內(nèi)攝取與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子，在內(nèi)體中與抗原解離，接著抗原結(jié)合分子返回到血漿中。這意味著與在提高抗原結(jié)合分子在中性PH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性之前，或在提高在酸性pH范圍內(nèi)抗原結(jié)合分子的人FcRn結(jié)合活性且降低在酸性pH范圍內(nèi)抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性(結(jié)合能力)至小于其在中性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性之前的抗原結(jié)合分子相比，循環(huán)數(shù)增加。因此，可通過測試上述“胞內(nèi)攝取是否得到促進(jìn)”或下述“藥代動力學(xué)是否改進(jìn)”，來評價循環(huán)數(shù)是否增加。本發(fā)明還提供用于促進(jìn)自細(xì)胞外與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子上胞內(nèi)解離出抗原的方法。更具體地講，本發(fā)明提供促進(jìn)自細(xì)胞外與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子上胞內(nèi)解離出抗原的方法，所述方法如下進(jìn)行通過提高在酸性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子在中性PH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性，并降低其在酸性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性至小于在中性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性。本發(fā)明還提供用于促進(jìn)自細(xì)胞外與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子上胞內(nèi)解離出抗原的方法，其基于改變抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的至少一個氨基酸，且同時改變在酸性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的至少一個氨基酸。本發(fā)明還提供用于促進(jìn)自細(xì)胞外與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子上胞內(nèi)解離出抗原的方法，所述方法如下進(jìn)行通過用組氨酸取代至少一個氨基酸或?qū)⒅辽僖粋€組氨酸插入抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，同時用不同氨基酸取代選自人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親本IgG Fe結(jié)構(gòu)域中的以下位置氨基酸中的至少一個氨基酸237、238、239、248、250、252、254、255、256、257、258、265、270、286、289、297、298、303、305、307、·308、309、311、312、314、315、317、325、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434 和 436 (EU 編號)。在本發(fā)明中，抗原可自細(xì)胞內(nèi)的任何位置處的抗原結(jié)合分子上解離；然而，優(yōu)選的解離位點是早期內(nèi)體。在本文中，“自抗原結(jié)合分子上胞內(nèi)解離出在細(xì)胞外與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原”不一定意味著通過與抗原結(jié)合分子結(jié)合攝入細(xì)胞的全部抗原都在細(xì)胞內(nèi)自抗原結(jié)合分子上解離。因此，可以接受的是，與在降低在酸性PH范圍內(nèi)抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性至小于在中性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性且同時提高在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性之前相比，在細(xì)胞內(nèi)自抗原結(jié)合分子上解離的抗原的比例增加。用于促進(jìn)自細(xì)胞外與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子上胞內(nèi)解離出抗原的這類方法與以下方法同義通過促進(jìn)與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子的攝取而賦予抗原結(jié)合分子促進(jìn)自抗原結(jié)合分子上胞內(nèi)解離出抗原的性質(zhì)的方法。本發(fā)明還提供用于促進(jìn)以抗原結(jié)合的形式攝入細(xì)胞中的不含抗原的抗原結(jié)合分子在胞外釋放的方法。更具體地講，本發(fā)明提供用于促進(jìn)以抗原結(jié)合的形式攝入細(xì)胞中的不含抗原的抗原結(jié)合分子在胞外釋放的方法，所述方法如下進(jìn)行通過提高在酸性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性并降低其在酸性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性至小于在中性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性。本發(fā)明還提供用于促進(jìn)以抗原結(jié)合的形式攝入細(xì)胞中的不含抗原的抗原結(jié)合分子在胞外釋放的方法，所述方法基于改變抗原結(jié)合分子中的至少一個氨基酸，且同時改變?nèi)薋cRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸。本發(fā)明還提供用于促進(jìn)以抗原結(jié)合的形式攝入細(xì)胞中的不含抗原的抗原結(jié)合分子在胞外釋放的方法，所述方法如下進(jìn)行通過用組氨酸取代至少一個氨基酸或?qū)⒅辽僖粋€組氨酸插入抗原結(jié)合分子，同時用不同氨基酸取代選自人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親本IgG Fe結(jié)構(gòu)域中的以下位置氨基酸中的至少一個氨基酸237、238、239、248、250、252、254、255、256、257、258、265、270、286、289、297、298、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、325、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434 和 436 (EU編號)。在本文中，“以抗原結(jié)合的形式攝入細(xì)胞中的不含抗原的抗原結(jié)合分子在胞外釋放”不一定意味著攝入細(xì)胞中的與抗原結(jié)合的全部抗原結(jié)合分子以不含抗原的形式在細(xì)胞外釋放?？梢越邮艿氖?，與在降低在酸性PH范圍內(nèi)抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性至小于在中性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性并提高在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性之前相比，以不含抗原的形式釋放到細(xì)胞外的抗原結(jié)合分子的比例增加。釋放到細(xì)胞外的抗原結(jié)合分子優(yōu)選保持抗原結(jié)合活性。用于促進(jìn)以抗原結(jié)合的形式攝入細(xì)胞的不含抗原的抗原結(jié)合分子在胞外釋放的這類方法與以下方法同義通過促進(jìn)與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子攝入細(xì)胞中而賦予抗原結(jié)合分子促進(jìn)以抗原結(jié)合的形式攝入細(xì)胞中的不含抗原的抗原結(jié)合分子在胞外釋放的性質(zhì)的方法。本發(fā)明還提供用于通過給予抗原結(jié)合分子而提高消除血漿抗原的能力的方法。在本發(fā)明中，“用于提高消除血漿抗原的能力的方法”與“用于提高抗原結(jié)合分子從血漿中消 除抗原的能力的方法”同義。更具體地講，本發(fā)明提供用于提高由在酸性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子消除血漿抗原的能力的方法，所述方法通過提高在中性pH范圍內(nèi)抗原結(jié)合分子的人FcRn結(jié)合活性來進(jìn)行。本發(fā)明還提供用于提高由在酸性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子消除血漿抗原的能力的方法，所述方法基于改變抗原結(jié)合分子的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸。本發(fā)明還提供用于提高由在酸性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子消除血漿抗原的能力的方法，所述方法通過使用包含具有取代的氨基酸序列的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域來進(jìn)行，所述取代為用不同氨基酸取代選自包含親本IgG的Fe結(jié)構(gòu)域的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親本IgG Fe結(jié)構(gòu)域中的以下位置氨基酸中的至少一個氨基酸237、238、239、248、250、252、254、255、256、257、258、265、270、286、289、297、298、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、325、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、
428,433,434和 436 (EU 編號)。本發(fā)明還提供用于提高抗原結(jié)合分子消除血漿抗原的能力的方法，所述方法如下進(jìn)行與在中性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性相比，降低消除血漿抗原的能力得到改進(jìn)的上述抗原結(jié)合分子在酸性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性。本發(fā)明還提供用于提高抗原結(jié)合分子消除血漿抗原的能力的方法，所述方法如下進(jìn)行通過改變消除血漿抗原的能力得到改進(jìn)的上述抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸。本發(fā)明還提供用于通過給予抗原結(jié)合分子以提高消除血漿抗原的能力的方法，所述方法如下進(jìn)行通過用組氨酸取代至少一個氨基酸或?qū)⒅辽僖粋€組氨酸插入消除血漿抗原的能力得到改進(jìn)的上述抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在本文中，“消除血漿抗原的能力”意指當(dāng)給予或體內(nèi)分泌抗原結(jié)合分子時從血漿中消除抗原的能力。因此，“抗原結(jié)合分子消除血漿抗原的能力的提高”在本文中意指與在提高抗原結(jié)合分子在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性之前或在增加人FcRn結(jié)合活性且同時降低其在酸性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性至小于在中性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性之前相比，給予抗原結(jié)合分子時從血漿中消除抗原的速率加快?？赏ㄟ^例如體內(nèi)給予可溶性抗原和抗原結(jié)合分子，并測量給予后血漿中可溶性抗原的濃度，來評價抗原結(jié)合分子從血漿中消除抗原的活性的提高。當(dāng)通過提高在中性PH范圍內(nèi)抗原結(jié)合分子的人FcRn結(jié)合活性，或通過提高其人FcRn結(jié)合活性且同時降低其在酸性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性至小于在中性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性，在給予可溶性抗原和抗原結(jié)合分子后血漿中的可溶性抗原濃度降低時，可認(rèn)定抗原結(jié)合分子消除血漿抗原的能力提高?？扇苄钥乖男问娇蔀榭乖Y(jié)合分子結(jié)合的抗原或抗原結(jié)合分子未結(jié)合的抗原，其濃度可分別測定為“血漿中抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原濃度”和“血漿中抗原結(jié)合分子未結(jié)合的抗原濃度”(后者與“血漿游離抗原濃度”同義)。因為“血漿總抗原濃度”意指抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原濃度和未結(jié)合的抗原濃度或“血漿游離抗原濃度”的總和，后者是抗原結(jié)合分子未結(jié)合的抗原濃度，可溶性抗原的濃度可測定為“血漿總抗原濃度”。用于測量“血漿總抗原濃度”或“血漿游離抗原濃度”的各種方法如下所述是本領(lǐng)域眾所周知的。本發(fā)明還提供用于改進(jìn)抗原結(jié)合分子的藥代動力學(xué)的方法。更具體地講，本發(fā)明提供用于通過提高在中性PH范圍內(nèi)抗原結(jié)合分子的人FcRn結(jié)合活性，而改進(jìn)在酸性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的藥代動力學(xué)的方法。此外，本發(fā)明提供用于通過改變抗原結(jié)合分子的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸，而改進(jìn)在酸性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的藥代動力學(xué)。
本發(fā)明還提供用于改進(jìn)在酸性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的藥代動力學(xué)，其通過使用包含具有取代的氨基酸序列的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域來進(jìn)行，所述取代為用不同氨基酸取代選自包含IgG的Fe結(jié)構(gòu)域的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親本IgG Fe結(jié)構(gòu)域中的以下位置氨基酸中的至少一個氨基酸237、238、239、248、250、252、254、255、256、257、258、265、270、286、289、297、298、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、325、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434 和 436 (EU 編號)。此外，本發(fā)明提供用于改進(jìn)抗原結(jié)合分子的藥代動力學(xué)的方法，所述方法如下進(jìn)行通過降低藥代動力學(xué)得到改進(jìn)的上述抗原結(jié)合分子在酸性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性至小于其在中性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性。本發(fā)明還提供用于改進(jìn)在酸性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的藥代動力學(xué)的方法，所述方法如下進(jìn)行通過改變藥代動力學(xué)得到改進(jìn)的上述抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸。本發(fā)明還提供用于改進(jìn)藥代動力學(xué)的方法，所述方法如下進(jìn)行通過用組氨酸取代至少一個氨基酸或?qū)⒅辽僖粋€組氨酸插入藥代動力學(xué)得到改進(jìn)的上述抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在本文中，“藥代動力學(xué)的提高”、“藥代動力學(xué)的改進(jìn)”和“優(yōu)良的藥代動力學(xué)”可以以另一方式描述為“血漿(血液)滯留的提高”、“血漿(血液)滯留的改進(jìn)”、“優(yōu)良的血漿(血液)滯留”和“延長的血漿(血液)滯留”。這些術(shù)語是同義的。在本文中，“藥代動力學(xué)的改進(jìn)”不僅僅是指在將抗原結(jié)合分子給予人或非人動物例如小鼠、大鼠、猴、兔和狗后直到從血漿中消除(例如直到抗原結(jié)合分子在胞內(nèi)降解等，且不能返回到血漿中)的時間延長，而且還指在給藥期至因降解所致消除期間，以允許抗原結(jié)合的形式(例如以抗原結(jié)合分子的無抗原形式)的抗原結(jié)合分子的血漿滯留延長。完整人IgG可與非人動物的FcRn結(jié)合。例如，可優(yōu)選使用小鼠對其給藥，以證實本發(fā)明的抗原結(jié)合分子的性質(zhì)，因為與人FcRn相比，完整人IgG可更牢地與小鼠FcRn結(jié)合(Int Immunol. 2001年12月；13(12) : 1551-9)。作為另一個實例，還可優(yōu)選使用小鼠，其中其天然FcRn基因被破壞且?guī)в写磉_(dá)的人FcRn基因這一轉(zhuǎn)基因(MethodsMolBiol. 2010 ；602 :93_104)，對該小鼠進(jìn)行給藥以證實本文下述本發(fā)明的抗原結(jié)合分子的性質(zhì)。具體而言，“藥代動力學(xué)的改進(jìn)”還包括時間延長直到由未與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子(抗原結(jié)合分子的無抗原形式)降解所致消除。如果抗原結(jié)合分子已經(jīng)與抗原結(jié)合，則血漿中的抗原結(jié)合分子不能與新的抗原結(jié)合。因此，抗原結(jié)合分子未與抗原結(jié)合的時間越長，它可與新抗原結(jié)合的時間越長(與另一抗原結(jié)合的機會越高)。這在體內(nèi)能夠縮短抗原游離于抗原結(jié)合分子的時間，并且延長抗原與抗原結(jié)合分子結(jié)合的時間?？赏ㄟ^給予抗原結(jié)合分子加快抗原從血漿中消除，而增加抗原結(jié)合分子的無抗原形式的血漿濃度，且延長抗原與抗原結(jié)合分子結(jié)合的時間。具體而言，本文中，“抗原結(jié)合分子的藥代動力學(xué)的改進(jìn)”包括在給予抗原結(jié)合分子后，抗原結(jié)合分子的無抗原形式的藥代動力學(xué)參數(shù)改進(jìn)(血漿半衰期延長、血漿平均滯留時間延長和血漿清除削弱中的任一個)、抗原與抗原結(jié)合分子結(jié)合的時間延長，以及血漿中抗原結(jié)合分子介導(dǎo)的抗原消除加快。可通過測定以下參數(shù)的任一個，來評價抗原結(jié)合分子的藥代動力學(xué)的改進(jìn)血漿半衰期、平均血漿滯留時間和抗原結(jié)合分子或其無抗原形式的血衆(zhòng)清除(“Pharmacokinetics :Enshu_niyoruRikai (Understanding throughpractice) Vanzando)。例如，在將抗原結(jié)合分子給予小鼠、大鼠、猴、兔、狗或人后，測定抗原結(jié)合分子或其無抗原形式的血漿濃度。然后，測定各參數(shù)。當(dāng)血漿半衰期或平均血漿滯留時間延長時，可認(rèn)定抗原結(jié)合分子的藥代動力學(xué)得到改進(jìn)。可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法測定參數(shù)。可按照隨附說明手冊，應(yīng)用藥代動力學(xué)分析軟 件WinNonlin(Pharsight),通過例如非無房室分析來對參數(shù)進(jìn)行恰當(dāng)評價?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法，例如米用Clin Pharmacol. 2008年4月；48 (4) 406-17中所描述的測定方法，測定無抗原的抗原結(jié)合分子的血漿濃度。在本文中，“藥代動力學(xué)的改進(jìn)”還包括在給予抗原結(jié)合分子后，抗原與抗原結(jié)合分子結(jié)合的時間延長?？赏ㄟ^測定游離抗原的血漿濃度，來評價在給予抗原結(jié)合分子后抗原與抗原結(jié)合分子結(jié)合的時間是否延長?？筛鶕?jù)所測定的游離抗原的血漿濃度或提高游離抗原濃度與總抗原深度的比率所需時間，來認(rèn)定延長。可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法，例如通過Pharm Res. 2006年I月；23 (I):95-103中描述的方法，來測定未與抗原結(jié)合分子結(jié)合的游離抗原的血漿濃度或游離抗原濃度與總濃度的比率?；蛘?，當(dāng)抗原在體內(nèi)具有特定功能時，可通過測試抗原功能是否被中和，來評價抗原是否與中和抗原功能的抗原結(jié)合分子(拮抗性分子)結(jié)合?？赏ㄟ^測定反映抗原功能的體內(nèi)標(biāo)志物，來評價抗原功能是否被中和?？赏ㄟ^測定反映抗原功能的體內(nèi)標(biāo)志物，來評價抗原是否與激活抗原功能的抗原結(jié)合分子(激動性分子)結(jié)合。游離抗原的血漿濃度和血漿中游離抗原的量與血漿中的抗原總量的比率的測定、體內(nèi)標(biāo)志物測定和這類測量不受特別限制；然而，優(yōu)選在給予抗原結(jié)合分子后過一定時間后實施測定。在本發(fā)明中，在給予抗原結(jié)合分子后的時間不受特別限制；本領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)所給予的抗原結(jié)合分子的性質(zhì)等，來確定合適的時間。這類時間包括例如給予抗原結(jié)合分子后I天、給予抗原結(jié)合分子后3天、給予抗原結(jié)合分子后7天、給予抗原結(jié)合分子后14天和給予抗原結(jié)合分子后28天。在本文中，“血漿抗原濃度”意指“血漿總抗原濃度”，其是抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原和未結(jié)合的抗原濃度的總和，或意指“血漿游離抗原濃度”，其是抗原結(jié)合分子未結(jié)合的抗原濃度。與給予包含完整人IgG Fe結(jié)構(gòu)域作為人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的參比抗原結(jié)合分子相t匕，或與當(dāng)不給予本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域分子時相比，通過給予本發(fā)明的抗原結(jié)合分子，可降低血漿總抗原濃度達(dá)2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1，000倍或
甚至更高倍?？扇缦掠嬎憧乖?抗原結(jié)合分子的摩爾比率A值各時間點的抗原摩爾濃度B值各時間點的抗原結(jié)合分子摩爾濃度 C值各時間點抗原摩爾濃度/抗原結(jié)合分子摩爾濃度(抗原/抗原結(jié)合分子摩爾比率)C = A/BoC值越小，表明每抗原結(jié)合分子的抗原消除效率越高，而C值越高，則表明每抗原結(jié)合分子的抗原消除效率越低?？乖?抗原結(jié)合分子摩爾比率可如上述計算。與包含完整人IgG Fe結(jié)構(gòu)域作為人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的參比抗原結(jié)合分子相比，給予本發(fā)明的抗原結(jié)合分子可降低抗原/抗原結(jié)合分子摩爾比率達(dá)2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1，000倍或甚至更高倍。在本文中，完整人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4優(yōu)選用作完整人IgG，目的在于針對其人FcRn結(jié)合活性或體內(nèi)活性對參比完整人IgG與抗原結(jié)合分子進(jìn)行比較。優(yōu)選可適當(dāng)使用參比抗原結(jié)合分子，其包含與目標(biāo)抗原結(jié)合分子相同的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和完整人IgG Fe結(jié)構(gòu)域作為人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域。更優(yōu)選使用完整人IgGl，目的在于針對其人FcRn結(jié)合活性或體內(nèi)活性對參比完整人IgG與抗原結(jié)合分子進(jìn)行比較?？砂磳嵤├?、8和13中所述，評價血漿總抗原濃度或抗原/抗體摩爾比率的降低。更具體地講，使用人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠品系32或品系276 (Jackson Laboratories,Methods Mol Biol. 2010 ；602 93-104)，當(dāng)抗原結(jié)合分子不與小鼠對應(yīng)抗原交叉反應(yīng)時，可通過抗原-抗體共注射模型或穩(wěn)態(tài)抗原輸注模型對其進(jìn)行評價。當(dāng)抗原結(jié)合分子與小鼠對應(yīng)物交叉反應(yīng)時，僅僅將抗原結(jié)合分子注射給人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠品系32或品系276 (Jackson Laboratories),便可對其進(jìn)行評價。在共注射模型中，將抗原結(jié)合分子和抗原的混合物給予小鼠。在穩(wěn)態(tài)抗原輸注模型，將裝有抗原溶液的輸注泵植入小鼠中以實現(xiàn)恒定的血漿抗原濃度，然后給小鼠注射抗原結(jié)合分子。以相同的劑量給予試驗抗原結(jié)合分子。采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法，在適當(dāng)?shù)臅r間點測量血漿總抗原濃度、血漿游離抗原濃度和血漿抗原結(jié)合分子濃度。可在給予后2、4、7、14、28、56或84天測量血漿總抗原濃度或游離抗原濃度及抗原/抗原結(jié)合分子摩爾比率以評價本發(fā)明的長期作用。換句話說，在給予抗原結(jié)合分子后2、
4、7、14、28、56或84天，通過測量血漿總抗原濃度或游離抗原濃度和抗原/抗原結(jié)合分子摩爾比率來測定長期血漿抗原濃度，以評價本發(fā)明的抗原結(jié)合分子的性質(zhì)?？赏ㄟ^評價任一個或多個上述時間點的降低來確定本發(fā)明所述抗原結(jié)合分子是否實現(xiàn)血漿抗原濃度或抗原/抗原結(jié)合分子摩爾比率的降低?？稍诮o予后15分鐘、1、2、4、8、12或24小時測量血漿總抗原濃度或游離抗原濃度和抗原/抗原結(jié)合分子摩爾比率，以評價本發(fā)明的短期作用。換句話說，通過在給予抗原結(jié)合分子后15分鐘、1、2、4、8、12或24小時測量血漿總抗原濃度或游離抗原濃度和抗原/抗原結(jié)合分子摩爾比率，來測定短期血漿抗原濃度，以評價本發(fā)明的抗原結(jié)合分子的性質(zhì)。
本發(fā)明的抗原結(jié)合分子的給藥途徑可選自皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、玻璃體內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、胃腸外和肌內(nèi)注射。在本發(fā)明中，優(yōu)選在人中藥代動力學(xué)的改進(jìn)。如果難以確定人中的血漿滯留，則其可根據(jù)小鼠(例如正常小鼠、表達(dá)人抗原的轉(zhuǎn)基因小鼠、表達(dá)人FcRn的轉(zhuǎn)基因小鼠)或猴(例如食蟹猴)中的血漿滯留來預(yù)測。在本文中，酸性pH范圍通常是指pH 4.0-pH 6.5。酸性pH范圍優(yōu)選為由pH
5.5-pH 6. 5 內(nèi)的任何 pH 值表示的范圍，優(yōu)選選自 5· 5、5· 6、5· 7、5· 8、5· 9、6· 0、6· 1、6· 2、
6.3、6. 4和6. 5，特別優(yōu)選pH 5. 8_pH6. O，這接近于體內(nèi)早期內(nèi)體的pH。同時，本文的中性pH范圍通常是指pH 6. 7-pH 10.0。中性pH范圍優(yōu)選為由pH 7. Ο-pH 8. O內(nèi)的任何pH值表示的范圍，優(yōu)選選自 pH 7. 0,7. 1,7. 2,7. 3,7. 4,7. 5,7. 6,7. 7,7. 8,7. 9 和 8. 0，特別優(yōu)選pH 7. 4，這與體內(nèi)血漿(血液)pH接近。如果由于其在pH 7. 4的低親和力所致，難以評價 人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域與人FcRn之間的結(jié)合親和力，則可使用pH 7. O替代pH 7.4。至于用于測定條件的溫度，可在10°C -50°C的任何溫度下評價人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域與人FcRn之間的結(jié)合親和力。優(yōu)選采用15°C-40°C的溫度以測定人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域與人FcRn之間的結(jié)合親和力。更優(yōu)選還采用200C _35°C的任何溫度，比如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34和35°C中的任一個，以測定人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域與人FcRn之間的結(jié)合親和力。實施例5中所述的25°C溫度是本發(fā)明的實施方案的一個實例。因此，本文中“降低酸性pH范圍內(nèi)抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性至小于在中性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性”意指與其在pH 6.7-pH 10. O下的抗原結(jié)合活性相比，抗原結(jié)合分子在pH 4. Ο-pH 6. 5下的抗原結(jié)合活性減弱。優(yōu)選上述表述意指與在pH 7. Ο-pH 8. O下的抗原結(jié)合活性相比，抗原結(jié)合分子在pH 5.5-pH 6. 5下的抗原結(jié)合活性減弱，更優(yōu)選意指與其在體內(nèi)血漿PH下的抗原結(jié)合活性相比，其在早期內(nèi)體pH下的抗原結(jié)合活性減弱。具體而言，與在pH 7. 4下抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性相比,在pH 5. 8-pH 6. O下抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性減弱。同時，本文的表述“降低酸性pH范圍內(nèi)抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性至小于在中性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性”亦可表述為“提高在中性pH范圍內(nèi)抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性至大于在酸性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性”。具體而言，在本發(fā)明中，可提高抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性在酸性和中性pH范圍之間的比率。例如，在下述實施方案中，KD (pH
5.8)/KD(pH 7.4)的值增加?？赏ㄟ^例如降低其在酸性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性、增加其在中性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性或兩者，來提高抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性在酸性和中性pH范圍之間的比率。在本文中，表述“與在中性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性相比，在酸性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性減弱”有時用“降低在酸性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性至小于在中性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性”代替。在本文中，在酸性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性意指在pH 4. 0_pH6. 5下的人FcRn結(jié)合活性，優(yōu)選在pH 5. 5-pH 6. 5下的人FcRn結(jié)合活性，特別優(yōu)選在pH 5. 8-pH 6. O下的人FcRn結(jié)合活性，pH 5.8-pH 6. O與體內(nèi)早期內(nèi)體pH相當(dāng)。同時，本文中，在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性意指在pH 6. 7-pH 10. O下的人FcRn結(jié)合活性，優(yōu)選在ρΗ7· Ο-pH 8. O下的人FcRn結(jié)合活性,特別優(yōu)選在pH 7. 4下的人FcRn結(jié)合活性,pH 7. 4與體內(nèi)血衆(zhòng)pH相當(dāng)。本發(fā)明的抗原結(jié)合分子具有人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域。人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域不受特別限制，只要抗原結(jié)合分子在酸性和中性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性?；蛘?，結(jié)構(gòu)域可具有直接或間接的人FcRn結(jié)合活性。這類結(jié)構(gòu)域包括例如IgG型免疫球蛋白、白蛋白、白蛋白結(jié)構(gòu)域3、抗人FcRn抗體、抗人FcRn肽和抗人FcRn支架分子的Fe結(jié)構(gòu)域,所有這些都具有與人FcRn直接結(jié)合的活性；以及與IgG或白蛋白結(jié)合的分子，其具有與人FcRn間接結(jié)合的活性。本發(fā)明的這類優(yōu)選結(jié) 構(gòu)域在酸性和中性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性。可在沒有任何改變的情況下使用該結(jié)構(gòu)域，只要它們在酸性和中性PH范圍內(nèi)已具有人FcRn結(jié)合活性。如果該結(jié)構(gòu)域在酸性和/或中性pH范圍內(nèi)只有弱的人FcRn結(jié)合活性或沒有人FcRn結(jié)合活性，則可通過改變抗原結(jié)合分子中的氨基酸使之具有人FcRn結(jié)合活性。然而，優(yōu)選通過改變?nèi)薋cRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸，使之在酸性和/或中性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性?；蛘?，可改變在酸性和/或中性pH范圍內(nèi)已具有人FcRn結(jié)合活性的結(jié)構(gòu)域中的氨基酸以提高人FcRn結(jié)合活性?？赏ㄟ^比較氨基酸改變前后的酸性和/或中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性，來選擇人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中所需的氨基酸改變。優(yōu)選的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域是與人FcRn直接結(jié)合的區(qū)域。這類優(yōu)選的人FcRn結(jié)合區(qū)包括例如抗體Fe結(jié)構(gòu)域。同時，能夠與多肽例如白蛋白或IgG(其具有人FcRn結(jié)合活性)結(jié)合的區(qū)域，可通過白蛋白、IgG等與人FcRn間接結(jié)合。因此，本發(fā)明的這類人FcRn結(jié)合區(qū)可以是與具有人FcRn結(jié)合活性的多肽結(jié)合的區(qū)域。本發(fā)明的抗原結(jié)合分子不受特別限制，只要它們包括具有對靶抗原有特異性的結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這類優(yōu)選的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含例如具有抗體的抗原結(jié)合區(qū)的結(jié)構(gòu)域。抗體的抗原結(jié)合區(qū)包含例如CDR和可變區(qū)。當(dāng)抗體的抗原結(jié)合區(qū)是CDR時，它可含有完整抗體的全部6個⑶R，或1、2或更多個⑶R。當(dāng)含有⑶R作為抗體的結(jié)合區(qū)時，它們可包含氨基酸缺失、取代、添加和/或插入，或者可以是CDR的部分。另一方面，用于本發(fā)明方法的抗原結(jié)合分子包含具有拮抗活性的抗原結(jié)合分子(拮抗性抗原結(jié)合分子)、具有激動活性的抗原結(jié)合分子(激動性抗原結(jié)合分子)和具有細(xì)胞毒性的分子。在優(yōu)選的實施方案中，抗原結(jié)合分子包含拮抗性抗原結(jié)合分子，特別是識別抗原(例如受體或細(xì)胞因子)的拮抗性抗原結(jié)合分子。在本發(fā)明中，目標(biāo)抗原結(jié)合分子不受特別限制，可以是任何抗原結(jié)合分子。本發(fā)明的抗原結(jié)合分子優(yōu)選包括抗原結(jié)合活性(抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域)和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域兩者。具體地講，優(yōu)選的本發(fā)明抗原結(jié)合分子包括與人FcRn結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域兩者的抗原結(jié)合分子包括例如抗體。在本發(fā)明的情況下優(yōu)選的抗體包括例如IgG抗體。當(dāng)要使用的抗體為IgG抗體時，IgG的類型不受限制；可以使用屬于任何同種型(亞類)的IgG例如IgGU IgG2、IgG3或IgG4。此外，本發(fā)明的抗原結(jié)合分子可包括抗體恒定區(qū)，并可將氨基酸突變引入恒定區(qū)。待引入的氨基酸突變包括例如強化或消弱與Fe Y受體結(jié)合的氨基酸突變(Proc Natl Acad Sci U S A. 2006年3月14日；103 (I I)4005-10)，但不限于這些實例?；蛘?，還可通過選擇合適的恒定區(qū)例如IgG2的恒定區(qū)，來改變PH依賴性結(jié)合。當(dāng)本發(fā)明的目標(biāo)抗原結(jié)合分子是抗體時，它可以是來源于任何動物的抗體，例如小鼠抗體、人抗體、大鼠抗體、兔抗體、山羊抗體或駱駝抗體。此外，抗體可為經(jīng)改變的抗體，例如嵌合抗體，并且特別是，在人源化抗體的序列中包括氨基酸取代的經(jīng)改變抗體等?？贵w還包括雙特異性抗體、與多種分子連接的抗體修飾產(chǎn)物和包括抗體片段的多肽?！扒逗峡贵w”是通過將來源于不同動物的序列組合起來而制備的抗體。具體而言，嵌合抗體包括例如具有來自小鼠抗體重鏈和輕鏈可變(V)區(qū)及來自人抗體的重鏈和輕鏈恒定(C)區(qū)的抗體?！叭嗽椿贵w”，亦稱為經(jīng)改造的人抗體，是其中將來源于非人哺乳動物(例如小鼠)的抗體的互補決定區(qū)(CDR)植入人抗體的CDR中的抗體。用于鑒定CDR的方法是已知的(Kabat 等，Sequence of Proteinsof Immunological Interest (1987), NationalInstitute of Health, Bethesda, Md. ;Chothia 等，Nature (1989) 342 :877)。適于該目的的通用遺傳重組技術(shù)也是已知的(參見歐洲專利申請EP 125023和WO 96/02576)。雙特異性抗體是指在同一抗體分子中具有識別不同表位的可變區(qū)的抗體。雙特異性抗體可以是識別兩個或更多個不同抗原的抗體，或識別相同抗原上的兩個或更多個不同表位的抗體?！?br> 此外，包括抗體片段的多肽包括例如Fab片段、F (ab ' ) 2片段、scFvs (NatBiotechnol. 2005 年 9 月；23(9) 1126-36),結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs) (W02004/05882U WO2003/002609)、scFv_Fc (W0 2005/037989)、dAb_Fc 和 Fe 融合蛋白。當(dāng)分子包括 Fe 結(jié)構(gòu)域時，F(xiàn)e結(jié)構(gòu)域可用作人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域。或者，可將FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域與這些分子融合。此外，適于本發(fā)明的抗原結(jié)合分子可為抗體樣分子。抗體樣分子(支架分子、肽分子)是可通過與祀分子結(jié)合而顯示出功能的分子(Current Opinion inBiotechnology(2006) 17 653-658 ；Current Opinionin Biotechnology(2007) 18 :1-10 ;Current Opinion in Structural Biology(1997) 7 463-469 ；Protein Science(2006) 15 14-27)，包括例如 DARPins (WO 2002/020565)、親和體(Affibody) (TO 1995/001937)、Avimer(W02004/044011 ；W0 2005/040229)和 Adnectin (W0 2002/032925)。如果這些抗體樣分子可以PH依賴性方式與靶分子結(jié)合和/或在中性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性，則可通過抗原結(jié)合分子促進(jìn)細(xì)胞對抗原攝入，通過給予抗原結(jié)合分子促進(jìn)血漿抗原濃度降低，并改進(jìn)抗原結(jié)合分子的藥代動力學(xué)，提高單個抗原結(jié)合分子可與之結(jié)合的抗原的數(shù)目。此外，抗原結(jié)合分子可以是由人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域和與靶標(biāo)結(jié)合的受體蛋白(包括配體)之間融合而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，包括例如TNFR-Fc融合蛋白、ILlR-Fc融合蛋白、VEGFR-Fc 融合蛋白和 CTLA4-Fc 融合蛋白(Nat Med. 2003 年 I 月；9(1) :47_52 ；BioDrugs.(2006)20(3) : 151-60)。如果這些受體-人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白以pH依賴性方式與靶分子(包括配體)結(jié)合和/或在中性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性，則可通過抗原結(jié)合分子促進(jìn)細(xì)胞對抗原攝入，通過給予抗原結(jié)合分子促進(jìn)血漿抗原濃度降低，并改進(jìn)抗原結(jié)合分子的藥代動力學(xué)，和增加單個抗原結(jié)合分子可與之結(jié)合的抗原的數(shù)目。受體蛋白經(jīng)適當(dāng)設(shè)計和修飾，使得包括與靶標(biāo)(包括配體)結(jié)合的受體蛋白的結(jié)構(gòu)域。如上文中提及的包括TNFR-Fc融合蛋白、ILlR-Fc融合蛋白、VEGFR-Fc融合蛋白和CTLA4_Fc融合蛋白的實例，本發(fā)明中優(yōu)選使用這樣的可溶性受體分子，其包含與所述靶標(biāo)(包括配體)結(jié)合所需要的所述受體蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域。這些經(jīng)設(shè)計和修飾的受體分子在本發(fā)明中稱為人工受體。設(shè)計和修飾受體分子以構(gòu)建人工受體分子所采用的方法是本領(lǐng)域已知的。此外，抗原結(jié)合分子可為融合蛋白，其中使與靶標(biāo)結(jié)合并具有中和作用的人工配體蛋白與人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合，且人工配體蛋白包括例如突變型IL-6(EMB0 J. 1994年12月15日；13(24) :5863-70)。如果這類人工配體融合蛋白可以pH依賴性方式與靶分子結(jié)合和/或在中性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性,則可通過抗原結(jié)合分子促進(jìn)細(xì)胞對抗原攝入，通過給予抗原結(jié)合分子促進(jìn)血漿抗原濃度降低，并改進(jìn)抗原結(jié)合分子的藥代動力學(xué)，和增加單個抗原結(jié)合分子可與之結(jié)合的抗原的數(shù)目。此外，本發(fā)明的抗體可包括修飾糖鏈。具有修飾糖鏈的抗體包括例如具有修飾的糖基化的抗體(W0 99/54342)、缺乏加至糖鏈的巖藻糖的抗體(W0 00/61739、WO02/31140、WO 2006/067847、W02006/067913)和具有帶二等分 GlcNAc 的糖鏈的抗體(W002/79255)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可適當(dāng)選擇除pH以外用于抗原結(jié)合或人FcRn結(jié)合活性的測定所使用的條件，所述條件不受特別限制。例如，按WO 2009/125825中所述采用MES緩沖 液在37°C下的條件，可用來測定活性。在另一個實施方案中，可采用實施例4或5中所述在25°C下的磷酸鈉緩沖液來測定活性。同時，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法，例如采用Biacore (GE Healthcare)等,來測定抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性和人FcRn結(jié)合活性。如果抗原是可溶性抗原，可通過將抗原作為分析物加至固定有抗原結(jié)合分子的芯片上，來測定抗原結(jié)合分子與可溶性抗原結(jié)合的活性。或者，如果抗原是膜型抗原，則可通過將抗原結(jié)合分子作為分析物加至抗原固定化芯片上，來測定抗原結(jié)合分子與膜型抗原結(jié)合的活性。可通過分別將人FcRn或抗原結(jié)合分子作為分析物加至固定有抗原結(jié)合分子或人FcRn的芯片上，來測定抗原結(jié)合分子的人FcRn結(jié)合活性。在本發(fā)明中，在酸性pH范圍內(nèi)抗原結(jié)合活性與在中性pH范圍內(nèi)抗原結(jié)合活性之間的比率不受特別限制，只要在酸性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性低于在中性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性。然而，KD(pH5.8)/KD(pH 7. 4)的值，其是抗原在pH 5. 8和pH 7. 4下的解離常數(shù)(KD)的比率，優(yōu)選為2或更大，更優(yōu)選10或更大，還更優(yōu)選40或更大。KD(pH 5.8)/KD (pH 7. 4)值的上限不受特別限制，可以是任何值，例如400、1，000或10，000，只要可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知技術(shù)生產(chǎn)。如果抗原是可溶性抗原，抗原結(jié)合活性的值可用解離常數(shù)(KD)表示。另一方面，如果抗原是膜型抗原，則活性可用表觀解離常數(shù)(表觀KD)表示?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法，采用例如Biacore (GEHealthcare)、Scatchard曲線、流式細(xì)胞儀等,測定解離常數(shù)(KD)和表觀解離常數(shù)(表觀KD)。 在本發(fā)明中，表示在酸性和中性pH范圍之間的抗原結(jié)合活性的比率的其它參數(shù)包括例如解離速率常數(shù)kd。如果使用解離速率常數(shù)(kd)而非解離常數(shù)(KD)作為代表結(jié)合活性比率的參數(shù)，則kd(在酸性pH范圍內(nèi))/kd(在中性pH范圍內(nèi))的值(其是抗原在酸性pH范圍內(nèi)和中性pH范圍的kd(解離速率常數(shù))的比率)，優(yōu)選為2或更大、更優(yōu)選5或更大、甚至更優(yōu)選10或更大、還更優(yōu)選30或更大。kd(在酸性pH范圍內(nèi))/kd(在中性pH范圍內(nèi))值的上限不受特別限制，可以是任何值，例如50、100或200，只要可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知技術(shù)生產(chǎn)。如果抗原是可溶性抗原，則抗原結(jié)合活性的值可使用解離速率常數(shù)(kd)表示?；蛘撸绻乖悄ば涂乖?，則C值可用表觀kd(表觀解離速率常數(shù))表示?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法，例如采用Biacore (GE Healthcare)、流式細(xì)胞儀等,來測定解離速率常數(shù)(kd)和表觀解離速率常數(shù)(表觀kd)。在本發(fā)明中，當(dāng)在不同pH下測定抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性時，優(yōu)選pH以外的測量條件是不變的。用于降低(減弱)抗原結(jié)合分子在酸性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性至小于在中性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性的方法(用于賦予pH依賴性結(jié)合能力的方法)不受特別限制，可通過任何方法實現(xiàn)。具體而言，如WO 2009/125825中所述,該方法包括例如通過用組氨酸取代抗原結(jié)合分子中的氨基酸或?qū)⒔M氨酸插入抗原結(jié)合分子中，以降低(減弱)在酸性PH范圍內(nèi)抗原結(jié)合活性至小于在中性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性的方法。已知可通過用組氨酸取代抗體中的氨基酸賦予抗體PH依賴性抗原結(jié)合活性(FEBS Letter (1992) 309 (I)85-88)。這類組氨酸突變(取代)或插入位點不受特別限制；可用組氨酸取代任何位點上的氨基酸或插入任何位點。組氨酸突變(取代)或插入的優(yōu)選位點包括例如其中突變或插入對抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性有影響的區(qū)域。這類區(qū)域包括這樣的位點，其中與突變或插入之前相比，突變或插入降低(減弱)在酸性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性至小于在中性·pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性(KD (在酸性pH范圍內(nèi))/KD (在中性pH范圍內(nèi))值增加)。如果抗原結(jié)合分子是抗體，則這類區(qū)域包括例如抗體可變區(qū)和⑶R。待引入(實現(xiàn))的組氨酸突變或插入的數(shù)目可由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)?shù)卮_定。組氨酸取代可在唯一的單一位點或者在兩個或更多個位點引入。或者，組氨酸可在唯一的單一位點或者在兩個或更多個位點插入。此外，除組氨酸突變以外，可引入組氨酸突變以外的突變(具有非組氨酸的氨基酸的突變(缺失、添加、插入和/或取代))。或者，組氨酸突變可與組氨酸插入聯(lián)合?？赏ㄟ^隨機方法實現(xiàn)這類組氨酸取代或插入，例如組氨酸掃描，其通過使用組氨酸而非本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的丙氨酸掃描中的丙氨酸來進(jìn)行。然后，可從用隨機組氨酸突變或插入而引入的抗原結(jié)合分子文庫中，選擇具有比引入突變之前大的KD (在酸性pH范圍內(nèi))/KD (在中性pH范圍內(nèi))值的抗原結(jié)合分子。如果用組氨酸取代抗原結(jié)合分子中的氨基酸或?qū)⒔M氨酸插入抗原結(jié)合分子中，則在組氨酸取代或插入后在中性PH范圍內(nèi)抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性優(yōu)選等于在組氨酸取代或插入前在中性PH范圍內(nèi)抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性，但對此沒有特別限制。在本文中，“在組氨酸取代或插入后在中性pH范圍內(nèi)抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性等于在組氨酸取代或插入前在中性pH范圍內(nèi)抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性”意指在組氨酸取代或插入后抗原結(jié)合分子保持在組氨酸取代或插入前抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性的10%或更大、優(yōu)選50%或更大、更優(yōu)選80%或更大、還更優(yōu)選90%或更大。如果抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性由于組氨酸取代或插入而降低，則可通過使抗原結(jié)合分子的一個或更多個氨基酸被取代、缺失、將一個或更多個氨基酸添加和/或插入至抗原結(jié)合分子來調(diào)整抗原結(jié)合活性，使得抗原結(jié)合活性變得等于在組氨酸取代或插入前的抗原結(jié)合活性。本發(fā)明還包含這類抗原結(jié)合分子，其結(jié)合活性因在組氨酸取代或插入后使抗原結(jié)合分子的一個或更多個氨基酸被取代、缺失、將一個或更多個氨基酸添加和/或插入至抗原結(jié)合分子而使之相等。用于降低(減弱)抗原結(jié)合分子在酸性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性至小于在中性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性的其它方法包括用非天然氨基酸取代抗原結(jié)合分子中的氨基酸或?qū)⒎翘烊话被岵迦肟乖Y(jié)合分子的方法。已知可通過使用非天然氨基酸，來人工調(diào)節(jié)pKa(Angew. Chem. Int. Ed. 2005,44,34 ；Chem Soc Rev. 2004 年 9 月 10 日，33 (7) 422-30 ；Amino Acids. (1999) 16(3-4) :345_79)。因此，在本發(fā)明中，可使用非天然氨基酸代替上述的組氨酸。引入非天然氨基酸的位點不受特別限制，可在任何位點進(jìn)行非天然氨基酸的取代或插入。非天然氨基酸取代或插入的優(yōu)選位點包括例如其中取代或插入對抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性產(chǎn)生影響的區(qū)域。例如，如果抗原結(jié)合分子是抗體，則這類區(qū)域包括抗體可變區(qū)和互補決定區(qū)(CDR)。同時，待引入的非天然氨基酸的數(shù)目不受特別限制；可在唯一的單一位點或者兩個或更多個位點上用非天然氨基酸取代?；蛘撸蓪⒎翘烊话被岵迦胛ㄒ坏膯我晃稽c或者兩個或更多個位點。此外，除了非天然氨基酸的取代或插入以外，可缺失、添加、插入和/或取代其它氨基酸。此外，可與上述組氨酸取代和/或插入組合進(jìn)行非天然氨基酸的取代和/或插入。在本發(fā)明中可使用任何非天然的氨基酸?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的非天然氨基酸。在本發(fā)明中，如果抗原結(jié)合分子是抗體，則組氨酸或非天然氨基酸取代的可能位點包括例如⑶R序列和負(fù)責(zé)抗體的⑶R結(jié)構(gòu)的序列，包括例如WO 2009/125825中所述位點。按照 Kabat 編號標(biāo)注氨基酸位置(Kabat EA 等(1991) Sequences of Proteins ofImmunologicalInterest, NIH)。 當(dāng)提及可變結(jié)構(gòu)域的殘基時(大致輕鏈的殘基1-107和重鏈的殘基1-113)，一般使用 Kabat 編號系統(tǒng)(例如 Kabat 等，Sequences of Immunological Interest.第 5版.Public Health Service,National Institutesof Health,Bethesda,Md. (1991))。當(dāng)提及免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的殘基時，一般使用“EU編號系統(tǒng)”或“EU指數(shù)”(例如Kabat等人報道的EU指數(shù)，同上)?！鞍凑誎abat的EU指數(shù)”是指人IgGl EU抗體的殘基編號。除非本文中另有說明，否則提及抗體可變結(jié)構(gòu)域的殘基編號意指通過Kabat編號系統(tǒng)的殘基編號。除非本文中另有說明，否則提及抗體恒定結(jié)構(gòu)域的殘基編號意指通過EU編號系統(tǒng)的殘基編號(參見例如WO 2006073941)。重鏈H27、H31、H32、H33、H35、H50、H58、H59、H61、H62、H63、H64、H65、H99、HlOOb和 H102輕鏈L24、L27、L28、L32、L53、L54、L56、L90、L92和 L94這些改變位點中，H32、H61、L53、L90和L94被假定為是最通用的改變位點。如果抗原是IL-6受體(例如人IL-6受體),優(yōu)選的改變位點包括下列位點。然而，改變位點在此不受特別限制。重鏈:H27、H31、H32、H35、H50、H58、H61、H62、H63、H64、H65、HlOOb和 H102輕鏈L24、L27、L28、L32、L53、L56、L90、L92和 L94具體而言，組氨酸或非天然氨基酸取代位點的優(yōu)選組合包括例如H27、H31和H35的組合；H27、H31、H32、H35、H58、H62 和 H102 的組合；L32 和 L53 的組合；及 L28、L32 和 L53的組合。此外，重鏈和輕鏈中取代位點的優(yōu)選組合包括例如H27、H3UL32和L53的組合。這些位點中，組氨酸或非天然氨基酸在唯一的單一位點或更多個位點被取代。同時，當(dāng)抗原結(jié)合分子是具有抗體恒定區(qū)的物質(zhì)時，用于降低(減弱)抗原結(jié)合分子在酸性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性至小于在中性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性的方法包括例如用于改變抗體恒定區(qū)中的氨基酸的方法。具體而言，這類方法包括例如用于取代WO2009/125825中所述恒定區(qū)(SEQ ID NO :11、12、13和14)的方法。同時，用于改變抗體恒定區(qū)的方法包括例如用于評價各種恒定區(qū)同種型(IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)和選擇降低在酸性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性(提高在酸性pH范圍內(nèi)的解離速率)的同種型的方法。這類方法還包括用于降低在酸性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性(提高在酸性pH范圍內(nèi)的解離速率)的方法，這通過將氨基酸取代引入野生型同種型的氨基酸序列(野生型IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的氨基酸序列)來進(jìn)行?？贵w恒定區(qū)中的鉸鏈區(qū)序列在同種型(IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)之間頗為不同，并且鉸鏈區(qū)氨基酸序列的差異對抗原結(jié)合活性有極大影響。因此，可根據(jù)抗原或表位的類型，選擇合適的同種型以降低在酸性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性(提高在酸性PH范圍內(nèi)的解離速率)。此外，由于鉸鏈區(qū)氨基酸序列的差異對抗原結(jié)合活性有極大影響，因此認(rèn)為野生型同種型氨基酸序列中優(yōu)選的氨基酸取代位點在鉸鏈區(qū)內(nèi)。當(dāng)通過上述方法等降低(減弱)抗原結(jié)合分子在酸性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性至小于在中性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性(當(dāng)KD (在酸性pH范圍內(nèi))/KD (在中性pH范圍內(nèi))的值增加時)時，通常優(yōu)選與原始抗體相比，KD (在酸性pH范圍內(nèi))/KD (在中性pH范圍內(nèi))值為兩倍或更多倍、優(yōu)選為5倍或更多倍、更優(yōu)選10倍或更多倍，但在此不受特別限制?？刹捎蒙鲜龇椒?，產(chǎn)生這樣的抗原結(jié)合分子，其在酸性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性通過不具有這類性質(zhì)的抗原結(jié)合分子的氨基酸取代或插入，被降低(減弱)至小于在中性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性(以pH依賴性方式結(jié)合的抗原結(jié)合分子)。其它方法包括用于直接獲得具有上述性質(zhì)的抗原結(jié)合分子的方法。例如，可采用PH依賴性抗原結(jié)合作為通過用抗原免疫動物(小鼠、大鼠、倉鼠、兔、人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠、人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因大鼠、人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因兔、美洲駝(llamas)、駱駝等)所獲得的抗體的指示物，通過篩選來選出具有所需目標(biāo)性質(zhì)的抗體?？贵w可通過雜交瘤技術(shù)或B細(xì)胞克隆技術(shù)產(chǎn)生(ProcNatl Acad Sci USA. 1996 年 7 月 23 日；93(15) :7843_8 ；J ImmunolMethods. 2006 年 10月 20 日；316(1-2) 133-43 ；Journal of the Associationfor Laboratory Automation ；WO 2004/106377、WO 2008/045140和W02009/113742)，其是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，但不限于這些?；蛘撸墒褂肞H依賴性抗原結(jié)合作為體外提供抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的文庫的指示物，通過篩選直接選出具有目標(biāo)性質(zhì)的抗體。這類文庫包括人幼稚文庫、非人動物和人的免疫文庫、半合成文庫和合成文庫，這些是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的文庫(MethodsMol Biol. 2002 ；178 87-100 ；J Immunol Methods. 2004 年 6 月；289(1_2) :65_80 ；以及ExpertOpin Biol Ther. 2007年5月；7(5) :763_79)，但不限于這些。然而，方法并非特別限于這些實例。本發(fā)明利用pH差異作為在血漿和內(nèi)體間的環(huán)境差異，以實現(xiàn)在血漿和內(nèi)體中抗原結(jié)合分子對抗原的差異結(jié)合親和力(在血漿中強結(jié)合而在內(nèi)體中弱結(jié)合)。因為血漿和內(nèi)體間的環(huán)境差異不限于PH的差異，因此可利用其濃度在血漿和內(nèi)體內(nèi)不同的其它因素，替代對抗原結(jié)合分子與抗原結(jié)合的PH依賴性結(jié)合性質(zhì)。這類因素也可用于產(chǎn)生在血漿與抗原結(jié)合但在內(nèi)體解離出抗原的抗體。因此，本發(fā)明還包括包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，其在酸性和中性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性，且在內(nèi)體中的抗原結(jié)合活性比在血漿中的低，其中在血漿中人FcRn結(jié)合活性強于完整人IgG的FcRn結(jié)合活性。用于提高在中性pH范圍內(nèi)本發(fā)明的抗原結(jié)合分子的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的人FcRn結(jié)合活性的方法不受特別限制，可通過任何方法提高。具體而言，當(dāng)IgG型免疫球蛋白的Fe結(jié)構(gòu)域用作人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域時，可通過改變其氨基酸來提高在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性。這類待改變的優(yōu)選IgG型免疫球蛋白的Fe結(jié)構(gòu)域包括例如親本人IgG(IgGl、IgG2、IgG3或IgG4及其經(jīng)工程改造的變體)的Fe結(jié)構(gòu)域?？蓪⑷魏挝稽c的氨基酸變成其它氨基酸，只要賦予或提高在中性PH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性。當(dāng)抗原結(jié)合分子具有人IgGl Fe結(jié)構(gòu)域作為人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域時,優(yōu)選與親本人IgGl的相比,所述分子具有加強在中性pH范圍內(nèi)與人FcRn結(jié)合的改變?？蓪崿F(xiàn)這類改變的氨基酸包括例如以下位置的氨基酸221-225、227、228、230、232、233-241、243-252、254-260、262-272、274、276、278-289、291-312、315-320、324、325、327-339、341、343、345、360、362、370、375-378、380、382、385-387、389、396、414、416、423、424、426-438、440 和 442 (EU 編號)。更具體地講，這類氨基酸改變包括例如列于表I的那些?？赏ㄟ^使用上述改變，提高在中性PH范圍內(nèi)IgG型免疫球蛋白的Fe結(jié)構(gòu)域的人FcRn結(jié)合。此外，與親本人IgG相比，可加強在酸性pH范圍內(nèi)與人FcRn結(jié)合的改變?nèi)绫?中的實例所示。當(dāng)從上述改變中選出還可加強在中性PH范圍內(nèi)與人FcRn結(jié)合的適當(dāng)改變時， 它們可適用于本發(fā)明。同時，可加強在酸性條件下Fv4-IgGl與人FcRn結(jié)合的改變的組合見表6-1和表6-2。親本人IgG Fe結(jié)構(gòu)域中待改變的特別優(yōu)選的氨基酸包括例如以下位置的氨基酸237、238、239、248、250、252、254、255、256、257、258、265、270、286、289、297、298、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、325、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434和436 (EU編號)?？赏ㄟ^用不同氨基酸取代選自上述氨基酸的至少一個氨基酸，來提高中性pH范圍內(nèi)抗原結(jié)合分子的人FcRn結(jié)合活性。特別優(yōu)選的改變包括例如親本IgG Fe結(jié)構(gòu)域中237位上的Gly被取代為Met的氨基酸取代；238位上的Pro被取代為Ala的氨基酸取代；239位上的Ser被取代為Lys的氨基酸取代；248位上的Lys被取代為Ile的氨基酸取代；250 位上的 Thr 被取代為 Ala、Phe> lie、Met、Gin、Ser> Val、Trp 或 Tyr 的氨基酸取代；252位上的Met被取代為Phe、Trp或Tyr的氨基酸取代；254位上的Ser被取代為Thr的氨基酸取代；255位上的Arg被取代為Glu的氨基酸取代；256位上的Thr被取代為Asp、Glu或Gln的氨基酸取代；257 位上的 Pro 被取代為 Ala、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Ser> Thr 或 Val 的氨基酸取代；258位上的Glu被取代為His的氨基酸取代；265位上的Asp被取代為Ala的氨基酸取代；270上的Asp被取代為Phe的氨基酸取代；286位上的Asn被取代為Ala或Glu的氨基酸取代；289位上的Thr被取代為His的氨基酸取代；297位上的Asn被取代為Ala的氨基酸取代；298上的Ser被取代為Gly的氨基酸取代；
303位上的Val被取代為Ala的氨基酸取代；305位上的Val被取代為Ala的氨基酸取代；307 位上的 Thr 被取代為 Ala、Asp、Phe> Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Val、Trp 或 Tyr 的氨基酸取代；
308 位上的 Val 被取代為 Ala、Phe、lie、Leu、Met、Pro、Gln 或 Thr 的氨基酸取代；309位上的Leu或Val被取代為Ala、Asp、Glu、Pro或Arg的氨基酸取代；311位上的Gln被取代為Ala、His或Ile的氨基酸取代；312位上的Asp被取代為Ala或His的氨基酸取代；314位上的Leu被取代為Lys或Arg的氨基酸取代；315位上的Asn被取代為Ala或His的氨基酸取代；317位上的Lys被取代為Ala的氨基酸取代；325位上的Asn被取代為Gly的氨基酸取代；332位上的Ile被取代為Val的氨基酸取代；334位上的Lys被取代為Leu的氨基酸取代；360位上的Lys被取代為His的氨基酸取代；376位上的Asp被取代為Ala的氨基酸取代；380位上的Glu被取代為Ala的氨基酸取代；382位上的Glu被取代為Ala的氨基酸取代；384位上的Asn或Ser被取代為Ala的氨基酸取代；385位上的Gly被取代為Asp或His的氨基酸取代；386位上的Gln被取代為Pro的氨基酸取代；387位上的Pro被取代為Glu的氨基酸取代；389位的Asn被取代為Ala或Ser的氨基酸取代；424位上的Ser被取代為Ala的氨基酸取代；428 位上的 Met 被取代為 Ala、Asp、Phe> Gly、His、lie、Lys> Leu、Asn、Pro、Gin、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr的氨基酸取代；433位上的His被取代為Lys的氨基酸取代；434位上的Asn被取代為Ala、Phe、His、Ser, Trp或Tyr的氨基酸取代；和436位上的Tyr或Phe被取代為His的氨基酸取代(EU編號)。同時，待改變的氨基酸的數(shù)目不受特別限制；可在唯一的單一位點上或者在兩個或更多個位點上改變氨基酸。兩個或更多個氨基酸改變的組合包括例如表3所列的那些。同時，與親本人IgG相比，可加強在酸性pH范圍內(nèi)與人FcRn結(jié)合的改變的組合見表4-1至4_5。當(dāng)也可加強在中性PH范圍內(nèi)與人FcRn結(jié)合的改變的合適組合選自上述改變時，它們可適用于本發(fā)明。此外，可加強在中性條件下Fv4-IgGl與人FcRn結(jié)合的改變的組合見表6_1和6_2。表中的符號表不在按EU編號所不的編號之后插入氨基酸。例如，'281S意指將S插入按EU編號的281位與282位之間。[表 I]位置I氨基酸改變
256P
280K
339T
385H
428L
434W，Y，F(xiàn)，A，H[表 2]·
權(quán)利要求
1.包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，其在中性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性，其中在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性強于KD 3. 2微摩爾。
2.包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，其在中性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性，其中在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性是完整人IgG的人FcRn結(jié)合活性的28倍。
3.包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，其在中性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性，其中在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性強于KD 2. 3微摩爾。
4.包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，其在中性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性，其中在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性是完整人IgG的人FcRn結(jié)合活性的38倍。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的抗原結(jié)合分子，其中所述中性pH范圍為pH7. 0-8. O。
6.包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，其中將抗原結(jié)合分子給予非人動物后的血漿總抗原濃度低于將參比抗原結(jié)合分子給予非人動物后的血漿總抗原濃度，所述參比抗原結(jié)合分子包含相同的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和完整人IgG Fe結(jié)構(gòu)域作為人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
7.抗原結(jié)合分子，其中將所述抗原結(jié)合分子給予非人動物后的血漿抗原濃度低于自未被給予抗原結(jié)合分子的非人動物所得到的血漿總抗原濃度。
8.包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，其中如下計算的所述抗原結(jié)合分子的抗原/抗原結(jié)合分子摩爾比率(C)C=A/B， 低于如下計算的包含相同抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和完整人IgG Fe結(jié)構(gòu)域作為人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的參比抗原結(jié)合分子的抗原/抗原結(jié)合分子摩爾比率(C’)；C，=A' /B，， 其中； A為將抗原結(jié)合分子給予非人動物后血漿中的總抗原濃度， B為將抗原結(jié)合分子給予非人動物后抗原結(jié)合分子的血漿濃度， A’為將參比抗原結(jié)合分子給予非人動物后血漿中的總抗原濃度， B’為將參比抗原結(jié)合分子給予非人動物后抗原結(jié)合分子的血漿濃度。
9.權(quán)利要求6-8中任一項的抗原結(jié)合分子，其中所述非人動物是人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠。
10.權(quán)利要求6-9中任一項的抗原結(jié)合分子，其中所述血漿抗原濃度是長期血漿總抗原濃度。
11.權(quán)利要求6-9中任一項的抗原結(jié)合分子，其中所述血漿抗原濃度是短期血漿總抗原濃度。
12.包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，其在酸性和中性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性，且具有在酸性pH范圍內(nèi)比在中性pH范圍內(nèi)低的抗原結(jié)合活性，其中在中性PH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性強于完整人IgG的人FcRn結(jié)合活性。
13.權(quán)利要求1-11中任一項的抗原結(jié)合分子，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域在酸性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性低于在中性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性。
14.權(quán)利要求12或13的抗原結(jié)合分子，其中在酸性pH范圍內(nèi)與在中性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性的比率以KD (在酸性pH范圍內(nèi))/KD (在中性pH范圍內(nèi))值計至少為2。
15.權(quán)利要求12-14中任一項的抗原結(jié)合分子，其包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸突變，所述突變包含用組氨酸取代抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的至少一個氨基酸或插入至少一個組氨酸。
16.權(quán)利要求12-14中任一項的抗原結(jié)合分子，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域獲自抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域文庫。
17.權(quán)利要求1-16中任一項的抗原結(jié)合分子，其包含因用不同氨基酸取代親本IgG的Fe結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸而產(chǎn)生的Fe結(jié)構(gòu)域作為人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
18.權(quán)利要求1-17中任一項的抗原結(jié)合分子，其中所述人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域是這樣的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含用不同氨基酸取代選自親本IgG的Fe結(jié)構(gòu)域中的以下位置氨基酸中的至少一個氨基酸的氨基酸序列237、238、239、248、250、252、254、255、256、257、258、265、270、286、289、297、298、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、325、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434 和 436 (EU 編號)。
19.權(quán)利要求1-18中任一項的抗原結(jié)合分子，其包含在親本IgG的Fe結(jié)構(gòu)域中包含氨基酸取代的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含選自以下按EU編號的至少一個氨基酸取代 · 237位上的Gly被取代為Met的氨基酸取代； · 238位上的Pro被取代為Ala的氨基酸取代； · 239位上的Ser被取代為Lys的氨基酸取代； · 248位上的Lys被取代為Ile的氨基酸取代； · 250位上的Thr被取代為Ala、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp或Tyr的氨基酸取代； · 252位上的Met被取代為Phe、Trp或Tyr的氨基酸取代； · 254位上的Ser被取代為Thr的氨基酸取代； · 255位上的Arg被取代為Glu的氨基酸取代； · 256位上的Thr被取代為Asp、Glu或Gln的氨基酸取代； · 257位上的Pro被取代為Ala、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Ser、Thr或Val的氨基酸取代； · 258位上的Glu被取代為His的氨基酸取代； ·265位上的Asp被取代為Ala的氨基酸取代； · 270上的Asp被取代為Phe的氨基酸取代； ·286位上的Asn被取代為Ala或Glu的氨基酸取代； ·289位上的Thr被取代為His的氨基酸取代； ·297位上的Asn被取代為Ala的氨基酸取代； · 298上的Ser被取代為Gly的氨基酸取代； ·303位上的Val被取代為Ala的氨基酸取代； · 305位上的Val被取代為Ala的氨基酸取代； · 307 位上的 Thr 被取代為 Ala、Asp、Phe> Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、A·rg、Ser、Val、Trp或Tyr的氨基酸取代； · 308位上的Val被取代為Ala、Phe> lie、Leu、Met、Pro、Gln或Thr的氨基酸取代； ·309位上的Leu或Val被取代為Ala、Asp、Glu、Pro或Arg的氨基酸取代； · 311位上的Gln被取代為Ala、His或Ile的氨基酸取代； · 312位上的Asp被取代為Ala或His的氨基酸取代；.314位上的Leu被取代為Lys或Arg的氨基酸取代； .315位上的Asn被取代為Ala或His的氨基酸取代； .317位上的Lys被取代為Ala的氨基酸取代； .325位上的Asn被取代為Gly的氨基酸取代； .332位上的Ile被取代為Val的氨基酸取代； .334位上的Lys被取代為Leu的氨基酸取代； .360位上的Lys被取代為His的氨基酸取代； .376位上的Asp被取代為Ala的氨基酸取代； .380位上的Glu被取代為Ala的氨基酸取代； .382位上的Glu被取代為Ala的氨基酸取代； .384位上的Asn或Ser被取代為Ala的氨基酸取代； .385位上的Gly被取代為Asp或His的氨基酸取代； .386位上的Gln被取代為Pro的氨基酸取代； .387位上的Ρι·ο被取代為Glu的氨基酸取代； .389位的Asn被取代為Ala或Ser的氨基酸取代； .424位上的Ser被取代為Ala的氨基酸取代； .428 位上的 Met 被取代為 Ala、Asp、Phe> Gly、His、lie、Lys> Leu、Asn、Pro、Gin、Ser>Thr、Val、Trp或Tyr的氨基酸取代； .433位上的His被取代為Lys的氨基酸取代； .434位上的Asn被取代為Ala、Phe> His、Ser、Trp或Tyr的氨基酸取代； 和436位上的Tyr或Phe被取代為His的氨基酸取代。
20.權(quán)利要求1-18中任一項的抗原結(jié)合分子,其人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含選自親本IgG的Fe結(jié)構(gòu)域中的以下至少一個氨基酸 氨基酸位置237上的Met ； 氨基酸位置238上的Ala ； 氨基酸位置239上的Lys ； 氨基酸位置248上的Ile ; 氨基酸位置 250 上的 Ala、Phe> lie、Met、Gin、Ser、Val> Trp 或 Tyr ； 氨基酸位置252上的Phe、Trp或Tyr ； 氨基酸位置254上的Thr ； 氨基酸位置255上的Glu ； 氨基酸位置256上的Asp、Glu或Gln ； 氨基酸位置 257 上的 Ala、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Ser> Thr 或 Val ； 氨基酸位置258上的His ; 氨基酸位置265上的Ala; 氨基酸位置270上的Phe ； 氨基酸位置286上的Ala或Glu ； 氨基酸位置289上的His ; 氨基酸位置297上的Ala;氨基酸位置298上的Gly ； 氨基酸位置303上的Ala; 氨基酸位置305上的Ala; 氨基酸位置 307 上的 Ala、Asp、Phe> Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Val、Trp 或 Tyr ； 氨基酸位置 308 上的 Ala、Phe> lie、Leu、Met、Pro、Gln 或 Thr ； 氨基酸位置309上的Ala、Asp、Glu、Pro或Arg ； 氨基酸位置311上的Ala、His或lie ； 氨基酸位置312上的Ala或His ； 氨基酸位置314上的Lys或Arg ； 氨基酸位置315上的Ala或His ； 氨基酸位置317上的Ala ； 氨基酸位置325上的Gly ； 氨基酸位置332上的Val ； 氨基酸位置334上的Leu ； 氨基酸位置360上的His ； 氨基酸位置376上的Ala ； 氨基酸位置380上的Ala ； 氨基酸位置382上的Ala ； 氨基酸位置384上的Ala ； 氨基酸位置385上的Asp或His ; 氨基酸位置386上的Pro ； 氨基酸位置387上的Glu ； 氨基酸位置389上的Ala或Ser ； 氨基酸位置424上的Ala; 氨基酸位置 428 上的 Ala、Asp、Phe> Gly、His、lie、Lys> Leu、Asn、Pro、Gin、Ser> Thr>Val、Trp 或 Tyr ； 氨基酸位置433位置上的Lys ； 氨基酸位置 434 上的 Ala、Phe> His、Ser、Trp 或 Tyr ； 和氨基酸位置436上的His (EU編號)。
21.權(quán)利要求18-20中任一項的抗原結(jié)合分子，其中親本IgG選自獲自非人動物的IgG0
22.權(quán)利要求18-20中任一項的抗原結(jié)合分子，其中親本IgG是人IgG。
23.權(quán)利要求1-22中任一項的抗原結(jié)合分子，其具有拮抗活性。
24.權(quán)利要求1-23中任一項的抗原結(jié)合分子，其與膜抗原或可溶性抗原結(jié)合。
25.權(quán)利要求1-24中任一項的抗原結(jié)合分子，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含與受體結(jié)合的人工配體。
26.權(quán)利要求1-24中任一項的抗原結(jié)合分子，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含與配體結(jié)合的人工受體。
27.權(quán)利要求1-24中任一項的抗原結(jié)合分子，其是抗體。
28.權(quán)利要求27的抗原結(jié)合分子，其中所述抗體選自嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
29.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-28中任一項的抗原結(jié)合分子。
30.用于通過提高其在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性而促進(jìn)抗原結(jié)合分子介導(dǎo)的細(xì)胞對抗原攝入的方法，其中所述抗原結(jié)合分子包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并在酸性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性。
31.用于通過提高其在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性且降低其在酸性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性至小于在中性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性而促進(jìn)抗原結(jié)合分子介導(dǎo)的細(xì)胞對抗原攝入的方法，其中所述抗原結(jié)合分子包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并在酸性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性。
32.用于通過提高其在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性而增加單個抗原結(jié)合分子可與之結(jié)合的抗原的數(shù)目的方法，其中所述抗原結(jié)合分子包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并在酸性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性。
33.用于通過提高其在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性且降低其在酸性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性至小于在中性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性而增加單個抗原結(jié)合分子可與之結(jié)合的抗原的數(shù)目的方法，其中所述抗原結(jié)合分子包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并在酸性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性。
34.用于通過提高其在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性而提高抗原結(jié)合分子從血漿中消除抗原的能力的方法，其中所述抗原結(jié)合分子包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并在酸性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性。
35.用于通過提高其在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性并降低其在酸性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性至小于在中性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性而提高抗原結(jié)合分子從血漿中消除抗原的能力的方法，其中所述抗原結(jié)合分子包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并在酸性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性。
36.用于通過提高其在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性而改進(jìn)抗原結(jié)合分子的藥代動力學(xué)的方法，其中所述抗原結(jié)合分子包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并在酸性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性。
37.用于通過提高其在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性并降低其在酸性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性至小于在中性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性而改進(jìn)抗原結(jié)合分子的藥代動力學(xué)的方法，其中所述抗原結(jié)合分子包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并在酸性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性。
38.用于促進(jìn)抗原結(jié)合分子與在細(xì)胞外與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原胞內(nèi)解離的方法，這通過提高其在中性PH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性并降低其在酸性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性至小于在中性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性來進(jìn)行，其中所述抗原結(jié)合分子包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并在酸性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性。
39.用于促進(jìn)以抗原結(jié)合的形式攝入細(xì)胞的抗原結(jié)合分子以無抗原形式胞外釋放的方法，這通過提高其在中性PH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性且降低其在酸性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性至小于在中性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性來進(jìn)行，其中所述抗原結(jié)合分子包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并在酸性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性。
40.用于通過提高其在中性pH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性而降低血漿中總血漿抗原濃度或游離血漿抗原濃度的方法，其中所述抗原結(jié)合分子包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并在酸性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性。
41.用于降低血漿中總血漿抗原濃度或游離血漿抗原濃度的方法，這通過提高其在中性PH范圍內(nèi)的人FcRn結(jié)合活性且降低其在酸性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性至小于在中性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性來進(jìn)行，其中所述抗原結(jié)合分子包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并在酸性PH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性。
42.權(quán)利要求30-41中任一項的方法，其中所述酸性pH范圍為pH5. 5-6. 5，所述中性pH 范圍為 pH 7. 0-8. O。
43.權(quán)利要求30-41中任一項的方法，其中所述在中性pH范圍內(nèi)人FcRn結(jié)合活性的提高是通過用不同氨基酸取代人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親本IgG Fe結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸而引起的增加。
44.權(quán)利要求30-41中任一項的方法，其中所述在中性pH范圍內(nèi)人FcRn結(jié)合活性的提高是通過用不同氨基酸取代選自人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親本IgG Fe結(jié)構(gòu)域中的以下位置氨基酸中的至少一個氨基酸而引起的增加237、238、239、248、250、252、254、255、256、257、258、265、270、286、289、297、298、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、325、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434 和 436 (EU 編號)。
45.權(quán)利要求31、33、35、37-39和41中任一項的方法，其中通過用組氨酸取代抗原結(jié)合分子的至少一個氨基酸或插入至少一個組氨酸降低在酸性pH范圍內(nèi)抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性至低于在中性PH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性。
46.權(quán)利要求31、33、35、37-39和41中任一項的方法，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域獲自抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域文庫。
47.權(quán)利要求31、33、35、37-39和41中任一項的方法，其中所述抗原結(jié)合活性的降低用KD (在酸性pH范圍內(nèi))/KD (在中性pH范圍內(nèi))值的增加來表示，所述值是相對于組氨酸取代或插入之前酸性PH范圍和中性pH范圍內(nèi)的抗原結(jié)合活性的比率。
48.用于產(chǎn)生抗原結(jié)合分子的方法，所述方法包括以下步驟 (a)選擇通過改變抗原結(jié)合分子的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸獲得的具有在中性PH范圍內(nèi)強于3. 2微摩爾的人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子； (b)得到編碼抗原結(jié)合分子的基因，其中在(a)中制備的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域與抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接；和 (C)使用(b)中制備的基因產(chǎn)生抗原結(jié)合分子。
49.用于產(chǎn)生抗原結(jié)合分子的方法，所述方法包括以下步驟 (a)選擇與在改變在酸性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸之前相比，在中性pH范圍內(nèi)具有較強的人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子； (b)改變抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸，并選擇與在酸性pH范圍內(nèi)相比在中性PH范圍內(nèi)具有較強抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子； (c)獲得編碼抗原結(jié)合分子的基因，其中在(a)和(b)中制備的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域與抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接；和(d)使用在(C)中制備的基因產(chǎn)生抗原結(jié)合分子。
50.用于產(chǎn)生抗原結(jié)合分子的方法，所述方法包括以下步驟 (a)選擇與在改變在酸性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸之前相比，在中性pH范圍內(nèi)具有較強的人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子； (b)選擇與在酸性pH范圍內(nèi)相比在中性pH范圍內(nèi)具有較強抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子; (c)獲得編碼抗原結(jié)合分子的基因，其中在(a)和(b)中制備的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域與抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接；和 (d)使用在(C)中制備的基因產(chǎn)生抗原結(jié)合分子。
51.通過權(quán)利要求48-50中任一項的生產(chǎn)方法產(chǎn)生的抗原結(jié)合分子。
52.用于篩選抗原結(jié)合分子的方法，所述方法包括以下步驟 (a)選擇通過改變抗原結(jié)合分子的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸獲得的具有在中性PH范圍內(nèi)強于3. 2微摩爾的人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子； (b)得到編碼抗原結(jié)合分子的基因，其中在(a)中制備的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域與抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接；和 (C)使用(b)中制備的基因產(chǎn)生抗原結(jié)合分子。
53.用于篩選抗原結(jié)合分子的方法，所述方法包括以下步驟 (a)選擇與在改變在酸性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸之前相比，在中性PH范圍內(nèi)具有較強的人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子； (b)改變抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸，并選擇與在酸性pH范圍內(nèi)相比在中性PH范圍內(nèi)具有較強抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子； (c)獲得編碼抗原結(jié)合分子的基因，其中在(a)和(b)中制備的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域與抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接；和 (d)使用在(C)中制備的基因產(chǎn)生抗原結(jié)合分子。
54.用于篩選抗原結(jié)合分子的方法，所述方法包括以下步驟 (a)選擇與在改變在酸性pH范圍內(nèi)具有人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸之前相比，在中性pH范圍內(nèi)具有較強的人FcRn結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子； (b)選擇與在酸性pH范圍內(nèi)相比在中性pH范圍內(nèi)具有較強抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子; (c)獲得編碼抗原結(jié)合分子的基因，其中在(a)和(b)中制備的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域與抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接；和 (d)使用在(C)中制備的基因產(chǎn)生抗原結(jié)合分子。
55.權(quán)利要求30-54中任一項的方法，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含與受體結(jié)合的人工配體。
56.權(quán)利要求30-54中任一項的方法，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含與配體結(jié)合的人工受體。
57.權(quán)利要求30-54中任一項的方法，其中所述抗原結(jié)合分子為抗體。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供用于促進(jìn)抗原結(jié)合分子介導(dǎo)的細(xì)胞對抗原攝入的方法、用于促進(jìn)血漿抗原濃度降低的方法、用于增加單個抗原結(jié)合分子可與之結(jié)合的抗原的數(shù)目的方法、用于改進(jìn)抗原結(jié)合分子的藥代動力學(xué)的方法、促進(jìn)細(xì)胞對抗原攝入的經(jīng)改良的抗原結(jié)合分子、能夠促進(jìn)血漿抗原濃度降低的抗原結(jié)合分子、能夠與抗原重復(fù)結(jié)合的抗原結(jié)合分子、具有改進(jìn)的藥代動力學(xué)的抗原結(jié)合分子、包含所述抗原結(jié)合分子的藥物組合物和用于產(chǎn)生上述這些的方法。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在血漿pH下具有人FcRn結(jié)合活性且抗原結(jié)合活性在早期內(nèi)體pH下比在血漿pH下低的抗體促進(jìn)細(xì)胞對抗原的攝入；這類抗體可增加單個抗體分子可與之結(jié)合的抗原的數(shù)目；通過給予這類抗體可促進(jìn)血漿抗原的降低；且通過使用這類抗體可改進(jìn)抗體藥代動力學(xué)。
文檔編號C07K16/00GK102918057SQ201180026699
公開日2013年2月6日 申請日期2011年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月30日
發(fā)明者井川智之, 石井慎也, 前田敦彥, 中井貴士 申請人:中外制藥株式會社