專(zhuān)利名稱(chēng)：抗pcsk9的高親和力人抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與人類(lèi)前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9 (PCSK9)特異性結(jié)合的人抗體和人抗體的抗原結(jié)合片段，以及使用這些抗體的治療方法。
關(guān)于相關(guān)技術(shù)的陳述前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是一種前蛋白轉(zhuǎn)化酶，屬于分泌的枯草桿菌酶家族的蛋白酶K亞族。該編碼蛋白是作為可溶性酶原合成的，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)過(guò)自身催化分子內(nèi)加工。證據(jù)顯示，PCSK9促進(jìn)LDL受體的降解從而增加血漿中LDL膽固醇含量，而 LDL受體介導(dǎo)肝內(nèi)的LDL胞吞過(guò)程，后者是從循環(huán)系統(tǒng)清除LDL的主要途徑。PCSK9蛋白的結(jié)構(gòu)顯示，它具有一個(gè)信號(hào)序列、接著是一個(gè)前結(jié)構(gòu)域、一個(gè)含有保守三元?dú)埢?D186、H2^5 和S386)的催化結(jié)構(gòu)域，以及一個(gè)C端結(jié)構(gòu)域。它是作為可溶性74-kDa前體合成的，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)過(guò)自身催化裂解而產(chǎn)生一個(gè)14-kDa前結(jié)構(gòu)域和60-kDa催化片段。業(yè)已顯示該自身催化活性是分泌過(guò)程所需要的。裂解之后，上述前結(jié)構(gòu)域保持與催化結(jié)構(gòu)域緊密相連的狀態(tài)。PCSK9 的抗體在例如 WO 2008/057457、WO 2008/057458、WO 2008/057459、WO 2008/063382、WO 2008/125623 以及 US2008/0008697 等專(zhuān)利中均有述及。
發(fā)明概要在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一些與人PCSK9(hPCSK9)特異性結(jié)合且中和其活性的完全人單克隆抗體(mAbs)及其抗原結(jié)合片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種與hPCSK9特異性結(jié)合的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，并至少具有以下一個(gè)特征
(i)相對(duì)于給藥前水平，能夠使血清總膽固醇含量下降至少約25至35%并保持這種下降趨勢(shì)達(dá)至少M(fèi)天，較佳的是使血清總膽固醇含量下降至少約30至40% ；
(i)相對(duì)于給藥前水平，能夠使血清LDL膽固醇含量下降至少約65至80%并保持這種下降趨勢(shì)達(dá)至少對(duì)天；
(iii)相對(duì)于給藥前水平，能夠使血清甘油三酯含量下降至少約25至40%；
(iv)不降低血清HDL膽固醇含量，或相對(duì)于給藥前水平，降低血清HDL膽固醇含量不超過(guò)5%。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種與hPCSK9特異性結(jié)合的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，并至少具有以下一個(gè)特征
(i)相對(duì)于給藥前水平，能夠使血清LDL膽固醇含量下降至少約40至70%并保持這種下降趨勢(shì)達(dá)至少60天或90天；
( )相對(duì)于給藥前水平，能夠使血清甘油三酯含量下降至少約25至40% ； (iii)不降低血清HDL膽固醇含量，或相對(duì)于給藥前水平，降低血清HDL膽固醇含量不超過(guò)5%。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體或其片段的特征是與包含hPCSK9(SEQ ID NO :755)的氨基酸殘基238的表位結(jié)合。在一個(gè)較特殊的實(shí)施方案中，該抗體或其片段與包含 hPCSK9 (SEQ ID NO :755)的一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸殘基238、153、159和；343的表位結(jié)合。 在一個(gè)較特殊的實(shí)施方案中，該抗體或其片段的特征是與在SEQ ID NO :755的192、194、 197和/或237位置不含氨基酸殘基的表位結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體或其片段的特征是與包含hPCSK9 (SEQ ID NO :755)的氨基酸殘基366的表位結(jié)合。在一個(gè)較特殊的實(shí)施方案中，該抗體或其片段與在SEQ ID NO 755的147、366和380位置包含一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸殘基的表位結(jié)合。在一個(gè)較特殊的實(shí)施方案中，該抗體或其片段的特征是，在SEQ ID NO :755的215和/或238位置與不含氨
基酸殘基的表位結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體或其片段的特征是，經(jīng)表面等離子體共振技術(shù)測(cè)量，相對(duì)于PH 7. 4條件下的結(jié)合親和力(Kd)，在pH 5. 5條件下顯示與hPCSK9的結(jié)合親和力Kd增強(qiáng)。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，經(jīng)表面等離子體共振技術(shù)測(cè)量，該抗體或其片段在酸性PH 條件下與PCSK9的結(jié)合親和力比在中性pH條件下增強(qiáng)至少20倍、至少40倍或至少50倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體或其片段的特征是，經(jīng)表面等離子體共振技術(shù)測(cè)量，未顯示在酸性pH條件下與PCSK9的結(jié)合親和力比在中性PH條件下有所增強(qiáng)。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，與中性PH條件相比，酸性pH條件下的結(jié)合力較小且T1/2較短。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體或抗原結(jié)合片段與人、人GOF突變D374Y、獼猴、恒河猴、小鼠、大鼠以及倉(cāng)鼠的PCSK9結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體或抗原結(jié)合片段與人和猴的PCSK9結(jié)合，但不與小鼠、 大鼠或倉(cāng)鼠的PCSK9結(jié)合。這些mAbs抗體可以是全長(zhǎng)的(例如IgGl或IgG4抗體)，或可僅包含一個(gè)抗原結(jié)合部分(例如Fab、F(ab’)2或scFv片段)，并可加以修飾以影響其功能，例如消除殘余的效應(yīng)子功能(Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164 :1925-1933)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，其包含一個(gè)選自下列一組序列的重鏈可變域(HCVR) =SEQ ID NO :2、18、22、26、42、46、50、66、70、74、90、 94、98、114、118、122、138、142、146、162、166、170、186、190、194、210、214、218、234、238、 242、258、262、266、282、286、290、306、310、314、330、334、338、354、358、362、378、382、386、 402、406、410、426、430、434、450、454、458、474、478、482、498、502、506、522、526、530、546、 550、554、570、574、578、594、598、602、618、622、626、642、646、650、666、670、674、690、694、 698、714、718、722、738和742，或一種與其實(shí)質(zhì)上相似具有至少90%、至少95%、至少98% 或至少99 %序列同一性的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，該HCVR是一個(gè)選自下列一組序列的氨基酸序列:SEQ ID NO :50、66、70、74、90、94、122、138、142、218、234、238、M2、258J62、314、 330和334。在一個(gè)較特殊的實(shí)施方案中，該HCVR包含SEQ ID NO :90或218。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體或其片段進(jìn)一步包含一個(gè)選自下列一組序列的輕鏈可變域(LCVR) =SEQ ID NO :10、20、24、34、44、48、58、68、72、82、92、96、106、116、120、130、 140、144、154、164、168、178、188、192、202、212、216、226、236、240、250、260、264、274、284、 288、298、308、312、322、332、336、346、356、360、370、380、384、394、404、408、418、428、432、 442、452、456、466、476、480、490、500、504、514、524、528、538、548、552、562、572、576、586、 596、600、610、620、624、634、644、648、658、668、672、682、692、696、706、716、720、730、740 和744，或一種與其實(shí)質(zhì)上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，該LCVR是一個(gè)選自下列一組序列的氨基酸序列SEQ ID NO :58、 68、72、82、92、96、130、140、144、226、236、240、250、260、264、322、332 和 336。在一個(gè)較特殊的實(shí)施方案中，該LCVR包含SEQ ID NO :92或226。 在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，該抗體或其片段包含一個(gè)選自下列一組序列的HCVR 和 LCVR(HCVR/LCVR)序列對(duì)SEQ ID NO :2/10、18/20、22/24、26/34、42/44、46/48、50/58、
66/68,70/'12,74/82>90/'92,94/96,.98/106、114/116、118/120、122/130、138/140,142/'144、146/'154,162；/164、166//168,170/'178,186/'188,190/'192,194/'202,210/'212、214/'216、218/'226、234,/236、238；/240,242/'250,258/,260、262/,264、266/''274,282/'284、286/'288、290/,298、306,/308、310,/312,314/'322,330//332,334//336,338//346,354/'356、358/'360、362/,370、378,/380、382,/384,386/,394、402//404,406；/408,410；/418,426/'428、430/'432、434；/442、450,/452、454,/456,458//466,474,/476,478,/480,482,/490,498/'500、,502/,504、506,/514、,522/524、526,/528,530；/538,546,/548,550/'552,554/'562,570/'572、574/'576、578/'586,594,/596、598；/600,602/'610,618/'620,622/,624、626/'634,642/'644、646/'648、650/,658、666,/668、670,/672,674/'682,690/,692、694//696,698//706,714/'716、718/'720、722/730,738/740 和 742/744。在-一個(gè)實(shí)施方案中，該HCVR和LCVR是一對(duì)選自下列一組
序列對(duì)的氨基酸序列對(duì):SEQ ID NO 50/58、66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、122/130、 138/140、142/144、218/226、234/236、238/240、242/250、258/260、262/264、314/322、 330/332和334/336。在一個(gè)較特殊的實(shí)施方案中、該HCVR/LCVR序列對(duì)包含SEQ ID NO: 90/92 或 218/226o在第二個(gè)方面，本發(fā)明的特點(diǎn)是有一種抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，其包含一個(gè)選自下列一組序列的重鏈 CDR3(HCDR3)域SEQID NO :8、32、56、80、104、128、152、176、200、 224、248、272、296、320、344、368、392、416、440、464、488、512、536、560、584、608、632、656、 680,704和728，或一種與其實(shí)質(zhì)上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99% 序列同一性的序列；以及一個(gè)選自下列一組序列的輕鏈⑶R30XDR3)域SEQ ID NO 16, 40、64、88、112、136、160、184、208、232、256、280、304、328、352、376、400、424、448、472、496、 520、544、568、592、616、640、664、688、712和736，或一種與其實(shí)質(zhì)上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，該HCDR3/IXDR3序列對(duì)是 SEQ ID NO :56/64、80/88、128/136、2M/232、248/256 或 320/3沘。在一個(gè)較特殊的實(shí)施方案中，該 HCDR3/LCDR3 包含 SEQ ID NO :80/88 或 224/232。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，其包含一個(gè)選自下列一組序列的重鏈 CDRl (HCDRl)域SEQ ID NO :4、28、52、76、100、124、148、 172、196、220、244、268、292、316、340、364、388、412、436、460、484、508、532、556、580、604、 628,652,676,700和724，或一種與其實(shí)質(zhì)上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列；一個(gè)選自下列一組序列的重鏈⑶R2(HCDR2)域SEQ ID NO 6、30、54、78、102、126、150、174、198、222、246、270、294、318、342、366、390、414、438、462、 486、510、534、558、582、606、630、654、678、702 和 726、或一種與其實(shí)質(zhì)上相似具有至少 90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列；一個(gè)選自下列一組序列的輕鏈 CDRl (LCDRl)域SEQ ID NO 12、36、60、84、108、132、156、180、204、228、252、276、300、324、348、372、396、420、444、468、492、516、540、564、588、612、636、660、684、708 和 732，或一種與其實(shí)質(zhì)上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列；以及一個(gè)選自下列一組序列的輕鏈 CDR2(LCDR2)域SEQ ID NO :14、38、62、86、110、1；34、158、 182、206、230、254、278、302、326、350、374、398、422、446、470、494、518、542、566、590、614、 638、662、686、710和734、或一種與其實(shí)質(zhì)上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，該重鏈和輕鏈⑶R序列是SEQ ID NO 52、54、56、60、62、64 ；76、78、80、84、86、88 ； 124、126、128、132、134、136 ；220、222、224、228、 230,232 ；244、246、248、252、254、256 ；以及 316、318、320、324、326、328。在一個(gè)較特殊的實(shí)施方案中，該重鏈和輕鏈CDR序列是SEQ ID NO :76、78、80、84、86、88 ；或220、222、224、228、 230、232。在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種與hPCSK9特異性結(jié)合的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗體片段包含位于選自下列一組序列的重鏈和輕鏈序列對(duì)內(nèi)的重鏈和輕鏈 CDR 域SEQ IDNO :2/10,18/20,22/24,26/34,42/44,46/48,50/58, 66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、98/106、114/116、118/120、122/130、138/140、142/144、 146/154、162/164、166/168、170/178、186/188、190/192、194/202、210/212、214/216、 218/226,234/236,238/240,242/250,258/260,262/264,266/274,282/284,286/288, 290/298,306/308,310/312,314/322,330/332,334/336,338/346,354/356,358/360, 362/370,378/380,382/384,386/394,402/404,406/408,410/418,426/428,430/432, 434/442,450/452,454/456,458/466,474/476,478/480,482/490,498/500,502/504, 506/514,522/524,526/528,530/538,546/548,550/552,554/562,570/572,574/576, 578/586,594/596,598/600,602/610,618/620,622/624,626/634,642/644,646/648, 650/658,666/668,670/672,674/682,690/692,694/696,698/706,714/716,718/720, 722/730、738/740和742/744。在一個(gè)實(shí)施方案中，該CDR序列位于選自下列一組氨基酸序列對(duì)的 HCVR 和 LCVR 域內(nèi)SEQ ID NO :50/58、66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、122/130、 138/140、142/144、218/226、234/236、238/240、242/250、258/260、262/264、314/322、 330/332和334/336。在一個(gè)較特殊的實(shí)施方案中，該CDR序列位于選自下列一組氨基酸序列對(duì)的 HCVR 和 LCVR 域內(nèi)=SEQ ID NO :90/92 或 218/226。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一些與hPCSK9特異性結(jié)合且中和其活性的完全人單克隆抗體(mAbs)或其抗原結(jié)合片段，其中該抗體或其片段顯示了一個(gè)或多個(gè)如下特征
(i)相對(duì)于給藥前水平，能夠使血清總膽固醇含量下降至少約25至35%并保持這種下降趨勢(shì)達(dá)至少M(fèi)天，較佳的是使血清總膽固醇含量下降至少約30至40% ；
(ii)相對(duì)于給藥前水平，能夠使血清LDL膽固醇含量下降至少約65至80%并保持這種下降趨勢(shì)達(dá)至少對(duì)天；
(iii)相對(duì)于給藥前水平，能夠使血清甘油三酯含量下降至少約25至40%；
(iv)不降低血清HDL膽固醇含量，或相對(duì)于給藥前水平降低血清HDL膽固醇含量不超過(guò)5% ；
(ν)與包含hPCSK9 (SEQ ID NO :755)的氨基酸殘基238的表位結(jié)合；
(vi)相對(duì)于pH 7. 4條件下，在pH 53時(shí)，表面等離子體共振測(cè)量顯示hPCSK9的結(jié)合親和力(KD)增強(qiáng)，親和力增加至少約20倍至50倍；
(vii)與人、人GOF突變D374Y、獼猴、恒河猴、小鼠、大鼠以及倉(cāng)鼠的PCSK9結(jié)合；
(viii)包含含有SEQID NO 80和88的重鏈和輕鏈CDR3序列；
(ix)包含選自SEQID NO 90和92的CDR序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種與hPCSK9特異性結(jié)合及中和其活性的完全人單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其中該抗體或其片段顯示了一個(gè)或多個(gè)如下特征
(i)相對(duì)于給藥前水平，能夠使血清LDL膽固醇含量下降至少約40至70%并保持這種下降趨勢(shì)達(dá)至少60天或90天；
( )相對(duì)于給藥前水平，能夠使血清甘油三酯含量下降至少約25至40% ；
(iii)不降低血清HDL膽固醇含量，或相對(duì)于給藥前水平降低血清HDL膽固醇含量不超過(guò)5%。
(iv)與包含hPCSK9(SEQ ID NO :755)的氨基酸殘基366的表位結(jié)合；
(ν)經(jīng)表面等離子體共振技術(shù)測(cè)量，未顯示在酸性PH條件下與PCSK9的結(jié)合親和力比在中性PH條件下有所增強(qiáng)；
(vi)與人和猴的PCSK9結(jié)合，但不與小鼠、大鼠或倉(cāng)鼠的PCSK9結(jié)合；
(vii)包含含有SEQID NO 224和232的重鏈和輕鏈CDR3序列；
(viii)包含選自SEQID NO :218和226的CDR序列。在第三方面，本發(fā)明提供了編碼抗PCSK9抗體或其片段的核酸分子。本發(fā)明還包括運(yùn)載本發(fā)明核酸的重組表達(dá)載體，以及引入這類(lèi)載體的宿主細(xì)胞，并包括一些在允許產(chǎn)生抗體和收集所產(chǎn)生抗體的條件下通過(guò)培養(yǎng)宿主細(xì)胞而生產(chǎn)抗體的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種抗體或其片段，其包含一個(gè)由選自下列序列的核酸序列編碼的 HCVR =SEQ ID NO :1、17、21、25、41、45、49、65、69、73、89、93、97、113、 117、121、137、141、145、161、165、169、185、189、193、209、213、217、233、237、241、257、261、 265、281、285、289、305、309、313、329、333、337、353、357、361、377、381、385、401、405、409、 425、429、433、449、453、457、473、477、481、497、501、505、521、525、529、545、549、553、569、 573、577、593、597、601、617、621、625、641、645、649、665、669、673、689、693、697、713、717、 721,737和741，或一種與其實(shí)質(zhì)上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同源性的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，該HCVR是由選自下列序列的核酸序列編碼的SEQ ID NO :49、65、69、73、89、93、121、137、141、217、233、237、241、257、261、313、329 和 333。在一個(gè)較特殊的實(shí)施方案中，該HCVR是由選自下列序列的核酸序列編碼的SEQ ID N0:89和 217。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體或其片段進(jìn)一步包含一個(gè)由選自下列一組序列的核酸序列編碼的 LCVR =SEQ ID NO :9、19、23、33、43、47、57、67、71、81、91、95、105、115、119、129、 139、143、153、163、167、177、187、191、201、211、215、225、235、239、249、259、263、273、283、 287、297、307、311、321、331、335、345、355、359、369、379、383、393、403、407、417、427、431、 441、451、455、465、475、479、489、499、503、513、523、527、537、547、551、561、571、575、585、 595、599、609、619、623、633、643、647、657、667、671、681、691、695、705、715、719、729、739 和 743，或一種與其實(shí)質(zhì)上相似具有至少90 %、至少95 %、至少98 %或至少99 %序列同源性的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，該LCVR是由選自下列一組序列的核酸序列編碼的SEQ ID NO57、67、71、81、91、95、129、139、143、225、235、239、249、259、263、321、331 和 335。在一個(gè)較特殊的實(shí)施方案中，該LCVR是由選自下列序列的核酸序列編碼的SEQ ID NO :91和225。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的特點(diǎn)是一種抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，其包含一個(gè)由選自下列序列的核苷酸序列編碼的HCDR3域=SEQ ID NO :7、31、55、79、103、127、151、 175、199、223、247、271、295、319、343、367、391、415、439、463、487、511、535、559、583、607、 631、655、679、703和727，或一種與其實(shí)質(zhì)上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同源性的序列；以及一個(gè)由選自下列序列的核苷酸序列編碼的LCDR3域SEQ ID NO :15、39、63、87、111、135、159、183、207、231、255、279、303、327、351、375、399、423、 447、471、495、519、543、567、591、615、639、663、687、711 和 735，或一種與其實(shí)質(zhì)上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同源性的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中， 該HCDR3和LCDR3序列是由下列核酸序列分別編碼的:SEQ ID NO :55/63、79/87、127/135、 223/231,247/255和319/327。在一個(gè)較特殊的實(shí)施方案中，該HCDR3和LCDR3序列對(duì)是由下列核酸序列編碼的:SEQ ID NO :79/87和223/231。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該抗體或其片段進(jìn)一步包含一個(gè)由選自下列一組序列的核苷酸序列編碼的 HCDRl 域=SEQ ID NO :3、27、51、75、99、123、147、171、195、219、對(duì)3、 267、291、315、339、363、387、411、435、459、483、507、531、555、579、603、627、651、675、699 和 723，或一種與其實(shí)質(zhì)上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列；一個(gè)由選自下列一組序列的核苷酸序列編碼的HCDR2域SEQ ID NO :5、29、53、77、 101、125、149、173、197、221、245、269、293、317、341、365、389、413、437、461、485、509、533、 557、581、605、629、653、677、701和725，或一種與其實(shí)質(zhì)上相似具有至少90%、至少95%, 至少98%或至少99%序列同源性的序列；一個(gè)由選自下列一組序列的核苷酸序列編碼的 LCDRl 域SEQ ID NO 11、35、59、83、107、131、155、179、203、227、251、275、299、323、347、 371、395、419、443、467、491、515、539、563、587、611、635、659、683、707 和 731，或一種與其實(shí)質(zhì)上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同源性的序列；以及一個(gè)由選自下列一組序列的核苷酸序列編碼的LCDR2域=SEQ ID NO :13、37、61、85、109、133、 157、181、205、229、253、277、301、325、349、373、397、421、445、469、493、517、541、565、589、 613、637、661、685、709和733，或一種與其實(shí)質(zhì)上相似具有至少90%、至少95%、至少98% 或至少99%序列同源性的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，該重鏈和輕鏈CDR序列是由下列核酸序列編碼的:SEQ ID NO :51、53、55、59、61、63 ；75、77、79、83、85、87 ；123、125、127、131、 133,135 ；219、221、223、227、229、231 ；243、245、247、251、253、255 ；以及 315、317、319、323、 325、327。在一個(gè)較特殊的實(shí)施方案中，該重鏈和輕鏈CDR序列是由下列核酸序列編碼的 SEQ ID NO :75、77、79、83、85、87 ；以及 219、221、223、227、229、231。在第四個(gè)方面，本發(fā)明的特點(diǎn)是一種與hPCSK9特異性結(jié)合的分離的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，其包含一個(gè)HCDR3和一個(gè)IXDR3，其中HCDR3包含一個(gè)結(jié)構(gòu)式為X1-X2-X3-X LX5-X6-X7-X8-X9-Xici-Xii-Xi2-Xi3-X14-X15-XW-X17-X18-X19-X2 的氨基酸序列(SEQ ID NO :747)， 其中 X1 是 Ala ；X2 是 Arg 或 Lys ；X3 是 Asp ；X4 是 Ser 或 Ile ；X5 是 Asn 或 Val ；X6 是 Leu 或 Trp ；X7 是 Gly 或 Met ；X8 是 Asn 或 Val ；X9 是 Phe 或 Tyr ；X10 是 Asp ；X11 是 Leu 或 Met ；X12 是 Asp或缺位；X13是Tyr或缺位；X14是Tyr或缺位；X15是Tyr或缺位乂6是Tyr或缺位；X17 是Gly或缺位；XW是Met或缺位；X19是Asp或缺位，以及X2°是Val或缺位；IXDR3包含一個(gè)結(jié)構(gòu)式為X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9的氨基酸序列(SEQ ID NO :750)，其中X1是Gln或 Met ；X2 是 Gln ；X3 是 Tyr 或 Thr ；X4 是 Tyr 或 Leu ；X5 是 Thr 或 Gln ；X6 是 Thr ；X7 是 Pro ；X8 是Tyr或Leu，以及X9是Thr。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該抗體或其片段進(jìn)一步包含一個(gè)結(jié)構(gòu)式為 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 的 HCDRl 序列(SEQ ID NO :745)，其中 X1 是Gly ；X2 是Phe ；X3 是Thr ； X4 是 Phe ；X5 是 Ser 或 Asn ；X6 是 Ser 或 Asn ；X7 是 Tyr 或 His ；以及 X8 是 Ala 或 Trp ；一個(gè)結(jié)構(gòu)式為 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 的 HCDR2 序列(SEQ ID NO :746)；其中 X1 是 Ile ；X2 是 Ser 或 Asn ；X3 是 Gly 或 Gln ；X4 是 Asp 或 kr ；X5 是 Gly ；X6 是 Ser 或 Gly ；X7 是 Thr 或 Glu ；以及 X8 是 Thr 或 Lys ；—個(gè)結(jié)構(gòu)式為 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xiq-X11-X12 的 LCDRl 序列(SEQ ID NO 748)，其中 X1 是 Gln ；X2 是 Ser ；X3 是 Val 或 Leu ；X4 是 Leu ；X5 是 His 或 Tyr ；X6 是 Arg 或 Ser ；X7 是 Ser 或 Asn ；X8 是 Asn 或 Gly ；X9 是 Asn ；X10 是 Arg 或 Asn ；X11 是 Asn 或 Tyr ；以及 X12是Phe或缺位；一個(gè)結(jié)構(gòu)式為X1-X2-X3的LCDR2序列(SEQ ID NO :749)，其中X1是Trp 或Leu ;X2是Ala或Gly ；以及乂3是％1·。

圖1顯示了 316P和300N mAbs的重鏈和輕鏈可變域的序列比對(duì)。在第五個(gè)方面，本發(fā)明的特點(diǎn)是一種人抗PCSK9抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，其包含一個(gè)由衍生自VH、Dh和Jh種系序列的核苷酸序列片段編碼的重鏈可變區(qū)(HCVR)，以及一個(gè)由衍生自Vk和Jk種系序列的核苷酸序列片段編碼的輕鏈可變區(qū)(LCVR)，其中該種系序列是(a) Vh基因片段3-23、Dh基因片段7_27、Jh基因片段2、Vk基因片段4_1以及Jk基因片段2 ；或(b) Vh基因片段3-7、 基因片段2-8、Jh基因片段6、Vk基因片段2- 以及Jk 基因片段4。在第六個(gè)方面，本發(fā)明的特點(diǎn)是一種與PCSK9蛋白(SEQ IDNO :755)結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中該抗體或其片段與一種變異PCSK9蛋白的結(jié)合比抗體或其片段與 SEQ ID NO :755的PCSK9蛋白之間的結(jié)合低50%。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，該抗體或其抗原結(jié)合片段與該變異PCSK9蛋白的結(jié)合親和力(Kd)比與PCSK9(SEQ IDNO :755)的結(jié)合力低約50%、低約60%、低約70%、低約80%、低約90%或低約95%。在一個(gè)實(shí)施方案中，該變異PCSK9蛋白在SEQ ID NO :755的238位包含至少一個(gè)突變。在一個(gè)較特殊的實(shí)施方案中，該突變?yōu)镈238R。在一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型蛋白SEQ ID NO :755，該抗體或抗體片段與變異PCSK9蛋白的結(jié)合親和力至少低90%，其中該變異蛋白在殘基238處包含一個(gè)突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型蛋白SEQ ID NO 755，該抗體或抗體片段與變異PCSK9蛋白的結(jié)合親和力至少低80%，其中該變異蛋白在一個(gè)或一個(gè)以上殘基153、159、238和343處包含一個(gè)突變。在一個(gè)較特殊的實(shí)施方案中，該突變是 S153R、E159R、D238R 和 D!343R 之一。在一個(gè)實(shí)施方案中，該變異PCSK9蛋白在SEQ ID NO :755的366位包含至少一個(gè)突變。在一個(gè)較特殊的實(shí)施方案中，該突變?yōu)镋366K。在一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型蛋白SEQ ID NO :755，該抗體或抗體片段與變異PCSK9蛋白的結(jié)合親和力至少低95%，其中該變異蛋白在殘基366處包含一個(gè)突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型蛋白SEQ ID NO 755，該抗體或抗體片段與變異PCSK9蛋白的結(jié)合親和力至少低70%、80%或90%，其中該變異蛋白在一個(gè)或一個(gè)以上殘基147、366和/或380處包含一個(gè)突變。在一個(gè)較特殊的實(shí)施方案中，該突變是S147F、E366K和V380M之一。
本發(fā)明包括具有一種經(jīng)修飾的糖基化模式的抗PCSK9抗體。在某些應(yīng)用中，進(jìn)行修飾以除去某些不希望的糖基化位點(diǎn)也許是有益的，或例如除去巖藻糖基以提高抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)功能(參閱Shield et al. (2002) JBC 277 :26733)。在其它一些應(yīng)用中，為了改變補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(CDC)，可進(jìn)行半乳糖基化的修飾。在第七個(gè)方面，本發(fā)明之特點(diǎn)是一種含有與hPCSK9特異性結(jié)合的重組人抗體或其片段以及一種藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明之特點(diǎn)是一種組合物，它是本發(fā)明之抗體或抗體的抗原結(jié)合片段和第二種治療劑的結(jié)合。第二種治療劑可為與本發(fā)明之抗體或其片段有利地結(jié)合的任何藥劑，例如，一種通過(guò)抑制3-羥基-3-甲基戊二酰(HMG)-輔酶A(CoA)還原酶能夠誘導(dǎo)膽固醇合成的細(xì)胞清除的藥劑，例如西利維司汀(cerovastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、匹伐他汀(pitavastin)、瑞舒伐它汀(rosuvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀 (lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)等；能夠抑制膽固醇吸收和/或膽汁酸再吸收的藥劑；能夠增加脂蛋白分解代謝的藥劑(如煙酸)；和/或在膽固醇如22-羥基膽固醇的清除過(guò)程中起作用的L)(R轉(zhuǎn)錄因子的活化劑。在第八個(gè)方面，本發(fā)明的特點(diǎn)是一些用本發(fā)明之抗PCSK9抗體或抗體的抗原結(jié)合片段抑制hPCSK9活性的方法，其中該治療方法包括施用一種療效量的含有本發(fā)明之抗體或抗體的抗原結(jié)合片段的藥物組合物。所治療的疾病是通過(guò)除去、抑制或降低PCSK9的活性而得到改善、減輕、抑制或預(yù)防的任何疾病或癥狀。可以本發(fā)明之方法治療的具體人群包括需要LDL血漿置換的患者、PCSK9激活突變(獲得功能的突變，即G0F)的患者、雜合家族性高膽固醇血癥患者(heFH)；不耐受抑制素或抑制素?zé)o法控制的原發(fā)性高膽固醇血癥患者；以及具有患高膽固醇血癥的危險(xiǎn)但可進(jìn)行預(yù)防性治療的患者。其它癥狀包括與次要原因如II型糖尿病相關(guān)的血脂異常、膽汁郁積型肝病(原發(fā)性膽汁性肝硬變化)、腎病綜合征、甲狀腺機(jī)能減退、肥胖癥；以及動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病的預(yù)防和治療。在本發(fā)明之方法的一些特殊的實(shí)施方案中，本發(fā)明之抗hPCSK9抗體或抗體片段可用于降低偏高的總膽固醇、非HDL膽固醇、LDL膽固醇、和/或載脂蛋白B (載脂蛋白B100) 的含量。本發(fā)明之抗體或抗體片段可單獨(dú)使用或與第二種藥劑如一種HMG-CoA還原酶的抑制劑和/或其它降低脂質(zhì)的藥物結(jié)合使用。其它的實(shí)施方案包括將如上所定義的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段用于減輕或抑制PCSK9介導(dǎo)的疾病或病癥。本發(fā)明包括在用于減輕或抑制PCSK9介導(dǎo)的疾病或病癥的藥劑的制造過(guò)程中，使用如上所定義的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段。在一些特殊的實(shí)施方案中，其中PCSK9介導(dǎo)的疾病或癥狀是高膽固醇血癥、高血脂癥、需要LDL血漿置換、雜合家族性高膽固醇血癥、 抑制素不耐受癥、抑制素?zé)o法控制、具有患高膽固醇血癥的危險(xiǎn)、血脂異常、膽汁郁積型肝病、腎病綜合征、甲狀腺機(jī)能減退、肥胖癥、動(dòng)脈粥樣硬化以及心血管疾病。在閱讀以下詳細(xì)敘述的過(guò)程中，其它的實(shí)施方案將變得很明顯。 附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1 重鏈(A)和輕鏈(B)可變區(qū)和抗體H1H316P和H1M300N的⑶R序列比較表。圖2 血清中抗體濃度隨時(shí)間的變化。316P 5mg/kg(D) ；300N 5mg/kg(〇)；316P15mg/kg(v) ；300N 15mg/kg(·)。圖3 以緩種 液對(duì)照變化百分比表示的血清總膽固醇水平。對(duì)照⑴；316P 5mg/ kg(ν) ；300Ν 5mg/kg(σ) ；316Ρ 15mg/kg( □ ) ；300N15mg/kg( Δ )。圖4 以緩衝液對(duì)照變化百分比表示的血清LDL膽固醇水平。對(duì)照⑴；316P 5mg/kg ( ν ) ；300N 5mg/kg ( σ ) ；316P 15mg/kg( □ ) ；300N 15mg/kg(A)。圖5 相對(duì)于緩沖液對(duì)照歸一化的血清LDL膽固醇水平。緩衝液對(duì)照(T) ；316P 5mg/kg ( ν ) ；300N 5mg/kg ( σ ) ；316P 15mg/kg( □ ) ；300N 15mg/kg(A)。圖6 以緩衝液對(duì)照變化百分比表示的血清HDL膽固醇水平。對(duì)照⑴；316P 5mg/kg ( ν ) ；300N 5mg/kg ( σ ) ；316P 15mg/kg( □ ) ；300N 15mg/kg(A)。圖7 以緩衝液對(duì)照變化百分比表示的血清甘油三酯水平。緩衝液對(duì)照(T)； 316P 5mg/kg(v) ；300N 5mg/kg ( σ ) ；316P 15mg/kg( □ ) ；300N 15mg/kg(A)。圖8 單劑量皮下注射后，以從基線(xiàn)的變化百分比表示的血清LDL膽固醇水平。 316P 5mg/kg(v) ；300N 5mg/kg(參)。圖9 單劑量皮下注射后血清抗體濃度隨時(shí)間的變化。316P 5mg/kg( · ) ；300N 5mg/kg (σ)。圖10 小鼠總肝勻漿LDL受體的西方印跡試驗(yàn)。于注射PBS(l-3行)、5mg/ kg 316P (4-6 行)或 5mg/kg 非 hPCSK9 特異性 mAb (7-8 行)后 M 小時(shí)，以及 1. 2mg/kg hPCSK9-mmh(所有行)注射后4小時(shí)取樣。 圖11 :316P對(duì)PCSK9Whu小鼠體內(nèi)血清LDL膽固醇水平的胃響。緩沖液對(duì)照(0 ； 316P lmg/kg(·); 316P 5mg/kg (畫(huà));316P 10mg/kg(||)o圖12 :C57BL/6小鼠的抗hPCSK9mAb血清藥代動(dòng)力學(xué)特性。單劑量注射對(duì)照I mAb(X)為 10mg/kg ;316Ρ(σ )為 10mg/kg 以及 300N(v)為 10mg/kg。圖13 :hPCSK9雜合小鼠的抗hPCSK9 mAb血清藥代動(dòng)力學(xué)特性單劑量10mg/kg 對(duì)照 I mAb(X) ；316Ρ(σ)禾口 300Ν(ν)。圖14 :316P對(duì)喂以正常飼料的敘利亞倉(cāng)鼠體內(nèi)血清LDL膽固醇水平的影響。緩沖液對(duì)照(·)；316P lmg/kg(v) ；316P 3mg/kg(o ) ；316P 5mg/kg(T)。
本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明在描述本發(fā)明的方法之前，應(yīng)該理解，本發(fā)明并非局限于所描述的具體方法和實(shí)驗(yàn)條件，因?yàn)檫@些方法和條件是可以改變的。還應(yīng)理解，本文所用的術(shù)語(yǔ)僅出于描述具體實(shí)施方案的目的，并非意在限制本發(fā)明，因?yàn)楸景l(fā)明之范圍僅受所附權(quán)利要求書(shū)的限制。除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)將具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。盡管與本文所述的方法和材料類(lèi)似或相當(dāng)?shù)娜魏畏椒ê筒牧隙伎捎糜诒景l(fā)明之實(shí)施或試驗(yàn)，但現(xiàn)將描述的是首選的方法和材料。
定義本文所用的術(shù)語(yǔ)“人類(lèi)前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9”或“hPCSK9”是指具有SEQ ID NO :7 所示核酸序列和SEQ ID NO :755所示氨基酸序列或其生物活性片段的hPCSK9。本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”意指由四條多肽鏈即兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)以二硫鍵相互連接而組成的免疫球蛋白分子。每條重鏈均由一個(gè)重鏈可變區(qū)(HCVR或VH)和一個(gè)重鏈恒定區(qū)組成(由CH1、CH2和CH3域組成)。每條輕鏈均由一個(gè)輕鏈可變區(qū)(LCVR或 VL)和一個(gè)輕鏈恒定區(qū)(CL)組成。VH和VL區(qū)可進(jìn)一步分成被稱(chēng)為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)，其中散布著保存性更好的被稱(chēng)為框架區(qū)(FR)的區(qū)域。每個(gè)VH和VL均由三個(gè)CDR和四個(gè)FR組成，從氨基端到羧基端按以下順序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。一個(gè)或多個(gè)CDR殘基的取代或一個(gè)或多個(gè)CDR的刪除也是可能的。在科學(xué)文獻(xiàn)中已經(jīng)敘述了其中一個(gè)或兩個(gè)⑶R被刪除以用于結(jié)合的抗體。Indian et al. (1995 FASEB J. 9 :133-139)基于已發(fā)表的晶體結(jié)構(gòu)，分析了抗體及其抗原之間的接觸域，并得出結(jié)論， 只有約五分之一至三分之一的⑶R殘基與抗原實(shí)際接觸。Indian還發(fā)現(xiàn)了許多抗體，其中一個(gè)或兩個(gè)CDR不含與抗原接觸的氨基酸(還可參閱Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320 415-428)。不接觸抗原的CDR殘基可基于先前的研究利用分子模擬和/或根據(jù)經(jīng)驗(yàn)從位于 Chothia⑶R域外的Kabat⑶R域識(shí)別(例如⑶RH2中的H60-H65殘基往往是不需要的)。 如果一個(gè)CDR或其殘基被刪除，通常它會(huì)被另一人抗體序列或這類(lèi)序列共有區(qū)內(nèi)占據(jù)相應(yīng)位置的氨基酸取代。CDR和氨基酸內(nèi)的取代位置也可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)選擇。經(jīng)驗(yàn)取代可以是保守的或不保守的取代。本文所用的術(shù)語(yǔ)“人抗體”意在包括含有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明之人HlAbs抗體可包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過(guò)體外隨機(jī)誘變或位點(diǎn)特異性誘變或通過(guò)體內(nèi)體細(xì)胞突變而引入的突變)，例如可在CDR中尤其是在CDR3中包括這樣的氨基酸殘基。但是，本文所用的術(shù)語(yǔ)“人抗體”并不意在包括其中衍生自另一哺乳動(dòng)物物種如小鼠的CDR序列被嫁接到人構(gòu)架序列上的mAbs抗體?！疤禺愋越Y(jié)合”或類(lèi)似術(shù)語(yǔ)意為一個(gè)抗體或抗原結(jié)合片段與一個(gè)在生理?xiàng)l件下相對(duì)穩(wěn)定的抗原形成復(fù)合體。特異性結(jié)合可以一個(gè)至少約IxlO-fiM或更小的平衡離解常數(shù)來(lái)描述(例如一個(gè)較小的Kd就意味著較緊密的結(jié)合)。確定兩個(gè)分子是否特異性結(jié)合的方法是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的，包括例如平衡透析、表面等離子體共振等方法。但是，特異性結(jié)合 hPCSK9的分離抗體對(duì)于其它抗原如來(lái)自其它物種的PCSK9分子可顯示交叉反應(yīng)性。然而， 與hPCSK9及一個(gè)或一個(gè)以上其它抗原結(jié)合的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)依然被認(rèn)為是“特異性結(jié)合” hPCSK9的抗體，如本文所用。術(shù)語(yǔ)“高親和力”抗體是指經(jīng)表面等離子共振技術(shù)例如BIAC0RE 或溶液親和 ELISA法測(cè)定，與hPCSK9的結(jié)合親和力為至少10_1(IM、較佳的是ΙΟ—^Μ、更佳的是10 Μ的 mAbs抗體。術(shù)語(yǔ)“慢離解速率(slow off rate) ”、“Koff”或“kd”是指經(jīng)表面等離子共振技術(shù)例如BIAC0RE 測(cè)定，以IxlO-3S-1或更低、較佳的是以lxlO—Y1或更低的速率常數(shù)從hPCSK9 離解的抗體。本文所用的抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡(jiǎn)稱(chēng)“抗體片段”)這一術(shù)語(yǔ)是指抗體中一個(gè)或多個(gè)保持了與hPCSK9特異性結(jié)合能力的片段?？贵w片段可包括一個(gè)Fab片段、一個(gè) F(ab' )2片段、一個(gè)Fv片段、一個(gè)dAb片段、一個(gè)含有⑶R的片段，或一個(gè)分離的⑶R。本發(fā)明的具體實(shí)施方案、抗體或抗體片段可與一種治療基團(tuán)(“免疫偶聯(lián)物”)如細(xì)胞毒素、化療藥物、免疫抑制劑或放射性同位素等偶聯(lián)。本文所用的“分離抗體”意指實(shí)質(zhì)上不含其它具有不同抗原特異性的mAbs的抗體(例如特異性結(jié)合hPCSK9的分離抗體就在實(shí)質(zhì)上不含能特異性結(jié)合hPCSK9之外抗原的 mAbs)。但是，特異性結(jié)合hPCSK9的分離抗體對(duì)于其它抗原如來(lái)自其它物種的PCSK9分子可具有交叉反應(yīng)性。本文所用的“中和抗體”(或“中和PCSK9活性的抗體”)意指其與hPCSK9的結(jié)合將導(dǎo)致PCSK9的至少一種生物活性被抑制的抗體。PCSK9生物活性的這種抑制可通過(guò)以本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的若干標(biāo)準(zhǔn)體外或體內(nèi)測(cè)定法中一種或多種方法測(cè)定PCSK9生物活性的一個(gè)或多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估(參閱下文的實(shí)施例)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“表面等離子共振”是指一種光學(xué)現(xiàn)象。基于這種光學(xué)現(xiàn)象可利用例如 BIAC0RE 系統(tǒng)(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ) 來(lái)檢測(cè)生物傳感器基質(zhì)中蛋白質(zhì)濃度的變化，從而對(duì)實(shí)時(shí)生物特異性相互作用進(jìn)行分析。本文所用的術(shù)語(yǔ)“KD”意指特定的抗體-抗原相互作用的平衡離解常數(shù)。術(shù)語(yǔ)“表位”是指抗原中與抗體結(jié)合的區(qū)域。表位可定義為結(jié)構(gòu)性表位或功能性表位。功能性表位通常是結(jié)構(gòu)性表位的一個(gè)亞型，并具有直接影響相互作用親和力的殘基。 表位可以是構(gòu)象表位，即由非線(xiàn)性氨基酸組成。在某些實(shí)施方案中，表位可包括決定簇，后者是分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)，如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷?；?lèi)或磺酰基類(lèi)；在某些實(shí)施方案中，表位可具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征和/或特定的電荷特征。術(shù)語(yǔ)“本質(zhì)上同一性”或“本質(zhì)上相同”當(dāng)指核酸或其碎片時(shí)，表示當(dāng)以適當(dāng)?shù)暮塑账岵迦牖騽h除與另一個(gè)核酸(或其互補(bǔ)鏈)最佳比對(duì)時(shí)，用下述任何著名的算法如FASTA、 BLAST或GAP測(cè)量，至少具有90%的核苷酸堿基序列相同性，更首選的是至少具有95%、 96 %、97 %、98 %或99 %的核苷酸堿基序列相同性。當(dāng)應(yīng)用于多肽時(shí)，術(shù)語(yǔ)本質(zhì)上相似”指兩個(gè)肽序列用諸如GAP或BESTFIT等程序的預(yù)設(shè)間隙重量達(dá)排列到最佳比對(duì)時(shí)，兩者至少有90%的序列相同性，更首選的是至少有 95%、98%或99%的序列相同性。首選的是，不相同的殘基位置的差別僅在于保守的氨基酸取代?！氨Ｊ氐陌被崛〈笔侵高@樣一種取代，即一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)含有化學(xué)性質(zhì) (例如電荷或疏水性)相似側(cè)鏈(R基團(tuán))的氨基酸殘基所取代。一般來(lái)說(shuō)，保守的氨基酸取代不會(huì)在實(shí)質(zhì)上改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。在兩個(gè)或更多的氨基酸序列相互之間的差別僅在于某些保守取代的情況中，可將序列相似性程度向上調(diào)整，以針對(duì)取代的保守特性作出校正。進(jìn)行這種調(diào)整的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。參閱例如Pearson (1994)Methods Mol. Biol. 24 :307-331.含有化學(xué)性質(zhì)相似側(cè)鏈的氨基酸類(lèi)別的實(shí)例包括1)脂族側(cè)鏈甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；幻脂族羥基側(cè)鏈絲氨酸和蘇氨酸；幻含酰胺側(cè)鏈天冬氨酸和谷氨酰胺；4)芳族側(cè)鏈苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸力)堿性側(cè)鏈賴(lài)氨酸、 精氨酸和組氨酸；和6)含硫側(cè)鏈天冬氨酸鹽和谷氨酸鹽，以及7)含硫側(cè)鏈半胱氨酸和甲硫氨酸。首選的保守氨基酸取代基是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、 賴(lài)氨酸-精氨酸、丙氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺?；蛘?，保守的取代是Gonnet et al. (1992) Science 256 :144；345中所公開(kāi)的PAM250 對(duì)數(shù)似然矩陣(PAM2501Og-likelihOOd matrix)中任何正值的變化。“中度保守的”取代是 PAM250對(duì)數(shù)似然矩陣中非負(fù)值的任何變化。
多肽的序列相似性通常用序列分析軟件來(lái)測(cè)量。蛋白質(zhì)分析軟件是用指定給各種取代(包括保守氨基酸取代)、缺失和其它修飾的相似性程度對(duì)相似的序列進(jìn)行比對(duì)。例如，GCG軟件含有諸如“GAP”和“BESTFIT”的程序，可以默認(rèn)參數(shù)使用這些程序，以確定緊密相關(guān)的多肽例如來(lái)自不同生物物種的同源多肽之間的序列同源性或序列同一性，或者野生型蛋白質(zhì)及其突變蛋白之間的序列同源性或序列同一性。參閱例如GCG Version 6. 1。還可以用GCG Version 6. 1中的FASTA程序以默認(rèn)參數(shù)或推薦參數(shù)來(lái)比較多肽序列。FASTA (例如FASTA2和FASTAiB)能提供被查詢(xún)序列和被搜索序列之間的最佳重迭區(qū)域的比對(duì)和序列同一性百分?jǐn)?shù)(Pearson(2000)，出處同上)。當(dāng)將本發(fā)明之序列與含有大量的源自不同生物的序列的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較時(shí)，另一首選的算法是BLAST計(jì)算機(jī)程序，尤其是BLASTP 或 TBLASTN，使用默認(rèn)參數(shù)。參閱如 Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215 :403410 及 (1997)NucleicAcids Res. 25 :3389402.在一些特殊的實(shí)施方案中，本發(fā)明之方法所使用的抗體或抗體片段可為單特異性、雙特異性或多特異性。多特異性抗體可以針對(duì)同一目標(biāo)多肽的不同表位，或可含有針對(duì)一個(gè)以上目標(biāo)多肽之表位的抗原結(jié)合域。可用于本發(fā)明的代表性雙特異性抗體形式涉及使用第一個(gè)免疫球蛋白(Ig)CH3結(jié)構(gòu)域和第二個(gè)Ig CH3結(jié)構(gòu)域，其中第一個(gè)和第二個(gè)IgCH3 結(jié)構(gòu)域相互之間相差至少一個(gè)氨基酸，且與無(wú)氨基酸差別的雙特異性抗體相比，其中至少一個(gè)氨基酸的差別降低了雙特異性抗體與蛋白A的結(jié)合力。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一個(gè)Ig CH3結(jié)構(gòu)域與蛋白A結(jié)合，第二個(gè)Ig CH3結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)降低或消除與蛋白A結(jié)合的突變， 例如一個(gè)H95R修飾(按照IMGT表現(xiàn)序列編號(hào)法；按照歐盟編號(hào)法則為H435R)。第二個(gè)CH3 結(jié)構(gòu)域可進(jìn)一步包含一個(gè)Y96F修飾(按照IMGT編號(hào)法；按照歐盟編號(hào)法則為W36F)。可在第二個(gè)CH3域內(nèi)找到的其它修飾包括在IgGl mAbs的情況下為D16E、L18M、N44S、K52N、 V57M和V82I (按照IMGT編號(hào)法；按照歐盟編號(hào)法則為D356E、L358M、N384S、K392N、V397M 和V422I)；在IgG2 mAbs的情況下為N44S、K52N和V82I (按照IMGT編號(hào)法；按照歐盟編號(hào)法則為 N384S、K392N 和 V422I)；以及在 IgG4 mAbs 情況下為 Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、 E79Q和V82I (按照IMGT編號(hào)法；按照歐盟編號(hào)法則為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、 E419Q和V422I)。上述雙特異性抗體的各種變化形式均被認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)?！坝行е委熈俊边@一短語(yǔ)意為對(duì)受藥對(duì)象能產(chǎn)生所需作用的量。確切的劑量將取決于治療的目的，并可由本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員使用已知技術(shù)確定(例如參閱Lloyd(1999)The Art，Science and Technology ofPharmaceutical Compounding)0
人抗體的制備在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)產(chǎn)生人抗體的方法是眾所周知的(例如參閱美國(guó)第6，596，541 號(hào)專(zhuān)利，Regeneron Pharmaceuticals, VEL0CIMMUNE )。VELOCIMMUNE 技術(shù)涉及到這樣一種轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生該小鼠的基因組包含一些與內(nèi)源小鼠恒定區(qū)基因座有效地連接 (operably linked)的人重鏈和輕鏈可變區(qū)，使得該小鼠能響應(yīng)抗原刺激而產(chǎn)生一種包含人可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的抗體。將編碼該抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)的DNA分離出來(lái)，并與編碼人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的DNA有效地連接。然后在能夠表達(dá)完全人抗體的細(xì)胞中表達(dá)該DNA。在具體的實(shí)施方案中，該細(xì)胞是一種CHO細(xì)胞?？贵w可在治療過(guò)程中用于阻斷配體-受體之間的相互作用或抑制受體組分之間的相互作用，而不是通過(guò)固定補(bǔ)體和參與補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(CDC)來(lái)殺滅細(xì)胞，或通過(guò)抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ACDC)來(lái)殺滅細(xì)胞。因此，抗體的恒定區(qū)對(duì)于抗體固定補(bǔ)體和介導(dǎo)細(xì)胞依賴(lài)性細(xì)胞毒性的能力是重要的。因此，可根據(jù)是否需要抗體介導(dǎo)細(xì)胞毒性來(lái)選擇抗體的同型。人抗體可以?xún)煞N與鉸鏈異質(zhì)性有關(guān)的形式存在。在一種形式中，抗體分子包含一種約150-160kDa的穩(wěn)定的四鏈構(gòu)建物，其中兩個(gè)二聚體通過(guò)一個(gè)重鏈間的二硫鍵連接在一起。在第二種形式中，該二聚體不是通過(guò)重鏈間的二硫鍵連接在一起，而是形成了一種由共價(jià)偶聯(lián)的輕鏈和重鏈(半抗體)組成的約75-80kDa的分子。這兩種形式的分離一直極為困難，甚至在親和純化之后也是如此。第二種形式在各種完整IgG同型中的出現(xiàn)頻率，是由于但不限于與抗體的鉸鏈區(qū)同型相關(guān)的結(jié)構(gòu)差異。人IgG4鉸鏈的鉸鏈區(qū)之單個(gè)氨基酸取代可將第二種形式(Angal et al. (1993)Molecular Immunology30 105)的出現(xiàn)頻度顯著地降低到利用人IgGl鉸鏈所觀(guān)察到的水平。本發(fā)明包括在鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)或CH3區(qū)中含有一個(gè)或多個(gè)突變的抗體。所述的突變可能是合乎需要的，例如在生產(chǎn)中用于提高所需抗體形式的產(chǎn)率。 通常，用所研究抗原沖擊致敏VEL0CIMMUNE 小鼠，并從表達(dá)抗體的小鼠回收淋巴細(xì)胞(如B細(xì)胞)。淋巴細(xì)胞可與一個(gè)骨髓瘤細(xì)胞系融合來(lái)制備永生雜交瘤細(xì)胞系，然后對(duì)這種雜交瘤細(xì)胞系進(jìn)行篩選，以識(shí)別能產(chǎn)生對(duì)相關(guān)抗原具有特異性之抗體的雜交瘤細(xì)胞系?？蓪⒕幋a重鏈和輕鏈可變區(qū)的DNA分離出來(lái)，并與合乎需要的重鏈和輕鏈的同型恒定區(qū)連接。這種抗體蛋白可在一種細(xì)胞如CHO細(xì)胞中產(chǎn)生。另外，編碼抗原特異的嵌合抗體或輕鏈和重鏈可變域的DNA可直接從抗原特異的淋巴細(xì)胞中分離出來(lái)。首先，分離包含一個(gè)人可變區(qū)和一個(gè)小鼠恒定區(qū)的抗體的高親和力嵌合抗體。如下所述，根據(jù)所需的特點(diǎn)，包括親和力、選擇性、表位等鑒定和選擇抗體。用合乎需要的人恒定區(qū)取代小鼠恒定區(qū)，以產(chǎn)生本發(fā)明之完全人抗體，例如野生型的或經(jīng)修飾的IgGl或 IgG4(例如SEQ ID NO :751,752,753) 0所選擇的恒定區(qū)可根據(jù)特定的用途而改變，而高親和力抗原結(jié)合特性和靶標(biāo)特異性特性則存在于可變區(qū)中。
表位作圖和相關(guān)技術(shù)為篩選能與特定表位結(jié)合的抗體(例如能阻斷IgE與其高親和力受體結(jié)合的抗體)，可進(jìn)行常規(guī)的交聯(lián)-阻斷分析，如 Antibodies，Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb.，NY)中所述。其它方法包括丙氨酸掃描突變體分析、肽印跡分析(Reineke (2004)Methods Mol Biol 248 :443-63)或肽切割分析。另外，還可采用諸如抗原的表位切除、表位提取和化學(xué)修飾的方法(TomerQOOOWrotein Science9 :487-496)。術(shù)語(yǔ)“表位”是指抗原上B細(xì)胞和/或T細(xì)胞對(duì)其作出響應(yīng)的位點(diǎn)。B細(xì)胞表位可由毗連的氨基酸形成，或者由通過(guò)蛋白質(zhì)的三級(jí)折迭而并列在一起的非毗連氨基酸形成。 由毗連氨基酸形成的表位在接觸變性溶劑時(shí)通?？傻靡员Ａ簦ㄟ^(guò)三級(jí)折迭形成的表位在用變性溶劑處理時(shí)通常會(huì)失去。表位通常包括至少3個(gè)、更經(jīng)常是至少5個(gè)或8-10個(gè)以獨(dú)特空間構(gòu)象出現(xiàn)的氨基酸。修飾輔助概況分析(Modification-Assisted Profiling，MAP)，也被稱(chēng)為基于抗原結(jié)構(gòu)的抗體譜分析(Antigen Structure-basedAntibody Profiling，ASAP)，是一種根據(jù)每種抗體與經(jīng)化學(xué)或酶學(xué)修飾的抗原表面的結(jié)合狀況的相似性對(duì)大量的抗同一抗原的單克隆抗體(mAbs)進(jìn)行分類(lèi)的方法(美國(guó)專(zhuān)利2004/0101920號(hào))。每一類(lèi)均可反映與另一類(lèi)所代表的表位截然不同或部分重迭的獨(dú)特表位。這種技術(shù)可以快速過(guò)濾遺傳上相同的 mAbs，從而可使鑒定工作集中在遺傳上不同的mAbs上。當(dāng)應(yīng)用于雜交瘤篩選時(shí)，MAP有助于鑒定某些罕見(jiàn)雜交瘤克隆，后者能產(chǎn)生具有所需特性的mAbs。MAP可用來(lái)將本發(fā)明的抗 PCSK9mAbs抗體分類(lèi)成結(jié)合不同表位的mAbs抗體組。在各種各樣的實(shí)施方案中，抗hPCSK9抗體或抗體的抗原結(jié)合片段與催化域(SEQ ID NO 755的約153至425)內(nèi)的一個(gè)表位結(jié)合；更具體的是，與從約153至約250或從約 250至約425的片段內(nèi)的一個(gè)表位結(jié)合；更具體的是，本發(fā)明之抗體或抗體片段與從約153 至約208、從約200至約260、從約250至約300、從約275至約325、從約300至約360、從約 350至約400，和/或從約375至約425的片段內(nèi)一個(gè)表位結(jié)合。在各種各樣的實(shí)施方案中，抗hPCSK9抗體或抗體的抗原結(jié)合片段與前肽域(SEQ ID NO 755的31至152殘基)內(nèi)的一個(gè)表位結(jié)合；更具體的是，與從約31殘基至約90殘基或從約90殘基至約152殘基內(nèi)一個(gè)表位結(jié)合；更具體的是，本發(fā)明之抗體或抗體片段與從約31殘基至約60殘基、從約60殘基至約90殘基、從約85殘基至約110殘基、從約100 殘基至約130殘基、從約125殘基至約150殘基、從約135殘基至約152殘基，和/或從約 140殘基至約152殘基的片段內(nèi)的一個(gè)表位結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，抗hPCSK9抗體或抗體的抗原結(jié)合片段與C端域(SEQ ID NO 755的4 至692殘基)內(nèi)的一個(gè)表位結(jié)合；更具體的是，與從約4 殘基至約570殘基或從約570殘基至約692殘基內(nèi)一個(gè)表位結(jié)合；更具體的是，本發(fā)明之抗體或抗體片段與從約 450殘基至約500殘基、從約500殘基至約550殘基、從約550殘基至約600殘基，和/或從約600殘基至約692殘基的片段內(nèi)的一個(gè)表位結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，抗體或抗體片段與一個(gè)表位結(jié)合，該表位包括催化域、前肽域或C端域內(nèi)和/或兩個(gè)或三個(gè)不同域內(nèi)的一個(gè)以上所列舉表位(例如催化域和C端域內(nèi)， 或前肽域和催化域內(nèi)，或前肽域、催化域和C端域內(nèi)的表位)。在某些實(shí)施方案中，該抗體或抗原結(jié)合片段與包含hPCSK9 (SEQ ID NO :755)的氨基酸殘基238的hPCSK9上的一個(gè)表位結(jié)合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表27)顯示，當(dāng)D238發(fā)生突變時(shí)， mAb 316P的Kd顯示結(jié)合親和力下降> 400倍( IxlO^9M至 4IOxIO^9M)且T172下降> 30倍(從 37至 lmin)。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，該突變是D238R。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明之抗體或抗原結(jié)合片段與在153、159、238和343位置上含有兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基酸殘基的hPCSK9的一個(gè)表位結(jié)合。如下所示，氨基酸殘基153、159或343的突變導(dǎo)致了親和力下降約5至10倍或T172 類(lèi)似的縮短。在一些特殊的實(shí)施方案中，突變?yōu)镾153R、E159R和/或D343R。在某些實(shí)施方案中，該抗體或抗原結(jié)合片段與包含hPCSK9 (SEQ ID NO :755)的氨基酸殘基366的hPCSK9上的一個(gè)表位結(jié)合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表27)顯示，當(dāng)E366發(fā)生突變時(shí)， mAb 300N的親和力顯示約50倍的下降( · 7x10-^9M至 36Χ1(Γ9Μ)且Τ1/2也類(lèi)似地縮短 (從 120至 2min)。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，該突變是E366K。本發(fā)明包括與本文所述的任何特殊代表性抗體一樣與表位結(jié)合的抗PCSK9抗體。 類(lèi)似地，本發(fā)明還包括與本文所述的任何特殊代表性抗體在與PCSK9或PCSK9片段結(jié)合過(guò)程中競(jìng)爭(zhēng)的抗PCSK9抗體。使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的常規(guī)方法，可以容易地確定一種抗體是否與本發(fā)明之對(duì)照抗PCSK9抗體一樣與同樣的表位結(jié)合，或在結(jié)合過(guò)程中競(jìng)爭(zhēng)。例如，為了確定一種試驗(yàn)抗體是否與本發(fā)明之對(duì)照抗PCSK9抗體一樣與同樣的表位結(jié)合，讓該對(duì)照抗體與PCSK9蛋白或肽在飽和條件下結(jié)合。然后，評(píng)估試驗(yàn)抗體與該P(yáng)CSK9分子結(jié)合的能力。如果該試驗(yàn)抗體在與對(duì)照抗PCSK9抗體飽和結(jié)合之后能夠與PCSK9結(jié)合，就可得出結(jié)論，該試驗(yàn)抗體和對(duì)照抗 PCSK9抗體與不同的表位結(jié)合。在另一方面，如果該試驗(yàn)抗體在與對(duì)照抗PCSK9抗體飽和結(jié)合之后不能與PCSK9分子結(jié)合，那么該試驗(yàn)抗體就可與本發(fā)明之對(duì)照抗PCSK9抗體所結(jié)合的同一表位結(jié)合。為了確定一種抗體是否與對(duì)照抗PCSK9抗體在結(jié)合過(guò)程中競(jìng)爭(zhēng)，在兩個(gè)方向?qū)嵤┥鲜鼋Y(jié)合方法在第一個(gè)方向，讓對(duì)照抗體與PCSK9分子在飽和條件下結(jié)合，然后評(píng)估試驗(yàn)抗體與該P(yáng)CSK9分子的結(jié)合。在第二個(gè)方向，讓試驗(yàn)抗體與PCSK9分子在飽和條件下結(jié)合， 然后評(píng)估對(duì)照抗體與該P(yáng)CSK9分子的結(jié)合。如果在這兩個(gè)方向只有第一個(gè)(飽和)抗體能夠與PCSK9分子結(jié)合，那就可以得出結(jié)論，該試驗(yàn)抗體與對(duì)照抗體在與PCSK9結(jié)合的過(guò)程中競(jìng)爭(zhēng)。如同本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所能理解的，與對(duì)照抗體在結(jié)合過(guò)程中競(jìng)爭(zhēng)的抗體未必與對(duì)照抗體所結(jié)合的同一表位結(jié)合，但可與一個(gè)重迭或鄰近的表位結(jié)合而在空間上阻斷該對(duì)照抗體。如果每個(gè)抗體競(jìng)爭(zhēng)性地抑制(阻斷)另一抗體與抗原的結(jié)合，兩個(gè)抗體就會(huì)與同一或重迭的表位結(jié)合。換言之，一種1倍、5倍、10倍、20倍或100倍過(guò)量的抗體將抑制另一抗體的結(jié)合達(dá)至少50%，但較佳的是75%，90%或甚至99%，如競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析所測(cè)量(參閱例如 Junghans et al. ,Cancer Res. 199050:1495-1502)?；蛘撸绻乖薪档突蛳环N抗體結(jié)合的幾乎所有的氨基酸突變能降低或消除另一種抗體的結(jié)合，則兩種抗體具有相同的表位。如果降低或消除一種抗體結(jié)合的某些氨基酸突變也能降低或消除另一種抗體的結(jié)合，則兩種抗體具有重迭的表位。然后可進(jìn)行其它常規(guī)實(shí)驗(yàn)(例如肽突變和結(jié)合分析)以確定是否觀(guān)察到的試驗(yàn)抗體的結(jié)合不足實(shí)際上是由于與對(duì)照抗體所結(jié)合的同一表位結(jié)合，或是否空間阻斷(或另一現(xiàn)象)是觀(guān)察到的結(jié)合不足的原因。這類(lèi)實(shí)驗(yàn)可采用ELISA、RIA、表面等離子體共振技術(shù)、 流式細(xì)胞計(jì)量法或本領(lǐng)域內(nèi)所具備的任何其它定量或定性的抗體結(jié)合分析。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種抗PCSK9抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，它與序列號(hào)為SEQ ID N0:755的PCSK9蛋白結(jié)合，其中該抗體或其片段與PCSK9和 PCSK9蛋白變體之間的結(jié)合低于該抗體或片段與序列號(hào)為SEQ ID NO :755的PCSK9蛋白之間的結(jié)合的50%。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，該P(yáng)CSK9蛋白變體在153、159、238和343位置包含至少一個(gè)殘基突變。在一個(gè)更特殊的實(shí)施方案中，至少一個(gè)突變是S153R、E159R、 D238R和D343R。在另一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，該P(yáng)CSK9蛋白變體包含至少一個(gè)位于366的突變。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，該P(yáng)CSK9蛋白變體在147、366和380位置包含至少一個(gè)殘基突變。在一個(gè)更特殊的實(shí)施方案中，該突變是S147F、E366K和/或V380M。
免疫偶聯(lián)物本發(fā)明包括一種與治療基團(tuán)(“免疫偶聯(lián)物”)如細(xì)胞毒素、化療藥物、免疫抑制劑或放射性同位素等偶聯(lián)的人抗PCSK9單克隆抗體。細(xì)胞毒素包括任何損害細(xì)胞的試劑。 適宜于形成免疫偶聯(lián)物的細(xì)胞毒素和化療劑的例子是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的。參閱如WO 05/103081。雙特異性本發(fā)明之抗體可以是單特異性的、雙特異性的，或多特異性的。多特異性mAbs抗體可以針對(duì)同一目標(biāo)多肽的不同表位，或可含有針對(duì)一個(gè)以上目標(biāo)多肽的抗原結(jié)合域。參閱，如 Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147 :60-69。人抗 PCSK9 mAbs 抗體可連接到另一個(gè)功能分子，如另一個(gè)肽或蛋白質(zhì)上，或與之共同表達(dá)。例如，一種抗體或其片段可與一種或多種其它分子實(shí)體如另一種抗體或抗體片段實(shí)現(xiàn)功能性(例如以化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價(jià)鍵連接或其它方式)連接，以產(chǎn)生具有第二種結(jié)合特異性的雙特異性或多特異性抗體?？捎糜诒景l(fā)明的代表性雙特異性抗體形式涉及使用第一個(gè)免疫球蛋白(Ig)CH3 結(jié)構(gòu)域和第二個(gè)Ig CH3結(jié)構(gòu)域，其中第一個(gè)和第二個(gè)Ig CH3結(jié)構(gòu)域相互之間相差至少一個(gè)氨基酸，且與無(wú)氨基酸差別的雙特異性抗體相比，其中至少一個(gè)氨基酸的差別降低了雙特異性抗體與蛋白A的結(jié)合力。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一個(gè)Ig CH3結(jié)構(gòu)域與蛋白A結(jié)合， 第二個(gè)Ig CH3結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)降低或消除與蛋白A結(jié)合的突變，例如一個(gè)H95R修飾(按照IMGT表現(xiàn)序列編號(hào)法；按照歐盟編號(hào)法則為H435R)。第二個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域可進(jìn)一步包含一個(gè)Y96F修飾(按照IMGT編號(hào)法；按照歐盟編號(hào)法則為W36F)?？稍诘诙€(gè)CH3域內(nèi)找到的其它修飾包括在IgGl抗體的情況下為D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I (按照 IMGT 編號(hào)法；按照歐盟編號(hào)法則為 D356E、L358M、N384S、K392N、V397M 和 V422I)；在 IgG2 抗體的情況下為N44S、K52N和V82I (按照IMGT編號(hào)法；按照歐盟編號(hào)法則為N384S、K392N 和 V422I)；以及在 IgG4 抗體的情況下為 Q15R、N44S、K52N、V57M、R6I、E79Q 和 V82I (按照 IMGT 編號(hào)法；按照歐盟編號(hào)法則為 Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q 和 V422I)。 上述雙特異性抗體的各種變化形式均被認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
生物等效物本發(fā)明之抗PCSK9抗體和抗體片段包括某些蛋白，這些蛋白含有不同于所述mAbs 抗體的氨基酸序列的氨基酸序列，但保留了與人PCSK9結(jié)合的能力。當(dāng)與母體序列比較時(shí)， 這類(lèi)變異的mAbs抗體和抗體片段包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的添加、缺失或取代，但顯示了與所述mAbs抗體的生物活性基本上相當(dāng)?shù)纳锘钚浴ｎ?lèi)似地，當(dāng)與所披露序列比較時(shí)，本發(fā)明之編碼抗PCSK9抗體的DNA序列含有的序列包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸的添加、缺失或取代， 但可編碼與本發(fā)明之抗PCSK9抗體或抗體片段基本上生物等效的抗PCSK9抗體或抗體片段。這類(lèi)變異氨基酸和DNA序列的實(shí)例已在上面討論。如果兩種抗原結(jié)合蛋白或抗體是醫(yī)藥等效物或醫(yī)藥替代物，當(dāng)在相似實(shí)驗(yàn)條件下無(wú)論以單劑或以多劑方式以相同摩爾劑量給藥時(shí)，其吸收速率和程度均未顯示顯著差別， 則它們被認(rèn)為是生物等效的。某些抗體如果它們的吸收程度相當(dāng)?shù)账俾什幌喈?dāng)，它們將被認(rèn)為是等效物或藥物替代物，并仍可被認(rèn)為是生物等效的，因?yàn)檫@種吸收速率的差別是有意設(shè)計(jì)的并反映在標(biāo)簽上，這種差別對(duì)于達(dá)到有效的體內(nèi)藥物濃度是非關(guān)鍵性的(例如對(duì)于慢性用途)，并被認(rèn)為對(duì)于所研究的特定醫(yī)藥產(chǎn)品在醫(yī)學(xué)上是無(wú)關(guān)重要的。在一個(gè)實(shí)施方案中，如果兩種抗原結(jié)合蛋白在安全性、純度和藥效方面沒(méi)有臨床意義上的差別，則它們是生物等效的。在一個(gè)實(shí)施方案中，如果一名患者可以在對(duì)照產(chǎn)品和生物產(chǎn)品之間轉(zhuǎn)換一次或多次而不良副作用的風(fēng)險(xiǎn)并未如預(yù)期那樣增加，包括與無(wú)這種轉(zhuǎn)換的連續(xù)治療相比在免疫原性方面無(wú)顯著的臨床變化或效率降低，則兩種抗原結(jié)合蛋白就是生物等效的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，如果兩種抗原結(jié)合蛋白在使用條件下都以一種或多種共同的作用機(jī)制起作用，且這類(lèi)機(jī)制是眾所周知的，則它們就是生物等效的。生物等效性可以體內(nèi)和體外的方法演示。生物等效性的測(cè)量包括，例如，(a) 一種在人類(lèi)或其它哺乳類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)的試驗(yàn)，其中血液、血漿、血清或其它生物體液中抗體或其代謝物的濃度是作為時(shí)間的函數(shù)測(cè)定的；(b) —種體外試驗(yàn)，該試驗(yàn)已與人的體內(nèi)試驗(yàn)生物利用率數(shù)據(jù)建立相關(guān)聯(lián)系并可根據(jù)人的體內(nèi)試驗(yàn)生物利用率數(shù)據(jù)合理預(yù)測(cè)；(c) 一種人類(lèi)或其它哺乳類(lèi)動(dòng)物的體內(nèi)試驗(yàn)，其中抗體(或其目標(biāo))適當(dāng)?shù)募毙运幚碜饔檬亲鳛闀r(shí)間的函數(shù)測(cè)定的；以及(d) —種控制良好的臨床試驗(yàn)，該試驗(yàn)確定抗體的安全性、有效性，或生物利用率或生物等效性。本發(fā)明抗PCSK9抗體的生物等效變體可通過(guò)例如取代生物活性不需要的各種殘基或序列或刪除生物活性不需要的端部或內(nèi)部殘基或序列而構(gòu)建。例如，對(duì)于生物活性并非必需的半胱氨酸殘基可被刪除或被其它氨基酸取代，以防在復(fù)原時(shí)形成不必要或不正確的分子內(nèi)二硫化物橋。
治療群體本發(fā)明提供了一些治療方法以治療需要使用本發(fā)明組合物的人類(lèi)患者。盡管改變生活方式和常規(guī)藥物治療往往能成功地降低膽固醇水平，但并非所有患者都能用這些手段達(dá)到推薦的目標(biāo)膽固醇水平。盡管積極地采用常規(guī)治療，但各種各樣的癥狀，如家族性高膽固醇血癥(FH)，似乎會(huì)抵制降低LDL-C水平的措施。純合和雜合家族性高膽固醇血癥患者(hora、heFH)是與過(guò)早出現(xiàn)的動(dòng)脈粥樣硬化血管疾病相關(guān)的癥狀。但是，診斷為 hoFH的患者在很大程度上對(duì)常規(guī)的藥物治療無(wú)反應(yīng)且只有有限的治療選擇。具體來(lái)說(shuō)，采用抑制膽固醇合成和上調(diào)肝臟LDL受體而降低LDL-C的抑制素進(jìn)行治療，對(duì)LDL受體不存在或有缺陷的患者效果甚小。據(jù)最近報(bào)道，在用最高劑量抑制素治療的基因型確定的hoFH 患者中，平均LDL-C下降還不到20%。在此治療方案基礎(chǔ)上增加IOmg/日的依澤替米貝 (ezetimibe)導(dǎo)致LDL-C水平總共下降了 27 %，但離最佳效果仍然相距甚遠(yuǎn)。類(lèi)似地，許多患者對(duì)抑制素?zé)o反應(yīng)、用抑制素治療對(duì)病情的控制較差，或不能耐受抑制素治療；一般來(lái)說(shuō)，這些患者用其它治療方式不能達(dá)到對(duì)膽固醇的控制。對(duì)于能克服現(xiàn)有治療措施之缺點(diǎn)的新治療方法有著很大的尚未滿(mǎn)足的需要?？梢员景l(fā)明之方法治療的具體人群包括需要LDL血漿置換的患者、PCSK9激活 (GOF)突變的患者、雜合家族性高膽固醇血癥患者(heFH)；不耐受抑制素或抑制素?zé)o法控制的原發(fā)性高膽固醇血癥患者；以及具有患高膽固醇血癥的危險(xiǎn)但可進(jìn)行預(yù)防性治療的患
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治療給藥和配方本發(fā)明提供了一些含有本發(fā)明之抗PCSK9抗體或其抗原結(jié)合片段的治療組合物。 本發(fā)明之治療組合物將與適宜的載體、賦形劑以及其它加入配方中改善轉(zhuǎn)移、遞送、耐受性等的制劑一起施用。在藥劑化學(xué)師所熟知的處方集里可以找到大量的適宜配方。雷氏藥學(xué)大全 -Remington' s Pharmaceutical SciencesiMack Publishing Company,Easton,PA. 0 這些配方包括，如粉劑、糊劑、油膏、凝膠、蠟劑、油劑、脂類(lèi)、含有脂(陽(yáng)離子或陰離子)的泡囊(如LIP0FECTIN )、DNA偶聯(lián)物、無(wú)水吸收性糊劑、水包油或油包水乳劑、乳膠狀碳蠟 (各種分子量的聚乙二醇)、半固體狀凝膠以及含有聚乙二醇的半固體狀混合物。還可參閱Powell et al. Compendium of Excipients for ParenteralFormulations (非腸道用配方賦形劑概論)，PDA (1998) J Pharm SciTechnol 52:238-311。其劑量可根據(jù)即將受藥的受試者的年齡和體形大小、目標(biāo)疾病、病癥、給藥途徑等因素而改變。當(dāng)本發(fā)明之抗體用于治療與PCSK9相關(guān)的各種病癥和疾病，包括高膽固醇血癥、與LDL和載脂蛋白B相關(guān)的疾病，以及脂質(zhì)代謝疾病等時(shí)，對(duì)于一名成年患者來(lái)說(shuō)以靜脈輸入本發(fā)明之抗體是有利的。通常是按照約0. 01至約20mg/kg體重，較佳的是按照約 0. 02至7、約0. 03至約5，或約0. 05至約;3mg/kg體重的單一劑量輸入。取決于病癥的嚴(yán)重程度，治療的頻率和持續(xù)時(shí)間可以調(diào)節(jié)。各種給藥系統(tǒng)是眾所周知的并可用于本發(fā)明之醫(yī)藥組合物的給藥，例如封裝于脂質(zhì)體、微粒、微膠囊中、能表達(dá)突變體病毒的重組細(xì)胞、受體介導(dǎo)的胞吞作用(參閱例如mi et al. (1987) J. Biol. Chem. 262 =4429-4432) 0給藥方法包括但不限于皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹腔內(nèi)、 靜脈、皮下、經(jīng)鼻、硬膜外以及經(jīng)口給藥。該組合物可以任何方便的途徑給藥，例如，輸注或快速注射，經(jīng)上皮或粘膜(例如口腔黏膜、直腸和腸黏膜等)吸收，并可與其它生物活性劑一起給藥。給藥方式可以是全身性或局部性的。該醫(yī)藥組合物也可以微囊尤其是脂質(zhì)體形式給藥(參閱Langer (1990) Science 249 :1527-1533 ；Treat et al. (1989)in Liposomes inthe Therapy of Infectious Disease and Cancer (月旨質(zhì)體用于傳染病禾口癌癥治療)，Lopez-Berestein and Fidler (eds. ), Liss, New York, pp.353-365 ；Lopez-Berestein, ibid. , pp.317-327 ；一般參閱同上)。在某些情況下，該醫(yī)藥組合物可以一種控制性釋放系統(tǒng)給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中， 可使用一個(gè)泵(參閱 Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14 :201)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可采用聚合物材料；參閱 Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRCPres.，Boca Raton, Florida (1974)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，可將一種控制釋放系統(tǒng)置于該組合物目標(biāo)的附件，從而只需要全身性劑量的一部分(參閱例如， Goodson, in Medical Applications of Controlled Release (控制釋放的醫(yī)學(xué)應(yīng)用)，出處同上，vol. 2，pp. 115-138，1984)?？勺⑸渲苿┛砂o脈注射、皮下、皮內(nèi)和肌內(nèi)注射、滴注輸液等劑型。這些可注射制劑可以公知的方法制備。例如，可以將上述抗體或其鹽溶解、懸浮或乳化在無(wú)菌水介質(zhì)或通常用于注射的油性介質(zhì)中，以此方式制備該可注射制劑。作為注射用的水介質(zhì)有例如生理鹽水、含葡萄糖和其它助劑的等滲溶液等，可結(jié)合使用適當(dāng)?shù)脑鋈軇?，如?如乙醇)、 多元醇(如丙二醇、聚乙二醇)，非離子型表面活性劑[例如聚山梨醇酯80、HC0_50(氫化蓖麻油的聚氧乙烯(50摩爾)加合物)]等。作為油性介質(zhì)，可采用例如芝麻油、豆油等，可結(jié)合使用增溶劑，如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等。如此制備的注射液最好是裝入一種適當(dāng)?shù)陌碴称恐?。本發(fā)明之醫(yī)藥組合物可用標(biāo)準(zhǔn)的針頭和針筒經(jīng)皮下或靜脈注射。此外，對(duì)于皮下給藥，一種筆型給藥裝置可方便地用于本發(fā)明之醫(yī)藥組合物的給藥。這種筆型給藥裝置可以重復(fù)使用或一次性使用。可重復(fù)使用的筆型給藥裝置一般采用一種可更換的含醫(yī)藥組合物的藥筒。一旦藥筒內(nèi)所有醫(yī)藥組合物均已輸出、藥筒變空，則可方便地丟棄空藥筒，并用一個(gè)含醫(yī)藥組合物的新藥筒取代。該筆型給藥裝置就可重復(fù)使用。在一次性使用的筆型給藥裝置中，沒(méi)有可更換的藥筒。而是，該一次性使用的筆型給藥裝置有一個(gè)預(yù)先充滿(mǎn)醫(yī)藥組合物的貯液器。一旦該貯液器內(nèi)藥物組合物用完，整個(gè)裝置則被丟棄。許多可重復(fù)使用的筆型和自動(dòng)注射給藥裝置已用于本發(fā)明之醫(yī)藥組合物的皮下給藥。其例子包括但當(dāng)然不限于A(yíng)UT0PENTM(0wenMumford，Inc.，Woodstock，英國(guó))、 DISETR0NIC 筆(DisetronicMedical Systems，Burghdorf，瑞士)、HUMALOG MIX 75/25 筆、HUMAL0G 筆、HUMALIN 70/30 筆(Eli Lilly and Co.，印第安納州印第安納波利斯)、N0V0PEN I、II 禾Π III 型(Novo Nordisk，哥本哈根，丹麥)、N0V0PEN JUNIOR (Novo Nordisk，哥本哈根，丹麥)、BD 筆(Becton Dickinson，新澤西州富蘭克林湖)、0ΡΤΙΡΕΝ 、 0ΡΤΙΡΕΝ PRO 、OPTIPEN STARLET ，以及 0PTICLIK (sanofi-aventis，德國(guó)法蘭克福)，此處僅列舉幾個(gè)品牌。用于本發(fā)明之醫(yī)藥組合物皮下給藥的一次性使用的筆型給藥裝置的例子包括但當(dāng)然不限于 S0L0STAR 筆(sanofi-aventis)，F(xiàn)LEXPEN (Novo Nordisk)，以及 KWIKPEN (Eli Lilly)。有利的是，上述口服或注射用醫(yī)藥組合物是制備成單位劑量的劑型，以包含一定劑量的活性成分。這種單位劑量的劑型包括例如片劑、丸劑、膠囊、注射液(安瓿)、栓劑等。 單位劑量的上述抗體含量一般為每劑約5至約500mg ；尤其是注射劑型，首選的是上述抗體含量為約5至約lOOmg，其它劑型中抗體含量為約10至約250mg。本發(fā)明提供了一些治療方法，其中將本發(fā)明之抗體或抗體片段用于治療各種涉及hPCSK9的高膽固醇血癥。本發(fā)明之抗PCSK9抗體或抗體片段對(duì)于高膽固醇血癥及類(lèi)似病癥的治療是尤其有用的。復(fù)合療法可包括本發(fā)明之抗PCSK9抗體與例如一種或多種藥劑結(jié)合，該藥劑(1)通過(guò)抑制3-羥基-3-甲基戊二酰(HMG)-輔酶A(CoA)還原酶能夠誘導(dǎo)膽固醇合成的細(xì)胞清除，如西利維司汀(cerivastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、 辛伐他汀(simvastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、瑞舒伐它汀(rosuvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(Iovastatin)、普伐他汀(pravastatin) ； (2)能夠抑制膽固醇吸收和/或膽汁酸再吸收；C3)能夠增加脂蛋白分解代謝(如煙酸)；以及在膽固醇如22-羥基膽固醇的清除過(guò)程中起作用的LXR轉(zhuǎn)錄因子的活化劑，或一種固定的結(jié)合如依澤替米貝(ezetimibe)加辛伐他汀(simvastatin)；—種抑制素加膽汁樹(shù)脂(如消膽胺 (cholestyramine)、降脂樹(shù)脂 II (colestipol)、考來(lái)維侖(colesevelam)，煙酸與一種抑制素的固定結(jié)合(如煙酸加洛伐他汀)；或與其它降脂質(zhì)藥劑如歐米加-3-脂肪酸乙酯(如 omacor)的固定結(jié)合。
實(shí)施例舉出以下實(shí)施例是為了向本領(lǐng)域一般技術(shù)人員就如何利用本發(fā)明之方法和組合物提供一個(gè)完整的披露和說(shuō)明，并非是為了限制被發(fā)明者視為其發(fā)明的范圍。已作出許多努力以確保所用數(shù)字的準(zhǔn)確性，但也應(yīng)考慮到某些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。除非另有說(shuō)明，分子量是指平均分子量，溫度是指攝氏度，壓力是指大氣壓或接近大氣壓。
實(shí)施例1 抗人PCSK9的人抗體的產(chǎn)生將VEL0CIMMUNE 小鼠用人PCSK9免疫，并以抗原特異免疫測(cè)定法用這些小鼠的血清以監(jiān)測(cè)抗原免疫反應(yīng)。從顯示較高抗hPCSK9抗體效價(jià)的免疫小鼠的脾臟收獲表達(dá)B細(xì)胞的抗hPCSK9，并與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合以形成雜交瘤。使用如下所述的分析法篩選該雜交瘤以鑒定表達(dá)hPCSK9特異性抗體的細(xì)胞系。該分析法鑒定了幾種產(chǎn)生嵌合的抗hPCSK9抗體的細(xì)胞系，這些抗體分別以 H1M300、H1M504、H1M505、H1M500、H1M497、H1M498、H1M494、 H1M309、H1M312、H1M499、H1M493、H1M496、H1M503、H1M502、H1M508、H1M495 以及 H1M492 表不。如美國(guó)專(zhuān)利2007/(^80945Α1中所述，人PCSK9特異性抗體還可從經(jīng)抗原免疫的B 細(xì)胞直接分離而不與骨髓瘤細(xì)胞融合。克隆重鏈和輕鏈可變域以產(chǎn)生完全人抗hPCSK9抗體，分別 H1H313、H1H314、H1H315、H1H316、H1H317、H1H318、H1H320、H1H321 以及 H1H334 表示。表達(dá)這些抗體的穩(wěn)定的重組CHO細(xì)胞系得以確定。
實(shí)施例2 基因利用分析為了分析所產(chǎn)生mAbs的結(jié)構(gòu)，對(duì)編碼抗體可變區(qū)的核酸進(jìn)行了克隆和測(cè)序。經(jīng) N-端氨基酸測(cè)序證實(shí)了預(yù)測(cè)的可變區(qū)氨基酸序列。從mAbs的核酸序列和預(yù)測(cè)的氨基酸序列出發(fā)，為每種抗體鏈鑒定了基因的用途。
表1抗體重鏈可變區(qū)輕鏈可變區(qū)VHDJHVKJKH1H3133-131-2643-153H1H3143-333-341-52H1H3153-333-344-11H1H3163-237-2724-12H1H3173-131-2641-61H1H3184-593-1061-91H1H3201-182-262-301H1H3212-51-762-284H1H3342-56-662-284H1M3003-72-862-284H1M5043-302-862-284H1M5053-302-862-284H1M5002-55-562-284H1M4971-182-262-302H1M4983-212-241-52H1M4943-115-1263-204H1M3093-216-1341-51H1M3123-216-1341-51H1M4993-216-1341-51H1M4933-216-1341-51H1M4963-136-1943-153H1M5031-182-262-281H1M5023-136-1343-153H1M5083-136-1343-153H1M4953-94-1761-93H1M4923-233-323-204
實(shí)施方案3 抗原結(jié)合親和力測(cè)定
hPCSK9與上述雜交瘤細(xì)胞系所產(chǎn)生的mAbs結(jié)合的平衡離解常數(shù)(Kd)是根據(jù)實(shí)時(shí)生物傳感器表面等離子體共振分析(BIAC0RE T100)的表面動(dòng)力學(xué)測(cè)定的。通過(guò)與 BIAC0RE 芯片直接化學(xué)偶聯(lián)而產(chǎn)生山羊抗小鼠IgG多克隆抗體，以4μ Ι/min的流量將每種抗體捕獲在其表面上達(dá)90秒鐘，以形成捕獲抗體表面。將濃度為50nM或12. 5nM的 hPCSK9-myc-myc-his(hPCSK9-mmh)注射在該捕獲抗體的表面上,流量為50 μ 1/min，注射 300秒鐘，并于25°C或37°C監(jiān)測(cè)抗原-抗體離解過(guò)程達(dá)15分鐘(KD = pM ；T1/2 = min)。 表權(quán)利要求
1.一種與人類(lèi)前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(hPCSK9)特異性結(jié)合的人抗體或人抗體的抗原結(jié)合片段，它具有以下一種或多種特征(i)相對(duì)于給藥前水平，能夠使血清總膽固醇含量下降至少約25至35%，并保持這種下降趨勢(shì)達(dá)至少對(duì)天；(ii)相對(duì)于給藥前水平，能夠使血清LDL膽固醇含量下降至少約65至80%，并保持這種下降趨勢(shì)達(dá)至少M(fèi)天，或能夠使血清LDL膽固醇含量下降至少約40至70%，并保持這種下降趨勢(shì)達(dá)至少60至90天；(iii)相對(duì)于給藥前水平，能夠使血清甘油三酯含量下降至少約25至40%；(iv)達(dá)到(i)至(iii)中的一項(xiàng)或多項(xiàng)而不降低血清HDL膽固醇含量，或相對(duì)于給藥前水平降低血清HDL膽固醇含量不超過(guò)5% ；(ν)達(dá)到(i)至(iii)中的一項(xiàng)或多項(xiàng)但根據(jù)ALT和AST測(cè)量確定，對(duì)肝功能影響很小或沒(méi)有可測(cè)量的影響。
2.如權(quán)利要求1所述的抗體或抗原結(jié)合片段，它包括一個(gè)選自下列一組序列的重鏈 CDR3(HCDR3)域SEQ ID NO :8、32、56、80、104、128、 152、176、200、224、248、272、296、320、344、368、392、416、440、464、488、512、536、560、584、 608、632、656、680、704 和 728 ；以及一個(gè)選自下列一組序列的輕鏈 CDR3(LCDR3)域SEQ ID NO :16、40、64、88、112、136、 160、184、208、232、256、280、304、328、352、376、400、424、448、472、496、520、544、568、592、 616、639、664、688、712 以及 736。
3.如權(quán)利要求2所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中HCDR3/IXDR3是SEQID NO :80/88 或 224/232。
4.如權(quán)利要求2所述的抗體或抗原結(jié)合片段，它進(jìn)一步包括一個(gè)選自下列一組序列的重鏈 CDRl (HCDRl)域SEQ ID NO :4、28、52、76、100、124、 148、172、196、220、244、268、292、316、340、364、388、412、436、460、484、508、532、556、580、 604、628、652、676、7000 以及 724 ；一個(gè)選自下列一組序列的重鏈 CDR2(HCDR2)域SEQ ID NO :6、30、M、78、102、126、 150、174、198、222、246、270、294、318、342、366、390、414、438、462、486、510、534、558、582、 606、630、654、678、702 以及 726 ；一個(gè)選自下列一組序列的輕鏈 CDRl (LCDRl)域SEQ ID NO 12、36、60、84、108、132、 156、180、204、228、252、276、300、324、348、372、396、420、444、468、492、516、540、564、588、 612、636、660、684、708 和 732 ；以及一個(gè)選自下列一組序列的輕鏈 CDR2(LCDR2)域SEQ ID NO :14、38、62、86、110、134、 158、182、206、230、254、278、302、326、350、374、398、422、446、470、494、518、542、566、590、 614、638、662、686、710 和 734。
5.如權(quán)利要求4所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中的輕鏈和重鏈CDR序列是選自以下一組序列SEQ ID NO :76、78、80、84、86、88 ；SEQ ID NO :220、222、224、228、230、232。
6.如以上任何一項(xiàng)申請(qǐng)專(zhuān)利范圍所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中HCVR是SEQIDNO 90 或 218，LCVR 是 SEQ ID NO 90 或 218。
7.如權(quán)利要求1所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其包含一個(gè)HCDR3序列和一個(gè)LCDR3序列，其中該 HCDR3 包含一個(gè)結(jié)構(gòu)式為 Xi-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xici-Xii-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20 的氨基酸序列(SEQID NO :747)，其中 X1 是 Ala ；X2 是 Arg 或 Lys ；X3 是 Asp ；X4 是 Ser 或 Ile ；X5 是 Asn 或 Val ；X6 是 Leu 或 Trp ；X7 是 Gly 或 Met ；X8 是 Asn 或 Val ；X9 是 Phe 或Tyr ；X10是Asp ；X11是Leu或Met ；X12是Asp或缺位；X13是Tyr或缺位；X14是Tyr或缺位；X15是Tyr或缺位；X16是Tyr或缺位；X17是Gly或缺位；X18是Met或缺位；X19是Asp或缺位；以及X2°是Val或缺位；以及該LCDR3包含一個(gè)結(jié)構(gòu)式為X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9的氨基酸序列(SEQ ID NO: 750)，其中 X1 是 Gln 或 Met ；X2 是 Gln ；X3 是 Tyr 或 Thr ；X4 是 Tyr 或 Leu ；X5 是 Thr 或 Gln ； X6 是 Thr ；X7 是 Pro ；X8 是 Tyr 或 Leu ；以及 X9 是 Thr。
8.如權(quán)利要求7所述之抗體或抗原結(jié)合片段，其進(jìn)一步包含HCDRl、HCDR2、IXDRl和 LCDR2，其中該 HCDRl 包含一個(gè)結(jié)構(gòu)式為 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 的氨基酸序列(SEQ ID NO :745)， 其中 X1 是 Gly ；X2 是 Phe ；X3 是 Thr ；X4 是 Phe ；X5 是 Ser 或 Asn ；X6 是 Ser 或 Asn ；X7 是 Tyr 或His ；以及X8是Ala或Trp ；該 HCDR2 包含一個(gè)結(jié)構(gòu)式為 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 的氨基酸序列(SEQ ID NO :746)， 其中 X1 是 lie ;X2 是 Ser 或 Asn ；X3 是 Gly 或 Gln ；X4 是 Asp 或 Ser ；X5 是 Gly ；X6 是 Ser 或 Gly ；X7 是 Thr 或 Glu ；以及 X8 是 Thr 或 Lys ；該 LCDRl 包含一個(gè)結(jié)構(gòu)式為 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xici-X11-X12 的氨基酸序列(SEQ ID NO :748)，其中 X1 是 Gln ；父2是^^ ；X3 是 Val 或 Leu ；X4 是 Leu ；X5 是 His 或 Tyr ；X6 是 Arg 或 kr ；X7 是 Ser 或 Asn ；X8 是 Asn 或 Gly ；X9 是 Asn ；X10 是 Arg 或 Asn ；X11 是 Asn 或 Tyr ；以及X12是Phe或缺位；該LCDR2包含一個(gè)結(jié)構(gòu)式為X1-X2-X3的氨基酸序列(SEQ IDNO :749)，其中X1是Trp或 Leu ；X2 是 Ala 或 Gly,以及 X3 是 Ser。
9.如以上任何一項(xiàng)申請(qǐng)專(zhuān)利范圍所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體或其片段與一種變異PCSK9蛋白的結(jié)合與該抗體或其片段與SEQID NO :755的PCSK9蛋白之間的結(jié)合相比低于50%。
10.如權(quán)利要求9所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中的變異PCSK9蛋白在選自下列一組的位置上含有至少一個(gè)殘基突變S153、E159、D238 和 D343 ；或S147、E366 和 V380。
11.如以上任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其包括一個(gè)由衍生自VH、 和Jh種系基因片段的核苷酸序列片段編碼的重鏈可變區(qū)(HCVR)，一個(gè)由衍生自Vk和Jk種系基因片段的核苷酸序列片段編碼的輕鏈可變區(qū)(LCVR)，其中該種系序列為a)Vh基因3-23、Dh基因7_27、Jh基因2、Vk基因4_1、Jk基因2，或b)VH基因3-7、Dh基因2-8、Jh基因6、Vk基因2_28、Jk基因4。
12.—種編碼上述任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述抗體或抗原結(jié)合片段的分離的核酸分子。
13.一種包含如權(quán)利要求11所述核酸分子的表達(dá)載體。
14.一種產(chǎn)生抗人PCSK9抗體或抗體的抗原結(jié)合片段的方法，其步驟包括將權(quán)利要求 13所述之表達(dá)載體引入一個(gè)分離的宿主細(xì)胞，在允許抗體或其片段產(chǎn)生和收集所產(chǎn)生抗體或其片段的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞。
15.一種含有如權(quán)利要求1至11所述之抗體或抗原結(jié)合片段以及一種藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物。
16.如權(quán)利要求15所述之藥物組合物，其進(jìn)一步包含第二種治療劑，該第二種治療劑選自一種3-羥基-3-甲基戊二酰(HMG)-輔酶A (CoA)還原酶的抑制劑、一種抑制素、一種膽固醇吸收和/或膽汁酸再吸收的抑制劑、一種增加脂蛋白分解代謝的藥劑，或一種L)(R轉(zhuǎn)錄因子活化劑。
17.一種治療可用PCSK9拮抗劑減輕、改善、抑制或預(yù)防的疾病或癥狀的方法，其包括給需要治療的患者施用一種治療劑量的如權(quán)利要求15或16所述之藥物組合物。
18.如權(quán)利要求17所述之方法，其中所述患者是人類(lèi)患者，患有高膽固醇血癥、高血脂癥、需要LDL血漿置換、被診斷為雜合家族性高膽固醇血癥、抑制素不耐受癥、抑制素?zé)o法控制、具有患高膽固醇血癥的危險(xiǎn)、血脂異常、膽汁郁積型肝病、腎病綜合征、甲狀腺機(jī)能減退、肥胖癥、動(dòng)脈粥樣硬化以及心血管疾病。
19.一種如權(quán)利要求1至11項(xiàng)中任何一所述之抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，用于減輕或抑制PCSK9介導(dǎo)的疾病或病癥。
20.在用于減輕或抑制PCSK9介導(dǎo)的疾病或病癥的藥劑制造過(guò)程中，應(yīng)用如權(quán)利要求1 至7項(xiàng)中任何一所述之抗體或抗體的抗原結(jié)合片段。
21.如權(quán)利要求20所述之應(yīng)用，其中PCSK9介導(dǎo)的疾病或癥狀是高膽固醇血癥、高血脂癥、需要LDL血漿置換、雜合家族性高膽固醇血癥、抑制素不耐受癥、抑制素?zé)o法控制、具有患高膽固醇血癥的危險(xiǎn)、血脂異常、膽汁郁積型肝病、腎病綜合征、甲狀腺機(jī)能減退、肥胖癥、動(dòng)脈粥樣硬化以及心血管疾病。
全文摘要
一種與人類(lèi)前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(hPCSK9)特異性結(jié)合并抑制其活性的人抗體或人抗體的抗原結(jié)合片段，其特征為，相對(duì)于給藥前水平，能使血清LDL膽固醇含量下降40至80％達(dá)24天、60天或90天，而血清HDL膽固醇含量則下降很少或不下降，且經(jīng)ALT和AST測(cè)量確定對(duì)肝功能影響很小或沒(méi)有可測(cè)量的影響。
文檔編號(hào)C12N9/64GK102245641SQ200980150206
公開(kāi)日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2009年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月15日
發(fā)明者D·麥克唐納, J·H·馬丁, M·W·斯利曼, T·T·黃 申請(qǐng)人:瑞澤恩制藥公司