專利名稱：：抗人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的高親和力人抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及與人神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)特異性結(jié)合的人抗體和人抗體的抗原結(jié)合片段，以及使用這些抗體的治療方法。
背景技術(shù)：
：神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)是最先確定的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素，其在周圍神經(jīng)元和中樞神經(jīng)元的發(fā)育和存活中的作用已被充分描述。NGF已被證明在周圍交感和胚胎感覺(jué)神經(jīng)元和基底前腦膽堿能神經(jīng)元的發(fā)育中是一種關(guān)鍵的存活和維持因子(Smeyneetal.(1994)Nature368246-249；Crowleyetal.(1994)Cell76:1001_1011)。NGF上調(diào)感覺(jué)神經(jīng)元中神經(jīng)肽的表達(dá)(Lindsayetal.(1989)Nature337:362-364)且其活性是通過(guò)兩種不同的膜結(jié)合受體-TrkA受體和p75普通神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素受體-介導(dǎo)的。NGF在患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其他類型關(guān)節(jié)炎的患者的滑液中含量增高。業(yè)已證明，在神經(jīng)性和慢性炎癥性疼痛動(dòng)物模型中，NGF拮抗劑可預(yù)防痛覺(jué)過(guò)敏和異常性疼痛?？筃GF抗體在諸如W001/78698,WO02/096458、W02004/032870、美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)2005/0074821、2004/0237124和2004/0219144等文獻(xiàn)中已有描述。
發(fā)明內(nèi)容在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供與人神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)特異性結(jié)合的完全人抗體及其抗原結(jié)合片段，其Kd值為大約5pM或更低，且不與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素_3(NT-3)發(fā)生交叉反應(yīng)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗NGF抗體或其片段與人NGF結(jié)合的KD值為l.OpM或更低。這些抗體的特征是以高親和力和高特異性與NGF結(jié)合，并能夠中和NGF的活性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體或其片段與人NGF結(jié)合的能力比與大鼠NGF和/或小鼠NGF結(jié)合高大約2_10倍。這些抗體可以是全長(zhǎng)的(例如IgGl或IgG4抗體)，或可僅包含一個(gè)抗原結(jié)合部分(例如Fab、F(ab’)2或scFv片段)，并可加以修飾以實(shí)現(xiàn)某種功能，例如消除殘余的效應(yīng)子功能(Glu可消除殘余效應(yīng)子功能(Reddyetal.(2000)J.Immunol.164=1925-1933)在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，其包含一個(gè)選自下列一組序列的重鏈可變區(qū)(HCVR):SEQIDN0:4，20，36，52，68，84，100，104，108，112，116，132，136，140，156，160，176，180，184，200，204，208，224，228，232，236，240，256，260，264，280，284，288，304，308，312，328，332，336，352，356，360，376，380，384，400，404，420，424，440，456，460，464，480，484，488，504，508，512，528和532，或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本上相似的序列；較優(yōu)選的是，抗體或其片段包含SEQ10而108、100或84中所示的110^;更優(yōu)選的是，其中的110^包含5￡0IDNO:108中所示的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或其片段進(jìn)一步包含一個(gè)選自下列一組序列的輕鏈可變區(qū)(LCVR):SEQIDNO12,28,44,60,76,92,102,106,110,114,124,134,138,148,158,168,178，182，192，202，206，216，226，230，234，238，248，258，262，272，282，286，296，306，310，320，330，334，344，354，358，368，378，382，392，402，412，422，432，448，458，462，472，482，486，496，506，510，520，530和534，或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本上相似的序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該LCVR為SEQIDN0:110、102或92；更優(yōu)選的是，該LCVR為SEQIDNO110中所示的氨基酸序列。在一些特定的實(shí)施方案中，抗體或其片段包含選自以下一組序列的HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)序列對(duì)SEQIDNO:4/12，20/28，36/44，52/60，68/76，84/92，100/102，104/106，108/110，112/114，116/124，132/134，136/138，140/148，156/158，160/168，176/178，180/182，184/192，200/202，204/206，208/216，224/226，228/230，232/234，236/238,240/248,256/258,260/262,264/272,280/282,284/286,288/296,304/306,308/310，312/320，328/330，332/334，336/344，352/354，356/358，360/368，376/378，380/382,384/392,400/402,404/412,420/422,424/432,440/448,456/458,460/462,464/472，480/482，484/486，488/496，504/506，508/510，512/520，528/530和532/534。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該HCVR/LCVR序列對(duì)為SEQIDNO:108/110、100/102或84/92中的一個(gè)序列對(duì)；更優(yōu)選的是，SEQIDNO:108/110o在第二個(gè)方面，本發(fā)明的特點(diǎn)是一種抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，其包含一個(gè)選自下列一組序列的重鏈CDR3(HCDR3)域SEQIDNO10，26，42，58，74，90，122，146，166，190，214，246，270，294，318，342，366，390，410，430，446，470，494和518，或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本上相似的序列；以及一個(gè)選自下列一組序列的輕鏈CDR3(LCDR3)域18，34，50，66，82，98，130，154，174，198，222，254，278，302,326,350,374,398,418,438,454,478,502和526，或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本上相似的序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，HCDR3/LCDR3序列對(duì)為SEQIDNO:90和98、214和222、410和418、430和438或446和454之一；更優(yōu)選的是，SEQIDNO90和98。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種抗體或其片段，其中還包含一個(gè)選自以下序列的重鏈CDRl(HCDRl)域SEQIDNO:6，22，38，54，70，86，118，142，162，186，210，242，266，290，314，338，362，386，406，426，442，466，490和514，或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本上相似的序列；一個(gè)選自以下序列的重鏈CDR2(HCDR2)域:SEQIDNO:8，24，40，56，72，88，120，144，164，188，212，244，268，292，316，340，364，388，408，428，444，468，492和516，或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本上相似的序列；一個(gè)選自以下序列的輕鏈⑶Rl(IXDRl)域SEQIDNO14，30，46，62，78，94，126，150，170，194，218，250，274，298，322，346，370，394，414，434，450，474，498和522，或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本上相似的序列；以及一個(gè)選自以下序列的輕鏈⑶R20XDR2)域SEQIDN0=16,32,48,64,80,96,128，152，172，196，220，252，276，300，324，348，372，396，416，436，452，476，500和524，或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本上相似的序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該重鏈和輕鏈⑶R序列為SEQIDNO=86,88,90,94,96和98；210,212,214,218,220和222；406，408，410，414，416和418；442，444，446，450，452和454；以及426，428，430，434，436和438；更優(yōu)選的是，該CDR序列為SEQIDNO:86，88，90，94，96和98。在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼抗NGF抗體或其片段的核酸分子。本發(fā)明還包括攜帶本發(fā)明核酸的重組表達(dá)載體，以及引入這類載體的宿主細(xì)胞，并包括在允許產(chǎn)生抗體和收集所產(chǎn)生抗體的條件下通過(guò)培養(yǎng)宿主細(xì)胞而生產(chǎn)抗體的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抗體或其片段，其中包含一個(gè)由選自下列序列的核酸序列編碼的HCVR:SEQIDNO:3，19，35，51，67，83，99，103，107，111，115，131，135，139，155，159，175，179，183，199，203，207，223，227，231，235，239，255，259，263，279，283，287，303，307，311，327，331，335，351，355，359，375，379，383，399，403，419，423，439，455，459，463,479,483,487,503,507,511,527和531，或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的基本上相同的序列。更優(yōu)選的是，該HCVR為SEQIDNO107或99所編碼。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或其片段進(jìn)一步包含一個(gè)由選自下列序列的核酸序列編碼的LCVR:SEQIDNO:11，27，43，59，75，91，101，105，109，113，123，133，137，147，157，167，177，181，191，201，205，215，225，229，233，237，247，257，261，271，281，285，295，305，309，319，329，333，343，353，357，367，377，381，391，401，411，421，431，447，457，461，471，481，485，495，505，509，519，529和533，或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的基本上相同的序列；優(yōu)選的是，該LCVR為SEQIDNO109或101所編碼。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的特點(diǎn)是一種抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，其包含一個(gè)由選自下列序列的核苷酸序列編碼的HCDR3域:SEQIDNO:9，25，41，57，73，89，121，145，165，189，213，245，269，293，317，341，365，389，409，429，445，469，493和517，或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的基本上相同的序列；以及一個(gè)由選自下列序列的核苷酸序列編碼的LCDR3域:SEQIDNO17，33，49，65，81，97，129，153，173，197，221，253，277，301，325，349，373，397，417，437，453，477，501和525，或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的基本上相同的序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，HCDR3和LCDR3序列分別為SEQIDNO89和97所編碼。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體或其片段還包含一個(gè)由選自以下核苷酸序列的序列編碼的HCDR1域:SEQIDNO:5，21，37，53，69，85，117，141，161，185，209，241，265，289，313,337,361,385,405,425,441,465,489和513，或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的基本上相同的序列；一個(gè)由選自以下核苷酸序列的序列編碼的HCDR2域SEQIDNO:7，23，39，55，71，87，119，143，163，187，211，243，267，291，315，339，363，387，407，427，443，467，491和515，或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的基本上相同的序列；一個(gè)由選自以下核苷酸序列的序列編碼的LCDR1域SEQIDN013，29，45，61，77，93，125，149，169，193，217，249，273，297，321，345，369，393，413，433，449，473，497和521，或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的基本上相同的序列；以及一個(gè)由選自以下核苷酸序列的序列編碼的LCDR2域SEQIDNO:15，31，47，63，79，95，127，151，171，195，219，251，275，299，323，347，371，395，415，435，451,475,499和523，或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的基本上相同的序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，其中的抗體或其片段包含由SEQIDN0:85、87和89編碼的重鏈CDR序列；以及由SEQIDNO:93、95和97編碼的輕鏈CDR序列。在第四個(gè)方面，本發(fā)明的特點(diǎn)是一種與人NGF特異性結(jié)合的分離的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，該抗體或片段包含一個(gè)HCDR3和一個(gè)IXDR3，其中HCDR3包含結(jié)構(gòu)式為f-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-Xn-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18^MSmi￥^J(SEQIDN0:537)，其中X1為Ala或Ser,X2為Thr或Lys，X3為Glu或lie，X4為Phe或Gly，X5為Val或Gly，X6為Val或Trp,X7為Val或Phe,X8為Thr或Gly,X9為Asn或Lys,X10為Phe或Leu,X11為Asp或Phe，X12為Asn或Ser，X13為Ser或缺失，X14為Tyr或缺失，X15為Gly或缺失，X16為Met或缺失，X17為Asp或缺失，X18為Val或缺失；LCDR3包含結(jié)構(gòu)式為tmmf-f的氨基酸序列(SEQID而540)，其中父1為6111，鏟為6111，父3為171~，父4為六卯，父5為六印或Asn,X6為Tyr或Trp,X7為Pro,X8為Tyr或Trp，且X9為Thr。在一個(gè)更特殊的實(shí)施方案中，該抗體或其片段進(jìn)一步包含一個(gè)結(jié)構(gòu)式為X1—X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8的HCDR1序列(SEQIDN0:535)，其中X1為Gly,X2為Phe,X3為Thr或Asn,X4為Phe或Leu,X5為Thr或Asp,X6為Asp或Glu,X7為Tyr或Leu,且X8為Ser或Ala；一個(gè)結(jié)構(gòu)式為f-fmfh的HCDR2序列(SEQIDNO:536)，其中X1為lie或Phe，X2為Asp或Ser,X3為Pro或Trp，X4為Glu或Asn，X5為Asp或Ser，X6為Gly,X7為Thr,Glu或Ser，X8為Thr或lie；—個(gè)包含結(jié)構(gòu)式為乂工-鏟-^-^-^-^-壙-^-^-乂”-乂“-父12-X13_X14_X15_X16_X17_X18的氨基酸序列的HCDR3(SEQIDNO537)，其中X1為Ala或Ser,X2為Thr或Lys，X3為Glu或Ile，X4為Phe或Gly，X5為Val或Gly，X6為Val或Trp，X7為Val或Phe，X8為Thr或Gly，X9為Asn或Lys,X10為Phe或Leu，X11為Asp或Phe，X12為Asn或Ser,X13為Ser或缺失，X14為Tyr或缺失，X15為Gly或缺失，X16為Met或缺失，X17為Asp或缺失，且X18為Val或缺失；一個(gè)結(jié)構(gòu)式為f-fm-f的LCDR1序列(SEQIDNO538)，其中X1為Gin或Arg,X2為Ala、Ser或Thr,X3為Val或lie,X4為Arg或Thr,X5為Asn、Phe或Tyr，且X6為Asp或Asn；一個(gè)結(jié)構(gòu)式為X:-X2-X3的LCDR2序列(SEQIDNO:539)，其中X1為Gly或Ala，X2為Ala，，且X3為Ser或Phe；以及一個(gè)包含結(jié)構(gòu)式為fHf-fHf的氨基酸序列的LCDR3(SEQIDNO:540)，其中X1為Gin,X2為Gin,X3為Tyr,X4為Asn,X5為Arg或Asn,X6為Tyr或Trp,X7為Pro,X8為Tyr或Trp，且X9為Thr。在第五個(gè)方面，本發(fā)明的特點(diǎn)是一個(gè)完全人抗體或抗體片段，經(jīng)基于PC12細(xì)胞的體外分析(如下所述)測(cè)量表明，該抗體或片段阻斷NGF活性的IC5(I為低于大約lOnM。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體顯示IC5(I為大約500pM或更低；較優(yōu)選的是IC5(I為大約100pM或更低；大約50pM或更低；或大約25pM或更低。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，經(jīng)表面等離子體共振(BIAC0RE)測(cè)量表明，該抗體或片段結(jié)合NGF的KD為低于大約500pM，優(yōu)選的是低于大約300pM，更優(yōu)選的是低于大約100pM，低于大約50pM，低于大約20pM；低于大約10pM，低于大約5pM，或低于大約lpM。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗NGF抗體或抗體片段與人NGF結(jié)合的Kd值為大約0.5pM或更低。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，其中的抗體或其片段與人NGF結(jié)合的親和力比與大鼠NGF結(jié)合的親和力高1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、或10倍，且比與小鼠NGF結(jié)合的親和力高1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、或10倍。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，其中的抗體或其片段對(duì)人NGF顯示高特異性，例如，不8會(huì)與密切相關(guān)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3(NT-3)發(fā)生交叉反應(yīng)。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)表面等離子體共振測(cè)量表明，這種高親和力和高選擇性的抗體或其片段對(duì)人NGF的Kd為1.OpM或更低，抑制NGF與受體TrkA和p75的結(jié)合，且不與人NT-3發(fā)生交叉反應(yīng)。NT-3在這樣一些生理過(guò)程，如肌肉運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元協(xié)調(diào)中起著關(guān)鍵的作用，因此，不與NT-3發(fā)生交叉反應(yīng)的抗體或抗體片段相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中的抗體提供了意想不到的臨床和治療優(yōu)勢(shì)?，F(xiàn)已證明，在神經(jīng)性疼痛的CCI模型中，NT-3可防止產(chǎn)生熱痛覺(jué)過(guò)敏(參見(jiàn)如Wilson-Gerwingetal.(2005)JNeuroscience25:758-767)。最近，外源NT-3已被證明可顯著地降低在產(chǎn)生神經(jīng)性疼痛方面起作用的兩個(gè)鈉通道的表達(dá)(Wilson-Gerwing&Verge(2006)Neuroscience141=2075-2085)。這些資料表明，NT-3在神經(jīng)性疼痛方面具有有益的作用。本發(fā)明包括具有修飾的糖基化模式的抗NGF抗體。在一些應(yīng)用中，修飾除去不需要的糖基化位點(diǎn)可能是有用的，或者缺少寡糖鏈上的巖藻糖部分的抗體，以增強(qiáng)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)功能(參見(jiàn)Shieldetal.(2002)JBC277:26733)。在其他應(yīng)用中，也可進(jìn)行半乳糖基化修飾來(lái)改變補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。在第六個(gè)方面，本發(fā)明的特點(diǎn)是一種含有與NGF特異性結(jié)合的重組人抗體或其片段以及一種可接受載體的組合物。在一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明的特點(diǎn)是一種由NGF抑制劑和第二治療劑的組合形成的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該NGF抑制劑為一種抗體或其片段。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該第二治療劑可為任何能夠和NGF抑制劑有利組合的適當(dāng)治療劑。在第七個(gè)方面，本發(fā)明的特點(diǎn)是利用本發(fā)明的抗NGF抗體或抗體的抗原結(jié)合部分抑制人NGF活性的方法。所治療的疾病是通過(guò)消除、抑制或降低NGF的活性而得到改善、減輕、抑制或預(yù)防的任何疾病或癥狀。更具體地說(shuō)，本發(fā)明通過(guò)施用一種NGF抑制劑，如本發(fā)明的抗體或抗體片段單獨(dú)使用，或與第二治療劑合用，提供了一種治療NGF介導(dǎo)的病癥或疾病的方法，如炎癥性疼痛、手術(shù)后刀口疼痛、復(fù)合性局部疼痛綜合征、原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性骨癌疼痛、神經(jīng)性疼痛、骨折疼痛、骨質(zhì)疏松骨折疼痛、燒傷、骨質(zhì)疏松、痛風(fēng)關(guān)節(jié)痛造成的疼痛、與鐮刀細(xì)胞危象相關(guān)的疼痛和其他傷害性疼痛，以及肝細(xì)胞癌、乳腺癌和肝硬化。在一些優(yōu)選的神經(jīng)性疼痛實(shí)施方案中，優(yōu)選地治療牽涉性三叉神經(jīng)痛、皰疹后神經(jīng)痛、幻肢痛、纖維肌痛、反射交感性營(yíng)養(yǎng)不良和神經(jīng)疼痛病癥。第二治療劑可為白介素-I(IL-I)抑制齊U，如美國(guó)第6，927，044號(hào)專利中描述的一種融合蛋白；或一種抗癲癇藥物，如伽瑪噴丁、普瑞巴林、托吡酯，或一種三環(huán)抗憂郁劑，如阿米替林、塞來(lái)考昔，一種細(xì)胞因子拮抗劑，如一種抗IL-1、IL-6、IL-6R、IL-18或IL-18R的拮抗蛋白或抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二治療劑為另一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素，如NT-3。在第八個(gè)方面，本發(fā)明提供一種如上所述的抗體或抗原結(jié)合片段，用于減輕或抑制NGF介導(dǎo)的人的疾病或病癥。NGF介導(dǎo)的病癥或疾病得到抑制而不會(huì)對(duì)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)造成顯著的影響，這種病癥或疾病為以下疼痛性疾病之一炎癥性疼痛、手術(shù)后刀口疼痛、神經(jīng)性疼痛、骨折疼痛、痛風(fēng)關(guān)節(jié)痛、皰疹后神經(jīng)痛、燒傷疼痛、癌癥疼痛、骨關(guān)節(jié)炎或類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疼痛、坐骨神經(jīng)痛、與鐮刀細(xì)胞危象有關(guān)的疼痛，或皰疹后神經(jīng)痛。在一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明包括如上所述的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段在制造用于減輕或抑制NGF介導(dǎo)的人類疾病或病癥的藥物中的應(yīng)用。通過(guò)閱讀以下詳細(xì)敘述，其他目標(biāo)和優(yōu)勢(shì)將變得很明顯。詳細(xì)說(shuō)明在描述本發(fā)明的方法之前，應(yīng)該理解，本發(fā)明并非局限于所描述的具體方法和實(shí)驗(yàn)條件，因?yàn)檫@些方法和條件是可以改變的。還應(yīng)理解，本文所用的術(shù)語(yǔ)僅出于描述具體實(shí)施方案的目的，并非意在限制本發(fā)明，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍僅受所附權(quán)利要求書(shū)的限制。除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)將具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。盡管任何與此處所述的方法和材料類似或等同的方法和材料均可采用，下面說(shuō)明的是優(yōu)選的方法和材料。定義本文所用的術(shù)語(yǔ)“人神經(jīng)生長(zhǎng)因子”或“NGF”是指具有SEQIDNO1所示核酸序列和SEQIDNO:2所示氨基酸序列的人NGF，或其生物活性片段。本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”意指由四條多肽鏈即兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)以二硫鍵相互連接而組成的免疫球蛋白分子。每個(gè)重鏈由一個(gè)重鏈可變區(qū)(縮寫(xiě)為HCVR或VH)和一個(gè)重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個(gè)域CH1、CH2和CH3組成。每個(gè)輕鏈由一個(gè)輕鏈可變區(qū)(縮寫(xiě)為L(zhǎng)CVR或VL)和一個(gè)輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)域CL組成。VH和VL區(qū)可進(jìn)一步分成被稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)，其中散布著較保守的被稱為框架區(qū)(FR)的區(qū)域。每個(gè)VH和VL均由三個(gè)CDR和四個(gè)FR組成，從氨基端到羧基端按以下順序排列:FRUCDRUFR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本文所用的術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡(jiǎn)稱“抗體部分”或“抗體片段”)系指一個(gè)或多個(gè)保留特異性結(jié)合一種抗原(如NGF)的能力的抗體片段。現(xiàn)已證明，抗體的抗原結(jié)合功能可由全長(zhǎng)抗體的片段來(lái)完成?？贵w的“抗原結(jié)合部分”這一術(shù)語(yǔ)所包含的結(jié)合片段的實(shí)例包括(i)一個(gè)Fab片段，即一個(gè)由VL、VH、CL和CHl域組成的單價(jià)片段；(ii)一個(gè)F(ab')2片段，即一個(gè)由在鉸鏈區(qū)通過(guò)二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片段組成的二價(jià)片段；(iii)一個(gè)由VH和CHl域組成的Fd片段；(iv)—個(gè)由一個(gè)抗體的單臂VL和VH域組成的Fv片段；(ν)—個(gè)由VH域組成的dAb片段(Wardetal.(1989)Nature241544-546)；以及一個(gè)孤立的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的兩個(gè)域VL和VH是由不同的基因編碼的，但它們可以通過(guò)重組方法，由一個(gè)合成的連接體連接在一起成為一個(gè)單獨(dú)的蛋白質(zhì)鏈，其中VL和VH區(qū)配對(duì)形成單價(jià)分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見(jiàn)例如Birdetal.(1988)Science242:423-426；和Hustonetal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879_5883)。這樣的單鏈抗體也被包含在抗體的“抗原結(jié)合部分”這一術(shù)語(yǔ)的范圍以內(nèi)。其他形式的單鏈抗體，如雙特異抗體(diabody)也包括在內(nèi)。雙特異抗體是二價(jià)雙特異性抗體，其中VH和VL域表達(dá)在一個(gè)多肽單鏈上，但使用一個(gè)太短以致不允許同一鏈上的兩個(gè)域配對(duì)的連接體，從而強(qiáng)迫這兩個(gè)域與另一個(gè)鏈上的互補(bǔ)域配對(duì)并形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見(jiàn)如Holligeretal.(1993)Proc.Natl.AcadSci.USA906444-6448；Poljaketal.(1994)Structure21121-1123)。此外，一種抗體或其抗原結(jié)合部分可能為該抗體或抗體部分與一個(gè)或多個(gè)其他蛋白質(zhì)或肽共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合而形成的較大免疫粘附分子的一部分。這類免疫粘附分子的實(shí)例包括利用鏈霉抗生物素的核心區(qū)產(chǎn)生的四聚物scFv分子(Kipriyanovetal.(1995)HumanAntibodiesandHybridomas6:93_101)以及利用半胱氨酸殘基、一個(gè)標(biāo)記肽和一個(gè)C-端多聚組氨酸標(biāo)簽產(chǎn)生的二價(jià)生物素標(biāo)記的scFv分子(Kipriyanovetal.(1994)Mol.Immunol.311047-1058)。抗體部分，如Fab和F(ab')2片段可從整個(gè)抗體利用常規(guī)技術(shù)制備，如對(duì)整個(gè)抗體分別用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶進(jìn)行消化。此外，抗體、抗體部分和免疫粘附分子可利用本文描述的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)獲得。本文所用的術(shù)語(yǔ)“人抗體”意在包括含有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可能包括不是由人類種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如由體外隨機(jī)或位點(diǎn)特異誘變或體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)，如在CDR，尤其是CDR3中。但是，此處所用的術(shù)語(yǔ)“人抗體”無(wú)意包括得自另外的哺乳動(dòng)物物種如小鼠的CDR序列植入到人類框架序列上的抗體。本文所用的“重組人抗體”意在包括所有利用重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的人抗體，如利用轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體(下面進(jìn)一步說(shuō)明)、從一個(gè)重組的組合人抗體庫(kù)分離的抗體(下面進(jìn)一步說(shuō)明)、從對(duì)于人免疫球蛋白基因而言為轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物(如小鼠)分離的抗體(參見(jiàn)如Tayloretal.(1992)Nucl.AcidsRes.206287-6295)或用任何其他涉及將人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。此類重組人抗體含有得自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。但是，在有些實(shí)施方案中，這些重組人抗體會(huì)經(jīng)受體外誘變(或者，當(dāng)使用的是人Ig序列轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物時(shí)，則經(jīng)受體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，因此，重組抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列雖然得自或與人種系VH和VL序列有關(guān)，卻可能并不自然存在于人體內(nèi)抗體種系庫(kù)中。本文所用的“分離抗體”意指基本上不含其他具有不同抗原特異性的抗體的抗體(例如特異性結(jié)合NGF的分離抗體就基本上不含能特異結(jié)合NGF之外的抗原的抗體)。但是，特異性結(jié)合NGF的分離抗體對(duì)于其他抗原如來(lái)自其他物種的NGF分子可具有交叉反應(yīng)性。此外，分離抗體可能基本上不含其他細(xì)胞材料和/或化學(xué)物質(zhì)。本文所用的“中和抗體”(或“中和NGF活性的抗體”)意指其與NGF的結(jié)合將導(dǎo)致NGF的生物活性被抑制的抗體。這種NGF生物活性的抑制可通過(guò)測(cè)量NGF生物活性的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志，如NGF誘發(fā)的細(xì)胞活化和NGF與NGF受體的結(jié)合來(lái)評(píng)估。這些NGF生物活性的標(biāo)志可通過(guò)本領(lǐng)域人員熟知的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的體外或體內(nèi)分析來(lái)評(píng)估(見(jiàn)下面的實(shí)施例)。“⑶R”或互補(bǔ)決定區(qū)為一個(gè)超變區(qū)，其中散布有稱為“框架區(qū)”的較保守的區(qū)域。一組⑶R可定義為一個(gè)氨基酸共有序列。本文所用的術(shù)語(yǔ)“表面等離子體共振”是指一種光學(xué)現(xiàn)象，基于這種光學(xué)現(xiàn)象可利用例如BIAC0RE系統(tǒng)(PharmaciaBiosensorAB,Uppsala,SwedenandPiscataway,N.J.)來(lái)檢測(cè)生物傳感器基質(zhì)中蛋白質(zhì)濃度的變化，從而對(duì)實(shí)時(shí)生物特異性相互作用進(jìn)行分析。本文所用的術(shù)語(yǔ)“KD”意指特定的抗體-抗原相互作用的平衡解離常數(shù)。本文所用有關(guān)編碼結(jié)合NGF的抗體或抗體部分(如VH，VL,⑶R3)的核酸的術(shù)語(yǔ)“分離的核酸分子”意指一個(gè)核酸分子，其中編碼抗體或抗體部分的核苷酸序列不含編碼結(jié)合NGF以外抗原的抗體或抗體部分的其他核苷酸序列，這些其他序列可能天然出現(xiàn)在人基因組DNA中該核酸的側(cè)翼。因此，例如，本發(fā)明編碼抗NGF抗體VH區(qū)的分離核酸不含有編碼其他結(jié)合除人NGF以外抗原的VH區(qū)的其他序列。術(shù)語(yǔ)“表位”包括任何決定簇，優(yōu)選的是能夠特異地結(jié)合免疫球蛋白或T-細(xì)胞受體的多肽決定簇。在某些實(shí)施方案中，表位決定簇可包括分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)，如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷?；惢蚧酋；?；在某些實(shí)施方案中，表位決定簇可具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征和/或特定的電荷特征。表位是指抗原中與抗體結(jié)合的區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)抗體在復(fù)雜蛋白質(zhì)和/或大分子混合物中優(yōu)先識(shí)別目標(biāo)抗原時(shí)，則稱該抗體特異地結(jié)合一個(gè)抗原。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)抗體與抗原結(jié)合的平衡解離常數(shù)小于或等于10_8M、更優(yōu)選的是平衡解離常數(shù)小于或等于10_9M、最優(yōu)選的是解離常數(shù)小于或等于ΙΟ,Μ的時(shí)候，則該抗體被稱為特異地結(jié)合該抗原。術(shù)語(yǔ)“基本同一性”或“基本相同”當(dāng)指核酸或其片段時(shí)，表示當(dāng)以適當(dāng)?shù)暮塑账岵迦牖騽h除與另一個(gè)核酸(或其互補(bǔ)鏈)最佳比對(duì)時(shí)，以下述任何公知的序列同一性算法如FASTA、BLAST或GAP測(cè)量，至少有大約90%的核苷酸堿基序列相同性，更優(yōu)選的是至少有大約95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸堿基序列相同性。當(dāng)應(yīng)用于多肽時(shí)，術(shù)語(yǔ)“基本相似性”或“基本上相似”指兩個(gè)肽序列用諸如GAP或BESTFIT等程序的默認(rèn)空位權(quán)重達(dá)到最佳比對(duì)時(shí)，兩者至少有90%的序列相同性，更優(yōu)選的是至少有95%、98%或99%的序列相同性。優(yōu)選的是，不同的殘基位置的差別僅在于保守的氨基酸取代?！氨Ｊ氐陌被崛〈笔侵高@樣一種取代，即一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)含有化學(xué)性質(zhì)(例如電荷或疏水性)相似側(cè)鏈(R基團(tuán))的氨基酸殘基所取代。一般來(lái)說(shuō)，保守的氨基酸取代不會(huì)在實(shí)質(zhì)上改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。在兩個(gè)或更多的氨基酸序列相互之間的差別僅在于某些保守取代的情況下，可將序列相似性百分比或程度向上調(diào)整，以針對(duì)取代的保守特性作出校正。進(jìn)行這種調(diào)整的方法對(duì)熟悉本領(lǐng)域的人員來(lái)說(shuō)是熟知的。參見(jiàn)如Pearson(1994)MethodsMol.Biol.24:307_331。含有化學(xué)性質(zhì)相似側(cè)鏈的氨基酸類別的實(shí)例包括1)脂族側(cè)鏈甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；2)脂族羥基側(cè)鏈絲氨酸和蘇氨酸；3)含酰胺側(cè)鏈天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳族側(cè)鏈苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)堿性側(cè)鏈賴氨酸、精氨酸和組氨酸；和6)酸性側(cè)鏈天冬氨酸和谷氨酸，以及7)含硫側(cè)鏈半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸取代組是纈氨酸_亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸_酪氨酸、賴氨酸_精氨酸、丙氨酸_纈氨酸、谷氨酸_天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺?；蛘撸Ｊ氐娜〈荊ormetetal.(1992)Science256144345中所公開(kāi)的PAM250對(duì)數(shù)似然矩陣(PAM250log-likelihoodmatrix)中具有正值的任何變化。“中度保守的”取代是PAM250對(duì)數(shù)似然矩陣中具有非負(fù)值的任何變化。多肽的序列相似性通常用序列分析軟件來(lái)測(cè)量。蛋白質(zhì)分析軟件是用指定給各種取代(包括保守氨基酸取代)、缺失和其他修飾的相似性程度對(duì)相似的序列進(jìn)行匹配。例如，GCG軟件含有諸如“GAP”和“BESTFIT”的程序，這些程序可以使用默認(rèn)參數(shù)，以確定緊密相關(guān)的多肽，如來(lái)自不同生物物種的同源多肽之間的序列同源性或序列同一性，或者野生型蛋白質(zhì)及其突變蛋白之間的序列同源性或序列同一性。參閱例如GCGVersion6.1。還可以用GCGVersion6.1中的FASTA程序以默認(rèn)參數(shù)或推薦參數(shù)來(lái)比較多肽序列。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)能提供被查詢序列和被搜索序列之間的最佳重迭區(qū)域的比對(duì)和序列同一性百分?jǐn)?shù)(Pearson(2000)，同上)。當(dāng)將本發(fā)明的序列與含有大量的源自不同生物的序列的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較時(shí)，另一優(yōu)選的算法是BLAST計(jì)算機(jī)程序，尤其是BLASTP或TBLASTN，使用默認(rèn)參數(shù)。參閱如Altschuletal.(1990)J.Mol.Biol.215:403410及Altschuletal.(1997)NucleicAcidsRes.25:3389402。人抗體的制備產(chǎn)生人抗體的方法包括，如VEL0CIMMUNE和XEN0M0USE技術(shù)(Greenetal.(1994)NatureGenetics7:13_21)、“微基因座(minilocus)”法以及噬菌體展示。VELOCIMMUNE技術(shù)(美國(guó)第6，596，541號(hào)專利，RegeneronPharmaceuticals)包括產(chǎn)生針對(duì)選擇的抗原的高特異性完全人抗體的方法。這一技術(shù)包括這樣一種轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生該小鼠的基因組包含一些與內(nèi)源小鼠恒定區(qū)基因座有效地連接(operablylinked)的人重鏈和輕鏈可變區(qū)，使得該小鼠能響應(yīng)抗原刺激而產(chǎn)生一種包含人可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的抗體。將編碼該抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)的DNA分離出來(lái)，并與編碼人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的DNA有效地連接。然后在能夠表達(dá)完全人抗體的細(xì)胞中表達(dá)該DNA。在具體的實(shí)施方案中，該細(xì)胞是CHO細(xì)胞?？贵w可在治療上用于阻斷配體_受體之間的相互作用或抑制受體組分之間的相互作用，而不是通過(guò)固定補(bǔ)體和參與補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)來(lái)殺滅細(xì)胞，或通過(guò)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)來(lái)殺滅細(xì)胞。因此，抗體的恒定區(qū)對(duì)于抗體固定補(bǔ)體和介導(dǎo)細(xì)胞依賴性細(xì)胞毒性的能力是重要的。因此，可根據(jù)是否需要抗體介導(dǎo)細(xì)胞毒性來(lái)選擇抗體的同種型。人免疫球蛋白可以兩種與鉸鏈異質(zhì)性有關(guān)的形式存在。在一種形式中，免疫球蛋白分子包含一種約150-160kDa的穩(wěn)定四鏈構(gòu)建物，其中兩個(gè)二聚體通過(guò)一個(gè)重鏈間的二硫鍵連接在一起。在第二種形式中，該二聚體不是通過(guò)鏈間二硫鍵連接在一起，而是形成了一種由共價(jià)偶聯(lián)的輕鏈和重鏈(半抗體)組成的約75-80kDa的分子。這兩種形式的分離一直極為困難，甚至在親和純化之后也是如此。第二種形式在各種完整IgG同種型中的出現(xiàn)頻率，取決于但不限于與抗體的鉸鏈區(qū)同種型相關(guān)的結(jié)構(gòu)差異。人IgG4鉸鏈的鉸鏈區(qū)中的單氨基酸取代可將第二種形式(Angaletal.(1993)MolecularImmunology30:105)的出現(xiàn)頻度顯著地降低到利用人IgGl鉸鏈通常所觀察到的水平。本發(fā)明包括在鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)或CH3區(qū)中含有一個(gè)或多個(gè)突變的抗體，所述的突變可能是合乎需要的，例如在生產(chǎn)中用于提高所需抗體形式的產(chǎn)率。本發(fā)明的抗體優(yōu)選的制備方法是采用VELOCIMMUNE技術(shù)。用所研究的抗原激發(fā)內(nèi)源性免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變區(qū)被置換為對(duì)應(yīng)的人可變區(qū)的轉(zhuǎn)基因小鼠，并從表達(dá)抗體的小鼠中收獲淋巴細(xì)胞(如B-細(xì)胞)。淋巴細(xì)胞可與一個(gè)骨髓瘤細(xì)胞系融合來(lái)制備永生雜交瘤細(xì)胞系，然后對(duì)這種雜交瘤細(xì)胞系進(jìn)行篩選，以鑒定出能產(chǎn)生對(duì)相關(guān)抗原具有特異性的抗體的雜交瘤細(xì)胞系?？蓪⒕幋a重鏈和輕鏈可變區(qū)的DNA分離出來(lái)，并與合乎需要的重鏈和輕鏈的同種型恒定區(qū)連接。這種抗體蛋白可在一種細(xì)胞如CHO細(xì)胞中產(chǎn)生。另夕卜，編碼抗原特異性嵌合抗體或輕鏈和重鏈可變區(qū)的DNA可直接從抗原特異的淋巴細(xì)胞中分離出來(lái)。一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的抗體具有很高的親和力，當(dāng)根據(jù)其與固定于固相上的抗原或溶液相中的抗原的結(jié)合進(jìn)行測(cè)量時(shí)，典型情況下Kd為從大約10_9直到大約ICT12M或更高，例如，至少為大約10_9M、至少為大約ΙΟ,Μ、至少為大約10_"Μ或至少為大約10_12Μ。首先，分離包含一個(gè)人可變區(qū)和一個(gè)小鼠恒定區(qū)的抗體的高親和力嵌合抗體。如下所述，根據(jù)所需的特征，包括親和力、選擇性、表位等，鑒定和選擇抗體。用合乎需要的人恒定區(qū)取代小鼠恒定區(qū)，以產(chǎn)生本發(fā)明的完全人抗體，例如野生型的或經(jīng)修飾的IgGl或IgG4(例如SEQIDN0:541、542或543)。所選擇的恒定區(qū)可根據(jù)特定的用途而改變，而高親和力抗原結(jié)合特性和靶標(biāo)特異性特性則存在于可變區(qū)中。表位作圖和相關(guān)技術(shù)為篩選能與特定表位結(jié)合的抗體(例如能阻斷IgE與其高親和力受體結(jié)合的抗體)，可進(jìn)行常規(guī)的交聯(lián)-阻斷分析，如HarlowandLane(1990，見(jiàn)上)中所述。其他方法包括丙氨酸掃描突變體分析、肽印跡分析(Reineke(2004)MethodsMolBiol248443-63)或肽切割分析。另外，還可采用諸如抗原的表位切除、表位提取和化學(xué)修飾的方法(Tomer(2000)ProteinScience9:487-496)。術(shù)語(yǔ)“表位”是指抗原上B細(xì)胞和/或T細(xì)胞對(duì)其作出響應(yīng)的位點(diǎn)。B細(xì)胞表位可由毗連的氨基酸形成，或者由通過(guò)蛋白質(zhì)的三級(jí)折疊而并列在一起的非毗連氨基酸形成。由毗連氨基酸形成的表位在接觸變性溶劑時(shí)通?？傻靡员Ａ?，而通過(guò)三級(jí)折疊形成的表位在用變性溶劑處理時(shí)通常會(huì)失去。表位通常包括至少3個(gè)、更經(jīng)常是至少5個(gè)或8-10個(gè)以獨(dú)特空間構(gòu)象出現(xiàn)的氨基酸。修飾輔助概況分析(Modification-AssistedProfiling，MAP)，也被稱為基于抗原結(jié)構(gòu)的抗體概況分析(AntigenStructure-basedAntibodyProfiling，ASAP)，是一種根據(jù)每種抗體與經(jīng)化學(xué)或酶學(xué)修飾的抗原表面的結(jié)合狀況的相似性對(duì)大量的抗同一抗原的單克隆抗體(mAbs)進(jìn)行分類的方法(美國(guó)專利2004/0101920號(hào))。每一類均可反映與另一類所代表的表位截然不同或部分重疊的獨(dú)特表位。這種技術(shù)可以快速過(guò)濾遺傳上相同的抗體，從而可使鑒定工作集中在遺傳上不同的抗體上。當(dāng)應(yīng)用于雜交瘤篩選時(shí)，MAP有助于鑒定某些能產(chǎn)生具有所需特性的mAb的罕見(jiàn)雜交瘤克隆。MAP可用來(lái)將本發(fā)明的抗NGF抗體分類成結(jié)合不同表位的抗體組。免疫偶聯(lián)物本發(fā)明包括一種與治療部分(“免疫偶聯(lián)物”)如細(xì)胞毒素、化療藥物、免疫抑制劑或放射性同位素等偶聯(lián)的人抗NGF單克隆抗體。細(xì)胞毒素包括任何損害細(xì)胞的試劑。適宜于形成免疫偶聯(lián)物的細(xì)胞毒素和化療劑的例子是本領(lǐng)域內(nèi)周知的。參閱如WO05/103081。雙特異性本發(fā)明的抗體可以是單特異性的、雙特異性的，或多特異性的。多特異性抗體可以針對(duì)同一目標(biāo)多肽的不同表位，或可含有針對(duì)一個(gè)以上目標(biāo)多肽的抗原結(jié)合域。參閱，如Tuttetal.(1991)J.Immunol.147:60-69。人抗NGF抗體可連接到另一個(gè)功能分子，如另一個(gè)肽或蛋白質(zhì)上，或與之共同表達(dá)。例如，一種抗體或其片段可與一種或多種其他分子實(shí)體如另一種抗體或抗體片段實(shí)現(xiàn)功能性(例如以化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價(jià)鍵連接或其他方式)連接，以產(chǎn)生具有第二種結(jié)合特異性的雙特異性或多特異性抗體。治療給藥和制劑本發(fā)明提供了一些含有本發(fā)明的抗NGF抗體或其抗原結(jié)合片段的治療組合物。本發(fā)明的治療組合物將與適宜的載體、賦形劑以及其他加入制劑中改善轉(zhuǎn)移、遞送、耐受性等的試劑一起施用。在藥劑化學(xué)師眾所周知的處方集里可以找到大量適宜的制劑雷氏藥學(xué)大全(Remington'sPharmaceuticalSciences，MackPublishingCompany,Easton，PA.)。這些制劑包括，如粉劑、糊劑、油膏、凝膠、蠟劑、油劑、脂類、含有脂(陽(yáng)離子或陰離子)的泡囊(如LIP0FECTIN)、DNA偶聯(lián)物、無(wú)水吸收性糊劑、水包油或油包水型乳劑、乳膠狀碳蠟(各種分子量的聚乙二醇)、半固體狀凝膠以及含有聚乙二醇的半固體狀混合物。還可參閱Powelletal.CompendiumofExcipientsforParenteralFormulations,PDA(1998)JPharmSciTechnol52:238-311。其劑量可根據(jù)即將受藥的受試者的年齡和體形大小、目標(biāo)疾病、病癥、給藥途徑等因素而改變。當(dāng)本發(fā)明的抗體用于治療與NGF相關(guān)的各種病癥和疾病，包括炎癥性疼痛、神經(jīng)性和/或傷害性疼痛、肝細(xì)胞癌、乳腺癌、肝硬化等時(shí)，對(duì)于一名成年患者來(lái)說(shuō)經(jīng)靜脈施用本發(fā)明的抗體是有利的，通常是按照約0.01至約20mg/kg體重，較佳的是按照約0.02至7、約0.03至約5，或約0.05至約3mg/kg體重，優(yōu)選的是按照約0.1至約10mg/kg體重，更優(yōu)選的是按照約0.1至約5mg/kg體重的單一劑量施用。取決于病癥的嚴(yán)重程度，治療的頻率和持續(xù)時(shí)間可以調(diào)節(jié)。各種給藥系統(tǒng)是周知的，它們可用于本發(fā)明的藥物組合物的給藥，例如封裝于脂質(zhì)體、微粒、微膠囊中、能表達(dá)突變病毒的重組細(xì)胞、受體介導(dǎo)的胞吞作用(參閱例如Wuetal.(1987)J.Biol.Chem.262=4429-4432)0給藥方法包括但不限于皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜脈、皮下、經(jīng)鼻、硬膜外以及經(jīng)口腔給藥。該組合物可以任何方便的途徑給藥，例如，輸注或快速注射，經(jīng)上皮或皮膚粘膜內(nèi)層(例如口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)吸收，并可與其他生物活性劑一起給藥。給藥方式可以是全身性或局部性的。該藥物組合物也可以微囊尤其是脂質(zhì)體形式給藥(參閱Langerl990Science2491527-1533；Treatetal.(1989)inLiposomesintheTherapyofInfectiousDiseaseandCancer,Lopez-BeresteinandFidler(eds.),Liss,NewYork,pp.353-365;Lopez-Berestein,ibid.，PP.317-327；一般參閱同上)。在某些情況下，該藥物組合物可以一種控制性釋放系統(tǒng)給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用一個(gè)泵(參見(jiàn)Langer，見(jiàn)上；Sefton(1987)CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14201)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可采用聚合物材料(參閱MedicalApplicationsofControlledRelease,Langerandffise(eds.),CRCPres.,BocaRaton,Florida(1974))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可在該藥物組合物的目標(biāo)附近放置一個(gè)受控釋放系統(tǒng)，因此僅需要全身劑量的一部分(參見(jiàn)如Goodson，inMedicalApplicationsofControlledRelease(1984)同上，vol.2，pp.115-138)。其他受控釋放系統(tǒng)的討論見(jiàn)Langer(1990)，Science2491527-1533?？勺⑸渲苿┛砂o脈注射、皮下、皮內(nèi)和肌內(nèi)注射、滴注輸液等劑型。這些可注射制劑可以公知的方法制備。例如，可以將上述抗體或其鹽溶解、懸浮或乳化在通常用于注射的無(wú)菌水性介質(zhì)或油性介質(zhì)中，以此方式制備該可注射制劑。作為注射用的水性介質(zhì)有例如生理鹽水、含葡萄糖和其他助劑的等滲溶液等，可結(jié)合使用適當(dāng)?shù)脑鋈軇?，如?如乙醇)、多元醇(如丙二醇、聚乙二醇)、非離子型表面活性劑[例如聚山梨醇酯80、HC0_50(氫化蓖麻油的聚氧乙烯(50摩爾)加合物)]等。作為油性介質(zhì)，可采用例如芝麻油、豆油等，可結(jié)合使用增溶劑，如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等。如此制備的注射液最好是裝入一種適當(dāng)?shù)陌碴称恐小Ｓ欣氖?，上述口服或腸胃外使用的藥物組合物制備成單位劑量的劑型，以包含一定劑量的活性成分。這種單位劑量的劑型包括例如片劑、丸劑、膠囊、注射液(安瓿)、栓劑等。單位劑量的抗體含量一般為每劑約5至約500mg；對(duì)注射劑型，優(yōu)選的是抗體含量為約5至lOOmg，其他劑型中抗體含量為約10至250mg。單一治療和組合治療。本發(fā)明提供了一些治療方法，其中將本發(fā)明的抗體或抗體片段用于治療與各種涉及NGF的疾病有關(guān)的疼痛。本發(fā)明的抗NGF抗體或抗體片段對(duì)于治療與神經(jīng)源性、神經(jīng)性或傷害性疼痛相關(guān)的任何病癥所造成的疼痛特別有用。在一些優(yōu)選的神經(jīng)性疼痛實(shí)施方案中，優(yōu)選治療牽涉性三叉神經(jīng)痛、皰疹后神經(jīng)痛、幻肢痛、纖維肌痛、反射交感性營(yíng)養(yǎng)不良和神經(jīng)疼痛病癥。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，優(yōu)選治療癌癥疼痛、尤其是骨癌疼痛、骨關(guān)節(jié)炎或類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疼痛、下背疼痛、手術(shù)后刀口疼痛、骨折疼痛、骨質(zhì)疏松骨折疼痛、骨質(zhì)疏松、痛風(fēng)關(guān)節(jié)痛、糖尿病性神經(jīng)病變、坐骨神經(jīng)痛、與鐮刀細(xì)胞危象相關(guān)的疼痛、偏頭痛以及其他神經(jīng)性和/或傷害性疼痛。其他適應(yīng)癥包括諸如乳腺癌(Adriaenssensetal.(2008)CancerRes68346-51)。在本發(fā)明治療方法的具體實(shí)施方案中，患有與痛風(fēng)有關(guān)的關(guān)節(jié)痛的受試者接受了本發(fā)明的抗體或抗體片段以及任選的第二治療藥劑的組合治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選地第二治療劑為白介素I(IL-I)拮抗劑，如利洛納塞(rilonac印t)("IL-1抗酒石酸酸性磷酸酶”;Regeneron)。適當(dāng)?shù)牡诙委熕巹┛蔀檫x自以下的一種或多種藥劑利洛納塞、阿那白滯素(KINERET，Amgen)、人IL-I受體拮抗劑(ILlRa)的重組、非糖基化形式、抗-IL-18藥物，如IL-18BP或衍生物、IL-18抗酒石酸酸性磷酸酶、或一種抗體，如抗-IL-18、抗-IL-18R1、抗-IL-18Racp、抗-IL-6和/或抗_IL6Ra抗體。可與NGF抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合使用的其他組合治療，單獨(dú)使用或與IL-I拮抗劑組合使用，包括低劑量秋水仙堿、阿司匹林或其他NSAID、類固醇，如潑尼松龍、氨甲喋呤，低劑量環(huán)孢霉素A、TNF抑制劑，如ENBREL或HUMIRA、其他炎癥性抑制劑，如半胱天冬蛋白酶-1的抑制齊IJ、p38、IKK1/2、CTLA-4Ig等、和/或共治療藥物，如尿酸合成抑制劑來(lái)抑制尿酸在體內(nèi)的積聚，如別嘌呤醇、尿酸分泌啟動(dòng)子來(lái)加速體內(nèi)積聚的尿酸的快速分泌，例如，羧苯磺胺、苯磺唑酮和/或苯溴馬隆為尿酸分泌啟動(dòng)子的實(shí)例；皮質(zhì)類固醇；以及其他非類固醇抗炎藥物(NSAID)，抗癲癇藥物，如托吡酯、加巴噴丁、普瑞巴林；塞來(lái)考昔；或另一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素，如NT-3。實(shí)施例舉出以下實(shí)例是為了向本領(lǐng)域一般技術(shù)人員就如何準(zhǔn)備和利用本發(fā)明的方法和組合物提供一個(gè)完整的披露和說(shuō)明并非意在限制發(fā)明者視為其發(fā)明的范圍。已作出許多努力以確保所用數(shù)字(如數(shù)量、溫度等)的準(zhǔn)確性，但也應(yīng)考慮到某些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。除非另有說(shuō)明，份數(shù)指的是重量份數(shù)，分子量指平均分子量，溫度指攝氏度，壓力指大氣壓或接近大氣壓。統(tǒng)計(jì)分析是采用帶有Bondferroni事后檢驗(yàn)和TurkeyHSD事后檢驗(yàn)的混合析因ANOVA進(jìn)行的。實(shí)施例1.免疫接種和抗體生成嚙齒類動(dòng)物的免疫可采用本領(lǐng)域任何已知的方法進(jìn)行(參見(jiàn)如HarlowandLane,Antibodies:ALaboratoryManual(實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))ColdSpringHarborPress,NewYork；MalikandLillehoj,Antibodytechniques(抗體技術(shù))AcademicPress,SanDiego)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，直接對(duì)具有編碼人Ig重鏈可變區(qū)和κ輕鏈可變區(qū)的DNA基因座的小鼠施用人NGF蛋白(VEL0CIMMUNE，Regeneron；美國(guó)第6，596，541號(hào)專利)，并用佐劑刺激免疫應(yīng)答。這樣的佐劑包括完全和不完全弗氏佐劑、MPL+TDM佐劑系統(tǒng)(Sigma)，或RIBI(胞壁酰二肽)(參見(jiàn)0，Hagan,VaccineAdjuvant,HumanPress,2000，Totawa,NJ)。這樣的佐劑通過(guò)將抗原隔離在局部?jī)?chǔ)庫(kù)中而防止多肽快速分散，可能包含能夠刺激宿主免疫應(yīng)答的因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，NGF是利用宿主細(xì)胞蛋白表達(dá)機(jī)制作為包含NGF基因并表達(dá)NGF的DNA質(zhì)粒間接施用的，以在體內(nèi)產(chǎn)生抗原多肽。在這兩種方法中，為了獲得最佳的抗抗原應(yīng)答，對(duì)小鼠每34周給予加強(qiáng)注射，每次注射10天后收集血清樣本。利用標(biāo)準(zhǔn)抗原直接結(jié)合ELISA方法監(jiān)測(cè)抗體免疫應(yīng)答。加強(qiáng)后的血清樣本經(jīng)3倍系列稀釋后，力口到NGF包被的板上。血清滴度定義為在分析中能產(chǎn)生本底信號(hào)兩倍的血清樣本的稀釋度。具有最佳應(yīng)答的動(dòng)物在處死前34天通過(guò)靜脈和腹膜內(nèi)注射接受最后一次沒(méi)有佐劑的加強(qiáng)免疫。收獲的脾細(xì)胞按下述方法處理，以獲得抗原特異性的單克隆抗體。實(shí)施例2.單克隆抗體的分離在一個(gè)實(shí)施方案中，將表達(dá)抗體的B細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合以形成雜交瘤細(xì)胞。將雜交瘤細(xì)胞涂布在HAT選擇下的96孔板上，并讓其生長(zhǎng)10到20天。按下述方法對(duì)得自具有成長(zhǎng)中的雜交瘤細(xì)胞的孔中的條件培養(yǎng)基進(jìn)行篩查，檢查抗原結(jié)合和受體阻斷活性。對(duì)表達(dá)目標(biāo)抗體的雜交瘤細(xì)胞利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行單細(xì)胞亞克隆，并對(duì)克隆細(xì)胞瘤細(xì)胞的VH和VL基因進(jìn)行克隆和排序。還利用IgG貧化培養(yǎng)基(Invitrogen)從抗原特異性雜交瘤培養(yǎng)物中純化抗體蛋白質(zhì)，其特征說(shuō)明見(jiàn)下。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原特異性抗體直接從抗原陽(yáng)性B細(xì)胞中分離而沒(méi)有利用特定骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行永生化，并產(chǎn)生了一個(gè)產(chǎn)生穩(wěn)定重組抗體的宿主CHO細(xì)胞，如USSNl1/809,482(美國(guó)專利公開(kāi)書(shū)2007/0280945)所述。實(shí)施例3.原始抗原結(jié)合和受體阻斷篩查為了鑒定產(chǎn)生抗原特異性抗體的雜交瘤，融合后10到20天，從96孔板上采集了條件培養(yǎng)基樣本，并利用高通量直接結(jié)合ELISA測(cè)定了抗原結(jié)合特異性。簡(jiǎn)而言之，即讓110和1100倍稀釋的條件培養(yǎng)基以IOOng/孔結(jié)合到重組NGF蛋白包被的MAXIS0RB板上(Nunc)。結(jié)合在板上的抗體利用山羊抗小鼠IgGFcy特異性HRP偶聯(lián)的多克隆抗體(JacksonImmunoLab)檢測(cè)。板用TMB物質(zhì)顯影(BDPharmigen)并記錄了OD45tlnm光密度。平行進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的還有，同樣稀釋度的樣品被加到鏈霉抗生物素呈遞的生物素標(biāo)記的NGF板上，并檢測(cè)了結(jié)合在板上的抗體。選擇對(duì)兩個(gè)板任意一個(gè)顯示結(jié)合活性的孔進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)大并低溫保存，包含抗體的上清液則用于進(jìn)一步分析，以獲得特異性、親和力和功能性概況。除了直接抗原結(jié)合篩查之外，還利用功能性篩查來(lái)鑒定可分泌帶有符合需要的性質(zhì)的抗體的克隆。用IOOng/孔重組人TrkA-hFc包被1&化0計(jì)板并在41放置過(guò)夜。讓稀釋度為12和110的條件培養(yǎng)基在溶液中結(jié)合到2ng/ml生物素NGF上1小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到TrkA-hFc包被的板上測(cè)量結(jié)合到板上的生物素NGF。結(jié)合到板上的生物素NGF用HRP偶聯(lián)的鏈霉抗生物素(Pierce)檢測(cè)，用TMB物質(zhì)顯影(BDPharmingen)，并記錄了光密度。培養(yǎng)基阻止生物素-NGF結(jié)合到TrkA-hFc上的雜交瘤被鑒定為可能的阻斷劑，并對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一步特征研究。對(duì)96孔條件培養(yǎng)基進(jìn)行了類似的體外篩查，該培養(yǎng)基得自利用含有從抗原陽(yáng)性B細(xì)胞直接分離的V基因的完全人IgG轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞。此外，還利用抗原包被的LUMINEX珠對(duì)NGF的結(jié)合活性進(jìn)行了篩查，利用PE偶聯(lián)的山羊抗人IgGFcy特異性多克隆抗體檢測(cè)了珠上的抗原特異性結(jié)合抗體。用BIAC0RE對(duì)抗原結(jié)合抗體進(jìn)行親和力測(cè)定。簡(jiǎn)而言之，得自粗培養(yǎng)上清液的抗體被捕獲在一個(gè)胺偶聯(lián)的hFc特異性多克隆抗體表面上。監(jiān)測(cè)了單一濃度下抗體的結(jié)合。利用一個(gè)11雙分子相互作用模型來(lái)擬合結(jié)合傳感圖，以便利用同樣條件下每個(gè)抗體相互作用的動(dòng)態(tài)速率常數(shù)ka和kd來(lái)確定抗原結(jié)合的親和力(Kd)。具體來(lái)說(shuō)，山羊抗人IgGFcy特異性多克隆抗體被共價(jià)偶聯(lián)到CM-5芯片表面，然后注入含抗體的CHO上清液5分鐘，速率為1μ1/min,再用緩沖液清洗。注入人NGF(25nM)3分鐘，以便讓NGF結(jié)合到人抗體固定的表面。注入NGF后，立即在表面上以100μ1/min的速率注射緩沖液10分鐘，并記錄RU信號(hào)的衰減。再生表面以除去結(jié)合的抗體和NGF，然后用下一個(gè)CHO上清液樣品重復(fù)該循環(huán)。實(shí)施例4抗原結(jié)合親和力測(cè)定人NGF抗體的抗原結(jié)合親和力通過(guò)表面動(dòng)力學(xué)利用實(shí)時(shí)生物傳感器表面等離子體共振分析(BIAC0RE)進(jìn)行測(cè)定。抗體被捕獲在由捕獲抗體直接胺偶聯(lián)到BIAC0RE芯片上產(chǎn)生的山羊抗人或抗小鼠IgG多克隆抗體表面上。在捕獲的抗體表面上注射了各種濃度的人NGF，同時(shí)對(duì)抗原與抗體的結(jié)合以及對(duì)結(jié)合的復(fù)合物的解離進(jìn)行了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)分析以獲得平衡解離常數(shù)(Kd)和解離速率常數(shù)，后者被用來(lái)計(jì)算抗原/抗體復(fù)合物的解離t1/2(表1)。人源化抗人NGF單克隆抗體E3(“RN624”)(他尼珠(tanezumab)；CAS編號(hào)880266-57-9；美國(guó)專利公開(kāi)書(shū)2004/0237124)被用作對(duì)照。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>NGF與選擇的純化抗體的抗原結(jié)合親和力也通過(guò)表面動(dòng)力學(xué)采用上述實(shí)時(shí)生物傳感器表面等離子體共振分析(BIAC0RE)測(cè)定。為方便起見(jiàn)，抗體301272-3H10-A10被重新命名為“REGN261”(HCVR/LCVRSEQIDNO:84/92和hlgGlSEQIDNO541)；301272-6E07-D10被重新命名為“REGN263”(HCVR/LCVRSEQIDNO:208/216和hlgGlSEQIDNO:541)。測(cè)試的衍生抗體包括REGN472(HCVR/LCVRSEQIDNO100/102和hlgGlSEQIDNO541),REGN474(HCVR/LCVRSEQIDNO100/102和突變的hIgG4SEQIDNO543),REGN475(HCVR/LCVRSEQIDNO:108/110和突變的hIgG4SEQIDNO543)，REGN476(HCVR/LCVRSEQIDNO:224/226和突變的hIgG4SEQIDNO:543)，以及REGN477(HCVR/LCVRSEQIDNO:232/234和突變的hIgG4SEQIDNO543)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實(shí)施例5.對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素_3(ΝΤ-3)的交叉反應(yīng)性NGF和ΝΤ-3屬于神經(jīng)生長(zhǎng)因子家族，是能使特定的神經(jīng)元群存活的堿性分泌性小蛋白。盡管這兩種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素具有一定的氨基酸同一性，但是，它們的生物功能可能不同(Bardeetal.1990ProgGrowthFactorRes2(4):237_48)。檢查了抗NGF抗體與人NT-3的結(jié)合交叉反應(yīng)性。簡(jiǎn)而言之，將山羊抗人IgG多克隆抗體以化學(xué)方式連接到CM5芯片上。注射抗NGF單克隆抗體，通過(guò)與芯片偶聯(lián)的多克隆抗體相互作用形成了一個(gè)大約50到900RU的固定抗體的表面。在該表面上注射濃度為20nM的NGF或NT-3蛋白質(zhì)，接著用緩沖液清洗，以便使結(jié)合的配體解離。對(duì)結(jié)合相和解離相都進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。結(jié)果示于表3(NB=未觀察到結(jié)合活性)。與對(duì)照抗體(RN624)相比，所有測(cè)試的抗體均未顯示可測(cè)量的與NT-3的結(jié)合，因此表明相對(duì)于對(duì)照抗體有較高程度的抗原特異性。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>還采用了基于OCTET的溶液競(jìng)爭(zhēng)分析來(lái)測(cè)量REGN475和RN624在溶液中競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合NT-3、NGF或人腦衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(hBDNF)的能力。簡(jiǎn)而言之，抗體-抗原樣品是在30°C下通過(guò)各種濃度的NT-3(0到4μM)、hBDNF(0到4μM)或NGF(0到0.2μΜ)與對(duì)照抗體RN624(2.5μg/ml)或REGN475(2.5μg/ml)預(yù)孵育1小時(shí)制備的。將鏈霉抗生物素高結(jié)合FA傳感器(HBS，F(xiàn)orteBio，Inc.，CA)與2μg/ml生物素NGF在30°C下孵育lOmin。然后將生物素-NGF結(jié)合的傳感器與預(yù)孵育的抗原-抗體樣品一起在30°C下孵育lOmin。孵育后，測(cè)量了生物層厚度的變化。將結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)化為相對(duì)于抗體在無(wú)競(jìng)爭(zhēng)情況下的結(jié)合的結(jié)合百分?jǐn)?shù)。如表4所示，NGF和RN624之間的結(jié)合被NT-3以劑量依賴性的方式阻斷，而REGN475和NGF之間的結(jié)合未被NT-3所阻斷。存在hBDNF并不能阻斷RN624或REGN475與NGF的結(jié)合，而可溶性NGF的存在則幾乎完全阻斷了RN624和REGN475結(jié)合到固定的NGF上。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>還利用BIAC0RE分析評(píng)估了選擇的純化人抗NGF抗體REGN472、REGN474、REGN475、REGN476、REGN477或?qū)φ湛贵wRN624與NT-3之間的結(jié)合，NT-3的濃度范圍為從1.25nM到40nM。盡管對(duì)照抗體(RN624)與NT-3結(jié)合的Kd為1.InM，所有測(cè)試的抗體均未顯示對(duì)NT-3的任何可測(cè)量的親和力。實(shí)施例6.與鼠和大鼠NGF的交叉反應(yīng)性在氨基酸序列上，人NGF(NGF)與小鼠NGF(mNGF)和大鼠NGF(rNGF)是高度同源的，同一性為大約90%。如上所述，對(duì)抗體與mNGF和rNGF的結(jié)合親和力進(jìn)行了測(cè)定。所有抗體對(duì)mNGF和rNGF均顯示交叉反應(yīng)性。一組抗體與所有物種的NGF強(qiáng)力結(jié)合，Kd值低于IOpM；第二組優(yōu)先結(jié)合NGF，對(duì)mNGF和rNGF顯示Kd>IOOpM(對(duì)照=RN624)(表5)。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>還測(cè)定了選擇的純化抗NGF抗體與mNGF和rNGF的結(jié)合親和力(表6)。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>實(shí)施例7.NGF與受體TrkA/hFc和p75/hFc的結(jié)合的抑制為了鑒定阻斷抗體，利用BIAC0RE3000儀器設(shè)計(jì)了受體阻斷分析。重組人TrkA-hFc和人p75_hFc蛋白經(jīng)胺偶聯(lián)到CM5芯片上，密度為大約5000-6000RU。人NGF(IOnM到25nM)被結(jié)合到TrkA和p75表面以測(cè)定NGF結(jié)合的最大RU。然后對(duì)表面進(jìn)行再生，將IOnM到25nMNGF與過(guò)量摩爾濃度的各個(gè)抗體或可溶受體相混合，并將溶液注射到再生的芯片表面，以確定剩余的游離NGF結(jié)合信號(hào)。表7顯示在抗體或受體存在的情況下，游離NGF結(jié)合到TrkA和p75的百分?jǐn)?shù)。在不存在抗體的情況下人NGF的最大RU結(jié)合被指定100%的相對(duì)值。陽(yáng)性對(duì)照采用RN624、TrkA-hFc和p75_hFc溶液，陰性結(jié)合對(duì)照采用IgGl對(duì)照(AVASTIN;Genentech，CA)。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>還利用競(jìng)爭(zhēng)夾心酶免疫吸附法(ELISA)定量地測(cè)量了選擇的測(cè)試抗體REGN472、REGN474、REGN475、REGN476和REGN477以及對(duì)照抗體RN624阻斷人NGF結(jié)合到人TrkA和P75受體的能力，其中固定濃度NGF溶液中有抗體存在時(shí)可防止NGF與包被在微量滴定板上的TrkA-hFc或p75-hFc結(jié)合。分析中所用的人NGF為從大腸桿菌產(chǎn)生的重組蛋白，人TrkA-hFc和p75-hFc蛋白為由與人IgGl的Fc部分直列融合的相應(yīng)受體細(xì)胞外域組成的二聚融合蛋白。在室溫下，用從1.5pM到1.5nM之間各種含量的抗體溶液滴定固定濃度為50pM、生物素標(biāo)記的NGF蛋白1小時(shí)。通過(guò)將生物素-NGF捕獲在hTrkA_hFc或hp75_hFc包被的微量滴定板上，接著用鏈霉抗生物素-HRP檢測(cè)板結(jié)合的生物素標(biāo)記的NGF來(lái)對(duì)溶液混合物中未結(jié)合的游離生物素-NGF進(jìn)行定量。具體來(lái)說(shuō)，微量滴定板是在4°C下，通過(guò)在板上包被0.5μg/mlhTrkA-hFc或1μg/mlhp75_hFc的PBS緩沖溶液過(guò)夜，然后在使用前用0.5%BSA封閉板而制備的。為了測(cè)量未結(jié)合的生物素-NGF，將預(yù)孵育的抗體和生物素-NGF溶液轉(zhuǎn)移到受體包被的板上，并在室溫下孵育1小時(shí)。利用鏈霉抗生物素-HRP檢測(cè)結(jié)合在板上的生物素標(biāo)記的NGF，用比色TMB底物顯影，并記錄了OD45tlnm光密度。利用raiSMTM(GraphPad,CA)提供的S型劑量-響應(yīng)模型分析了OD45tlnm值對(duì)預(yù)結(jié)合溶液中REGN475濃度的依賴性。預(yù)測(cè)的IC5tl值定義為阻斷50%的50pM生物素標(biāo)記NGF與受體包被板的結(jié)合所需要的抗體濃度，用來(lái)指示抗體阻斷NGF結(jié)合到hTrkA-hFc或hp75_hFc上的效能。表8顯示針對(duì)hTrkA-hFc和hp75_hFc測(cè)試的每種抗體的IC5tl值。對(duì)照mAb=RN624。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>實(shí)施例8.對(duì)ΝΤ-3與受體TrkA-、TrkB-,TrkC-和p75_hFc結(jié)合的抑制還測(cè)試了在500nMREGN475、RN624和AVASTIN(IgGl對(duì)照)存在的條件下，20nM人NT-3分別與人TrkA-、TrkB-,TrkC-和p75_hFc表面的結(jié)合。利用胺偶聯(lián)程序?qū)⑷薚rkA-hFc(9300RU)、人TrkB-hFc(6000RU)、人TrkC-hFc(9100RU)和人p75_hFc(7500RU)共價(jià)偶聯(lián)到BIACORECM5芯片表面。將20nM人NT-3與500nM對(duì)照(IgGl對(duì)照AVASTIN)、REGN475、RN624、hTrkA-hFc、TrkB-hFc、TrkC-hFc或p75_hFc在溶液中混合。結(jié)合混合物首先在室溫下孵育以達(dá)到平衡(大約1小時(shí))，然后注射到上述TrkA-hFc、TrkB-hFc、TrkC-hFc和p75_hFc的表面。測(cè)定了每個(gè)樣品中人NT-3結(jié)合的水平。每個(gè)樣品混合物的結(jié)合RU按照陰性對(duì)照樣品(即帶有500nMAVASTIN的20nM人NT-3)的RU值標(biāo)準(zhǔn)化，并表示為與Trk表面結(jié)合的％(表9)。對(duì)ΝΤ-3與受體的結(jié)合，REGN475幾乎未顯示任何干擾，而其余樣品則對(duì)ΝΤ-3與受體的結(jié)合顯示顯著的阻斷。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>實(shí)施例9.NGF生物活性的體外中和NGF抗體阻斷NGF依賴性和TrkA受體介導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)活性的能力的研究是利用由編碼人TrkA受體的質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MG87細(xì)胞進(jìn)行的。簡(jiǎn)而言之，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞被胰蛋白酶化并以每毫升大約2.5x10s細(xì)胞的密度重新懸浮，然后以每孔5，000細(xì)胞涂布到96孔組織培養(yǎng)板上。純化的抗體蛋白質(zhì)用確定的培養(yǎng)基加0.BSA進(jìn)行系列稀釋，并加到涂布的細(xì)胞上，濃度范圍為從0到500nM。向孔中加入人NGF，最終濃度為373pM。在一個(gè)加濕的5%CO2培養(yǎng)箱中于37°C培養(yǎng)3天后，測(cè)量應(yīng)答。用CCK8試劑盒(Dojindo)測(cè)量了細(xì)胞生長(zhǎng)活性并記錄了OD45tlnm光密度。分析了信號(hào)對(duì)抗體濃度的依賴性并報(bào)告了IC5tl值(表10，第2欄)。另外還用大鼠腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞系PC12對(duì)NGF抗體阻斷NGF信號(hào)p75和TrkA受體介導(dǎo)的活性的能力進(jìn)行了體外測(cè)量，PC12可內(nèi)源性表達(dá)上面兩種受體(Urdialesetal.1998J.Neuroscience18(17):6767_6775)。簡(jiǎn)而言之，PC12細(xì)胞被含有連接到螢光素酶基因的血清應(yīng)答元件(SRE)的報(bào)道質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以每毫升大約2.5x10s細(xì)胞的密度重新懸浮，然后以每孔50，000細(xì)胞加到96孔組織培養(yǎng)板上的Opti-MEM培養(yǎng)基中過(guò)夜。純化的抗體蛋白質(zhì)用培養(yǎng)基(DMEM加0.1%BSA)進(jìn)行系列稀釋，并加到涂布的細(xì)胞上，濃度范圍為從0到ΙΟΟηΜ。向孔中加入人NGF，最終濃度為12.5pM。將細(xì)胞于37°C在一個(gè)加濕的7.5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時(shí)后，利用BRIGHTGLOW螢光素酶分析系統(tǒng)(Promega)測(cè)量了螢光素酶活性。IC5tl值按如上所述的方法測(cè)定并報(bào)各于表10第3欄中。對(duì)照mAb=RN624。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>另外，還利用上述螢光素酶分析方法評(píng)估了選擇的純化抗NGF抗體REGN472、REGN474和REGN475以及對(duì)照mAbRN624通過(guò)PC12細(xì)胞系中p75和TrkA受體介導(dǎo)的活性阻斷NGF信號(hào)的能力(表11)。表11<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>利用上述螢光素酶分析方法評(píng)估了抗NGF抗體REGN475和對(duì)照抗體通過(guò)PC12細(xì)胞系中ρ75和TrkA受體介導(dǎo)的活性阻斷ΝΤ-3信號(hào)的能力，所做的變動(dòng)是12.5pMNGF換成了75ηΜΝΤ-3。結(jié)果表明，對(duì)照mAbRN624阻斷NT-3信號(hào)的IC5tl大約為104.8nM，而在當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)條件下，REGN475并不影響ΝΤ-3的信號(hào)傳遞。進(jìn)一步還研發(fā)了測(cè)量抗NGF抗體REGN475和RN624通過(guò)TrkC在體外中和ΝΤ-3介導(dǎo)的細(xì)胞功能的生物分析方法。用一個(gè)SRE-螢光素酶報(bào)道質(zhì)粒轉(zhuǎn)染了表達(dá)TrkC的工程ΗΕΚ293細(xì)胞系。在一個(gè)6小時(shí)的分析中，ΝΤ-3驅(qū)動(dòng)螢光素酶的表達(dá)。利用螢光素酶分析評(píng)估了REGN475和RN624通過(guò)TrkC受體介導(dǎo)的活性在此工程細(xì)胞系中阻斷ΝΤ-3信號(hào)的能力。將工程ΗΕΚ293細(xì)胞系以每孔IxlO4細(xì)胞加入到96孔板上的無(wú)血清培養(yǎng)基中，并在37°C和5%CO2下培養(yǎng)過(guò)夜。濃度范圍為1.6μM到28ρΜ的REGN475和RN624與15ρΜΝΤ-3一起預(yù)孵育1小時(shí)，然后將該混合物加到細(xì)胞中。然后在37°C、5%C02下培養(yǎng)細(xì)胞6小時(shí)。通過(guò)加入相等孔體積的BRIGHTGLOW(Promega)測(cè)定螢光素酶活性。結(jié)果顯示，在15pM恒定濃度NGF存在的條件下，RN624抑制NT-3介導(dǎo)的螢光素酶活性的IC5tl值為150_200ηΜ，而REGN475對(duì)于ΝΤ-3介導(dǎo)的螢光素酶活性沒(méi)有抑制作用。實(shí)施例10.NGF生物活性的體內(nèi)中和炎癥性疼痛的完全弗氏佐劑(CFA)測(cè)試。為了確定抗NGF抗體在一個(gè)慢性周圍炎癥性小鼠模型中是否能夠減輕疼痛，在C57BL/6雄性小鼠的后爪皮下注射了完全弗氏佐劑(CFA)，造成熱痛覺(jué)過(guò)敏，并用Hargreaves實(shí)驗(yàn)(Torresetal.(2007)Pain130:267-278)對(duì)疼痛進(jìn)行測(cè)量。對(duì)照小鼠僅接受載體(即PBS)。在小鼠經(jīng)過(guò)3天每天2-3小時(shí)適應(yīng)了Hargreaves裝置(336型，IITCLifeScience)之后，將活動(dòng)強(qiáng)度設(shè)置為17%，在該裝置中進(jìn)行測(cè)試。采用25秒截止時(shí)間以避免組織損傷。對(duì)每只小鼠，每天在30分鐘時(shí)間內(nèi)獲得3個(gè)讀數(shù)，中值潛伏時(shí)間用于分析。獲得了Hargreaves裝置的基線讀數(shù)之后，在后爪腳掌內(nèi)注射50%CFA溶液(10mg/20μ1)之前一小時(shí)，皮下注射10mg/kg或25mg/kg的測(cè)試抗NGF抗體301272-7E05-F6(REGN268)和301272-7G09-E4(REGN270)，以及作為陽(yáng)性對(duì)照的人源化抗NGF抗體(RN624)。CFA注射之后，Hargreaves實(shí)驗(yàn)每天重復(fù)進(jìn)行多達(dá)4天，計(jì)算了爪收回潛伏時(shí)間相對(duì)于基線的降低％(表12和表13，平均％變化士SEM)。與僅接受載體的動(dòng)物相比較，對(duì)于每種受試的抗體，至少在實(shí)驗(yàn)中有一天觀察到熱痛覺(jué)過(guò)敏有顯著的降低(ρ<0.001-0.05)。測(cè)試抗體和對(duì)照抗體之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表12每組η=7；所有組10mg/kg。表13載體:n=5；對(duì)照RN624:n=5，10mg/kg；兩個(gè)REGN269:n=9)。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表13<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>手術(shù)后傷口疼痛模型。利用一個(gè)嚙齒動(dòng)物手術(shù)后疼痛模型來(lái)研究抗NGF抗體治療的有效性，該模型中，一個(gè)后爪腳掌切口造成對(duì)觸摸的敏感性增加、保護(hù)行為和熱痛覺(jué)過(guò)敏。腳掌切口手術(shù)中，C57BL/6小鼠在異氟烷麻醉下接受通過(guò)皮膚、筋膜的切口，然后分離下面的屈肌并垂直切為兩部分?？p合恢復(fù)后，小鼠5天中在Hargreaves試驗(yàn)中接受熱痛覺(jué)過(guò)敏測(cè)試，并在負(fù)重測(cè)試(600型，IITCLifeScience)中接受保護(hù)行為測(cè)試。在切口前1小時(shí)，單次皮下注射載體(η=7)、mAbREGN268(η=7)或?qū)φ誱AbRN624(η=7)，劑量為10mg/kg(表14，相對(duì)于Hargreaves基線的平均百分變化士SEM)。表15顯示負(fù)重測(cè)試的結(jié)果(受影響的后肢上平均重量分布百分?jǐn)?shù)士SEM)(每組η=7，對(duì)照RN624和REGN268各為10mg/kg)。在兩次測(cè)試中，與僅接受載體的對(duì)照小鼠相比，用測(cè)試抗體或?qū)φ湛贵w預(yù)治療顯著降低了手術(shù)后疼痛(P<0.001-0.05)。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表15<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>為了研究抗NGF抗體是否能夠在手術(shù)后刀口疼痛模型中減輕形成的疼痛，在手術(shù)后的第一天進(jìn)行了行為研究工作后，對(duì)動(dòng)物腹膜內(nèi)注射了REGN475(25mg/kg，η=7)、RN624(25mg/kg，n=7)和IgGl對(duì)照抗體(25mg/kg，n=7)。熱痛覺(jué)過(guò)敏測(cè)試用Hargreaves試驗(yàn)進(jìn)行，機(jī)械異常性疼痛用vonFrey試驗(yàn)進(jìn)行。在vonFrey試驗(yàn)中，小鼠在一個(gè)底部是金屬網(wǎng)的裝置中每天適應(yīng)了2-3個(gè)小時(shí)，共適應(yīng)4天后進(jìn)行測(cè)試。按照遞增的次序通過(guò)金屬網(wǎng)孔用一系列vonFrey絲線接觸有切口的后爪的腳掌表面，進(jìn)行測(cè)試。如果對(duì)絲線觸動(dòng)的反應(yīng)是爪子從平臺(tái)上舉起，則被認(rèn)為是陽(yáng)性反應(yīng)。從最細(xì)的絲線開(kāi)始，用每根vonFrey絲線觸動(dòng)多達(dá)5次，直到觀察到反應(yīng)。Hargreaves試驗(yàn)的結(jié)果(表16)表明到手術(shù)后72小時(shí)，REGN475抗體治療導(dǎo)致熱痛覺(jué)過(guò)敏顯著逆轉(zhuǎn)(ρ<0.001-0.01)。RN624治療的小鼠群未見(jiàn)這種回到基線的情況，而是與IgG對(duì)照治療組行為相似。在vonFrey試驗(yàn)中(腳掌收縮閾值)(g)(表17)，兩種抗NGF抗體對(duì)機(jī)械異常性疼痛都產(chǎn)生了類似的減輕作用(P<0.001-0.05)(IgGl對(duì)照=AVASTIN,25mg/kg,η=7；RN624,25mg/kg,η=7；REGN475，25mg/kg，η=7)。表16<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>表17<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>第4天，在切口后疼痛模型的行為試驗(yàn)完成后，收集了小鼠的血清并用夾心酶免疫吸附法(ELISA)分析了神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3(ΝΤ-3)的循環(huán)水平。檢測(cè)極限(40pg/ml)被定義為背景之上兩倍標(biāo)準(zhǔn)偏差(2σ)，并用至少5個(gè)ΝΤ-3標(biāo)準(zhǔn)定義對(duì)濃度曲線的響應(yīng)。與用REGN475(未檢測(cè)到=ND,η=7)或IgG對(duì)照(AVASTIN;ND，η=7)治療的小鼠相比，用RN624治療的小鼠的ΝΤ-3水平(平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差pg/ml，表18)顯示出顯著的增力口(172士114pg/ml，η=7)。表18<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>為了比較起見(jiàn)，初次接受試驗(yàn)的C57BL/6小鼠在異氟烷麻醉下接受50mg/kg的REGN475、RN624或IgGl對(duì)照mAb(AVASTIN)皮下注射，在治療后第1、7和14天利用夾心ELISA分析了血清中NT-3的水平。檢測(cè)極限(40pg/ml)被定義為背景之上兩倍標(biāo)準(zhǔn)偏差(2σ),并用至少5個(gè)NT-3標(biāo)準(zhǔn)定義對(duì)濃度曲線的響應(yīng)。上述手術(shù)后切口疼痛模型觀察表明，與REGN475(ND，η=6)或IgG對(duì)照(ND，η=6)相比，RN624治療的小鼠的ΝΤ-3水平(表19)升高了(131-199pg/ml，η=6)。表19<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>急性痛風(fēng)關(guān)節(jié)痛模型。通過(guò)注射尿酸單鈉(MSU)晶體到踝部而造成關(guān)節(jié)疼痛的小鼠模型被用來(lái)研究本發(fā)明抗體治療痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)痛的療效。將無(wú)內(nèi)毒素的MSU晶體(0.5mg/20μ1)注射到C57BL/6小鼠的踝關(guān)節(jié)內(nèi)，然后在注射MSU晶體后用Hargreaves試驗(yàn)測(cè)試小鼠的腳后跟熱痛達(dá)三天。Hargreaves試驗(yàn)的適應(yīng)參數(shù)和裝置設(shè)定如上所述。在MSU晶體注射到踝關(guān)節(jié)之前1小時(shí)，皮下注射測(cè)試mAb7E05-F6(REGN268；η=7)、6E07-D10(REGN263；η=7)，或?qū)φ盏娜嗽椿痬Ab(RN624；η=7)，或載體(η=7)，劑量為10mg/kgo如表20和表21所示，與僅接受載體的對(duì)照小鼠相比，測(cè)試抗體顯著地降低了關(guān)節(jié)疼痛(P<0.001-0.05)。表20<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表21<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>通過(guò)對(duì)小鼠注射一種IL-I拮抗劑(IL-Itrap(利洛西普)，Economidesetal.(2003)Nature9:47-52)或秋水仙素進(jìn)行了抗NGF抗體在急性痛風(fēng)模型中減輕形成的疼痛的能力的進(jìn)一步研究。注射MSU晶體到踝關(guān)節(jié)一天后，對(duì)小鼠注射mIL-ltrap(35mg/kg；η=7)、秋水仙素(lmg/kg；η=7)、對(duì)照mAbRN624(10mg/kg；η=7)，或載體(η=7)，并如上所述測(cè)試熱痛覺(jué)過(guò)敏。另外，另一批小鼠(η=3)接受了mIL-ltrap和對(duì)照RN624的聯(lián)合治療。在治療后第2天，與僅用載體治療(ρ<0.001-0.05)，或單獨(dú)使用抗抗體治療(P<0.001)，或單獨(dú)使用IL-I拮抗劑治療相比(ρ<0.001)，抗NGF抗體和IL-I拮抗劑的聯(lián)合治療顯著地減輕了形成的熱痛覺(jué)過(guò)敏(表22)。表22<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>神經(jīng)性疼痛。對(duì)C57BL／6雄性小鼠采用神經(jīng)性疼痛的部分坐骨神經(jīng)結(jié)扎模型(SeltZer模型)(Malmbergeta1．(1998)Pain76215—222)，其中通過(guò)用7一。絲質(zhì)縫合線在每只小鼠一條大腿的坐骨神經(jīng)大約l／3到l／2直徑處打一個(gè)很緊的結(jié)產(chǎn)生部分神經(jīng)損傷。手術(shù)后，讓小鼠恢復(fù)至少兩天，然后利用HargreaVeS測(cè)試在術(shù)后數(shù)周內(nèi)研究小鼠的熱疼痛過(guò)敏。對(duì)照小鼠進(jìn)行了假手術(shù)，該手術(shù)中，暴露了坐骨神經(jīng)并提起，但未結(jié)扎。術(shù)后，在術(shù)后第4天和第7天對(duì)小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，以便確認(rèn)已經(jīng)產(chǎn)生了熱痛覺(jué)過(guò)敏。手術(shù)后第7天，對(duì)小鼠皮下注射mAbREGN268(100mg/kg)、IgGl對(duì)照(AVASTIN100mg/kg)以及載體。在這一神經(jīng)損傷模型中，REGN268顯著地減輕了形成的熱痛覺(jué)過(guò)敏(表23;p<0.05)。在假手術(shù)小鼠中未觀察到這種疼痛減輕。結(jié)果表達(dá)為相對(duì)于Hargreaves基線的平均百分變化士SEM(假手術(shù)載體，η=3；假手術(shù)-100mg/kgIgGl對(duì)照(AVASTIN),η=4；假手術(shù)-100mg/kgREGN268,η=5；Seltzer-載體，η=5；Seltzer-100mg/kgIgGl對(duì)照(AVASTIN),η=5；Seltzer-100mg/kgREGN268,η=8)。表23<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>100mg/kgREGN268,n=7)。表24<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>第三個(gè)試驗(yàn)中，用Seltzer模型對(duì)另一個(gè)抗NGF抗體REGN475的能力進(jìn)行了測(cè)試。Seltzer手術(shù)后，在術(shù)后第5天和第7天對(duì)小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，以便確認(rèn)已經(jīng)產(chǎn)生了熱痛覺(jué)過(guò)敏。然后，在手術(shù)后第7天，對(duì)小鼠皮下或腹膜內(nèi)注射REGN475(50mg/kg)、對(duì)照mAbRN624(50mg/kg)或IgGl對(duì)照(AVASTIN)(50mg/kg)。兩批小鼠中，無(wú)論是皮下注射(表25)還是腹膜內(nèi)注射(表26)抗NGF抗體，都觀察到了顯著的疼痛減輕，而對(duì)照IgGl未顯示任何疼痛減輕效應(yīng)(P<0.001-0.05)(相對(duì)于Hargreaves基線的平均百分變化士SEM；50mg/kgIgGl對(duì)照，n=7；50mg/kgRN624,n=7；50mg/kgREGN475,n=7)。表25<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表26<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>為了確定抗體在體內(nèi)中和人NGF活性的能力，準(zhǔn)備了內(nèi)源小鼠NGF基因座被人NGF基因置換的轉(zhuǎn)基因小鼠。這些小鼠被用于Seltzer神經(jīng)性疼痛模型來(lái)測(cè)試REGN268和對(duì)照mAb。Seltzer術(shù)后，在術(shù)后第4天和第8天對(duì)小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，以便確認(rèn)已經(jīng)產(chǎn)生了熱痛覺(jué)過(guò)敏。然后，在手術(shù)后第8天，對(duì)小鼠皮下注射50mg/kgmAbREGN268(n=7)、50mg/kg對(duì)照RN624(n=8)，或50mg/kgIgGl對(duì)照(AVASTIN)(n=6)。結(jié)果(表27)表明，REGN268在減輕人源化NGF小鼠的神經(jīng)性疼痛方面與人源化抗NGF抗體同樣有效，而IgGl對(duì)照卻沒(méi)有任何減輕疼痛的效應(yīng)(P<0.05)。表27<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>實(shí)施例11.抗NGF對(duì)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)機(jī)能的影響為了研究抗NGF治療是否能夠改變運(yùn)動(dòng)機(jī)能，評(píng)估了初次受試C57BL/6雄性小鼠在旋轉(zhuǎn)測(cè)試中的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力。首先訓(xùn)練動(dòng)物待在轉(zhuǎn)棒儀上(ColumbusInstruments,3.5cm直徑，9cm寬)，旋轉(zhuǎn)速度逐漸加快(最大轉(zhuǎn)速lOrpm)。訓(xùn)練中，小鼠保持在lOrpm的轉(zhuǎn)棒儀上，直到它們能夠連續(xù)行走60秒，或直到它們連續(xù)3天每天在lOrpm的轉(zhuǎn)棒儀上走動(dòng)了2分鐘。訓(xùn)練之后，將每只動(dòng)物連續(xù)3次放在轉(zhuǎn)速為lOrpm的轉(zhuǎn)棒儀上(每次測(cè)試之間有一簡(jiǎn)短間隔)，并記錄摔下的潛伏時(shí)間。1分鐘后，移開(kāi)動(dòng)物，如果它們沒(méi)有摔下來(lái)，則記60秒的分?jǐn)?shù)。每只小鼠三次測(cè)試的中值分?jǐn)?shù)用于分析。在轉(zhuǎn)棒儀上獲得基線讀數(shù)后，皮下注射50mg/kg或100mg/kg的mAbsREGN475、RN624,或IgG陰性對(duì)照。抗體注射后，對(duì)小鼠進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)20天的測(cè)試。結(jié)果(表28，表達(dá)為摔下潛伏時(shí)間，單位為秒)(平均值士sem)表明，用RN624而不是用REGN475治療的小鼠具有顯著的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力損害(p<0.001-0.05)。很有趣的是，據(jù)報(bào)道，NT-3和TrkC敲除小鼠顯示異常運(yùn)動(dòng)和姿勢(shì)，并失去了本體感受(Ernforsetal.(1994)Cell77:503_512；和Kleinetal.(1994)Nature368=249-251)。除了轉(zhuǎn)棒儀外，還對(duì)注射抗NGF抗體的首次受試小鼠進(jìn)行了Hargreaves和vonFrey試驗(yàn)。在施用抗體后20天所進(jìn)行的Hargreaves和vonFrey試驗(yàn)中，在任何實(shí)驗(yàn)組的小鼠中(每組n=6)，均未見(jiàn)任何顯著差別。表28<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>實(shí)施例12.皰疹后神經(jīng)痛患者的治療一位在帶狀皰疹部位形成了慢性疼痛的患者被診斷為患有皰疹后神經(jīng)痛。對(duì)該患者施用了治療有效量的包含本發(fā)明抗NGFmAb的藥學(xué)上可接受的組合物進(jìn)行治療。藥物施用可通過(guò)皮下注射或靜脈注射，抗NGF抗體的濃度最好在0.1到10mg/kg體重之間。治療頻度可為每1-12周治療一次，或視需要決定。施用抗NGF抗體組合物后幾天內(nèi)，患者的疼痛達(dá)到了實(shí)質(zhì)性減輕。重復(fù)施用抗NGFmAb組合物維持了這種疼痛減輕狀態(tài)。實(shí)施例13.骨關(guān)節(jié)炎疼痛患者的治療一位因骨關(guān)節(jié)炎在任何關(guān)節(jié)造成中度到嚴(yán)重疼痛的患者接受了治療有效量的包含本發(fā)明抗NGFmAb的藥學(xué)上可接受的組合物的治療。該組合物可以靜脈注射，抗NGF抗體濃度可為10Ug/kg體重到10mg/kg體重之間。治療頻度可為每1-12周治療一次，或視需要決定。施用抗NGF抗體組合物后幾天內(nèi)，患者的疼痛達(dá)到了實(shí)質(zhì)性減輕，受影響的關(guān)節(jié)重新獲得了活動(dòng)能力。該治療可視需要重復(fù)進(jìn)行。權(quán)利要求一種特異性地結(jié)合人神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的人抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，其KD經(jīng)表面等離子體共振測(cè)量為5pM或更低，其中該抗體或其片段與人NGF結(jié)合的KD值比與大鼠和小鼠NGF結(jié)合的KD值高大約2倍到大約10倍。2.如權(quán)利要求1所述的人抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗體片段包含一個(gè)重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(HCDR3)和一個(gè)輕鏈⑶R3(IXDR3)，其中所述HCDR3和IXDR3包含的氨基酸序列分別與SEQIDNO:90和98所列的氨基酸序列至少具有90%的序列同一性。3.如權(quán)利要求2所述的人抗體或抗原結(jié)合片段，其進(jìn)一步包含一個(gè)HCDR1、HCDR2、LCDRl和LCDR2，其中HCDRl為SEQIDNO:86，HCDR2為SEQIDNO88,LCDRl為SEQIDNO94，且LCDR2為SEQIDNO:96。4.一種特異性結(jié)合人神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的人抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，其Kd為5PM或更低，其中該抗體或其抗原結(jié)合片段包含一個(gè)重鏈可變區(qū)(HCVR)和一個(gè)輕鏈可變區(qū)(LCVR)，其中所述HCVR禾口LCVR為與SEQIDNO108和110或SEQIDNO100禾口102中所列的氨基酸序列至少具有90%序列同一性的氨基酸序列。5.一種以5pM的KD特異性結(jié)合人NGF且包含HCDR3和IXDR3的人抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，其中HCDR3包含結(jié)構(gòu)式為Xi-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xiq-Xii-Xi2-X13-X14-X15-X16-X17-X18的氨基酸序列(SEQID而537)，其中父1為六1￡1或5吐，鏟為1111~或1^8，父3為6111或116，X4為Phe或Gly,X5為Val或Gly,X6為Val或Trp,X7為Val或Phe,X8為Thr或Gly,X9為Asn或Lys，X10為Phe或Leu，X11為Asp或Phe，X12為Asn或Ser，X13為Ser或缺失，X14為Tyr或缺失，X15為Gly或缺失，X16為Met或缺失，X17為Asp或缺失，以及X18為Val或缺失；且LCDR3包含結(jié)構(gòu)式為X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9的氨基酸序列(SEQIDN0:540)，其中X1為Gin,X2為Gin,X3為Tyr,X4為Asn,X5為Arg或Asn,X6為Tyr或Trp,X7為Pro,X8為Tyr或Trp，且X9為Thr。6.如權(quán)利要求5所述的抗體或抗體片段，該抗體或抗體片段進(jìn)一步包含HCDRl、HCDR2、LCDRl和LCDR2，其中HCDRl包含結(jié)構(gòu)式為X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8的氨基酸序列(SEQIDN0:535)，其中X1為Gly,X2為Phe,X3為Thr或Asn,X4為Phe或Leu,X5為Thr或Asp,X6為Asp或Glu,X7為Tyr或Leu，且X8為Ser或Ala；HCDR2包含結(jié)構(gòu)式為X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8的氨基酸序列(SEQIDN0:536)，其中X1為Ile或Phe,X2為Asp或Ser,X3為Pro或Trp,X4為Glu或Asn,X5為Asp或Ser,X6為Gly,X7為Thr、Glu或Ser,X8為Thr或Ile；LCDRl包含結(jié)構(gòu)式為X1-X2-X3-X4-X5-X6的氨基酸序列(SEQIDNO:538)，其中X1為Gln或Arg,X2為Ala、Ser或Thr，X3為Val或Ile，X4為Arg或Thr，X5為AsruPhe或Tyr，且X6為Asp或Asn；以及LCDR2包含結(jié)構(gòu)式為X1-X2-X3的氨基酸序列(SEQIDNO539)，其中X1是Gly或Ala；X2是Ala，且X3是Ser或Phe。7.編碼如權(quán)利要求1到6中任何一項(xiàng)所述的人抗體或抗原結(jié)合片段的核酸分子。8.一種包含如權(quán)利要求7所述的核酸分子的表達(dá)載體。9.一種產(chǎn)生抗人NGF抗體或抗體的抗原結(jié)合片段的方法，其步驟包括將權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體引入一個(gè)分離的宿主細(xì)胞，在允許該抗體或抗體片段產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞，和收集所產(chǎn)生的抗體或抗體片段。10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞、CHO細(xì)胞或COS細(xì)胞。11.一種包含如權(quán)利要求1至6中任何一項(xiàng)所述的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段以及一種藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物。12.如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其進(jìn)一步包含選自白介素-I(IL-I)抑制劑、抗癲癇藥、細(xì)胞因子拮抗劑和另外一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素的治療劑。13.如權(quán)利要求1至6中任何一項(xiàng)所述的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，用于減輕或抑制人的NGF介導(dǎo)的疾病或病癥。14.如權(quán)利要求11所述的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，供與另一種選自白介素-I(IL-I)抑制劑、抗癲癇藥、細(xì)胞因子拮抗劑和另外一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素的治療劑聯(lián)合使用。15.如權(quán)利要求13或14所述的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，其中所述NGF介導(dǎo)的病癥或疾病被抑制，而沒(méi)有顯著地?fù)p害運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)。16.如權(quán)利要求12到15中任何一項(xiàng)所述的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，其中所述NGF介導(dǎo)的病癥或疾病選自炎癥性疼痛、手術(shù)后刀口疼痛、神經(jīng)性疼痛、骨折疼痛、痛風(fēng)關(guān)節(jié)痛、皰疹后神經(jīng)痛、燒傷疼痛、癌癥疼痛、骨關(guān)節(jié)炎或類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疼痛、坐骨神經(jīng)痛、與鐮刀細(xì)胞危象有關(guān)的疼痛，或皰疹后神經(jīng)痛。17.如權(quán)利要求1至6中任何一項(xiàng)所述的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段在制備用于減輕或抑制NGF介導(dǎo)的人疾病或病癥的藥物中的用途。18.如權(quán)利要求17所述的用途，其中所述NGF介導(dǎo)的病癥或疾病被抑制而沒(méi)有顯著損害運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)。19.如權(quán)利要求17所述的用途，其中所述NGF介導(dǎo)的病癥或疾病選自炎癥性疼痛、手術(shù)后刀口疼痛、神經(jīng)性疼痛、骨折疼痛、痛風(fēng)關(guān)節(jié)痛、皰疹后神經(jīng)痛、燒傷疼痛、癌癥疼痛、骨關(guān)節(jié)炎或類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疼痛、坐骨神經(jīng)痛、與鐮刀細(xì)胞危象有關(guān)的疼痛，或皰疹后神經(jīng)痛。20.如權(quán)利要求17到19中任何一項(xiàng)所述的用途，用于制備與選自白介素-1(IL-I)抑制劑、抗癲癇藥、細(xì)胞因子拮抗劑和另外一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素的另一種治療劑聯(lián)合使用的藥物。21.一種通過(guò)抑制NGF能得以抑制、改善或減輕的NGF相關(guān)病癥或疾病的治療方法，該方法包括對(duì)需要的人類受試者施用第一治療劑和第二治療劑，其中第一治療劑為特異性結(jié)合人神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，表面等離子體共振測(cè)得其Kd為5pM，其中該抗體或其片段與人NGF結(jié)合的Kd比該抗體或片段與大鼠和小鼠NGF結(jié)合的Kd高大約2倍到大約10倍。22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段為權(quán)利要求1到5中任何一項(xiàng)中的抗體或抗原結(jié)合片段。23.如權(quán)利要求21或22所述的方法，其中所述第二治療劑為一種白介素-I(IL-I)抑制劑、一種抗癲癇藥、一種細(xì)胞因子拮抗劑或另外一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素。24.如權(quán)利要求21至23中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述NGF介導(dǎo)的病癥或疾病被抑制而沒(méi)有顯著損害運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)。25.如權(quán)利要求21到24中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述NGF介導(dǎo)的病癥或疾病選自炎癥性疼痛、手術(shù)后刀口疼痛、神經(jīng)性疼痛、骨折疼痛、痛風(fēng)關(guān)節(jié)痛、皰疹后神經(jīng)痛、燒傷疼痛、癌癥疼痛、骨關(guān)節(jié)炎或類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疼痛、坐骨神經(jīng)痛、與鐮刀細(xì)胞危象有關(guān)的疼痛，或皰疹后神經(jīng)痛。全文摘要一種特異地結(jié)合人神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的人抗體或抗原結(jié)合片段，其KD為5pM或更低，且不與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3(NT-3)發(fā)生交叉反應(yīng)，該抗體或片段與人NGF結(jié)合的KD值比與大鼠和小鼠NGF結(jié)合的KD值高大約2倍到大約10倍。該抗體在治療疼痛方面很有用，包括炎癥性疼痛、手術(shù)后刀口疼痛、神經(jīng)性疼痛、骨折疼痛、骨質(zhì)疏松骨折疼痛、皰疹后神經(jīng)痛、骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、癌癥疼痛、燒傷疼痛、痛風(fēng)關(guān)節(jié)痛、以及諸如肝細(xì)胞癌、乳腺癌和肝硬化等疾病。文檔編號(hào)C07K16/22GK101827609SQ200880102743公開(kāi)日2010年9月8日申請(qǐng)日期2008年8月8日優(yōu)先權(quán)日2007年8月10日發(fā)明者J·C·賴恩哈特,J·H·瑪丁,L·麥克唐納德,M·R·摩拉,R·托雷斯申請(qǐng)人:里珍納龍藥品有限公司