專(zhuān)利名稱(chēng)：一種抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2的單鏈抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種全新的可與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2 (vascular endothelial growth factorreceptor, VEGFR)特異結(jié)合的高親和力全人源單鏈抗體，能抑制VEGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vascularendothelial cell,HUVEC)的增殖，是一種具有抗血管生成活性的基因工程抗體。
背景技術(shù)：
癌細(xì)胞在生長(zhǎng)因子受體的激活下增殖，癌細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)會(huì)促進(jìn)自身促血管生長(zhǎng)因子如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)等的表達(dá)上調(diào)，刺激內(nèi)皮細(xì)胞活化，分泌出其他血管生成所需要的蛋白酶，引起一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過(guò)抗凋亡等機(jī)制調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的存活，促進(jìn)新生血管形成并維持其完整性。內(nèi)皮細(xì)胞在VEGF等刺激因子作用下增殖，大量增殖的內(nèi)皮細(xì)胞重新排列形成條索狀，刺激成纖維細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)，形成新的血管。人VEGF受體2(VEGFR-2)，又稱(chēng)為KDR(kinase insertdomain-containing receptor, KDR)是VEGF的主要信號(hào)傳導(dǎo)受體，其參與新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖、生存，在腫瘤周?chē)苄律^(guò)程中具有重要的作用。因此，抑制VEGF/VEGFR-2途徑是抑制腫瘤轉(zhuǎn)移及生長(zhǎng)的重要途徑。靶向VEGF信號(hào)通路藥物主要有三類(lèi):一類(lèi)是直接作用于受體細(xì)胞內(nèi)區(qū)段以防止信號(hào)傳導(dǎo)的合成的酪氨酸激酶抑制劑(ΤΚΙ)，主要包括ΡΤΚ787，Sutent, Sorafinib,Zactima and Recentin等 等；另一類(lèi)是抗VEGF阻斷配體結(jié)合到受體胞外功能域的單克隆抗體(MAb),包括貝伐單抗(bevacizumab)和阿普西柏(afIibercept)等,第三類(lèi)是作用于VEGFR-2 的抗體，如:RamucirumabaMC-1121B)和 CDP-791。貝伐單抗(bevacizumab,商品名AVASTIN)是抗人VEGF的人源化IgGl單克隆抗體，于2004年被美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)作為抑制腫瘤血管生成的抗腫瘤藥物。而靶向VEGFR-2的抗體將因其選擇的高度特異性而體現(xiàn)出更好的潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。KDR作為一種酪氨酸激酶受體，由一個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域，一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)胞質(zhì)內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域組成，其胞外有7個(gè)胞外免疫球蛋白樣區(qū)，其中3區(qū)(含有97個(gè)氨基酸)對(duì)VEGF的緊密結(jié)合部位貢獻(xiàn)最為突出。前期工作中以KDR胞外3區(qū)(KDR3)為靶抗原，利用曬菌體展示技術(shù)從Griffin.1單鏈抗體庫(kù)中篩選出了具有單鏈抗體(single chainantibody variable fragments, scFv)AK404R。一般來(lái)說(shuō)，親和力高的抗體比親和力低的抗體在體內(nèi)的半衰期要長(zhǎng)，因此對(duì)治療用的抗體來(lái)說(shuō)，親和力的高低將是一個(gè)極為重要的因素。一種抗體的親和力，其分子基礎(chǔ)在于抗體可變區(qū)，尤其是CDR區(qū)的基因序列。由于AK404R未經(jīng)過(guò)抗原免疫驅(qū)動(dòng)的親和力成熟過(guò)程，需要提高其親和力以獲得滿(mǎn)足臨床應(yīng)用需求的高親和力單鏈抗體。本發(fā)明利用蛋白質(zhì)非定向突變技術(shù)，將AK404R的CDR3區(qū)進(jìn)行突變，獲得突變抗體庫(kù)，自該庫(kù)中篩選獲得較高親和力的噬菌體單鏈抗體。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明基于具有提高體外親和力的單鏈抗體突變體庫(kù)的構(gòu)建，提供一種具有潛在醫(yī)學(xué)和藥學(xué)價(jià)值的全人源的抗KDR3的高親和力單鏈抗體。技術(shù)方案一種抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2的單鏈抗體，所述單鏈抗體包括重鏈可變區(qū)域和輕鏈可變區(qū)域，并且重鏈可變域和輕鏈可變區(qū)域通過(guò)柔性肽連接，柔性肽的氨基酸序列為SEQ ID NO:9 ；其特征在于:其中所述的抗體含有重鏈⑶R3域，該域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；輕鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；含有重鏈⑶R2域，該域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；所述的抗血管內(nèi)表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體具有輕鏈CDR2域，該域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；含有重鏈⑶Rl域，該域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；所述的抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體具有輕鏈CDRl域，該域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列。所述的一種抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2的單鏈抗體，其特征在于:所述的重鏈可變區(qū)域的氨基酸序列為SEQ ID NO:1 ;輕鏈可變區(qū)域?yàn)镾EQ ID NO:2的氨基酸序列，
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一種分離的核酸，其特征在于該核酸編碼上述的抗體。—種表達(dá)載體，含有上述的核酸。一種重組宿主細(xì)胞，含上述的表達(dá)載體。上述任一項(xiàng)的抗體或抗體片段的應(yīng)用，選擇性地與VEGFR-2結(jié)合或抑制VEGF與VEGFR-2的結(jié)合或中和VEGF。上述任一項(xiàng)的抗體片段,選自單鏈抗體、Fab、單鏈Fv、雙抗體和三抗體。上述任一項(xiàng)的抗體或抗體片段的偶聯(lián)物。所述的偶聯(lián)物，含有抗腫瘤藥物、靶組成部分或報(bào)告組成部分。其中所述的AK404R的序列為SEQ ID NO:11。AK404R-VHI GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT GGG 451EVQLVESGGGVVQPG 1546 AGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT 9016RSLRLSCAASGFTFS30VH-CDRl91 AGC TAT GCT ATG CAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGC AAG GGG CTG 13531 SYAMH WVRQAPGKGL45VH-CDR2136 GAG TGG GTG GCA GTT ATA TCA TAT GAT GGA AGT AAT AAA TAC TAT 18046 E W V A VISYDGSNKYY 60
181 GCA GAC TCC GTG AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC 22561 ADSVKG RFTISRDNS75226 AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC 27076KNTLYLQMNSLRAED90VH-CDR3271 ACG GCC GTG TAT TAC TGT GCA AGA CGG TTT GAG CCT CCT TTT GAC 31591TAVYYCAR R F E P P F D 105316 TAT TGG GGC CAA GGT ACC CTG GTC ACC GTC360106 YffGQGTLVTV120AK404R-VLI CTT CAG TCT GTG CTG ACT CAG CCA CCC TCA GCG TCT GGG ACC CCC 451LQSVLTQPPSASGTP15VL-CDRl46 GGG CAG AGG GTC ACC ATC TCT TGT TCT GGA AGC AGC TCC AAC ATC 9016GQRVTISC S G S S S N I 3091 GGA AGT AAT ACT GTA AAC TGG TAC CAG CAG CTC CCA GGA ACG GCC 13531 GSNTVN WYQQLPGTA 45VL-CDR2136 CCC AAA CTC CTC ATC TAT AGT AAT AAT CAG CGG CCC TCA GGG GTC 18046 P K L L I Y S N N Q R P S G V 60181 CCT GAC CGA TTC TCT GGC TCC AAG TCT GGC ACC TCA GCC TCC CTG 22561PDRFSGSKSGTSASL 75226 GCC ATC AGT GGG CTC CAG TCT GAG GAT GAG GCT GAT TAT TAC TGT 27076AISGLQSEDEADYYC 90VL-CDR3271 GCA GCA TGG GAT GAC AGC CTG CCG GCG TCT GTA TTC GGC GGA GGG 31591 AAffDDSLPASV FGGG 105316 ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT336106 T K L T V L G120發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明:本發(fā)明中抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2單鏈抗體基因序列全長(zhǎng)732bp (AKl I，見(jiàn)SEQID NO: 10)，244個(gè)氨基酸 。具有117個(gè)氨基酸的重鏈可變區(qū)(SEQ ID NO:1)和112個(gè)氨基酸的輕鏈可變區(qū)(SEQ ID NO:2)，通過(guò)15個(gè)氨基酸的柔性肽連接(SEQ ID NO:9)。含有本發(fā)明血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2單鏈抗體基因的表達(dá)載體和表達(dá)宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增本發(fā)明單鏈抗體基因的任意片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。有益效果:本發(fā)明基于具有提高體外親和力的單抗體突變體庫(kù)的構(gòu)建，提供一種具有潛在醫(yī)學(xué)和藥學(xué)價(jià)值的全人源的抗KDR3的高親和力單鏈抗體，突變后的單鏈抗體AK-1l顯示出比親本抗體AK404R提高3倍的體外親和力和更強(qiáng)的抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞增殖的活性。本發(fā)明單鏈抗體的特征為特異性高親和力結(jié)合人VEGFR-2胞外3區(qū)-KDR3，在體外能夠抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞的增殖。具體來(lái)說(shuō):本發(fā)明通過(guò)錯(cuò)配PCR對(duì)親本單鏈抗體AK404R重鏈和輕鏈⑶R3區(qū)進(jìn)行突變，建立抗體的次級(jí)突變庫(kù)；以人VEGFR-2胞外3區(qū)蛋白KDR3為靶抗原，篩選獲得一個(gè)對(duì)靶抗原KDR3親和力顯著提高的單鏈抗體AK-1l ;用ImM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；利用滲透體克提取細(xì)菌周質(zhì)蛋白，低濕離心去除細(xì)胞碎片，將上清采用鎳柱親和層析法進(jìn)行分離純化；測(cè)定單鏈抗體AK-1l對(duì)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞增殖的抑制作用。本發(fā)明得到對(duì)靶抗原KDR3親和力提高的單鏈抗體AK-11，體外抑制HUVEC細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明得到的單鏈抗體可以顯著抑制HUVEC細(xì)胞的增殖。本發(fā)明為治療以血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體的表達(dá)，特別是過(guò)量表達(dá)為特征的疾病提供了基于抗體的療法，相關(guān)疾病包括但不限于癌癥和視網(wǎng)膜黃斑病變等糖尿病并發(fā)眼部疾病。


圖1是用錯(cuò)配PCR技術(shù)構(gòu)建次級(jí)突變庫(kù)的構(gòu)建圖。圖2是單鏈抗體AK-1l的結(jié)構(gòu)示意圖。VH-⑶R1，紅色；VH_⑶R2，綠色；VH_⑶R3，黃色；VL-CDRl，藍(lán)色；VL_CDR2，紫紅色；VL_CDR3，青綠色。圖3顯示SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳圖，描述發(fā)酵表達(dá)的AK-1l通過(guò)鎳柱進(jìn)行分離純化的結(jié)果，泳道I為菌體周質(zhì)提取物上清，泳道2為鎳柱親和層析的樣品收集液，泳道3 9分別為PBS，含10，20，50，80，100，200，500mM咪唑緩沖液洗脫獲得，其中含IOOmM咪唑緩沖液洗脫鎳柱得到的為較純的目的蛋白。圖4是ELISA檢測(cè)親和力的結(jié)果圖，單鏈抗體AK-1l的吸光值平均為親本抗體的吸光值的3倍。圖5描述并比較了單鏈抗體AK-1l和親本單鏈抗體AK404R對(duì)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞增殖的抑制作用。
具體實(shí)施例方式以下借助非限制性實(shí)施例舉詳細(xì)描述本發(fā)明。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明精神的前提下對(duì)它所做的任何顯而易見(jiàn)的改動(dòng)，特別是對(duì)若干部件的等同替換，都構(gòu)成對(duì)本發(fā)明專(zhuān)利權(quán)的侵犯，將承擔(dān)相應(yīng)的法律責(zé)任。實(shí)施例中涉及的百分比，其中固定試劑為重量體積百分比，液體試劑為體積百分比。實(shí)施例1錯(cuò)配PCR-次級(jí)突變庫(kù)的構(gòu)建以親本單鏈抗體AK404R的DNA(Juan Zhang,Haixin Li,Xiuyun Wang, et al.[J].Biotechnology Progress, 2012, PMID:22581629)為模板，設(shè)計(jì)引物 Pl 和 P2，其中 Pl 和 P2引物的序列(5' —3')分別為 GGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCC(Sfi I)ATGG(SEQ ID NO:12)，TTGGCCCCAATAGTCNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKTCTTGCACAGTAAT(SEQ ID NO:13);在反應(yīng)體系中加入 7mmol/LMgCl2、lmmol/L dCTP/dTTP、02mmol/dATP/dGTP、0.5mmol/L MnCl2>5U Taq 酶,94°C預(yù)變性 5min,每循環(huán)反應(yīng)條件為 94°C lmin, 55°C lmin,72°C lmin，進(jìn)行35輪循環(huán)后，72°C延伸7min。PCRl產(chǎn)物經(jīng)電泳分析后作為PCR2的模板，Pl和 P3 為引物，其中 P3 引物序列(5' — 3')為 5' -CACCACTCGAG (Xho I) ACGGTGACCAGGGTACCTTGGCCCCAATAGT (SEQ ID NO: 13)，進(jìn)行第二輪PCR，得到VH的突變體。按照同樣的方法，對(duì)輕鏈⑶R3區(qū)進(jìn)行突變，所用引物為P4、P5、P6，其中P4、P5、P6的序列(5' —3')分別為CTATTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGGTG(SEQ ID NO: 14),CTCCGCCGAANNKNNKNNKNNKNNKNNKGTCATCCCATG(SEQ ID NO:15)，GATGTGCGGCC(NotI)GCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCCTCCGCCGAATA (SEQ ID NO: 16)，得到VL的突變體，突變后的VH和VL經(jīng)過(guò)重疊延伸PCR組裝成完整的單鏈抗體，產(chǎn)物經(jīng)柱(購(gòu)自Biomiga中國(guó))純化后和噬菌粒表達(dá)載體pHEN2 (購(gòu)自 Griffin I library，序列見(jiàn) htt p://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk) 一起用 Sfil 和 Notl酶切，載體用CIAP-牛小腸堿性磷酸酶(購(gòu)自Fermentas公司)去磷酸化后，16°C用T4DNA連接酶(購(gòu)自Fermentas公司)連接過(guò)夜，獲得由一系列含有重鏈和輕鏈CDR3突變的單鏈抗體基因分別與噬菌粒表達(dá)載體連接構(gòu)成的重組載體pHEN2-mAK404R的單鏈抗體次級(jí)突變庫(kù)。用Bio-rad的電轉(zhuǎn)儀及配套的電轉(zhuǎn)杯在1.3kV下將構(gòu)建的重組載體進(jìn)行電穿孔法轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli TGl (Novagen公司)，將轉(zhuǎn)化菌稀釋至不同的梯度:原液、10_2、10_4和10'分別取50 μ I鋪于含有20mM MgSO4和100 μ g/ml Amp的SOB瓊脂板，37°C培養(yǎng)12 16h，隨機(jī)挑取20株單克隆菌株送測(cè)序公司測(cè)序，檢測(cè)抗體序列的多樣性。按照平板上長(zhǎng)的單克隆個(gè)數(shù)計(jì)算庫(kù)容量。從板上刮除克隆，隨后加入30%甘油，混勻，儲(chǔ)存于-80°C，即為次級(jí)突變庫(kù)?？贵w文庫(kù)的擴(kuò)增參考常規(guī)噬菌體文庫(kù)的擴(kuò)增方法(參照沈倍奮《重組抗體》，科學(xué)出版社，2005年)，以KDR3為抗原，進(jìn)行實(shí)施例2，自該突變次級(jí)庫(kù)中篩選單鏈抗體。實(shí)施例2抗KDR3單鏈抗體突變體的篩選及鑒定以包被緩沖液(IOOmM Tris, NaCl 150mM，ρΗ9.0)稀釋 KDR3 蛋白(Juan Zhang,Haixin Li, Wei Chen. Preparation of Extracellular Domain 3 of Human VEGFReceptor-2 and the Monitoring of Its Real-Time Binding to VEGF by Biosensors.Biotechnol.Prog.，2009, Vol.25, N0.6)至 100 μ g/ml ;取 4mI 加入到免疫管中，4°C包被過(guò)夜；次日，充上清，PBS迅速洗管3次；2% MPBS (含有2%脫脂牛奶的PBS)，37°C封閉2h ;充封閉液，用PBS迅速洗管3次；將實(shí)施例1制備的噬菌體抗體突變庫(kù)(1012 IO13p.f.u)懸浮于4ml 2%10^5并加入到免疫管中，室溫反復(fù)倒轉(zhuǎn)301^11后，于室溫靜置901^11以上；以含有0.1 % Tween-20的PBS洗管10次，再以PBS洗管10次去除去污劑；加入Iml IOOmM三乙胺(700 μ I 7.18mol/L三乙胺加入50ml水中)，室溫反復(fù)倒轉(zhuǎn)孵育lOmin，進(jìn)行特異性洗脫；0.5ml IMTris (pH7.4)用于迅速中和洗脫下來(lái)的噬菌體；中和后的噬菌體用于感染對(duì)數(shù)期的E.coli TG1，進(jìn)行擴(kuò)增和制備，用于下一輪篩選，連續(xù)進(jìn)行四輪篩選。四輪篩選中KDR3 包被的濃度分別為 5 μ g/ml, 5 μ g/ml, 2.5 μ g/ml, I μ g/ml。任意挑取取第四輪篩選獲得的噬菌體感染200 μ I處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的感染琥珀突變型蛋白表達(dá)菌株Ε.coli HB2151 (Novagen公司)，ImM的IPTG于30°C誘導(dǎo)過(guò)夜，進(jìn)行抗體ELISA篩選親和力高的單鏈抗體。方法如下:酶標(biāo)板包被I μ g/ml的KDR3，每孔100 μ I。4°C包被過(guò)夜，5%的脫脂奶粉封閉，37°C封閉2h。將制備得到的上清中的不同種類(lèi)的抗體各100 μ I加入到對(duì)應(yīng)的孔中。一抗為1: 2000稀釋的鼠源抗C-MyC抗體，二抗為1: 5000稀釋HRP標(biāo)記的山羊抗鼠抗體,加入TMB顯色液顯色30min后,每孔加入50 μ I lmol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定0D450/0D650作為最后檢測(cè)結(jié)果。實(shí)施例3抗KDR3單鏈抗體的可溶性表達(dá)及分離純化挑選抗體ELISA初步檢測(cè)值較高的菌株，37°C培養(yǎng)至0D600 = 0.8，加入終濃度ImM的IPTG，30°C誘導(dǎo)過(guò)夜，取樣進(jìn)行15% SDS-PAGE，分析目的蛋白表達(dá)。將過(guò)夜菌液6000rpm，4°C離心15min，收集菌體；PBS重懸洗滌菌體一次，采用滲透休克法破碎菌體，即高滲溶液(50mM Tris-HCl，20%蔗糖，ImM EDTA, pH8.0)重懸菌體，緩慢攪拌lOmin，4°C，9000g離心lOmin，倒出上清，用冰冷的5mM MgSO4重懸沉淀，緩慢攪拌lOmin, 4°C, IOOOOg離心20min將上清與上一步上清合并用于鎳柱(購(gòu)自GE Healthcare)親和層析純化，用不同濃度的咪唑洗滌雜蛋白，洗脫目的蛋白；15% SDS-PAGE檢測(cè)收集的樣品，-20°C保存目的蛋白，命名為單鏈抗體AK11，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2，重鏈和輕鏈由SEQ ID NO:9相連。實(shí)施例4ELISA測(cè)定相對(duì)親和力方法同實(shí)施例2初步檢測(cè)親和力ELISA。將KDR3溶解在0.05mol/L碳酸緩沖液(pH9.6)中，終濃度為I μ g/ml，每孔100 μ I將抗原加到96孔板中，4°C包被過(guò)夜。5%的脫脂奶粉封閉2h。分別加入4000，3000，2000，1000, 500, 250nM/ml的AK-1I抗體，以親本單鏈抗體作對(duì)照，37°C孵育90min，用PBST洗三次，每次5min。一抗為1: 2000稀釋的鼠源抗c-Myc抗體，二抗為1: 5000稀釋HRP標(biāo)記的山羊抗鼠抗體。加入TMB顯色液顯色30分鐘后，每孔加入50 μ I lmol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定0D450/0D650作為最后檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果見(jiàn)圖4，在相同的濃度下，突變體AKll的吸光度值0D450/650高于3倍親本AK404R的吸光度值，顯示突變抗體對(duì)抗原有較高的親和力。實(shí)施例5單鏈抗 體AKl I對(duì)HUVEC細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用HUVEC細(xì)胞(購(gòu)自上海生化與細(xì)胞所)于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長(zhǎng)滿(mǎn)90%以上時(shí)，換液。將重懸后的細(xì)胞稀釋至3X IO4細(xì)胞/ml，96孔板中每孔加100μ 1，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組(即不含細(xì)胞，只加培養(yǎng)基)，于37°C、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后加待測(cè)物。用DMEM+1 % FBS 培養(yǎng)基將 AK-1l 稀釋到:5000ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、100ng/ml、50ng/mlU0ng/nL.每孔100 μ 1，每個(gè)濃度設(shè)置三個(gè)平行孔(η = 3)，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照和陰性對(duì)照(無(wú)VEGF)，VEGF終濃度為10ng/ml。最后于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)72h后,每孔加入5mg/ml MTT溶液12 μ I,于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。然后于平板離心機(jī)中，3000rpm離心5min后，吸出孔中溶液，加入150 μ I/孔DMSO溶液，再于微量振蕩器上振蕩lOmin，最后酶標(biāo)儀上檢測(cè)570nm和630nm處的吸光度值，則每個(gè)孔的吸光度值即為 A570-A630?？贵w對(duì)VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞抑制率計(jì)算公式為:(Ara-AgV(Ag-As) X 100%。結(jié)果見(jiàn)圖5，在本實(shí)驗(yàn)條件下，單鏈抗體AK-1l對(duì)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞增殖的50%抑制濃度，即IC50值為15.08nM，而在相同實(shí)驗(yàn)條件下，親本抗體AK404R的IC50值為
19.65nM，顯示突變體具有高于親本抗體的體外抗血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的活性。
權(quán)利要求
1.一種抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2的單鏈抗體，所述單鏈抗體包括重鏈可變區(qū)域和輕鏈可變區(qū)域，并且重鏈可變域和輕鏈可變區(qū)域通過(guò)柔性肽連接，柔性肽的氨基酸序列為SEQID NO:9，其特征在于:其中所述的抗體含有重鏈⑶R3域，該域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；輕鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1 所述的一種抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2的單鏈抗體，其特征在于:所述的重鏈可變區(qū)域的氨基酸序列為SEQ ID NO:1 ;輕鏈可變區(qū)域?yàn)镾EQ ID NO:2的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種經(jīng)過(guò)體外親和力成熟的全人源的抗KDR3單鏈抗體AK-11，具體為AK-11的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)免疫球蛋白分子的氨基酸序列，以及包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)免疫球蛋白分子的氨基酸序列，包括對(duì)應(yīng)于互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3的序列。本發(fā)明還提供產(chǎn)生和表達(dá)AK-11的方法，用錯(cuò)配PCR建庫(kù)和噬菌體篩選的方法篩選獲得了一株親和力較高的全人源的抗VEGFR2單鏈抗體AK-11，后通過(guò)原核細(xì)胞分泌表達(dá)、親和層析純化獲得單鏈抗體。本發(fā)明的單鏈抗體可特異性結(jié)合于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2，可以抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC的生長(zhǎng)，可應(yīng)用于制備治療劑。
文檔編號(hào)C07K16/28GK103113469SQ20121039374
公開(kāi)日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月17日
發(fā)明者張娟, 王旻, 齊海迪, 曹婉璐, 李致科, 王澤根 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)