涉及具有強(qiáng)烈降低的受體結(jié)合親和力的細(xì)胞因子的融合因子的制作方法
【專利說明】潰及具有強(qiáng)烈降低的受體結(jié)合親和力的細(xì)胞因子的融合因子
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種包含至少兩個細(xì)胞因子的融合蛋白，其中至少一個是對它的受體 或?qū)λ囊环N受體具有強(qiáng)烈降低的結(jié)合親和力的修飾的細(xì)胞因子。優(yōu)選地，兩個細(xì)胞因子 由接頭，優(yōu)選是GGS接頭連接。本發(fā)明還設(shè)及用于治療疾病的所述融合蛋白。
[0002] 細(xì)胞因子是分泌或膜結(jié)合的小蛋白質(zhì)，其在細(xì)胞間通訊中起至關(guān)重要作用。細(xì)胞 因子結(jié)合于它的同源受體復(fù)合物會觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)事件的級聯(lián)，所述級聯(lián)使得細(xì)胞能 夠根據(jù)細(xì)胞、細(xì)胞作為其一部分的組織和器官的需要感應(yīng)它的周圍環(huán)境并對它的周圍環(huán)境 起應(yīng)答。它們在特征上是多效性的，運意味著視祀細(xì)胞的性質(zhì)和發(fā)育狀態(tài)而定，它們激起廣 泛范圍的應(yīng)答。此外，它們中的一些是高度冗余的，因為若干細(xì)胞因子具有重疊活性，此使 得它們能夠在功能上彌補(bǔ)相互損失。細(xì)胞因子活性可為自分泌性、旁分泌性或內(nèi)分泌性的， 從而導(dǎo)致在指定術(shù)語細(xì)胞因子、膚激素和生長因子之間的模糊界限。
[0003] 已知六種不同結(jié)構(gòu)類別的細(xì)胞因子:a螺旋束細(xì)胞因子，其包括大多數(shù)白介素、集 落刺激因子和激素樣生長激素和瘦素(Nicola和化Iton, 1998) 聚腫瘤壞死因子(TNF)家 族(I化iss和Naismith,2000);半脫氨酸結(jié)生長因子(Sun和Davies, 1995);包括白介素-1家 族的PS葉形折疊(0-trefoil fold)組(Murzin等，1992);白介素17(比-17)家族(Gaffen, 2011)和趨化因子(Nomiyama等，2013)。
[0004] 若干細(xì)胞因子已得到重要臨床應(yīng)用。實例包括紅血球生成素化PO)、粒細(xì)胞集落刺 激因子(G-CSF)、干擾素 a2和-PW及生長激素。相反，常常由于它們的促炎癥性質(zhì)，使所選細(xì) 胞因子括抗也得到特定醫(yī)學(xué)應(yīng)用。此處的主要實例是用W阻斷TWa活性W抗擊如類風(fēng)濕 性關(guān)節(jié)炎的自體免疫疾病的策略。由于運些成功，正在探究用W優(yōu)化細(xì)胞因子在臨床中的 活性的策略。運些策略包括優(yōu)化半衰期，降低免疫原性，向特定細(xì)胞類型進(jìn)行祀向遞送W及 遺傳融合兩個細(xì)胞因子，即所謂融合因子(fusokine)。
[0005] 融合因子是使用接頭序列遺傳連接的兩個不同細(xì)胞因子的人工組合。融合因子的 首個實例是作為粒細(xì)胞-巨隧細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)和IL-3的融合蛋白的PIXY321或 pixykine(Donahue等，1988)，其相較于任一單獨細(xì)胞因子顯示優(yōu)越的造血和免疫作用。運 個作用可通過與它們的相應(yīng)受體復(fù)合物的結(jié)合增強(qiáng)來解釋。值得注意的是，兩種受體共有 信號傳導(dǎo)性ec亞單位，從而排除在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)水平上的協(xié)同作用。在III期臨床試驗中， PIXY321在相較于單獨GM-CSF時未顯示優(yōu)越性質(zhì)（O'Shau曲nessy等，1996)。也探究了與IL-2家族的細(xì)胞因子的基于GM-CSF的融合因子。運些細(xì)胞因子都通過包含T C亞單位的受體復(fù) 合物進(jìn)行信號傳導(dǎo)。與GM-CSF的此類融合因子的實例包括化-2(Stagg等，2004)、化-15 (Rafei 等，2007)和比-21 (Williams 等，2010a)，也稱為GIFT2、GIFT15 和GIFT21。在信號傳導(dǎo) 水平（即祀細(xì)胞內(nèi)的協(xié)同作用）與細(xì)胞水平（即不同祀細(xì)胞類型之間的協(xié)同作用）兩者上均 可預(yù)期協(xié)同作用。舉例來說，GIFT2相較于未融合細(xì)胞因子的組合誘導(dǎo)更強(qiáng)力NK細(xì)胞活化 (Penafuerte等，2009)，而GIFT15誘導(dǎo)未曾預(yù)期的強(qiáng)力免疫抑制性B細(xì)胞群體（Rafei等， 2009a)。同樣地，GIFT21對單核細(xì)胞發(fā)揮出乎意料的促炎性作用(Williams等，201化）。組合 a螺旋細(xì)胞因子的融合因子的另一實例是比-2^kl2(Gillies等，2002;化hn等，2012)。
[0006] 另一類別的融合因子組合來自不同結(jié)構(gòu)家族的細(xì)胞因子。實例包括IL-18(IL-1細(xì) 胞因子家族的成員）和IL-2的融合物(Acres等，2005) W及IL-18與EGF(表皮生長因子)之間 的融合物。因為常觀察到EGFR在某些腫瘤細(xì)胞類型上過度表達(dá)，所W后述融合因子提供使 比-18活性祀向EGFR+腫瘤細(xì)胞的可能性化U等，2008)。也更詳細(xì)地探究了a螺旋束細(xì)胞因子 與趨化因子之間的融合物。趨化因子常使用濃度梯度起操縱免疫細(xì)胞向感染和炎癥部位 遷移的作用。許多趨化因子受體顯示限制性表達(dá)模式，從而允許祀向所選(免疫)細(xì)胞。此 夕h通過蛇根堿(serpentine)進(jìn)行信號傳導(dǎo)，G蛋白偶聯(lián)趨化因子受體在根本上不同于由a 螺旋束細(xì)胞因子受體復(fù)合物活化的路徑，并且可預(yù)期正協(xié)同和負(fù)協(xié)同交互作用機(jī)理。值得 注意的是，趨化因子的設(shè)計N末端截短形式可保留它們的受體結(jié)合性質(zhì)，但顯示括抗性行 為。一實例是GM-CSF與缺乏前5個N末端氨基酸的N末端截短的CCL2之間的融合因子，也稱為 GMMEl (Rafei等，2009b)。運個融合因子誘導(dǎo)炎癥性CCR化細(xì)胞的調(diào)亡，并且用GMMEl處理的 小鼠顯示實驗誘發(fā)的自體免疫疾病評分(包括分別針對多發(fā)性硬化癥(Rafei等，2009b)和 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rafei等，2009c)的EAE和CIA)降低。同樣地，運個融合因子誘導(dǎo)CCR化腫瘤 細(xì)胞的調(diào)亡(Rafei等，2011)。
[0007]然而，W前未探究野生型細(xì)胞因子與對它的同源受體復(fù)合物具有強(qiáng)烈降低的親和 力的突變細(xì)胞因子之間的融合物。運個方法的優(yōu)勢是野生型細(xì)胞因子的可能全身性毒性被 消除。驚人地，我們發(fā)現(xiàn)此類融合因子允許細(xì)胞因子活性達(dá)成細(xì)胞特異性祀向，借此此類突 變細(xì)胞因子可重新獲得它對祀向細(xì)胞的活性，而不具有野生型細(xì)胞因子的負(fù)面作用。如W 下所例示，已使用=種各自由來自在結(jié)構(gòu)上不同的細(xì)胞因子類別的兩個細(xì)胞因子組成的融 合因子證明該原理的一般適用性。
[000引 X化l/IFNa2突變體
[0009] X化1是一種由CD8+T細(xì)胞、Thl細(xì)胞極化CD4+T細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌的93個氨基酸的趨 化因子。它與僅由樹突細(xì)胞表達(dá)的趨化因子受體XCRl相互作用。在小鼠中，XCRl在大多數(shù)脾 CDllc+CD8a+樹突細(xì)胞中表達(dá)，而僅有極少的子組CDScT樹突細(xì)胞表達(dá)運個受體(Dorner等 2009) dXCRI是與小鼠 CDSa+樹突細(xì)胞同源的哺乳動物細(xì)胞(包括人細(xì)胞)的保守選擇性標(biāo)志 物(Crozat等2010)。引起關(guān)注的是，已顯示I型干擾素（IFNa/e)對運個樹突細(xì)胞子組的作用 對小鼠中先天性免疫識別生長的腫瘤至關(guān)重要(化ertes等2011)。
[0010] 全身性IFNa療法具有相當(dāng)大的毒性，包括如重度疲勞、發(fā)熱、寒冷、抑郁、甲狀腺功 能障礙、視網(wǎng)膜疾病、脫發(fā)、皮膚干燥、皮疹、發(fā)癢和骨髓抑制的副作用。因此，將高度值得的 是使IFN活性僅祀向應(yīng)該用IFN處理的細(xì)胞群體。對于在抗腫瘤療法中應(yīng)用，祀向表達(dá)XCRl 的樹突細(xì)胞的群體是高度合乎需要的，因為運些細(xì)胞?？谥铝τ诳乖徊孢f呈(Bachem等 2012)。許多實驗數(shù)據(jù)表明表達(dá)XCRl的樹突細(xì)胞群體代表在腫瘤微環(huán)境中必須與I型IFN反 應(yīng)W引發(fā)最終將允許達(dá)成腫瘤破壞和免疫的免疫應(yīng)答的關(guān)鍵細(xì)胞群體(Gajewski等2012)。
[0011] 人IF化2-Q124R突變體對鼠類IFNARl鏈具有高親和力，而對鼠類IFNAR2鏈具有低 親和力(Weber等，1987)。它顯示對鼠類細(xì)胞的活性極低，并且因此代表適于使IF腳舌性祀向 所選小鼠細(xì)胞的工程改造的I型IFN亞型的原型(PCT/EP2013/050787)。
[0012] (XL2O/IL10
[0013] CC趨化因子(XL20,也稱為肝和活化調(diào)控的趨化因子（LARC)、巨隧細(xì)胞炎癥性蛋 白-3a(MIP-3a)或Exodus-I,是一種主要在肝和淋己組織中表達(dá)的96個氨基酸的蛋白質(zhì) 化iesMma等，1997)。在分泌后，(XL20通過結(jié)合屬于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)I家族的CC趨化 因子受體6(CCR6)來發(fā)揮它的活性(Baba等，1997)。報道了關(guān)于不同白細(xì)胞子組的CCR6表 達(dá)，但化17細(xì)胞群體的CCR6表達(dá)被文獻(xiàn)最充分證明（Sin曲等，2008)。正?；?7功能為針對 一定范圍的病原體的保護(hù)性免疫所必不可少，所述病原體包括結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis ) (Khader等，2007)、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae) "e等，2001)和百日咳博德特氏菌（BordetelIa pe;rtussis)巧iggins等， 2006) O
[0014]已堅定地確定IL-10對不同T細(xì)胞子組(特別是化17細(xì)胞）的擴(kuò)增和分化的增強(qiáng)作 用（Sutton等，2006; Acosta-Ro化iguez等，2007; Dunne等，2010;化aw等，2012)。在T細(xì)胞子 組之中，化17細(xì)胞表達(dá)最高水平的IL-1R，并且IL-I在化17致敏中起重要作用。因此，控制激 動性IL-I活性可應(yīng)用于其中免疫刺激性作用將為合乎需要的不同生理/病理過程中。然而， 關(guān)于在免疫刺激性療法中使用IL-I的一個主要顧慮是它在全身性施用時的重度毒性。因 此，當(dāng)可使IL-I作用限于所選細(xì)胞群體時，毒性問題可能被解決，運打開例如作為T細(xì)胞佐 劑用于增強(qiáng)對微弱疫苗的應(yīng)答的治療遠(yuǎn)景(Ben-Sasson等，2011)。為使IL-I突變體特異性 祀向化17細(xì)胞群體，使用由融合于CCL20祀向部分的突變IL-I組成的IL-I變體。因為活化將 僅被限于表達(dá)CCR6的細(xì)胞(即Thl7細(xì)胞），所W預(yù)期無重大全身性毒性。
[001引 TNFa/瘦素突變體
[0016] TWa是一種具有廣泛范圍的生物活性的細(xì)胞因子，所述活性包括細(xì)胞毒性、調(diào)控 免疫細(xì)胞W及介導(dǎo)炎癥性應(yīng)答。它是一種具有233個氨基酸的自我裝配性、非共價結(jié)合的同 源S聚II型跨膜蛋白。TNFa作為膜結(jié)合W及可溶性蛋白質(zhì)具有活性，在由TNFa轉(zhuǎn)化酶 (TACE，也稱為ADAM17)蛋白水解裂解76個氨基末端氨基酸(前導(dǎo)序列）之后從細(xì)胞膜釋放。 它通過均為在配體結(jié)合的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中具有富含半脫胺酸的基序的跨膜糖蛋白的巧中不 同受體，即TNF-Rl (p55)和TNF-R2 (p75)進(jìn)行信號傳導(dǎo)。盡管具有細(xì)胞外同源性，但它們具有 不同的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，并且因此信號傳導(dǎo)不同的TN巧舌性化ehlgans和Pfeffer ,2005)。如W 前由Bosched等，2010所述，我們產(chǎn)生由通過GGGGS接頭偶聯(lián)的S個TNF單體組成的單鏈變 體（scTNF)。
[0017] 瘦素是一種設(shè)及許多生物過程，包括免疫、繁殖、線性生長、葡萄糖穩(wěn)態(tài)、骨代謝和 脂肪氧化的16kDa的脂肪細(xì)胞細(xì)胞因子，但因它作為飽腹感信號的顯著作用而最眾所周知 化alaas等，1995)。由于它對免疫細(xì)胞的作用，瘦素也牽設(shè)于若干自體免疫疾病中（Ukuni 等，2008)。瘦素活性的選擇性祀向可有益于代謝病癥與免疫或炎癥相關(guān)病癥兩者。
[0018] 本發(fā)明的第一方面是一種包含至少兩個細(xì)胞因子的融合蛋白，其中至少一個