專利名稱：表達(dá)多種免疫調(diào)節(jié)劑的工程改造細(xì)胞及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療疾病和病癥，例如癌癥的基因治療領(lǐng)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供工程改造免疫細(xì)胞或治療支持細(xì)胞(TSC)以表達(dá)一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑和這些細(xì)胞作為治療劑的應(yīng)用。背景白介素-12(IL_12)是參與許多生物學(xué)過程，包括但不限于保護(hù)性免疫應(yīng)答和抑制腫瘤發(fā)生的I型細(xì)胞因子家族成員(Abdi等.，2006 ；Adorini, 1999 ；Adorini, 2001 ； Adorini 等.，2002 ；Adorini 等.，1996 ；Akhtar 等.，2004 ；Akiyama 等.，2000 ；Al-Mohanna 等·，2002 ；Aliberti 等·，1996 ；AlIavena 等·，1994 ；Alli 和 Khar, 2004 ；Alzona 等·， 1996 ；Amemiya 等.，2006 ；Araujo 等.，2001 ；Arulanandam 等.，1999 ；Athie 等.，2000 ； Athie-Morales 等.，2004 ；BertagnolIi 等.，1992 ；Bhardwaj 等.，1996 ；Biedermann 等.， 2006 ；Brunda 禾口 Gately，1994 ；Buchanan 等.，1995 ；Romani 等.，1997 ；Rothe 等.，1996 ； Satoskar 等·，2000 ；Schopf 等·，1999 ；Thomas 等·，2000 ；Tsung 等·，1997 ；Wolf 等·， 1994 ；Yuminamochi等.，2007)。越來越多的證據(jù)提示IL-12可能是控制人疾病的有希望靶標(biāo)(例如，癌癥)。雖然IL-12因?qū)?型抗腫瘤NK細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞(Trinchieri，2003) 的強(qiáng)效抑制活性而有希望作為癌癥治療劑，但重組人IL-12(rhIL-U)在患者中報(bào)道的毒性(Atkins等.，1997)以及GMP-級(jí)rhIL_12對(duì)于臨床應(yīng)用的來源有限阻礙了成功的IL-12 治療方法。因此，基因治療方法可能代表了更安全、更能維持的治療方法看來是合理的。實(shí)際上，發(fā)現(xiàn)實(shí)施腫瘤內(nèi)或腫瘤周圍遞送重組病毒-(Sangro等·，2004 ；Triozzi等·，2005) 或依據(jù)質(zhì)粒的IL-12 cDNA (Heinzerling等.，2005)或IL-12基因修飾的自體成纖維細(xì)胞 (Kang等.，2001)的I期臨床試驗(yàn)是安全而良好耐受的。然而，接受這些基因治療的患黑色素瘤或各種癌的患者中的目標(biāo)臨床反應(yīng)是罕見、可變、瞬時(shí)的并且在很大程度上集中在治療部位(Heinzerling等.，2005 ；Kang等.， 2001 ；Sangro等·，2004 ；Triozzi等· ,2005)。在疾病消退是部分或完全的情況下，注意到腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞頻率增加(Heinzerling等，2005 ；Sangro等.，2004)和循環(huán)腫瘤特異性 ⑶8+T細(xì)胞的水平升高(Heinzerling等.，2005)，與這些患者中抗原特異性T細(xì)胞的交叉致敏提高一致。
由于特異性T細(xì)胞的交叉致敏最好通過用作IL-12的天然但受調(diào)節(jié)來源的樹突細(xì)胞(DC)完成(Berard等.，2000)，基于DC的IL-12基因治療的優(yōu)秀臨床前效力的最近報(bào)道引起極大興趣(Satoh 等.，2002 ；Tatsumi 等.，2003 ；Yamanaka 等.，2002)。例如，腫瘤內(nèi)(i.t.)注射經(jīng)工程改造以產(chǎn)生IL-12p70(通過重組腺病毒感染)的DC顯示導(dǎo)致小鼠模型中廣泛反應(yīng)性、腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞庫的交叉致敏極大改善并伴有腫瘤排斥(Tatsumi 等.，2003)。假定以前利用在CMV啟動(dòng)子控制下的編碼mIL-12的重組腺病毒(rAd. cIL12, (Tatsumi等.，2003))，工程改造DC產(chǎn)生IL-12是組成型的，因此該細(xì)胞因子早期在腫瘤病損中和晚期在腫瘤引流淋巴結(jié)中關(guān)于治療結(jié)果的免疫學(xué)影響無法解決。因此，出于調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和選擇轉(zhuǎn)基因活化時(shí)間的目的，需要為條件化表達(dá)IL-12而工程改造的DC。 本發(fā)明為利用此類細(xì)胞提供有希望的治療結(jié)果。發(fā)明概述本發(fā)明提供在一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子控制下，編碼具有一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的一種或多種功能的蛋白質(zhì)的重組載體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子是條件性的。 在另一實(shí)施方式中，所述一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子是組成型的。在另一實(shí)施方式中，所述載體是編碼一種或多種蛋白質(zhì)的腺病毒載體，通過提供可溶性小分子配體，例如二酰基胼(例如， RG-115819、RG-115830或RG-115932)條件激活的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)所述一種或多種蛋白質(zhì)表達(dá)。 該載體能控制免疫細(xì)胞和TSC表達(dá)一種或多種蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供條件性表達(dá)具有一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的一種或多種功能的一種或多種蛋白質(zhì)的載體，所述載體包含編碼基因開關(guān)(gene switch)的多核苷酸，其中編碼基因開關(guān)的所述多核苷酸包含(1)與啟動(dòng)子操作性相連的至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和( 編碼具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)的多核苷酸，該多核苷酸與所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動(dòng)子相連。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述免疫調(diào)節(jié)劑選自IL-l、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、 IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R DN 或其亞基、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL_27、GM_CSF、 IFN- α、IFN- γ、CCL3 (ΜΙΡ-la)、CCL5 (RANTES)、CCL7 (MCP3)、XCLl (淋巴細(xì)胞趨化因子)、 CXCLl (MGSA- α )、CCR7、CCL19 (MIP_3b)、CXCL9 (MIG)、CXCLlO (IP-10)、CXCLl2 (SDF-I)、 CCL21(6Ckine)、0X40L、4_lBBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防衛(wèi)素、HMGBl、Flt3L、IFN_3、 TNF- α、dnFADD、TGF- α、PD-L1RNAi, PD-Ll 反義寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L 和 SlOO。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供表達(dá)具有一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的一種或多種功能的一種或多種蛋白質(zhì)和具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)的載體，其包含編碼基因開關(guān)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(1)與啟動(dòng)子操作性相連的至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，( 編碼具有所述一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的一種或多種功能的所述一種或多種蛋白質(zhì)的多核苷酸，和(3)編碼具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸；其中( 和(3)的至少一種多核苷酸與所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動(dòng)子相連。本發(fā)明還提供制備表達(dá)具有一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)的細(xì)胞，例如免疫細(xì)胞或TSC群體的方法，所述方法通過用條件性表達(dá)具有一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的一種或多種功能的一種或多種蛋白質(zhì)的重組載體修飾(例如，轉(zhuǎn)染、電穿孔等) 細(xì)胞，其中所述載體包含編碼基因開關(guān)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(1)與啟動(dòng)子操作性相連的至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和( 編碼具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)的多核苷酸，該多核苷酸與所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動(dòng)子相連。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供制備表達(dá)具有一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的一種或多種功能的一種或多種蛋白質(zhì)和具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)的細(xì)胞，例如免疫細(xì)胞或TSC群體的方法，所述方法通過用包含編碼基因開關(guān)的多核苷酸的重組載體修飾細(xì)胞，其中所述多核苷酸包含(1)與啟動(dòng)子操作性相連的至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，( 編碼具有所述一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的一種或多種功能的所述一種或多種蛋白質(zhì)的多核苷酸，和(3)編碼具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸；其中( 和(3)的至少一種多核苷酸與所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動(dòng)子相連。本發(fā)明還提供制備表達(dá)具有一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)的細(xì)胞，例如免疫細(xì)胞或TSC群體的方法，所述細(xì)胞用條件性表達(dá)具有一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的一種或多種功能的一種或多種蛋白質(zhì)的重組載體修飾(例如，轉(zhuǎn)染、電穿孔等)，其中所述載體包含編碼基因開關(guān)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(1)與啟動(dòng)子操作性相連的至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子， 和( 編碼具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)的多核苷酸，該多核苷酸與所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動(dòng)子相連。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供表達(dá)具有一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的一種或多種功能的蛋白質(zhì)和具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)的細(xì)胞，例如免疫細(xì)胞或TSC的群體，所述細(xì)胞用重組載體修飾，其中所述載體包含編碼基因開關(guān)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(1) 與啟動(dòng)子操作性相連的至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，( 編碼具有所述一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的一種或多種功能的所述一種或多種蛋白質(zhì)的多核苷酸，和C3)編碼具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸；其中(2)和 (3)的至少一種多核苷酸與所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動(dòng)子相連。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含兩種或更多種本發(fā)明細(xì)胞，例如免疫細(xì)胞或 TSC的群體的組合物，其中所述組合物中的各細(xì)胞群體表達(dá)的一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑與該組合物中其它一種或多種細(xì)胞群體表達(dá)的一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑不同。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物包含兩種細(xì)胞群體。在另一實(shí)施方式中，所述組合物包含多于兩種細(xì)胞群體。在另一實(shí)施方式中，所述組合物包含三種細(xì)胞群體。在另一實(shí)施方式中，所述組合物包含四種細(xì)胞群體。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供體外工程改造的細(xì)胞，例如免疫細(xì)胞或TSC，所述細(xì)胞包含含有編碼基因開關(guān)的多核苷酸的載體，其中所述多核苷酸包含(1)與啟動(dòng)子操作性相連的至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和( 編碼具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸，該多核苷酸與所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動(dòng)子相連。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供體外工程改造的細(xì)胞，例如免疫細(xì)胞或TSC，所述細(xì)胞包含含有編碼基因開關(guān)的多核苷酸的載體，其中所述多核苷酸包含(1)與啟動(dòng)子操作性相連的至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，(2)編碼具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸，和C3)編碼具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸；其中(2)和(3)的至少一種多核苷酸與所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動(dòng)子相連。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含兩種或更多種本發(fā)明的體外工程改造細(xì)胞， 例如免疫細(xì)胞或TSC的群體的組合物，其中所述組合物中各體外工程改造細(xì)胞群體包含含有編碼基因開關(guān)的多核苷酸的載體，其中所述多核苷酸包含(1)與啟動(dòng)子操作性相連的至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和(2) 編碼具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸，該多核苷酸與所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動(dòng)子相連，其中所述組合物中各體外工程改造細(xì)胞群體表達(dá)的一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑與該組合物中其它一種或多種體外工程改造細(xì)胞群體表達(dá)的一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑不同。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含兩種或更多種體外工程改造細(xì)胞，例如免疫細(xì)胞或TSC的群體的組合物，所述細(xì)胞群體各自包含含有編碼基因開關(guān)的多核苷酸的載體，其中所述多核苷酸包含(1)與啟動(dòng)子操作性相連的至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，( 編碼具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸，和(3)編碼具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸；其中(2)和(3)的至少一種多核苷酸與所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動(dòng)子相連。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物包含兩種體外工程改造細(xì)胞群體。在另一實(shí)施方式中，所述組合物包含多于兩種體外工程改造細(xì)胞群體。在另一實(shí)施方式中，所述組合物包含三種體外工程改造細(xì)胞群體。在另一實(shí)施方式中，所述組合物包含四種體外工程改造細(xì)胞群體。本發(fā)明還提供包含本文所述細(xì)胞，例如免疫細(xì)胞或TSC群體的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，編碼具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)的多核苷酸在基因開關(guān)的啟動(dòng)子的控制下，編碼具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸在組成型啟動(dòng)子的控制下。在另一實(shí)施方式中，編碼具有一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)的多核苷酸和編碼具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸均在基因開關(guān)的多順反子啟動(dòng)子的控制下。在另一實(shí)施方式中，編碼具有一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)的多核苷酸在基因開關(guān)的啟動(dòng)子的控制下，編碼具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸在不同于基因開關(guān)啟動(dòng)子的條件性啟動(dòng)子的控制下。在又一個(gè)實(shí)施方式中，編碼具有一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)的多核苷酸的基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)與具有 IL-12的功能的多核苷酸的基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)是正交的。在又一個(gè)的實(shí)施方式中，編碼各蛋白質(zhì)的各多核苷酸的基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)是正交的。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供癌癥的治療方法，所述癌癥例如但不限于黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腎癌和前列腺癌以及表1所列的癌癥。作為重組cDNA載體施用時(shí)，IL-12 基因治療在動(dòng)物模型研究中顯示抗腫瘤效力(Faure等.，1998 ；Sangro等.，200 ，但在基因修飾的DC中施用時(shí)，更是如此(Satoh等.，2002 ；Svane等.，1999 ；Tatsumi等·，2003 ； Yamanaka等.，2002)。然而，迄今為止，利用質(zhì)?；虿《据d體的IL-12基因治療的人I期試驗(yàn)未能在癌癥環(huán)境中實(shí)現(xiàn)持久的目標(biāo)臨床反應(yīng)(Heinzerling等.，2005 ；Kang等.，2001 ； Sangro等.，2004 ；Triozzi等.，2005)。本文所述的基因治療提供有希望的治療模式。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供治療哺乳動(dòng)物的腫瘤的方法，包括以下步驟(a)將免疫細(xì)胞或TSC群體腫瘤內(nèi)給予腫瘤微環(huán)境，所述細(xì)胞經(jīng)體外工程改造以條件性表達(dá)具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)；和
(b)將治療有效量的激活配體給予所述哺乳動(dòng)物；從而誘導(dǎo)具有所述免疫調(diào)節(jié)劑的功能的蛋白質(zhì)表達(dá)并治療所述腫瘤。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供治療哺乳動(dòng)物的腫瘤的方法，包括以下步驟(a)將兩種或更多種免疫細(xì)胞或TSC群體腫瘤內(nèi)給予腫瘤微環(huán)境，所述細(xì)胞經(jīng)體外工程改造以條件性表達(dá)具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)，其中各群免疫細(xì)胞或TSC表達(dá)不同集合的一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑；和(b)將治療有效量的一種或多種激活配體給予所述哺乳動(dòng)物；從而誘導(dǎo)具有所述免疫調(diào)節(jié)劑的功能的蛋白質(zhì)表達(dá)并治療所述腫瘤。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供治療哺乳動(dòng)物的腫瘤的方法，包括以下步驟(a)將免疫細(xì)胞或TSC群體腫瘤內(nèi)給予腫瘤微環(huán)境，所述細(xì)胞經(jīng)體外工程改造以條件性表達(dá)具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)和具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)，其中具有所述免疫調(diào)節(jié)劑或IL-12的功能的至少一種蛋白質(zhì)在配體激活的條件性啟動(dòng)子的控制下；和(b)將治療有效量的激活配體給予所述哺乳動(dòng)物；從而誘導(dǎo)具有所述免疫調(diào)節(jié)劑的功能的蛋白質(zhì)和/或具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)表達(dá)并治療所述腫瘤。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供治療哺乳動(dòng)物的腫瘤的方法，包括以下步驟(a)將兩種或更多種免疫細(xì)胞或TSC群體腫瘤內(nèi)給予腫瘤微環(huán)境，所述細(xì)胞經(jīng)體外工程改造以條件性表達(dá)具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)和具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)，其中各群免疫細(xì)胞或TSC表達(dá)不同集合的具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)，其中具有所述免疫調(diào)節(jié)劑或IL-12的功能的至少一種蛋白質(zhì)在配體激活的條件性啟動(dòng)子的控制下；和(b)將治療有效量的一種或多種激活配體給予所述哺乳動(dòng)物；從而誘導(dǎo)具有所述免疫調(diào)節(jié)劑的功能的蛋白質(zhì)和/或具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)表達(dá)并治療所述腫瘤。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供治療哺乳動(dòng)物的疾病或病癥的方法，包括以下步驟(a)將修飾細(xì)胞群體給予所述哺乳動(dòng)物，所述細(xì)胞經(jīng)修飾以條件性表達(dá)具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)；和(b)將治療有效量的激活配體給予所述哺乳動(dòng)物；從而誘導(dǎo)具有所述免疫調(diào)節(jié)劑的功能的蛋白質(zhì)表達(dá)并治療所述疾病或病癥。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供治療哺乳動(dòng)物的疾病或病癥的方法，包括以下步驟(a)將兩種或更多種修飾細(xì)胞群體給予所述哺乳動(dòng)物，所述細(xì)胞經(jīng)修飾以條件性表達(dá)具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)，其中各群修飾細(xì)胞表達(dá)不同集合的一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑；和(b)將治療有效量的一種或多種激活配體給予所述哺乳動(dòng)物；從而誘導(dǎo)具有所述免疫調(diào)節(jié)劑的功能的蛋白質(zhì)表達(dá)并治療所述疾病或病癥。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供治療哺乳動(dòng)物的疾病或病癥的方法，包括以下步驟(a)將修飾細(xì)胞群體給予所述哺乳動(dòng)物，所述細(xì)胞經(jīng)修飾以條件性表達(dá)具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)和具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)，其中具有所述免疫調(diào)節(jié)劑或IL-12的功能的至少一種蛋白質(zhì)在配體激活的條件性啟動(dòng)子的控制下；和(b)將治療有效量的激活配體給予所述哺乳動(dòng)物；從而誘導(dǎo)具有所述免疫調(diào)節(jié)劑的功能的蛋白質(zhì)和/或具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)表達(dá)并治療所述疾病或病癥。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供治療哺乳動(dòng)物的疾病或病癥的方法，包括以下步驟(a)將兩種或更多種修飾細(xì)胞群體給予所述哺乳動(dòng)物，所述細(xì)胞經(jīng)修飾以條件性表達(dá)具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)和具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)，其中各群修飾細(xì)胞表達(dá)不同集合的具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)，其中具有所述免疫調(diào)節(jié)劑或IL-12的功能的至少一種蛋白質(zhì)在配體激活的條件性啟動(dòng)子的控制下；和(b)將治療有效量的一種或多種激活配體給予所述哺乳動(dòng)物；從而誘導(dǎo)具有所述免疫調(diào)節(jié)劑的功能的蛋白質(zhì)和/或具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)表達(dá)并治療所述疾病或病癥。本發(fā)明還提供測(cè)定基于工程改造的細(xì)胞，例如免疫細(xì)胞或TSC的治療效力的方法，該方法通過檢測(cè)治療開始前患者的IFN-Y表達(dá)或活性水平，從而獲得對(duì)照水平，然后給予工程改造的細(xì)胞以表達(dá)具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)和任選表達(dá)具有 IL-12的功能的蛋白質(zhì)，給予有效量的激活配體，然后檢測(cè)IFN-Y的表達(dá)水平以產(chǎn)生測(cè)試水平，比較對(duì)照水平與測(cè)試水平以測(cè)定治療方案是否有效。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供測(cè)定基于體外工程改造的細(xì)胞，例如免疫細(xì)胞或 TSC的治療方案在患者中的效力的方法，包括(a)給予體外工程改造的細(xì)胞之前，檢測(cè)從有此需要的所述患者獲得的第一生物學(xué)樣品中干擾素-Y (IFN-y)的表達(dá)水平或活性水平或二者，從而獲得對(duì)照水平；(b)給予有此需要的患者體外工程改造的細(xì)胞，所述細(xì)胞經(jīng)工程改造以條件性表達(dá)具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)和任選表達(dá)具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)；(c)給予有此需要的所述患者有效量的激活配體；(d)給予體外工程改造的免疫細(xì)胞和激活配體之后，檢測(cè)從有此需要的所述患者獲得的第二生物學(xué)樣品中IFN-Y的表達(dá)水平或活性水平或二者，從而獲得測(cè)試水平；和(e)比較IFN-γ的對(duì)照水平或測(cè)試水平，其中IFN-γ的表達(dá)、活性或二者的測(cè)試水平相比于對(duì)照水平增加表明該治療方案在有此需要的所述患者中有效。附圖詳述

圖1顯示編碼hIL-12的雙順反子轉(zhuǎn)錄物的調(diào)控啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒圖譜。圖2顯示編碼hIL-21和hIL_15的雙順反子轉(zhuǎn)錄物的調(diào)控啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒圖譜。圖3顯示編碼mIL-12的雙順反子轉(zhuǎn)錄物的調(diào)控啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒圖譜。圖4顯示編碼mIL-21和mIL_15的雙順反子轉(zhuǎn)錄物的調(diào)控啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒圖譜。
圖5顯示hIL-21的調(diào)控啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒圖譜。圖6顯示mIL-21的調(diào)控啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒圖譜。圖7顯示編碼hIL-12和hIL_21的三順反子轉(zhuǎn)錄物的調(diào)控啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒圖譜。圖8顯示編碼mIL-12和mIL_21的三順反子轉(zhuǎn)錄物的調(diào)控啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒圖譜。圖9顯示的是載體rAd. RheoIL12的結(jié)構(gòu)，其中El和E3區(qū)已被刪除，RheoSwitch 治療系統(tǒng)(RTS) -IL-12元件取代了 El區(qū)。標(biāo)記為“IL-12”的框代表由IRES隔開的IL_12p40 和IL-12p35編碼序列。序列詳述免疫調(diào)節(jié)劑細(xì)胞因子白介素I(IL-I)是抵御感染的炎性應(yīng)答的重要細(xì)胞因子，其多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為:M28983 (AlL-Ia) ；M15330 (人 IL-1 β ) ；AF201830 (人 IL-1 δ )； AF201831 (人 IL-I ε) ；AF201832(人 IL-I ζ) ；AF201833(人 IL-I η) ；NM_010554(小鼠 IL-I a ) ;NM_008361(小鼠 IL-1 β ) ;NM_019451 (小鼠 L-1 δ ) ;NM_019450 (小鼠 IL-lf6) ；NM_027163(小鼠 IL_lf8) ；NM_153511 (小鼠 IL_lf9) ；NM_204524(雞 IL-I β )； ΝΜ_017019(大鼠IL-Ia)；和NM_031512 (大鼠IL-I β )，它們的序列通過引用納入本文。白介素I(IL-I)的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為ΑΑΑ59134(人 IL-I a ) ；AAA59135 (人 IL-I β ) ；AAF25210 (人 IL-I δ ) ；AAF25211 (人 IL-I ε )； AAF25212(人 1L-1 ζ ) ；AAF25213(人 IL-1 η) ；ΝΡ_034684(小鼠 IL-1 a ) ；NP_032387 (小鼠 IL-I β ) ;NP_0623M (小鼠 L-1 δ ) ;NP_062323 (小鼠 IL_lf6) ;NP_081439(小鼠 IL-lf8) ；NP_705731 (小鼠 IL-lf9) ；NP_989855 (雞 IL-1 β ) ；ΝΡ_058715(大鼠 IL-1 a )； 和NP_113700(大鼠IL-Ιβ)，它們的序列通過引用納入本文。Laurent等·，Psychiatr. Genet. 7 =103(1997)鑒定人白介素_1 β基因中的多態(tài)性突變。白介素2(IL-2)屬于細(xì)胞因子家族，包括IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21， 其多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為U25676(人)；NM_008366(小鼠)； NM_204153(雞)；和NM_053836(大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。白介素2(IL_2)的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為AAA70092(人)； NP_032392 (小鼠)；NP_989484 (雞)；和NP_446288 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。Liu 等·，Appl. Biochem. Biotechnol. 133 :77(2006)產(chǎn)生突變型人 IL-2， Lorberboum 等·，J. Biol. Chem. 265 :16311 (1990)描述了嵌合型 IL-2 的產(chǎn)生。白介素4(IL_4)是誘導(dǎo)原初輔助T細(xì)胞分化成TH2細(xì)胞的細(xì)胞因子，其多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為M23442(人)；匪_021觀3(小鼠)；ΝΜ_001007079 (雞)； 和NM_201270(大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。白介素4(IL_4)的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為AAA59150(人)； NP_067258(小鼠)；NP_001007080 (雞)；禾口 NP_958427(大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。Kawashima 等.，J. Med. Genet. 35 :502 (1998)描述了特應(yīng)性皮炎相關(guān)的 IL-4 基因多態(tài)性。白介素7(IL_7)是B和T細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要的細(xì)胞因子。IL_7的多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為J04156(人)；NM_008371(小鼠)；NM_001037833 (雞)；和 NM_013110(大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。白介素7(IL_7)的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為AAA59156(人)； NP_032397(小鼠)；NP_001032922 (雞)；禾口 NP_037242(大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。Feng等·，Genetics 175 :545 (2007)鑒定了 IL-7中導(dǎo)致功能缺陷的點(diǎn)突變。白介素9(IL_9)是T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，是造血細(xì)胞的調(diào)節(jié)劑。IL_9的多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為NM_000590(人)；NM_008373(小鼠)； NM_001037825(雞)；和ΝΜ_001105747 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。白介素9(IL_9)的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為NP_000581(人)； NP_032399 (小鼠)；NP_00103^14 (雞)；和NP_001099217 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。IL-12是一種細(xì)胞因子，其可用作激活的T和NK細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，增強(qiáng)NK/淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞的裂解活性，以及刺激靜息外周血單核細(xì)胞(PBMC)產(chǎn)生IFN-γ。IL-12 的多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為NM_000882(人IL12A) ；NM_002187(人 IL12B) ；NM_008351(小鼠 IL12a) ；NM_008352(小鼠 IL12b) ；NM_213588(雞 IL12A)； NM_213571 (雞 IL12B) ；NM_053390 (大鼠 IL12a)；和 NM_022611 (大鼠 IL12b)，它們的序列通過引用納入本文。白介素12(IL_12)的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為NP_000873(人 IL12A) ；NP_002178(人 IL12B) ；NP_032377(小鼠 IL12a) ；NP_032378(小鼠 IL12b)； NP_998753 (雞 IL12A) ；NP_998736 (雞 IL12B) ；NP_445842 (大鼠 IL12a)；禾口 NP_072133 (大鼠IL12b)，它們的序列通過引用納入本文。白介素15(IL_15)是調(diào)節(jié)T和天然殺傷細(xì)胞激活和增殖的細(xì)胞因子。IL-15 的多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為U14407(人)；NM_008357(小鼠)； EU334509 (雞)；和AFO15719 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。白介素15(IL_15)的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為AAA21551(人)； NP_032383(小鼠)；ABY55312(X|)；和AAB94536(大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。白介素18(IL_18)是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，微生物產(chǎn)物感染后，其與白介素 12 —起誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力。IL-18的多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為 U90434(人)；NM_008360(小鼠)；EU747333(雞)；和AY258448 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。白介素18(IL_18)的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為AAB50010(人)； NP_032386(小鼠)；ACE79188(雞)；和AAP14669(大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。白介素21(IL_21)是通過誘導(dǎo)細(xì)胞增殖而對(duì)免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，包括天然殺傷細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞具有強(qiáng)效調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，其多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得， 登錄號(hào)為AF254069(人)；NM_021782 (小鼠)；NM_0010M835 (雞)；和 NM_001108943 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。
白介素21(IL_21)的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為AAG^348(人)； NP_068554 (小鼠)；NP_001020006 (雞)；和NP_00110M13 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。白介素27(IL_27)是在調(diào)節(jié)B和T淋巴細(xì)胞活性中起重要作用的細(xì)胞因子。IL-27 的多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為AY099296(人)；NM_145636 (小鼠)；和 XM_344962(大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。白介素27(IL-27)的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為AAM34498(人)； NP_663611 (小鼠)；和XP_344963(大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。干擾素β I(IFNBl)是結(jié)合特異性細(xì)胞表面受體(IFNAR)的一組干擾素蛋白的成員，并刺激巨噬細(xì)胞和天然殺傷(NK)細(xì)胞引發(fā)抗病毒反應(yīng)，其多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為ΝΜ_002176(人)；NM_010510(小鼠)；NM_0010M836 (雞)；和 NM_019127 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。干擾素β 1 (IFNBl)的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為 ΝΡ_002167(人)；NP_0;34640 (小鼠)；ΝΡ_001020007(雞)；和 NP_062000 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。干擾素Y(IFN-Y)是可溶性細(xì)胞因子，其是唯一的II型干擾素并具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性。IFN-Y的多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為 NM_000619 (人)；NM_008337 (小鼠)；禾口 ΝΜ_138880 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。干擾素γ (IFN-Y)的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為 NP_000610 (人)；NP_032363 (小鼠)；和ΝΡ_620235 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。腫瘤壞死因子(TNF-α)是主要由單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞分泌的多功能促炎細(xì)胞因子，其對(duì)脂質(zhì)代謝、凝血、胰島素耐受和內(nèi)皮功能有影響，其多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為X02910(人)；NM_013693(小鼠)；和BC107671 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。TNF-α的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為CAA^669 (人)； NP_038721 (小鼠)；和AAI07672(大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。趨化因子趨化因子(C基序)配體1(XCL1，也稱為淋巴細(xì)胞趨化因子)對(duì)⑶4+和⑶8+T 細(xì)胞有趨化作用，但對(duì)單核細(xì)胞沒有，其誘導(dǎo)外周血淋巴細(xì)胞中的胞內(nèi)鈣升高。)(CL1的多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為NM_002995(人)；NM_008510 (小鼠)；和 NM_134361 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。XCLl的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為NP_002986(人)； NP_032536 (小鼠)；和NP_599188 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。美國(guó)專利第 6，022，534號(hào)公開了淋巴細(xì)胞趨化因子，其用于吸引細(xì)胞毒性T細(xì)胞和/或NK細(xì)胞，和/或誘導(dǎo)固有細(xì)胞增殖。還公開了分離和利用抗淋巴細(xì)胞趨化因子抗體及)(CL1融合蛋白的方法。CC趨化因子配體3(CCL3)也稱為巨噬細(xì)胞炎性蛋白_1 (MIP-I)，其參與多形核白細(xì)胞募集和激活中的急性炎性狀態(tài)，即所謂的單核因子(主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一類細(xì)胞因子)，其多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為NM_0(^983 (人)；NM_011337(小鼠)；和NM_013025(大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。CCL3的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為NP_002974(人)； NP_035467(小鼠)；和NP_037157(大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。CCL5 (RANTES)是參與炎癥和哮喘的促炎細(xì)胞因子，其多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為AF043341(人)；NM_013653 (小鼠)；和NM_031116 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。CCL5的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為AAC03541 (人)； NP_038681 (小鼠)；和NP_112378(大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。CC趨化因子配體7(CCL7)是參與炎癥和癌癥侵入期間巨噬細(xì)胞募集的趨化因子， 其多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為ΝΜ_006273(人)；NM_013654(小鼠)；和 NM_001007612(大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。CCL7的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為NP_006^4(人)； NP_038682(小鼠)；和NP_001007613 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。趨化因子(CXC基序)配體9(CXCL9，也稱為MIG)是、干擾素可誘導(dǎo)的T細(xì)胞化學(xué)引誘物。CXCL9的多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為NM_002416(人)； NM_0108599(小鼠)；和NM_145672(大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。CXC9的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為NP_002407(人)； NP_032625(小鼠)；和NP_663705(大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。趨化因子(C-X-C基序)配體10(CXCL10)是在免疫系統(tǒng)細(xì)胞的化學(xué)引誘、T細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附、抗腫瘤活性和血管發(fā)生中起作用的小細(xì)胞因子。CXCLio的多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為X02530(人)；NM_021274(小鼠)；和BC058444 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。趨化因子(C-X-C基序)配體IO(CXCLIO)的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為:CAA26370(A ) ；NP_067249(小鼠)；和AAH58444(大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。趨化因子(C-X-C基序)配體12(CXCL12)也稱為基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1 (SDF-I)，其是屬于互泌素家族的小細(xì)胞因子，該家族的成員激活白細(xì)胞，常由促炎刺激物，例如LPS、 TNF或ILl誘導(dǎo)。CXCL12的多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為NM_000609 (人)； NM_001012477 (小鼠)；NM_204510 (雞)；和ΝΜ_001033883 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。CXCL12的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為NP_000600(人)； NP_001012495 (小鼠)；NP_989841 (雞)；禾口 ΝΡ_001029055 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。Hansson 等.，Microbes and Infection 8 :841 Q006)討論了趨化因子(C-C 基序)受體7(CCR7)和趨化因子(C-C基序)配體19(CCL19，也稱為ΜΙΡ-3β)之間的相互作用對(duì)于初級(jí)免疫應(yīng)答至關(guān)重要。CCR7的多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為 ΝΜ_001838 (人)；和NM_007719 (小鼠)，它們的序列通過引用納入本文。CCR7的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為ΝΡ_001829(人)；和 ΝΡ_031745(小鼠)，它們的序列通過引用納入本文。
CCL19的多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為NM_006274(人)；和 NM_011888 (小鼠)，它們的序列通過引用納入本文。CCL19的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為NP_006^5(人)；和 NP_036018(小鼠)，它們的序列通過引用納入本文。CC趨化因子配體21 (CCL21)是⑶4+，但非⑶8+T細(xì)胞達(dá)到它們的穩(wěn)態(tài)“設(shè)定點(diǎn)”必需的已知CCR7配體，擾亂CCL21表達(dá)可改變對(duì)于自身免疫力的敏感性，其多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為AB00M09(人)；NM_011335(小鼠CCL21a) ；NM_011124(小鼠 CCL21b)；和NM_023052(小鼠CCL21c)；它們的序列通過引用納入本文。CCL21的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為BAA21817(人)； NP_0;35465 (小鼠 CCL21a) ；NP_0352M (小鼠 CCL21b)；和 NP_075539(小鼠 CCL21c)，它們的序列通過引用納入本文。白介素-8(IL-8)是一種趨化因子，也稱為嗜中性粒細(xì)胞激活肽-1或SCYB8，其是幾類細(xì)胞響應(yīng)于炎性刺激而分泌的組織衍生肽。美國(guó)專利號(hào)6，133，426和6，177，980公開了人源化抗-IL-8抗體的氨基酸和多核苷酸序列。人IL-8的多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為NM_000584，其序列通過引用納入本文。人IL-8的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為NP_000575，其序列通過引用納入本文。生長(zhǎng)因子粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)是一種細(xì)胞因子，其起到白細(xì)胞生長(zhǎng)因子作用、刺激干細(xì)胞產(chǎn)生粒細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞)和單核細(xì)胞。GM-CSF的多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為M11734(人)；NM_009969(小鼠)；EU520303(雞)；NM_001037660(大鼠 Csf 2ra)；和 NM_133555 (大鼠 Csf2rb)，它們的序列通過引用納入本文。粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為AAA52122(人)；NP_034099 (小鼠)；ACB115;34(雞)；NP_001032749 (大鼠 Csf2ra)； 和NP_598239(Csf2rb)，它們的序列通過引用納入本文。FMS-相關(guān)酪氨酸激酶配體(FLT3/FLK2配體，F(xiàn)lt3L)可在造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞或二者上起到生長(zhǎng)因子受體的作用，其多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為 U04806 (人)；和ΝΜ_013520 (小鼠)，它們的序列通過引用納入本文。FLT3/FLK2配體(Flt3L)的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為 AAA17999(人)；和NP_038548(小鼠)，它們的序列通過引用納入本文。在一些人癌癥中上調(diào)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α (TGF-α)能可逆地賦予培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化表型，其多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為NM_001099691(人)；NM_031199(小鼠)；NM_001001614(雞)；和NM_012671 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。TGF-α的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為NP_001093161 (人)； NP_112476(小鼠)；NP_001001614(雞)；禾口 NP_036803(大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。佐劑防衛(wèi)素是涉及抵御許多革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌、真菌和病毒的先天免疫應(yīng)答的抗微生物肽。防衛(wèi)素的多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為 Χ92744(人 hBD-Ι) ；AJ000152 (人 hBD_2) ；AF217245(人 β 防衛(wèi)素 _3) ；AJ314835(人 β 防衛(wèi)素-4) ；ΑΒ089180(人 hBD-5) ；AY1M466 (人防衛(wèi)素 β 106，DEFB106) ；AF540979 ( A β 防衛(wèi)素 107，DEFB107) ；AF529416(人 β 防衛(wèi)素，DEFB108) ；DQ012014(人 β 防衛(wèi)素 110，DEFBl 10) ；DQ012015(人 β 防衛(wèi)素 111，DEFBl 11) ；DQ012016(人 β 防衛(wèi)素 112，DEFBl 12) ；DQ012017(人 β 防衛(wèi)素 113，DEFBl 13) ；DQ012018(人 β 防衛(wèi)素 114， DEFBl 14) ；DQ012019(人 β 防衛(wèi)素 115，DEFB115) ；DQ012020(人 β 防衛(wèi)素 116，DEFB116)； DQ012021(人 β 防衛(wèi)素 117，DEFB117) ；NM_007843 (小鼠防衛(wèi)素 β 1) ；NM_010030 (小鼠防衛(wèi)素 β 2,Defb2) ；NM_013756(小鼠防衛(wèi)素 β 3,Defb3) ；NM_019728 (小鼠防衛(wèi)素 ^4,Defb4)； NM_030734(小鼠防衛(wèi)素 β 5，Defb5) ；NM_054074(小鼠防衛(wèi)素 β 6，Defb6) ；NM_139220(小鼠防衛(wèi)素 β 7) ；ΝΜ_153108(小鼠防衛(wèi)素 3 8，Defb8) ；NM_139219 (小鼠防衛(wèi)素 3 9，Defb9)； 和NM_139225(小鼠防衛(wèi)素β 10，DefblO)；它們的序列通過引用納入本文。β-防衛(wèi)素的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為CAA63405(人 hBD-Ι) ；CAB65126(人 hBD_2) ；AAF73853 (人 β 防衛(wèi)素-3) ；CAC85520(人 β 防衛(wèi)素-4) ；BAC10630(人 hBD-5) ；AAM93908 (人防衛(wèi)素 β 106，DEFB106) ；ΑΑΝ33115(人 β 防衛(wèi)素 107，DEFB107) ；AAQ09525 (人 β 防衛(wèi)素，DEFB108) ；ΑΑΥ59750 (人 β 防衛(wèi)素 110，DEFBl 10) ；ΑΑΥ59751 (人 β 防衛(wèi)素 111，DEFBl 11) ；ΑΑΥ59752 (人 β 防衛(wèi)素 112，DEFBl 12) ；ΑΑΥ59753 (人 β 防衛(wèi)素 113，DEFBl 13) ；ΑΑΥ59754(人 β 防衛(wèi)素 114， DEFBl 14) ；ΑΑΥ59755(人 β 防衛(wèi)素 115，DEFB115) ；AAY59756 (人 β 防衛(wèi)素 116，DEFB116)； AAY59757 (人 β 防衛(wèi)素 117，DEFBl 17) ；ΝΡ_031869(小鼠 defeninP 1) ；NP_034160(小鼠防衛(wèi)素β 2，Defb2) ；NP_038784 (小鼠防衛(wèi)素β 3，Defb3) ；NP_062702 (小鼠防衛(wèi)素 β 4，Defb4) ；NP_109659(小鼠防衛(wèi)素 β 5，Defb5) ；NP_473415 (小鼠防衛(wèi)素 β 6，Defb6)； NP_631966(小鼠防衛(wèi)素 β 7，Defb7) ；NP_694748 (小鼠防衛(wèi)素 β 8，Defb8) ；NP_631965(小鼠防衛(wèi)素β 9, Defb9)；和NP_631971(小鼠防衛(wèi)素β 10，DefblO)，它們的序列通過引用納入本文。其它人和大鼠防衛(wèi)素肽序列還可參見美國(guó)專利第5，242, 902號(hào)。高遷移率族蛋白-I(HMGBl)蛋白是非組蛋白染色體蛋白，其起到細(xì)胞因子的作用，介導(dǎo)針對(duì)壞死性細(xì)胞死亡和癌癥、病原體入侵、外傷和膿毒癥的局部和全身性反應(yīng)。HMGBl蛋白的多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為NM_002128(人)； ΝΜ_010439 (小鼠)；NM_204902 (雞)；禾口 ΝΜ_012963 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。高遷移率族蛋白-I(HMGBl)的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為 NP_002119(人)；NP_034569(小鼠)；NP_990233 (雞)；和 NP_037095 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。吞噬細(xì)胞SlOO蛋白介導(dǎo)炎性反應(yīng)并將炎性細(xì)胞募集至組織損傷部位，該蛋白是對(duì)于先天免疫力至關(guān)重要的損傷相關(guān)分子模式(DAMP)分子的成員。參見R)ell 等.，J. Leukocyte Biol. 81 1 (2006)。SlOO蛋白質(zhì)的多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為:BC014392(人 S100A1) ；BC002829 (人 S100A2) ；BC012893(人 S100A3)； BC016300(人S100A4) ；Z18954 (人 S100D) ；BC001431(人 S100A6) ；BC034687 (人S100A7)； BC005928(人 S100A8) ；BC047681(人 S100A9) ；BC015973(人 S100A10) ；D38583(人鈣囊素(clagizzarin)) ；NM_011309 (小鼠 SlOOal) ；NM_009115 (小鼠 SlOOb) ；NM_013650 (小鼠S100a8) ；NM_009114(小鼠 S100a9) ；NM_011310 (小鼠 S100a3) ；NM_011311 (小鼠 S100a4)； 和NM_011312(小鼠S100a5)，它們的序列通過引用納入本文。SlOO蛋白質(zhì)的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為AAH14392(人 S100A1) ；AAH02829 (人 S100A2) ；AAH12893(人 S100A3) ；AAH16300(人 S100A4)； CAA79479 (人 S100D) ；AAHO1431 (人 S100A6) ；AAH34687(人 S100A7) ；AAH05928(人 S100A8) ；AAH47681 (人 S100A9) ；AAH15973(人 S100A10) ；BAA07597 (人鈣囊素 (clagizzarin)) ；NP_035439 (小鼠 SlOOal) ；NP_033141(小鼠 SlOOb) ；NP_038678 (小鼠 S100a8) ；NP_033140(小鼠 S100a9) ；NP_035440 (小鼠 S100a3) ；NP_035441 (小鼠 S100a4)； 和NP_035442(小鼠S100a5)，它們的序列通過引用納入本文。甘露聚糖是一種植物多糖，其是甘露糖的聚合物，可用于產(chǎn)生免疫應(yīng)答。美國(guó)專利第5，807, 559號(hào)公開了甘露聚糖的免疫原性偶聯(lián)物，其可用于產(chǎn)生針對(duì)腫瘤相關(guān)碳水化合物結(jié)構(gòu)或針對(duì)感染因子和/或受感染宿主細(xì)胞上表達(dá)的碳水化合物結(jié)構(gòu)的T細(xì)胞免疫力。 美國(guó)專利第5，773，425號(hào)公開了甘露聚糖在緩解癥狀和/或治愈病毒性疾病和增強(qiáng)免疫應(yīng)答中的應(yīng)用?？ń槊?BCG)是一種活的減毒分枝桿菌，用作防止嚴(yán)重和致命肺結(jié)核的疫苗。美國(guó)專利第7，393，541號(hào)公開了產(chǎn)生佐劑疫苗以便產(chǎn)生針對(duì)哺乳動(dòng)物對(duì)象中分枝桿菌的體內(nèi)T-細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答。還參見Hubbard和CollinsJnfect. Immun. 59 ) :570。美國(guó)專利第5，292, 513號(hào)公開了利用熱殺傷BCG在需要提升殺細(xì)菌和抗病毒活性的患者中體內(nèi)致敏巨噬細(xì)胞的方法。BCG的完整基因組序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為NC_008769(牛分枝桿菌 BCG Pasteur 1173P2 株(M. bovis BCG str. Pasteur 1173P2)，完整基因組)。細(xì)菌脂多糖(LPQ是革蘭氏陰性細(xì)菌感染后誘導(dǎo)強(qiáng)烈免疫應(yīng)答的內(nèi)毒素。美國(guó)專利第4，148，877號(hào)公開了從細(xì)菌培養(yǎng)物中分級(jí)分離LPS，以及各部分作為藥物來誘導(dǎo)針對(duì)細(xì)菌感染的抵抗力的應(yīng)用。美國(guó)專利第5，292, 513號(hào)公開了用LPS在需要提升殺細(xì)菌和抗病毒活性的患者中體內(nèi)致敏巨噬細(xì)胞的方法。共刺激分子(正)0X40配體(0X40L)屬于腫瘤壞死因子(配體)超家族成員4 (Tnfsf4)，表達(dá)在樹突細(xì)胞上并促進(jìn)Th2細(xì)胞分化。0X40配體的多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為 X79929 (人)；U12763 (小鼠)；和AF037067 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。0X40配體(0X40L)的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為CAA56^4(人)； AAA21871 (小鼠)；和AAC67236 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。4-1BB配體G-1BBL)屬于腫瘤壞死因子(配體)超家族成員9(Tnfsf9)，其是2 型跨膜糖蛋白，表達(dá)在激活的T淋巴細(xì)胞上。4-1BBL的多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得， 登錄號(hào)為NM_003811(人)；NM_009404(小鼠)；和AY33M09 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。4-1BB配體G-1BBL)的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為 NP_003802 (人)；NP_033430 (小鼠)；和AAQO1228 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。CD40蛋白屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員5，在介導(dǎo)各種免疫和炎性應(yīng)答中至關(guān)重要，包括T細(xì)胞依賴性免疫球蛋白類轉(zhuǎn)化、記憶B細(xì)胞發(fā)育和生發(fā)中心形成。CD40 蛋白的多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為X60592(人)；NM_170701(小鼠)；NM_204665(雞)；和NM_134360(大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。CD40蛋白的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為CAA43045(人)； NP_733802 (小鼠)；NP_989996 (雞)；和NP_599187 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。糖皮質(zhì)激素-誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體家族相關(guān)蛋白(GITR)能通過T細(xì)胞刺激引發(fā)有效的腫瘤免疫力。給予抗-GITR單克隆抗體(mAb)可引發(fā)強(qiáng)效腫瘤特異性免疫力并消除已有的腫瘤而不引發(fā)明顯的自身免疫疾病。參見Ko等.，J. Exp. Med. 7 :885 0005)。美國(guó)專利號(hào)6，503，184B1公開了抗-GITR抗體。GITR配體(GITRL)的多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為 AY358868 (人)；和AY359852 (小鼠)，它們的序列通過引用納入本文。GITR配體(GITRL)的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為AAQ89227(人)； 和AAQ55265 (小鼠)，它們的序列通過引用納入本文。皰疹病毒進(jìn)入介質(zhì)(HVEM)結(jié)合配體(HSVgD)也稱為p30，或者LIGHT，其是參與 T細(xì)胞共刺激的TNF家族成員。LIGHT具有兩種受體，皰疹病毒進(jìn)入介質(zhì)(HVEM)和淋巴毒素-β受體(LT- β R)。作為HVEM的配體，HSVgD通過用作T細(xì)胞的共刺激因子而激活T細(xì)胞，其導(dǎo)致T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌。LIGHT的多核苷酸和氨基酸序列參見美國(guó)專利第 7，118，742號(hào)。美國(guó)專利第5，654，174號(hào)描述了羧基末端殘基缺失的變體gD蛋白。⑶70是結(jié)合⑶27的細(xì)胞因子。其在T-細(xì)胞活化中起作用，誘導(dǎo)共刺激的T細(xì)胞增殖和增強(qiáng)細(xì)胞裂解性T-細(xì)胞產(chǎn)生。CD70的多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為NM_001252(人)；NM_011617(小鼠)；和NM_001106878 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。CD70的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為NP_001M3(人)； NP_035747(小鼠)；和ΝΡ_001100348 (大鼠)，它們的序列通過引用納入本文。ICOS-L是T-細(xì)胞-特異性細(xì)胞表面受體ICOS的配體，其用作T-細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌的共刺激信號(hào)。ICOS-L還誘導(dǎo)B-細(xì)胞增殖和分化成漿細(xì)胞。ICOS-L能在介導(dǎo)針對(duì)炎性條件的局部組織應(yīng)答以及通過共刺激記憶T細(xì)胞功能調(diào)節(jié)第二免疫應(yīng)答中起到至關(guān)重要作用。ICOS-L的多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為NM_015259(人)；和 NM_015790(小鼠)，它們的序列通過引用納入本文。ICOS-L的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為NP_056074(人)；和 NP_056605(小鼠)，它們的序列通過引用納入本文。PD-Ll (也稱為⑶274)蛋白表達(dá)在激活的單核細(xì)胞、T和B細(xì)胞中。用IFN-γ處理后，PD-Ll在單核細(xì)胞中上調(diào)，用IFN-Y以及其它激活劑處理后，在樹突細(xì)胞和角化細(xì)胞中上調(diào)。PD-Ll蛋白的多核苷酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為ΝΜ_014143(人)；和 NM_021893(小鼠)，它們的序列通過引用納入本文。PD-Ll蛋白的氨基酸序列可從公開數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為NP_0M862(人)；和 NP_068693(小鼠)，它們的序列通過引用納入本文。共刺激分子(負(fù))細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞-相關(guān)抗原4 (CTLA4)是免疫球蛋白超家族成員，其是激活的 T細(xì)胞表達(dá)的共刺激分子。美國(guó)專利號(hào)7，034，121和6，984，720公開了 CTLA4的抗體的制備方法和應(yīng)用。美國(guó)專利第6，984，720號(hào)公開了抗-CTLA4抗體的重鏈和輕鏈的氨基酸序列。PD-I分子是結(jié)合PD-I配體(PD-Ll)的免疫球蛋白基因超家族成員。PDLl結(jié)合T 細(xì)胞上的PD-I受體將共刺激信號(hào)傳遞給該細(xì)胞，從而阻止細(xì)胞通過細(xì)胞周期的進(jìn)展，并增強(qiáng)T細(xì)胞增殖。用抗-PD-Ll抗體抑制PD-Ll和T細(xì)胞上受體之間的相互作用導(dǎo)致稱為免疫細(xì)胞無反應(yīng)的免疫應(yīng)答下調(diào)。美國(guó)專利第7，029，674號(hào)公開了抗-PD-Ll抗體的制備方法和序列。PD-L2主要是PD-I (或人同系物PD⑶1)的配體。然而，有報(bào)道說PD-12以不依賴 PDOTl的方式參與對(duì)于T淋巴細(xì)胞增殖和IFN- γ產(chǎn)生至關(guān)重要的共刺激信號(hào)。與PDOTl相互作用通過阻斷細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞因子產(chǎn)生而抑制T-細(xì)胞增殖。Yamazaki等.，J. of Immunol. 169 :5538 (2002)和 Ansari 等.，J. Exp. Med. 198 :63 (2003)描述了抗-PD-L2 單克隆抗體的制備。對(duì)抗免疫抑制劑(Counter Immune Suppressants)(耐受抑制劑)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β)是通過與兩種跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，I型和 II型之一相互作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化的多功能蛋白。參見Chen等.，Science 28 1335(1993)。II型TGF受體(TGFR2)磷酸化和激活自身磷酸化的I型受體，然后結(jié)合并激活SMAD轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物。Lynch MA等.，Cancer Res. 58 :4227(1998)描述了與人卵巢癌相關(guān)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體II型基因(TGFBR2)中的突變。Brand等.，J. Biol. Chem. 268 11500-11503(1993)描述了預(yù)計(jì)的絲氨酸/蘇氨酸激酶胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域缺失(TGFi3R2 cDNA H2-3FF的核苷酸1172-2036，可從公共數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號(hào)為M85079，氨基酸序列的登錄號(hào)為AAA61164)損害所有三種TGF-β (1、2和3)依賴性基因表達(dá)。TGF-β在大多數(shù)人腫瘤中產(chǎn)生，抑制腫瘤抗原特異性細(xì)胞免疫。faster等.，J. Immunother. 31 =500(2008)描述了細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞中顯性陰性TGFi3 R2的表達(dá)可導(dǎo)致對(duì)TGF-β抑制性作用的耐受。TGF^與TGFa協(xié)同作用誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化。其還用作負(fù)自分泌生長(zhǎng)因子。TGF^激活和信號(hào)傳導(dǎo)的失調(diào)可導(dǎo)致凋亡。Ziyadeh等.，Proc. Natl. Acad. Sci. 97 :8015 (2000)描述了給予抗-TGFii抗體能阻止db/db小鼠(產(chǎn)生明顯腎病的II型糖尿病模型)中的腎臟機(jī)能不全和腎小球硬化癥。TGF β單克隆抗體的制備和使用方法描述于美國(guó)專利第6，419，擬8號(hào)。 Barcellos-HofT 等.，Am J. Pathol. 147 :5(1995)還描述了產(chǎn)生 TGF β 抗體的方法。TGF β 融合蛋白構(gòu)建物的氨基酸和核苷酸序列描述于美國(guó)專利第6，756，215號(hào)。IL-10是激活的Th2細(xì)胞、B細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。IL-10抑制許多細(xì)胞因子的合成，包括激活的巨噬細(xì)胞和輔助T細(xì)胞產(chǎn)生的 IFN-Y、IL-2、IL-3、TNF和GM-CSF。IL-10可用于促進(jìn)激活的人B細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化， 抑制Thl應(yīng)答以阻止移植物排異和T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病。0' Farrell等.，EMBO J.17 :1006(1998) ；Kanbayashi 等·，Cell Immunol. 171 :153(1996) ；Fukushima 等·， Br. J. Ophthalmol. 90 :1535(2006)；禾口 van Lent 等·，Ann. Rheum. Dis. 66 :334(2007)描述了抗-IL10抗體的制備。美國(guó)專利第7，326，567號(hào)公開了 IL-10抗體的多核苷酸序列。美國(guó)專利第5，837，232號(hào)公開了用抗-IL-10抗體治療B-細(xì)胞介導(dǎo)自身免疫疾病的方法。細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白(SOCS)家族蛋白形成調(diào)節(jié)細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)的經(jīng)典負(fù)反饋系統(tǒng)的一部分。Alexander等.Cell 98 :597 (1999)描述了細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白I(SOCSl)是干擾素-Y信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵抑制劑，并阻止該細(xì)胞因子可能的致命新生兒作用。Hi Iton等·，Proc.Natl .AcacUci .USA 95:114(1999)討論了 SOCSl 參與通過 JAK/ STAT3途徑傳導(dǎo)信號(hào)的細(xì)胞因子的負(fù)調(diào)節(jié)。Ohya等.J. Biol. Chem. 272 :27178(1997)描述了 SOCS蛋白表現(xiàn)為通過白介素6 (IL-6)和白血病抑制因子(LIF)信號(hào)傳導(dǎo)的主要調(diào)節(jié)物。 美國(guó)專利第6，534，277號(hào)公開了抗-SOCSl抗體的制備和使用方法，其中編碼SOCSl抗體的核酸序列引入細(xì)胞，從而細(xì)胞或其后代表達(dá)該抗體，然后為治療作用體內(nèi)給予重組細(xì)胞。美國(guó)專利號(hào)6，323，317和7，049，418還公開了抗-SOCSl抗體。TGF-α是能結(jié)合EGF受體并與TGF-β協(xié)同作用以促進(jìn)軟瓊脂中不依賴貼壁的細(xì)胞增殖的促有絲分裂多肽。Ellis等.，N.Engl. J.Med. 317 :158(1987)描述了 TGF-α 在黑色素瘤的某些伴癌表現(xiàn)中起作用。美國(guó)專利第4，742，003號(hào)和Xian等.，The J. of Histochem. & Cytochem. 47 :949 (1999)描述了抗-TGF-α 抗體的制備方法。腫瘤壞死因子受體(TNFRl)和Fas均含有胞質(zhì)死亡結(jié)構(gòu)域的!^as-相關(guān)蛋白，其對(duì)于程序性細(xì)胞死亡(凋亡)和受體寡聚的Fas和TNF-誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)至關(guān)重要。已鑒定到稱為FADD的哺乳動(dòng)物蛋白，其具有結(jié)合Fas受體的胞質(zhì)區(qū)或結(jié)構(gòu)域并抑制Fas介導(dǎo)凋亡的能力。FADD的多核苷酸序列可從公共數(shù)據(jù)庫獲得，其登錄號(hào)是U24231，其氨基酸序列的登錄號(hào)是ΑΑΑ86517，這些序列通過引用納入本文。美國(guó)專利號(hào)6，562，797Β1描述了 FADD片段或編碼它的核酸，其是功能完整的天然FADD的顯性陰性抑制劑。
0175]序列表描述0176]SEQIDNO1是編碼mIL-12和m-IL21的構(gòu)建物的多核苷酉I序列。0177]SEQIDNO2是編碼hIL-12和h-IL21的構(gòu)建物的多核苷酉I序列。0178]SEQIDNO3是編碼mIL-21和m-IL15的構(gòu)建物的多核苷酉I序列。0179]SEQIDNO4是編碼mIL-12的構(gòu)建物的多核苷!脧序列。0180]SEQIDNO5是編碼hIL-12和hIL-15的構(gòu)建物的多核苷酉I序列。0181]SEQIDNO6是編碼hIL-21的構(gòu)建物的多核苷!脧序列。0182]SEQIDNO7是編碼mIL-21的構(gòu)建物的多核苷!脧序列。0183]SEQIDNO8是編碼hIL-21的構(gòu)建物的多核苷!脧序列。0184]SEQIDNO9是編碼mIL-21的多核苷酸序列。0185]SEQIDNO:10是mIL-21的氨基酸序列。0186]SEQIDNO11是編碼mIL-15的多核苷酸序列。0187]SEQIDNO:12是mIL-15的氨基酸序列。0188]SEQIDNO13是編碼mIL-12的mp40的多核苷·脧序列。0189]SEQIDNO:14是mIL-12的mp40的的氨基酸序列。0190]SEQIDNO15是編碼mIL-12的mp35的多核苷·脧序列。0191]SEQIDNO:16是mIL-12的mp35的氨基酸序列。0192]SEQIDNO17是編碼hIL-21的多核苷酸序列。0193]SEQIDNO:18是hIL-21的氨基酸序列。0194]SEQIDNO19是編碼hIL-15的多核苷酸序列。0195]SEQIDNO:20是hIL-15的氨基酸序列。0196]SEQIDNO21是編碼hIL-12的p40的多核苷醛 序列。0197]SEQIDNO22是hIL-12的p40的氨基酸序列。
SEQ ID NO 23是編碼hIL-12的p35的多核苷酸序列。SEQ ID NO 24 是 hIL-12 的 p35 的氨基酸序列。SEQ ID NO 25是在果蠅(Drosophila)中發(fā)現(xiàn)的蛻皮素反應(yīng)元件的核酸序列。SEQ ID NO J6是在黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)中發(fā)現(xiàn)的蛻皮素反應(yīng)元件的核酸序列。SEQ ID NO 27是在黑腹果蠅中發(fā)現(xiàn)的蛻皮素反應(yīng)元件的核酸序列。SEQ ID NO 28尋靶內(nèi)切核酸酶(HE) (I-SceI)的限制性位點(diǎn)。SEQ ID NO :29是包含人IL-12編碼序列的腺病毒載體的DNA序列 Ad-RTS-hIL-12(SPI-RheoIL-12)。發(fā)明詳述定義除非另外定義，本文所用的所有本領(lǐng)域術(shù)語、符號(hào)和其他科學(xué)術(shù)語或?qū)Ｓ忻~都與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的常用意義相同。在某些情況下，為了澄清和/或?yàn)榱吮阌趨⒖己屠斫?，本文以通常理解的意思定義了術(shù)語，本文的這種定義的內(nèi)容不應(yīng)被理解為必然意味著與本領(lǐng)域通常所理解的有實(shí)質(zhì)差別。分子生物學(xué)術(shù)語和/或方法和/ 或方案通常所理解的定義可在Rieger等，《經(jīng)典遺傳學(xué)和分子遺傳性詞典》(Glossary of Genetics Classical and Molecular),第 5 版，紐約 SV 出版社(Springer-Verlag :New York)，1991 ；Lewin,《基因V》(Genes V)，牛津大學(xué)出版社紐約，1994 ；Sambrook等，《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)(第 3 版，2001)以及 Ausubel 等，《當(dāng)代分子生物學(xué)手冊(cè)》(Current Protocols in Molecular Biology) (1994) 中找到。使用商品化試劑盒和/或試劑過程中用到的方法通常按照廠家的指導(dǎo)和/或說明書和/或參數(shù)執(zhí)行，除非另外說明。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“分離的”指已從其原始環(huán)境(其天然存在的環(huán)境)中提取出來的生物學(xué)材料(細(xì)胞、核酸或蛋白質(zhì))。例如，以天然狀態(tài)存在于植物或動(dòng)物內(nèi)的多核苷酸不是分離的，但是當(dāng)同一多核苷酸從其天然存在的臨近核酸中分離出來后就被認(rèn)為是“分離的”。適用于生物學(xué)材料的術(shù)語“純化的”不要求該材料的存在形式顯示絕對(duì)純度，排除其它化合物的存在。其不過是一種相對(duì)的定義。“核酸”、“核酸分子”、“寡核苷酸”、“核苷酸”和“多核苷酸”可互換使用，指單鏈形式或雙鏈螺旋形式的核糖核苷(腺苷、鳥苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脫氧核苷(脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷或脫氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式，或它們的任何磷酸酯類似物，例如硫代磷酸酯和硫酯。雙鏈DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。術(shù)語核酸分子，特別是DNA或RNA分子，僅指該分子的一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)，并不將其局限于任何具體的三級(jí)形式。因此，該術(shù)語包括在線形或環(huán)狀DNA分子(例如，限制性片段)、質(zhì)粒、超螺旋化DNA和染色體中發(fā)現(xiàn)的雙鏈DNA，等等。討論具體雙鏈DNA分子的結(jié)構(gòu)時(shí)，本文可根據(jù)沿DNA的非轉(zhuǎn)錄鏈(即，具有與mRNA同源的序列的鏈)僅以5’到3’方向給出序列的正常慣例描述序列。“重組DNA分子”是經(jīng)過分子生物學(xué)操作的DNA分子。DNA包括但不限于 cDNA、基因組DNA、質(zhì)粒DNA、合成DNA和半合成DNA。應(yīng)用于多核苷酸序列的術(shù)語“片段”指相對(duì)于參比核酸長(zhǎng)度縮短并在共同部分包含與參比核酸相同的核苷酸序列的核苷酸序列。本發(fā)明的這種核酸片段可以適當(dāng)?shù)匕谧鳛槠涑煞值妮^大多核苷酸中。這種片段包含長(zhǎng)度為至少6、8、9、10、12、15、18、20、21、22、 23、24、25、30、39、40、42、45、48、50、51、54、57、60、63、66、70、75、78、80、90、100、105、120、 135、150、200、300、500、720、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000 或更多個(gè)本發(fā)明核酸的
連續(xù)核苷酸的寡核苷酸或由它們構(gòu)成。本文所用的“分離的核酸片段”指單鏈或雙鏈RNA或DNA聚合物，任選含有合成、 非天然或改變的核苷酸堿基。DNA聚合物形式的分離的核酸片段可包含cDNA、基因組DNA 或合成DNA的一個(gè)或多個(gè)片段?！盎颉敝赴幋a功能分子的核苷酸的多核苷酸，包括僅通過轉(zhuǎn)錄(例如，生物活性RNA分子)或通過轉(zhuǎn)錄和翻譯(例如，多肽)產(chǎn)生的功能分子。術(shù)語“基因”包括cDNA和基因組DNA核酸?！盎颉边€指表達(dá)特定RNA、蛋白質(zhì)或多肽的核酸片段，其包含在編碼序列之前(5’ -非編碼序列)和之后(3’ -非編碼序列)的調(diào)控序列?！疤烊换颉敝柑烊话l(fā)現(xiàn)的包含其本身調(diào)控序列的基因?！扒逗闲突颉敝阜翘烊换虻娜魏位?，其包含未在自然界中一起發(fā)現(xiàn)的調(diào)控和/或編碼序列。因此，嵌合型基因可包含來自不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或來自同一來源的調(diào)控序列和編碼序列，但排列方式不同于天然發(fā)現(xiàn)的。嵌合型基因可包含來自不同來源的編碼序列和/或來自不同來源的調(diào)控序列?！皟?nèi)源性基因”指在生物體的基因組中其天然位置發(fā)現(xiàn)的天然基因?！巴鈦怼被蚧颉爱愒础被蛑覆皇撬拗鳈C(jī)體中正常發(fā)現(xiàn)的，而是通過基因傳遞引入該宿主機(jī)體的基因。外來基因可包含插入非天然機(jī)體中的天然基因，或嵌合型基因?！稗D(zhuǎn)基因”是通過轉(zhuǎn)化方法引入基因組的基因。例如， 白介素-12(IL-12)基因編碼IL-12蛋白。IL-12是35_kD亞基(p35)和40_kD亞基(p40) 的異源二聚體，兩個(gè)亞基以二硫鍵相連形成完整的功能性IL-12p70。IL-12基因編碼p35 和p40兩個(gè)亞基。“異源DNA”指不是天然位于細(xì)胞中，或細(xì)胞的染色體位點(diǎn)中的DNA。異源DNA可包括細(xì)胞的外來基因。術(shù)語“基因組”包括染色體以及線粒體、葉綠體和病毒DNA或RNA。當(dāng)單鏈形式的核酸分子可在合適的溫度和溶液離子強(qiáng)度的條件下與另一核酸分子退火時(shí)，稱該核酸分子可與該另一核酸分子，例如cDNA、基因組DNA或RNA “雜交”。雜交和洗滌條件是本領(lǐng)域熟知的，例子見Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloning =A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港(1989)，特別是其中的第11章和表格11. 1。溫度和離子強(qiáng)度的條件決定了雜交的“嚴(yán)謹(jǐn)性”?？烧{(diào)整嚴(yán)謹(jǐn)性條件以篩選適度相似的片段，例如遠(yuǎn)親生物體的同源性序列，篩選高度相似片段，例如復(fù)制極其相關(guān)生物體的功能酶的基因。對(duì)于初步篩選同源性核酸，可采用對(duì)應(yīng)于Tm為551的低嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件，例如，5X SSC、0. 1%SDS、0. 25%奶，無甲酰胺；或者30%甲酰胺、5X SSC、0. 5% SDS0中等嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件對(duì)應(yīng)于較高的Tm，例如，40%甲酰胺，和5X或6X SSC0高度嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件對(duì)應(yīng)于最高Tm，例如50%甲酰胺，5X或6X SSC0雜交要求兩個(gè)核酸含有互補(bǔ)序列，雖然取決于雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性，但堿基之間的錯(cuò)配是可能的。術(shù)語“互補(bǔ)”用于描述能彼此雜交的核苷酸堿基之間的關(guān)系。例如，對(duì)于0嫩，腺嘌呤與胸腺嘧啶互補(bǔ)，胞嘧啶與鳥嘌呤互補(bǔ)。因此，本發(fā)明還包括與本文所公開或所用完整序列以及那些基本上相似的核酸序列互補(bǔ)的分離核酸片段。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，采用包括在Tm為55°C實(shí)施雜交步驟的雜交條件并利用上述條件檢測(cè)多核苷酸。在其它實(shí)施方式中，1是601、631或65°C。雜交后洗滌也決定了嚴(yán)謹(jǐn)性條件。一組條件采用一系列洗滌，開始為6X SSC、 0. 5%SDS，室溫下15分鐘(min)；然后替換為2X SSC、0. 5% SDS、45°C，30分鐘；然后是0. 2X SSC、0. 5% SDS, 5030分鐘，重復(fù)兩次。優(yōu)選的一組嚴(yán)謹(jǐn)性條件利用較高的溫度，其中洗滌與上述相同，除了在0. 2X SSC、0. 5% SDS中的最后兩次30分鐘洗滌的溫度升高至60°C。 優(yōu)選的另一組高嚴(yán)謹(jǐn)性條件采用65°C，在0. IX SSC、0. 1% SDS中進(jìn)行最后兩次洗滌。雜交核酸的適度嚴(yán)謹(jǐn)性取決于本領(lǐng)域熟知的變量，即核酸長(zhǎng)度和互補(bǔ)程度。兩條核苷酸序列之間的相似性或同源性越高，具有那些序列的核酸雜交體的Tm值越高。核酸雜交的相對(duì)穩(wěn)定性(對(duì)應(yīng)于較高的Tm)按以下順序降低RNA RNA、DNA RNA、DNA:DNA。對(duì)于長(zhǎng)度超過100個(gè)核苷酸的雜交體，已有計(jì)算Tm的方程(參見Sambrook等，同上，9. 50-0. 51)。 對(duì)于與較短核酸，即寡核苷酸雜交，錯(cuò)配的位置更重要，寡核苷酸的長(zhǎng)度決定其特異性(參見 Sambrook 等，同上，11. 7-11. 8)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，采用雜交條件檢測(cè)多核苷酸，所述雜交條件包括在低于500mM鹽和至少37°C進(jìn)行雜交步驟，在2X SSPE中，至少63°C溫度進(jìn)行洗滌步驟。在另一實(shí)施方式中，雜交條件包括在低于200mM鹽和至少37°C進(jìn)行雜交步驟。在又一個(gè)實(shí)施方式中，雜交條件包括雜交和洗滌步驟均為2X SSPE和63V。在另一實(shí)施方式中，可雜交核酸的長(zhǎng)度是至少約10個(gè)核苷酸。可雜交核酸的最低長(zhǎng)度優(yōu)選至少約15個(gè)核苷酸；例如至少約20個(gè)核苷酸；例如至少30個(gè)核苷酸。此外，技術(shù)人員應(yīng)知道可根據(jù)諸如探針長(zhǎng)度等因素，視需要調(diào)節(jié)溫度和洗滌溶液鹽濃度。術(shù)語“探針”指可與互補(bǔ)的單鏈靶核酸堿基配對(duì)形成雙鏈分子的單鏈核酸分子。本文所用的術(shù)語“寡核苷酸”指可與基因組DNA分子、cDNA分子、質(zhì)粒DNA或mRNA 分子雜交的短核酸。寡核苷酸可以作標(biāo)記，例如核苷酸，或是已共價(jià)偶聯(lián)了標(biāo)記物，例如生物素的核苷酸。標(biāo)記的寡核苷酸可用作探針來檢測(cè)核酸的存在。寡核苷酸(其中一條和兩條可作標(biāo)記)可用作PCR引物，用于克隆全長(zhǎng)核酸或其片段、用于DNA測(cè)序或用于檢測(cè)核酸的存在。寡核苷酸還可用于和DNA分子形成三螺旋。通常合成制備寡核苷酸，優(yōu)選用核酸合成儀。因此，可將寡核苷酸制備成含非天然產(chǎn)生的磷酸酯類似鍵，例如硫酯鍵等?！耙铩敝概c靶核酸序列雜交以形成雙鏈核酸區(qū)域的寡核苷酸，該區(qū)域可用作合適條件下DNA合成的起點(diǎn)。這種引物可用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或DNA測(cè)序中?！熬酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)”縮寫成PCR，指酶促擴(kuò)增特定核酸序列的體外方法。PCR包括一系列重復(fù)的溫度循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)包括3個(gè)階段模板核酸變性以分離靶分子諸鏈，單鏈 PCR寡核苷酸引物與模板核酸退火，和DNA聚合酶使得退火引物延伸。PCR提供檢測(cè)核酸的初始組合中靶分子是否存在，以及在定量或半定量條件下測(cè)定靶分子相對(duì)量的方法。“逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”縮寫成RT-PCR，指從一種或多種RNA分子酶促產(chǎn)生一種或多種cDNA靶分子，然后酶促擴(kuò)增上述一種或多種cDNA靶分子內(nèi)一種或多種特定核酸序列的體外方法。RT-PCR還提供檢測(cè)核酸的初始組合中靶分子是否存在，以及在定量或半定量條件下測(cè)定靶分子相對(duì)量的方法。DNA “編碼序列”指編碼多肽的雙鏈DNA序列，當(dāng)其置于合適調(diào)控序列的控制下，能在細(xì)胞中體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄和翻譯成多肽?！昂线m的調(diào)控序列”指位于編碼序列上游(5’非編碼序列)、其中或下游(3’非編碼序列)的核酸序列，其影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性、或翻譯。調(diào)控序列可包括啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、聚腺苷酸化識(shí)別序列、 RNA加工位點(diǎn)、效應(yīng)子結(jié)合位點(diǎn)和莖環(huán)結(jié)構(gòu)。編碼序列的邊界由5’(氨基)末端的起始密碼子和3’(羧基)末端的翻譯終止密碼子決定。編碼序列可包括但不限于原核生物序列、 來自mRNA的cDNA、基因組DNA序列和甚至是合成DNA序列。如果編碼序列要在真核細(xì)胞中表達(dá)，聚腺苷酸化信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于編碼序列的3’?！伴_放讀框”縮寫成0RF，指一定長(zhǎng)度的核酸序列，可以是DNA、cDNA或RNA，其包含翻譯起始信號(hào)或起始密碼子，例如ATG或AUG和終止密碼子，其有翻譯成多肽序列的可能。本文利用術(shù)語“頭-對(duì)-頭”描述兩條多核苷酸序列相對(duì)彼此的取向。當(dāng)一條多核苷酸的編碼鏈的5’端毗連另一多核苷酸的編碼鏈的5’端時(shí)，該兩條多核苷酸以頭-對(duì)-頭取向布置，從而各多核苷酸的轉(zhuǎn)錄方向以遠(yuǎn)離另一多核苷酸的5’端的方向進(jìn)行。術(shù)語 “頭-對(duì)-頭”可縮寫為(5，)-到-(5，)，還可以符號(hào)(一一)或(3，一 5，5，一 3，)表示。本文利用術(shù)語“尾-對(duì)-尾”描述兩條多核苷酸序列相對(duì)彼此的取向。當(dāng)一條多核苷酸的編碼鏈的3’端毗連另一多核苷酸的編碼鏈的3’端時(shí)，該兩條多核苷酸以尾-對(duì)-尾取向布置，從而各多核苷酸的轉(zhuǎn)錄方向朝另一多核苷酸進(jìn)行。術(shù)語“尾-對(duì)-尾”可縮寫為 (3，)_ 到 _(3，)，還可以符號(hào)(一一)或(5，一3，3，一 5，)表示。本文利用術(shù)語“頭-對(duì)-尾”描述兩條多核苷酸序列相對(duì)彼此的取向。當(dāng)一條多核苷酸的編碼鏈的5’端毗連另一多核苷酸的編碼鏈的3’端時(shí)，該兩條多核苷酸以頭-對(duì)-尾取向布置，從而各多核苷酸的轉(zhuǎn)錄方向與另一多核苷酸的轉(zhuǎn)錄方向相同。術(shù)語“頭-對(duì)-尾” 可縮寫為(5，)_到_(3，)，還可以符號(hào)(一一)或(5，一 3，5，一 3，)表示。術(shù)語“下游”指相對(duì)參比核苷酸序列3’定位的核苷酸序列。具體地說，下游核苷酸序列通常涉及轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)后的序列。例如，基因的翻譯起始密碼子位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的下游。術(shù)語“上游”指相對(duì)參比核苷酸序列5’定位的核苷酸序列。具體地說，上游核苷酸序列通常涉及位于編碼序列或轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的5’側(cè)的序列。例如，大多數(shù)啟動(dòng)子位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的上游。術(shù)語“限制性內(nèi)切核酸酶”和“限制性酶”可互換使用，指能結(jié)合雙鏈DNA內(nèi)的特定核苷酸序列并在其中進(jìn)行切割的酶?！巴粗亟M”指將外來DNA序列插入另一 DNA分子，例如將載體插入染色體。載體優(yōu)選靶向用于同源重組的特異性染色體位點(diǎn)。對(duì)于特異性同源重組，載體可含有足夠長(zhǎng)的染色體序列的同源性區(qū)域，從而載體能互補(bǔ)結(jié)合并摻入染色體。同源性區(qū)域越長(zhǎng)，序列相似性越高可提高同源重組的效率?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的幾種方法來擴(kuò)增本發(fā)明的多核苷酸。一旦確立合適的宿主系統(tǒng)和生長(zhǎng)條件，可大量擴(kuò)增和制備重組表達(dá)載體。如本文所述，可用的表達(dá)載體包括但不限于以下載體或它們的衍生物人或動(dòng)物病毒，例如痘病毒或腺病毒；昆蟲病毒，例如桿狀病毒；酵母載體；噬菌體載體(例如，λ噬菌體)和質(zhì)粒及粘粒DNA載體，等等?！拜d體”指用于將核酸克隆和/或傳遞入宿主細(xì)胞的任何運(yùn)載體。載體可以是可與另一 DNA區(qū)段相連從而復(fù)制所連區(qū)段的復(fù)制子?！皬?fù)制子”指用作DNA體內(nèi)復(fù)制的自主單元，即能在其本身控制下復(fù)制的任何遺傳元件(例如，質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、染色體、病毒)。術(shù)語“載體”包括用于在體外、離體或體內(nèi)將核酸引入細(xì)胞的病毒和非病毒運(yùn)載體。本領(lǐng)域已知的大量載體可用于操作核酸、將反應(yīng)元件和啟動(dòng)子摻入基因，等等?？赡艿妮d體包括， 例如質(zhì)粒或修飾的病毒，包括，例如噬菌體，如λ噬菌體衍生物，或質(zhì)粒，如pBR322或pUC 質(zhì)粒衍生物，或Bluescript載體。可用于本發(fā)明的載體的另一例子是如WO 2007/038276 所述的弗吉尼亞州布萊克斯堡的英特列克星敦公司antrexon Corp. , Blacksburg, VA)的 UltraVector 產(chǎn)生系統(tǒng)。例如，可通過將合適DNA片段連接入具有互補(bǔ)粘性末端的所選載體實(shí)現(xiàn)將對(duì)應(yīng)于反應(yīng)元件和啟動(dòng)子的DNA片段插入合適載體?；蛘?，可對(duì)DNA分子的兩端作酶促修飾，或者可通過將核苷酸序列(接頭)連接入DNA末端來產(chǎn)生任何位點(diǎn)。這種載體可經(jīng)工程改造而含有可選擇標(biāo)記基因以供選擇已將標(biāo)記摻入細(xì)胞基因組的細(xì)胞。這種標(biāo)記能鑒定和/或選擇摻入標(biāo)記并表達(dá)其所編碼蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。病毒載體，特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已用于細(xì)胞以及活的動(dòng)物對(duì)象中的各種基因遞送應(yīng)用?？捎玫牟《据d體包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺伴隨病毒、痘病毒、桿狀病毒、牛痘病毒、單純皰疹病毒、E-B病毒、腺病毒、雙粒病毒和花椰菜花葉病毒載體。非病毒載體包括質(zhì)粒、脂質(zhì)體、荷電脂質(zhì)(細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑)、DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物和生物聚合物。除核酸外，載體還可包含一個(gè)或多個(gè)調(diào)控區(qū)域和/或用于選擇、檢測(cè)和監(jiān)測(cè)核酸傳遞結(jié)果(傳遞至何種組織、表達(dá)持續(xù)時(shí)間等)的可選擇標(biāo)記。術(shù)語“質(zhì)粒”指常攜帶基因的染色體外元件，其不是細(xì)胞中間代謝的一部分，通常是環(huán)狀雙鏈DNA分子的形式。這種元件可以是衍生自任何來源的單鏈或雙鏈DNA或RNA，線形、環(huán)狀或超螺旋的自發(fā)復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，其中許多核苷酸序列連接或重組入獨(dú)特構(gòu)建物中，該構(gòu)建物能將所選基因產(chǎn)物的啟動(dòng)子片段和DNA序列連同合適的3’非翻譯序列引入細(xì)胞。“克隆載體”指“復(fù)制子”，其是單位長(zhǎng)度的核酸，優(yōu)選DNA，其順序復(fù)制并包含復(fù)制起點(diǎn)，例如質(zhì)粒、噬菌體或粘粒，另一核酸區(qū)段可與其相連從而能復(fù)制所連接的區(qū)段?？寺≥d體能在一類細(xì)胞中復(fù)制，在另一類中表達(dá)(穿梭載體)?？寺≥d體可包含一條或多條序列以便用于選擇包含該載體的細(xì)胞和/或一個(gè)或多個(gè)多克隆位點(diǎn)以便插入感興趣序列。術(shù)語“表達(dá)載體”指載體、質(zhì)?；蜻\(yùn)載體，其設(shè)計(jì)成能在轉(zhuǎn)化入宿主后表達(dá)所插入的核酸序列?？寺〉幕颍?，插入的核酸序列通常置于調(diào)控元件，例如啟動(dòng)子、最小啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等的控制下?？捎糜隍?qū)動(dòng)核酸在所需宿主細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)調(diào)控區(qū)或啟動(dòng)子多種多樣，并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉?；旧夏茯?qū)動(dòng)這些基因表達(dá)的任何啟動(dòng)子可用于表達(dá)載體，包括但不限于病毒啟動(dòng)子、細(xì)菌啟動(dòng)子、動(dòng)物啟動(dòng)子、哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子、合成啟動(dòng)子、組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子、病因或疾病相關(guān)啟動(dòng)子、發(fā)育特異性啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、光調(diào)節(jié)啟動(dòng)子(light regulated promoter) ；CYC1、HIS3、GAL1、GAL4、GAL10、 ADHU PGK, PH05、GAPDH、ADCU TRPU URA3、LEU2、ENO, TPI、堿性磷酸酶啟動(dòng)子(用于在酵母(Saccharomyces)中表達(dá))；AOXl啟動(dòng)子(用于在畢赤酵母(Pichia)中表達(dá))；β -內(nèi)酰胺Bi、lac、ara、tet、trp、1PL、1PK、T7、tac、禾口 trc 啟動(dòng)子(用于在大腸桿菌(Escherichia coli)中表達(dá))；光調(diào)節(jié)_、種子特異性_、花粉特異性_、子房特異性的、花椰菜花葉病毒 35S、CMV 35S最小、木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)、葉綠素a/b結(jié)合蛋白、核酮糖1，5_ 二磷酸羧化酶、枝條-特異性、根特異性、幾丁質(zhì)酶、應(yīng)激誘導(dǎo)型、水稻東格魯桿狀病毒、植物超級(jí)啟動(dòng)子、馬鈴薯亮氨酸氨肽酶、硝酸鹽還原酶、甘露堿合酶、胭脂堿合酶、泛素、玉米蛋白和花青甙啟動(dòng)子(可用于在植物細(xì)胞中表達(dá))；本領(lǐng)域已知的動(dòng)物和哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子，包括但不限于SV40早期(SV40e)啟動(dòng)子區(qū)域、勞斯肉瘤病毒(RSV)的3’長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)中所含的啟動(dòng)子、腺病毒(Ad)的ElA啟動(dòng)子或主要晚期啟動(dòng)子(MLP)基因、巨細(xì)胞病毒(CMV) 早期啟動(dòng)子、單純皰疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)啟動(dòng)子、桿狀病毒IEl啟動(dòng)子、延伸因子 la (EFl)啟動(dòng)子、磷酸甘油酸酯激酶(PGK)啟動(dòng)子、泛素⑴be)啟動(dòng)子、白蛋白啟動(dòng)子、小鼠金屬硫蛋白-L啟動(dòng)子的調(diào)控序列和轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)、遍在啟動(dòng)子(ubiquitous promoter) (HPRT、波形蛋白、α-肌動(dòng)蛋白、微管蛋白等)、中間絲的啟動(dòng)子(索蛋白、神經(jīng)絲、角蛋白、 GFAP等)、治療基因的啟動(dòng)子(MDR、CFTR或VIII型因子等的)、病因或疾病相關(guān)啟動(dòng)子、 和顯示組織特異性并已用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的啟動(dòng)子，例如在胰腺腺泡細(xì)胞中有活性的彈性蛋白酶I基因調(diào)控區(qū)；在胰腺β細(xì)胞中有活性的胰島素基因調(diào)控區(qū)、在淋巴細(xì)胞中有活性的免疫球蛋白基因調(diào)控區(qū)、在睪丸、乳腺、淋巴和肥大細(xì)胞中有活性的小鼠乳腺腫瘤病毒調(diào)控區(qū)；白蛋白基因、在肝中有活性的Apo AI和Apo AII調(diào)控區(qū)、在肝中有活性的甲胎蛋白基因調(diào)控區(qū)、在肝中有活性的a 1-抗胰蛋白酶基因調(diào)控區(qū)、在骨髓細(xì)胞中有活性的β-球蛋白基因調(diào)控區(qū)、在大腦的少突膠質(zhì)細(xì)胞中有活性的髓磷脂堿蛋白基因調(diào)控區(qū)、在骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕鏈-2基因調(diào)控區(qū)、和在下丘腦中有活性的促性腺激素釋放激素基因調(diào)控區(qū)、丙酮酸激酶啟動(dòng)子、絨毛蛋白啟動(dòng)子、脂肪酸結(jié)合腸蛋白的啟動(dòng)子、平滑肌細(xì)胞 α-肌動(dòng)蛋白的啟動(dòng)子，等等。此外，可通過加入增強(qiáng)子或調(diào)節(jié)序列等來修飾這些表達(dá)序列?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法，例如轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(溶酶體融合)、利用基因槍或DNA載體運(yùn)輸?shù)鞍讓⑤d體引入所需的宿主細(xì)胞(參見，例如 mi 等，J.Biol. Chem. 267 :963(1992)；恥等，J. Biol. Chem. 263 14621(1988)；和 Hartmut 等，加拿大專利申請(qǐng)?zhí)?2,012,311)。還可通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染體內(nèi)引入本發(fā)明的多核苷酸。在過去10年，利用脂質(zhì)體在體外包裝和轉(zhuǎn)染核酸逐漸增多。可利用合成的陽離子脂質(zhì)制備用于體內(nèi)轉(zhuǎn)染編碼標(biāo)記的基因的脂質(zhì)體，該脂質(zhì)設(shè)計(jì)成能減少脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染遇到的困難和危險(xiǎn)(Feigner等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84 :7413 (1987) ；Mackey 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :8027 (1988)；和 Ulmer等，Science 259:1745(1993))。使用陽離子脂質(zhì)可促進(jìn)包裝帶負(fù)電的核酸，還促進(jìn)與帶負(fù)電細(xì)胞膜融合(Feigner 等，Science 337:387(1989))。W095/18863, W096/17823 和U. S. 5，459，127描述了傳遞核酸特別有用的脂質(zhì)化合物和組合物。采用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染將外源性基因體內(nèi)引入特定組織具有一定實(shí)際優(yōu)點(diǎn)。脂質(zhì)體分子靶向特定細(xì)胞代表了一類優(yōu)點(diǎn)。 直接轉(zhuǎn)染特定細(xì)胞類型明顯在具有細(xì)胞異質(zhì)性的組織，例如胰腺、肝臟、腎臟和腦中特別理想?？蔀榘邢蚰康膶⒅|(zhì)與其它分子化學(xué)偶聯(lián)(Mackey等，1988，同上)?？蓪邢虻碾模缂に鼗蛏窠?jīng)遞質(zhì)和蛋白質(zhì)，例如抗體，或非肽分子化學(xué)偶聯(lián)于脂質(zhì)體。其它分子也可用于促進(jìn)核酸的體內(nèi)轉(zhuǎn)染，例如陽離子寡肽(如W095/21931)、衍生自DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的肽(如W096/25508)或陽離子聚合物(如W095/21931)。還可能將載體作為裸DNA質(zhì)粒體內(nèi)引入(參見，美國(guó)專利號(hào)5，693，622,5, 589，466 和5，580, 859)。還可采用受體介導(dǎo)的DNA遞送方法(Curiel等，Hum. Gene Ther. 3 147 (1992)；和 Wu 等，J. Biol. Chem. 262 4429 (1987))。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”指細(xì)胞攝取外源性或異源的RNA或DNA。當(dāng)這種RNA或DNA被引入細(xì)胞時(shí)，稱該細(xì)胞被外源性或異源的RNA或DNA “轉(zhuǎn)染”。當(dāng)轉(zhuǎn)染的RNA或DNA實(shí)現(xiàn)表型改變時(shí)，稱細(xì)胞被外源性或異源RNA或DNA “轉(zhuǎn)化”。轉(zhuǎn)化RNA或DNA可以整合(共價(jià)相連)入構(gòu)成細(xì)胞基因組的染色體DNA?！稗D(zhuǎn)化”指將核酸片段傳遞入宿主生物體的基因組，從而導(dǎo)致遺傳學(xué)穩(wěn)定的遺傳性。含有轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主生物體稱為“轉(zhuǎn)基因”或“重組”或“轉(zhuǎn)化”的生物體。此外，包含本發(fā)明多核苷酸的重組載體可包含它們要在其中擴(kuò)增或表達(dá)的細(xì)胞宿主的一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，標(biāo)記或可選擇標(biāo)記。術(shù)語“可選擇標(biāo)記”指鑒定因子，通常是能基于標(biāo)記基因的作用而選擇的抗生素或化學(xué)耐受基因(即耐受抗生素、耐受除草劑)、比色標(biāo)記、酶、熒光標(biāo)記等，其中該作用用于示蹤感興趣核酸的遺傳性和/或鑒定遺傳了該感興趣核酸的細(xì)胞或生物體。本領(lǐng)域已知并使用的可選擇標(biāo)記的例子包括提供氨芐青霉素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、潮霉素、雙丙氨酰膦除草劑、磺酰胺等耐受性的基因；和用作表型標(biāo)記的基因，即，花青甙調(diào)節(jié)基因、異
(isopentanyl transferase gene)等。術(shù)語“報(bào)告基因”指編碼能依據(jù)報(bào)告基因的作用而得到鑒定的鑒定因子的核酸， 其中該作用用于示蹤感興趣核酸的遺傳性，鑒定已遺傳了感興趣核酸的細(xì)胞或生物體，和/ 或檢測(cè)基因表達(dá)誘導(dǎo)或轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域已知并使用的報(bào)告基因的例子包括但不限于螢光素酶(Luc)、綠色熒光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、β -半乳糖苷酶(LacZ)、β -葡糖醛酸糖苷酶(Gus)等?？蛇x擇標(biāo)記基因也可視作報(bào)告基因?！皢?dòng)子”和“啟動(dòng)子序列”可互換使用，指能控制編碼序列或功能RNA表達(dá)的DNA 序列。編碼序列通常位于啟動(dòng)子序列的3’端。啟動(dòng)子可以完全來自天然基因，或由來自天然發(fā)現(xiàn)的不同啟動(dòng)子的不同元件構(gòu)成，或者甚至包含合成的DNA區(qū)段。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道不同啟動(dòng)子可在不同組織或細(xì)胞類型中，或在不同發(fā)育階段，或?qū)Σ煌h(huán)境或生理?xiàng)l件起反應(yīng)而指導(dǎo)基因表達(dá)。導(dǎo)致基因在大多數(shù)細(xì)胞類型中，在大部分時(shí)間內(nèi)表達(dá)的啟動(dòng)子通常稱為“組成型啟動(dòng)子”。導(dǎo)致基因在特定細(xì)胞類型中表達(dá)的啟動(dòng)子通常稱為“細(xì)胞特異性啟動(dòng)子”或“組織特異性啟動(dòng)子”。導(dǎo)致基因在特定發(fā)育或細(xì)胞分化階段表達(dá)的啟動(dòng)子通常稱為“發(fā)育特異性啟動(dòng)子”或“細(xì)胞分化特異性啟動(dòng)子”。在用誘導(dǎo)啟動(dòng)子的藥劑、生物分子、化學(xué)品、配體、光等接觸或用這些物質(zhì)處理細(xì)胞后得到誘導(dǎo)并導(dǎo)致基因表達(dá)的啟動(dòng)子通常稱為“誘導(dǎo)型啟動(dòng)子”或“可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子”。還應(yīng)知道，由于在大多數(shù)情況中，調(diào)控序列的確切邊界并未完全限定，不同長(zhǎng)度的DNA片段可具有相同的啟動(dòng)子活性。在本發(fā)明的任何載體中，載體任選包含本文公開的啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子是本文表1所列的啟動(dòng)子。在本發(fā)明的任何載體中，載體任選包含組織特異性啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述組織特異性啟動(dòng)子是本文公開的組織特異性啟動(dòng)子。在另一實(shí)施方式中，所述組織特異性啟動(dòng)子是本文表2所列的組織特異性啟動(dòng)子。啟動(dòng)子序列在其3’末端通常結(jié)合有轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)并向上延伸(5’方向)，從而包含在可檢測(cè)背景水平啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄所需的最少數(shù)量的堿基或元件。在啟動(dòng)子序列中可發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(通過，例如核酸酶Sl作圖不難限定)以及負(fù)責(zé)RNA聚合酶結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(共有序列)?！爸委熼_關(guān)啟動(dòng)子” (TSP)指控制基因開關(guān)組件表達(dá)的啟動(dòng)子。本文它處詳細(xì)描述了基因開關(guān)和它們的各種組件。在某些實(shí)施方式中，TSP是組成型的，即組成型活化的。組成型TSP可以是組成型遍在的(即，在任何組織或細(xì)胞中廣泛起作用，無需其它因子或調(diào)節(jié)劑)或組成型組織或細(xì)胞特異性的(即，在特定組織類型或細(xì)胞類型中廣泛起作用，無需其它因子或調(diào)節(jié)劑)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的TSP在疾病、病癥或病狀相關(guān)條件下活化。在涉及兩種或更多種TSP的本發(fā)明某些實(shí)施方式中，啟動(dòng)子可以是組成型或可活化啟動(dòng)子的組合。本文所用的“在疾病、病癥或病狀相關(guān)條件下活化的啟動(dòng)子”包括但不限于 疾病-特異性啟動(dòng)子、對(duì)特定生理、發(fā)育、分化或病理狀況起反應(yīng)的啟動(dòng)子、對(duì)特定生物分子起反應(yīng)的啟動(dòng)子和對(duì)疾病、病癥或病狀相關(guān)的特定組織或細(xì)胞類型，例如腫瘤組織或惡性細(xì)胞起反應(yīng)的啟動(dòng)子。TSP可包含天然產(chǎn)生啟動(dòng)子的序列、衍生自天然產(chǎn)生啟動(dòng)子的修飾序列或合成序列(例如，將反應(yīng)元件插入最小啟動(dòng)子序列來改變啟動(dòng)子的反應(yīng)性)。當(dāng)RNA聚合酶將編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后經(jīng)反式RNA剪接(如果編碼序列含有內(nèi)含子)并翻譯成該編碼序列所編碼的蛋白質(zhì)時(shí)，稱編碼序列受到細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列的“控制”?！稗D(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列，，指在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼序列的DNA調(diào)節(jié)序列，例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子等。在真核細(xì)胞中，聚腺苷酸化信號(hào)是調(diào)控序列。術(shù)語“反應(yīng)元件”指一個(gè)或多個(gè)順式作用的DNA元件，其賦予受與轉(zhuǎn)錄因子的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用介導(dǎo)的啟動(dòng)子反應(yīng)性。該DNA元件的序列可以是回文的(完美或不完美的)，或者其由被數(shù)量不同的核苷酸隔開的序列基序或半位點(diǎn)構(gòu)成。半位點(diǎn)可以是相似或相同的，排列成正向或反向重復(fù)或排列成一個(gè)半位點(diǎn)或串聯(lián)的毗連半位點(diǎn)的多聚體。依據(jù)要摻入反應(yīng)元件的細(xì)胞或生物體的性質(zhì)，反應(yīng)元件可包含從不同生物體分離的最小啟動(dòng)子。有或沒有配體存在下，轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合反應(yīng)元件的DNA序列以啟動(dòng)或阻遏受該反應(yīng)元件調(diào)節(jié)的下游基因轉(zhuǎn)錄。天然蛻皮素受體的反應(yīng)元件的DNA序列的例子包括:RRGG/TTCANTGAC/ACYY(SEQ ID NO :25)(參見 Cherbas 等，Genes Dev. 5 :120(1991))； AGGTCAN(n)AGGTCA，其中％)可以是一個(gè)或多個(gè)間隔核苷酸(SEQ ID NO :26)(參見D' Avino 等，Mol. Cell. Endocrinol. 113 :1(1995))；和 GGGTTGAATGAATTT(SEQ ID NO 27)(參見 Antoniewski 等，Mol. Cell Biol. 14 :4465 (1994))。術(shù)語“操作性連接”指核酸序列與一個(gè)核酸片段的結(jié)合，使得一個(gè)的功能受另一個(gè)的影響。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能影響編碼序列的表達(dá)時(shí)(即，該編碼序列受啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制)， 稱該啟動(dòng)子操作性連接于該編碼序列。編碼序列可以正義或反義方向操作性連接于調(diào)節(jié)序列。本文所用的術(shù)語“表達(dá)”指通過衍生自核酸或多核苷酸的正義(mRNA)或反義RNA 的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定累積。表達(dá)還指將mRNA翻譯成蛋白質(zhì)或多肽。術(shù)語“盒”、“表達(dá)盒”和“基因表達(dá)盒”指可插入核酸或多核苷酸特定限制性位點(diǎn)或通過同源重組獲得的DNA區(qū)段。DNA區(qū)段包含編碼感興趣多肽的多核苷酸，并且將盒和限制性位點(diǎn)設(shè)計(jì)成能確保該盒插入合適的讀框以供轉(zhuǎn)錄和翻譯?！稗D(zhuǎn)化盒”指包含編碼感興趣多肽的多核苷酸，并且除該多核苷酸外，還具有有助于轉(zhuǎn)化具體宿主細(xì)胞的元件的特定載體。本發(fā)明的盒、表達(dá)盒、基因表達(dá)盒和轉(zhuǎn)化盒還可包含能增強(qiáng)編碼感興趣多肽的多核苷酸在宿主細(xì)胞中表達(dá)的元件。這些元件可包括但不限于啟動(dòng)子、最小啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、反應(yīng)元件、終止序列、聚腺苷酸化序列等。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“基因開關(guān)”是指啟動(dòng)子相關(guān)的反應(yīng)元件與配體依賴性轉(zhuǎn)
33錄因子系統(tǒng)的組合，在存在一種或多種配體的情況下，轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)可調(diào)節(jié)有反應(yīng)元件和啟動(dòng)子摻入的基因的表達(dá)。術(shù)語“編碼基因開關(guān)的多核苷酸”是指啟動(dòng)子相關(guān)的反應(yīng)元件與編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)的多核苷酸的組合，在存在一種或多種配體的情況下，轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)可調(diào)節(jié)有反應(yīng)元件和啟動(dòng)子摻入的基因的表達(dá)。本發(fā)明的治療開關(guān)啟動(dòng)子可以是可用于治療、緩解或預(yù)防特定疾病、病癥或病狀的任何啟動(dòng)子。例子包括但不限于只在特定疾病、病癥或病狀期間顯示表達(dá)增加的基因的啟動(dòng)子和在特定細(xì)胞條件下(例如，增殖、凋亡、PH改變、氧化狀態(tài)、氧水平)顯示表達(dá)增加的基因的啟動(dòng)子。在基因開關(guān)包含多條轉(zhuǎn)錄因子序列的一些實(shí)施方式中，可通過組合疾病或病癥-特異性啟動(dòng)子與組織或細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子以限制表達(dá)治療產(chǎn)物的組織從而增加該治療方法的特異性。因此，治療開關(guān)啟動(dòng)子的定義包括組織-或細(xì)胞類型-特異性啟動(dòng)子。作為疾病特異性啟動(dòng)子的例子，治療癌癥有用的啟動(dòng)子包括致癌基因的啟動(dòng)子。 致癌基因類別的例子包括但不限于生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)因子受體、蛋白激酶、程序性細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)因子和轉(zhuǎn)錄因子。致癌基因的具體例子包括但不限于sis、erb B、erb B-2、raS、abl、 myc和bcl-2及TERT。其它癌癥相關(guān)基因的例子包括腫瘤相關(guān)抗原基因和在腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)的其它基因(例如，MAGE-1、癌胚抗原、酪氨酸酶、前列腺特異性抗原、前列腺特異性膜抗原、p53、MUC-1、MUC-2、MUC-4、HER-2/neu、Τ/Τη、MART-U gplOO、GM2、Τη、sTn 和湯普森-弗萊德里系抗原(Thompson-Friedenreich antigen) (TF))。表1和2所列參考文獻(xiàn)公開了本領(lǐng)域已知并可用作本發(fā)明治療開關(guān)啟動(dòng)子的啟動(dòng)子序列和其它調(diào)節(jié)元件(例如增強(qiáng)子)，以及各啟動(dòng)子相關(guān)的疾病/病癥(表1)或組織特異性(表2)。這些參考文獻(xiàn)中公開的啟動(dòng)子序列通過引用全文納入本文。表 權(quán)利要求
1.一種載體，其條件性表達(dá)具有一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的一種或多種功能的一種或多種蛋白質(zhì)，所述載體包含編碼基因開關(guān)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(1)與啟動(dòng)子操作性相連的至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和( 編碼具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)的多核苷酸，該多核苷酸與所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動(dòng)子相連，其中所述一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R DN 或其亞基、IL-15、IL-18、 IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF, IFN-α、IFN- y , IFN-α 1、IFN-α 2、IL-15-R-a、 CCL3 (MIP-Ia)、CCL5 (RANTES)、CCL7 (MCP3)、XCLl (淋巴細(xì)胞趨化因子)、CXCLl (MGSA- α )、 CCR7、CCL19 (MIP-3b)、CXCL9 (MIG)、CXCLlO (IP-10)、CXCL12 (SDF-I)、CCL21 (6Ckine)、 0X40L、4-lBBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防衛(wèi)素、HMGBl、Flt3L、IFN_3 ,TNF-α、dnFADD、 BCG, TGF- α、PD-LIRNAi、PD-L1 反義寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L 和 SlOO。
2.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述載體是腺病毒載體。
3.如權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于，所述載體還包含編碼具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，編碼具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的所述一種或多種蛋白質(zhì)的所述多核苷酸和編碼具有IL-12的功能的所述一種或多種蛋白質(zhì)的所述多核苷酸在所述基因開關(guān)的調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的控制下。
5.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述基因開關(guān)是基于蛻皮素受體(EcR)的基因開關(guān)。
6.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，編碼基因開關(guān)的所述多核苷酸包含第一啟動(dòng)子控制下的第一轉(zhuǎn)錄因子序列和第二啟動(dòng)子控制下的第二轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列和所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列所編碼的蛋白質(zhì)相互作用形成行使配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子功能的蛋白質(zhì)復(fù)合物。
7.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，編碼具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)的所述多核苷酸編碼一種或多種人免疫調(diào)節(jié)劑。
8.如權(quán)利要求3所述的載體，其特征在于，編碼具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)的所述多核苷酸編碼人IL-12。
9.一種產(chǎn)生表達(dá)具有一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)的免疫細(xì)胞或治療支持細(xì)胞(TSC)群體的方法，包括用條件性表達(dá)具有一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的一種或多種功能的一種或多種蛋白質(zhì)的重組載體修飾所述免疫細(xì)胞，其中所述載體包含編碼基因開關(guān)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(1)與啟動(dòng)子操作性相連的至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和( 編碼具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)的多核苷酸，該多核苷酸與所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動(dòng)子相連，其中所述一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4, IL-5、IL-7、IL-8、IL-9, IL-10R DN 或其亞基、IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-24, IL-27, GM-CSF, IFN- α、IFN- y、IFN- α 1、IFN- α 2、IL-15-R- α、CCL3 (ΜΙΡ-la)、CCL5 (RANTES)、 CCL7 (MCP3)、XCLl (淋巴細(xì)胞趨化因子)、CXCLl (MGSA- α )、CCR7、CCL19 (MIP_3b)、 CXCL9(MIG)、CXCLlO(IP-10)、CXCL12(SDF-I)、CCL21(6Ckine)、0X40L、4_1BBL、CD40、CD70、 GITRL、LIGHT、b-防衛(wèi)素、HMGBl、Flt3L、IFN-3 ,TNF-α、dnFADD、TGF_ α ,PD-Ll RNAi、PD_Ll反義寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L 和 SlOO。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述載體是腺病毒載體。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述載體還包含編碼具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，編碼具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的所述蛋白質(zhì)的所述多核苷酸和編碼具有IL-12的功能的所述蛋白質(zhì)的所述多核苷酸在所述基因開關(guān)的控制下。
13.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述基因開關(guān)是基于蛻皮素受體(EcR)的基因開關(guān)。
14.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，編碼基因開關(guān)的所述多核苷酸包含第一啟動(dòng)子控制下的第一轉(zhuǎn)錄因子序列和第二啟動(dòng)子控制下的第二轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列和所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列所編碼的蛋白質(zhì)相互作用形成行使配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子功能的蛋白質(zhì)復(fù)合物。
15.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，編碼具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的蛋白質(zhì)的所述多核苷酸編碼人免疫調(diào)節(jié)劑。
16.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，編碼具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)的所述多核苷酸編碼人IL-12。
17.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是人樹突細(xì)胞。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述樹突細(xì)胞是骨髓樹突細(xì)胞。
19.一種表達(dá)具有一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)的免疫細(xì)胞或 TSC群體，所述細(xì)胞用條件性表達(dá)具有一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的一種或多種功能的一種或多種蛋白質(zhì)的重組載體修飾，其中所述載體包含編碼基因開關(guān)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(1)與啟動(dòng)子操作性相連的至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和( 編碼具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)的多核苷酸，該多核苷酸與所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動(dòng)子相連，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10RDN 或其亞基、IL-15、IL-18、 IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF, IFN-α、IFN-α 1、IFN-α 2、IL-15-R-a、IFN- γ , CCL3 (MIP-Ia)、CCL5 (RANTES)、CCL7 (MCP3)、XCLl (淋巴細(xì)胞趨化因子)、CXCLl (MGSA- α )、 CCR7、CCL19 (MIP-3b)、CXCL9 (MIG)、CXCLlO (IP-10)、CXCL12 (SDF-I)、CCL21 (6Ckine)、 0X40L、4-lBBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防衛(wèi)素、HMGBl、Flt3L、IFN_3 ,TNF-α、dnFADD、 TGF-α、PD-LlRNAi、PD-Ll 反義寡核苷酸、TGFbRII DN、IC0S-L 和 SlOO0
20.如權(quán)利要求19所述的群體，其特征在于，所述載體是腺病毒載體。
21.如權(quán)利要求19所述的群體，其特征在于，所述載體還包含編碼具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
22.如權(quán)利要求19所述的群體，其特征在于，編碼具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的所述蛋白質(zhì)的所述多核苷酸和編碼具有IL-12的功能的所述蛋白質(zhì)的所述多核苷酸在所述基因開關(guān)的控制下。
23.如權(quán)利要求19所述的群體，其特征在于，所述基因開關(guān)是基于EcR的基因開關(guān)。
24.如權(quán)利要求19所述的群體，其特征在于，編碼基因開關(guān)的所述多核苷酸包含第一啟動(dòng)子控制下的第一轉(zhuǎn)錄因子序列和第二啟動(dòng)子控制下的第二轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列和所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列所編碼的蛋白質(zhì)相互作用形成行使配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子功能的蛋白質(zhì)復(fù)合物。
25.如權(quán)利要求19所述的群體，其特征在于，編碼具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的蛋白質(zhì)的所述多核苷酸編碼人免疫調(diào)節(jié)劑。
26.如權(quán)利要求21所述的群體，其特征在于，編碼具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)的所述多核苷酸編碼人IL-12。
27.如權(quán)利要求19所述的群體，其特征在于，所述細(xì)胞是人樹突細(xì)胞。
28.如權(quán)利要求27所述的群體，其特征在于，所述樹突細(xì)胞是骨髓樹突細(xì)胞。
29.—種體外工程改造的免疫細(xì)胞或TSC，所述細(xì)胞包含含有編碼基因開關(guān)的多核苷酸的載體，其中編碼具有開關(guān)的所述多核苷酸包含(1)與啟動(dòng)子操作性相連的至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和( 編碼具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸，該多核苷酸與所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動(dòng)子相連，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑選自=IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、 IL-10RDN 或其亞基、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、 IFN- α 1、INF- α 2、IL-15R α、CCL3 (MIP-Ia)、CCL5 (RANTES)、CCL7 (MCP3)、XCLl (淋巴細(xì)胞趨化因子)、CXCLl (MGSA- α )、CCR7、CCL19 (MIP_3b)、CXCL9 (MIG)、CXCLlO (IP-10)、 CXCL12 (SDF-I)、CCL21 (6Ckine)、0X40L、4_1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防衛(wèi)素、 HMGBl、Flt3L、IFN-β ,TNF-α、dnFADD、TGF-α、PD_LlRNAi、a PD-Ll 反義寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L 和 SlOO。
30.如權(quán)利要求四所述的體外工程改造免疫細(xì)胞，其特征在于，所述載體是腺病毒載體。
31.如權(quán)利要求四所述的體外工程改造免疫細(xì)胞，其特征在于，所述載體還包含編碼具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
32.如權(quán)利要求四所述的體外工程改造免疫細(xì)胞，其特征在于，編碼具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的所述蛋白質(zhì)的所述多核苷酸和編碼具有IL-12的功能的所述蛋白質(zhì)的所述多核苷酸在所述基因開關(guān)的控制下。
33.如權(quán)利要求四所述的體外工程改造免疫細(xì)胞，其特征在于，所述基因開關(guān)是基于 EcR的基因開關(guān)。
34.如權(quán)利要求四所述的體外工程改造免疫細(xì)胞，其特征在于，編碼基因開關(guān)的所述多核苷酸包含第一啟動(dòng)子控制下的第一轉(zhuǎn)錄因子序列和第二啟動(dòng)子控制下的第二轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列和所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列所編碼的蛋白質(zhì)相互作用形成行使配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子功能的蛋白質(zhì)復(fù)合物。
35.如權(quán)利要求四所述的體外工程改造免疫細(xì)胞，其特征在于，編碼具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的蛋白質(zhì)的所述多核苷酸編碼人免疫調(diào)節(jié)劑。
36.如權(quán)利要求31所述的體外工程改造免疫細(xì)胞，其特征在于，編碼具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)的所述多核苷酸編碼人IL-12。
37.如權(quán)利要求四所述的體外工程改造免疫細(xì)胞，其特征在于，所述免疫細(xì)胞是人樹突細(xì)胞。
38.如權(quán)利要求37所述的體外工程改造免疫細(xì)胞，其特征在于，所述樹突細(xì)胞是骨髓樹突細(xì)胞。
39.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求19所述的體外工程改造免疫細(xì)胞或TSC群體。
40.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求四所述的體外工程改造免疫細(xì)胞或TSC。
41.如權(quán)利要求39或40所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物適于腫瘤內(nèi)、 腹膜內(nèi)或皮下給予。
42.如權(quán)利要求39所述的藥物組合物，其特征在于，所述細(xì)胞群體包含至少IO4個(gè)細(xì) 胞。
43.如權(quán)利要求39所述的藥物組合物，其特征在于，所述細(xì)胞群體包含至少IO7個(gè)細(xì)胞。
44.一種治療哺乳動(dòng)物的腫瘤的方法，包括(a)將免疫細(xì)胞或TSC群體腫瘤內(nèi)給予腫瘤微環(huán)境，所述細(xì)胞經(jīng)體外工程改造以條件性表達(dá)具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)；和(b)將治療有效量的一種或多種激活配體給予所述哺乳動(dòng)物；從而誘導(dǎo)具有所述免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)表達(dá)并治療所述腫瘤，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑選自:IL_1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R DN 或其亞基、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、IFN-α 1、 INF-α 2、IL-15Ra、CCL3 (ΜΙΡ-la)、CCL5 (RANTES)、CCL7 (MCP3)、XCLl (淋巴細(xì)胞趨化因子)、CXCL1(MGSA-α )、CCR7、CCL19(MIP_3b)、CXCL9(MIG)XXCLlO(IP-10),CXCL12(SDF-I)、 CCL21(6Ckine)、0X40L、4_lBBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防衛(wèi)素、HMGBl、Flt3L、IFN_3、 TNF- α、dnFADD、TGF- α、PD-L1RNAi, PD-Ll 反義寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L 和 SlOO。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述腫瘤是良性腫瘤。
46.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述腫瘤是惡性腫瘤。
47.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述腫瘤是黑色素瘤。
48.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述腫瘤是惡性黑色素瘤皮膚癌。
49.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述體外工程改造的免疫細(xì)胞包含含有編碼基因開關(guān)的多核苷酸的載體，其中所述多核苷酸包含(1)與啟動(dòng)子操作性相連的至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和(2)編碼具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸，該多核苷酸與所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動(dòng)子相連。
50.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述載體是腺病毒載體。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述載體還包含編碼具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，編碼具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的所述蛋白質(zhì)的所述多核苷酸和編碼具有IL-12的功能的所述蛋白質(zhì)的所述多核苷酸在所述基因開關(guān)的控制下。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述基因開關(guān)是基于EcR的基因開關(guān)。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其特征在于，編碼基因開關(guān)的所述多核苷酸包含第一啟動(dòng)子控制下的第一轉(zhuǎn)錄因子序列和第二啟動(dòng)子控制下的第二轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列和所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列所編碼的蛋白質(zhì)相互作用形成行使配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子功能的蛋白質(zhì)復(fù)合物。
55.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，編碼具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的蛋白質(zhì)的所述多核苷酸編碼人免疫調(diào)節(jié)劑。
56.如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，編碼具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)的所述多核苷酸編碼人IL-12。
57.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述免疫細(xì)胞是人樹突細(xì)胞。
58.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述樹突細(xì)胞是骨髓樹突細(xì)胞。
59.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述配體是二?；荨?br> 60.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述配體選自RG-115819、RG-115932和 RG-I15830。
61.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述配體是酰氨基酮或嘴二唑啉。
62.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，在所述體外工程改造的免疫細(xì)胞之前或之后的1小時(shí)內(nèi)給予所述配體。
63.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，在所述體外工程改造的免疫細(xì)胞之前或之后的M小時(shí)內(nèi)給予所述配體。
64.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，在所述體外工程改造的免疫細(xì)胞之前或之后的48小時(shí)內(nèi)給予所述配體。
65.一種測(cè)定基于體外工程改造的免疫細(xì)胞的治療方案在患者中的效力的方法，包括(a)給予體外工程改造的免疫細(xì)胞之前，檢測(cè)從有此需要的所述患者獲得的第一生物學(xué)樣品中干擾素-Y (IFN-y)的表達(dá)水平或活性水平或二者，從而獲得對(duì)照水平；(b)給予有此需要的患者體外工程改造的免疫細(xì)胞，所述細(xì)胞經(jīng)工程改造以條件性表達(dá)具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)和任選表達(dá)具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)；(c)給予有此需要的所述患者有效量的激活配體；(d)給予體外工程改造的免疫細(xì)胞和激活配體之后，檢測(cè)從有此需要的所述患者獲得的第二生物學(xué)樣品中IFN-Y的表達(dá)水平或活性水平或二者，從而獲得測(cè)試水平；和(e)比較IFN-γ的對(duì)照水平與測(cè)試水平，其中IFN-Y的表達(dá)、活性或二者的測(cè)試水平相比于對(duì)照水平增加表明該治療方案在有此需要的所述患者中有效，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R DN 或其亞基、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、IFN-α 1、 INF- α 2、IL-15R α、CCL3 (MIP-Ia)、CCL5 (RANTES)、CCL7 (MCP3)、XCLl (淋巴細(xì)胞趨化因子)、CXCL1(MGSA-α )、CCR7、CCL19(MIP_3b)、CXCL9(MIG)XXCLlO(IP-10),CXCL12(SDF-I)、 CCL21(6Ckine)、0X40L、4_lBBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防衛(wèi)素、HMGBl、Flt3L、IFN_3、 TNF- α、dnFADD、TGF- α、PD-L1RNAi, PD-Ll 反義寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L 和 SlOO。
66.如權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于，有此需要的所述患者是人患者。
67.如權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于，所述患者是癌癥患者。
68.如權(quán)利要求67所述的方法，其特征在于，所述癌癥患者是黑色素瘤患者。
69.如權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于，通過ELISA檢測(cè)IFN-γ水平。
70.如權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于，所述免疫細(xì)胞經(jīng)體外工程改造以條件性表達(dá)具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)和任選表達(dá)具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)， 所述免疫細(xì)胞包含含有編碼基因開關(guān)的多核苷酸的載體，其中所述多核苷酸包含(1)與啟動(dòng)子操作性相連的至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和( 編碼具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)和任選的IL-12的多核苷酸，該多核苷酸與所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動(dòng)子相連。
71.如權(quán)利要求70所述的方法，其特征在于，所述載體是腺病毒載體。
72.如權(quán)利要求70所述的方法，其特征在于，所述基因開關(guān)是基于EcR的基因開關(guān)。
73.如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，所述配體結(jié)合EcR配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
74.如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，所述配體是二酰基胼。
75.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述配體選自RG-115819、RG-115932和 RG-I15830。
76.如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，所述配體是酰氨基酮或嗎二唑啉。
77.如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，編碼基因開關(guān)的所述多核苷酸包含第一啟動(dòng)子控制下的第一轉(zhuǎn)錄因子序列和第二啟動(dòng)子控制下的第二轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列和所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列所編碼的蛋白質(zhì)相互作用形成行使配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子功能的蛋白質(zhì)復(fù)合物。
78.如權(quán)利要求70所述的方法，其特征在于，編碼具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)的所述多核苷酸編碼人IL-12。
79.如權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于，所述免疫細(xì)胞是人樹突細(xì)胞。
80.如權(quán)利要求79所述的方法，其特征在于，所述樹突細(xì)胞是骨髓樹突細(xì)胞。
81.如權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于，所述激活配體經(jīng)腫瘤內(nèi)、口服、腹膜內(nèi)或皮下給予。
82.如權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于，在所述體外工程改造的樹突細(xì)胞之前或之后的1小時(shí)內(nèi)給予所述激活配體。
83.如權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于，在所述體外工程改造的樹突細(xì)胞之前或之后的M小時(shí)內(nèi)給予所述激活配體。
84.如權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于，在所述體外工程改造的樹突細(xì)胞之前或之后的48小時(shí)內(nèi)給予所述激活配體。
85.—種試劑盒，其包含(a)工程改造以含有載體的免疫細(xì)胞，所述載體包含編碼基因開關(guān)的多核苷酸，而所述基因開關(guān)控制具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)和任選的具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)的表達(dá)，和(b)激活所述基因開關(guān)的配體。
86.如權(quán)利要求85所述的試劑盒，其特征在于，所述配體是RG-115819、RG-115830或 RG-115932。
87.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，編碼基因開關(guān)的所述多核苷酸包含一個(gè)啟動(dòng)子控制下的第一轉(zhuǎn)錄因子序列和第二轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列和所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列所編碼的蛋白質(zhì)相互作用以形成行使配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子的功能的蛋白質(zhì)復(fù)合物。
88.如權(quán)利要求87所述的載體，其特征在于，所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列和所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列通過EMCV內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IREQ相連。
89.如權(quán)利要求四所述的體外工程改造免疫細(xì)胞，其特征在于，編碼基因開關(guān)的所述多核苷酸包含一個(gè)啟動(dòng)子控制下的第一轉(zhuǎn)錄因子序列和第二轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列和所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列所編碼的蛋白質(zhì)相互作用以形成行使配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子的功能的蛋白質(zhì)復(fù)合物。
90.如權(quán)利要求89所述的體外工程改造免疫細(xì)胞，其特征在于，所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列和所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列通過EMCV內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IREQ相連。
91.如權(quán)利要求53所述的方法，其特征在于，編碼基因開關(guān)的所述多核苷酸包含一個(gè)啟動(dòng)子控制下的第一轉(zhuǎn)錄因子序列和第二轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列和所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列所編碼的蛋白質(zhì)相互作用以形成行使配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子的功能的蛋白質(zhì)復(fù)合物。
92.如權(quán)利要求91所述的體外工程改造免疫細(xì)胞，其特征在于，所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列和所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列通過EMCV內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IREQ相連。
93.如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，編碼基因開關(guān)的所述多核苷酸包含一個(gè)啟動(dòng)子控制下的第一轉(zhuǎn)錄因子序列和第二轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列和所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列所編碼的蛋白質(zhì)相互作用以形成行使配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子的功能的蛋白質(zhì)復(fù)合物。
94.如權(quán)利要求93所述的體外工程改造免疫細(xì)胞，其特征在于，所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列和所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列通過EMCV內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IREQ相連。
95.一種組合物，其包含兩種或更多種體外工程改造免疫細(xì)胞或治療支持細(xì)胞的群體， 其中所述組合物中各體外工程改造細(xì)胞群體包含含有編碼基因開關(guān)的多核苷酸的載體，其中所述多核苷酸包含(1)與啟動(dòng)子操作性相連的至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和( 編碼具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸，該多核苷酸與所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動(dòng)子相連，其中所述組合物中各體外工程改造細(xì)胞群體表達(dá)的一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑與該組合物中其它一種或多種體外工程改造細(xì)胞群體表達(dá)的一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑不同。
96.一種治療哺乳動(dòng)物的腫瘤的方法，包括(a)將兩種或更多種免疫細(xì)胞或TSC群體腫瘤內(nèi)給予腫瘤微環(huán)境，所述細(xì)胞經(jīng)體外工程改造以條件性表達(dá)具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)，其中各群免疫細(xì)胞或TSC表達(dá)不同集合的一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑；和(b)將治療有效量的一種或多種激活配體給予所述哺乳動(dòng)物；從而誘導(dǎo)具有所述免疫調(diào)節(jié)劑的功能的蛋白質(zhì)表達(dá)并治療所述腫瘤。
97.一種治療哺乳動(dòng)物的腫瘤的方法，包括(a)將兩種或更多種免疫細(xì)胞或TSC群體腫瘤內(nèi)給予腫瘤微環(huán)境，所述細(xì)胞經(jīng)體外工程改造以條件性表達(dá)具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)和具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)，其中各群免疫細(xì)胞或TSC表達(dá)不同集合的具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能的一種或多種蛋白質(zhì)，其中具有所述免疫調(diào)節(jié)劑或IL-12的功能的至少一種蛋白質(zhì)在配體激活的條件性啟動(dòng)子的控制下；和(b)將治療有效量的一種或多種激活配體給予所述哺乳動(dòng)物； 從而誘導(dǎo)具有所述免疫調(diào)節(jié)劑的功能的蛋白質(zhì)和/或具有IL-12的功能的蛋白質(zhì)表達(dá)并治療所述腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明提供產(chǎn)生體外工程改造的免疫細(xì)胞的方法和在動(dòng)物中的治療性應(yīng)用，所述細(xì)胞在有激活配體存在下，在基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)控制下條件性表達(dá)白介素-12(IL-12)和一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑。
文檔編號(hào)C12N5/07GK102575227SQ200980150164
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2009年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月8日
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