專(zhuān)利名稱(chēng)：：利用免疫調(diào)節(jié)劑化合物治療過(guò)敏性疾病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于治療、預(yù)防、抑制或減輕受試者的過(guò)敏性疾病或其影響的治療方法，其包括向受試者施用有效量的式A的免疫調(diào)節(jié)劑化合物R-NH-CH-(CH2)"h——C-XCOOHO(A)在式A中，n是l或2，R是氫、酰基、垸基或肽片段，且X是芳族氨基酸或雜環(huán)氨基酸或其衍生物。優(yōu)選地，X為L(zhǎng)-色氨酸或D-色氨酸。圖1為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的結(jié)果的圖示。圖2為本發(fā)明的其它結(jié)果的圖示。圖3為本發(fā)明的其它結(jié)果的圖示。圖4為本發(fā)明的其它結(jié)果的圖示。圖5為本發(fā)明的其它結(jié)果的圖示。圖6為本發(fā)明的其它結(jié)果的圖示。圖7為本發(fā)明的其它結(jié)果的圖示。5圖8為本發(fā)明的其它結(jié)果的圖示。優(yōu)選實(shí)施方案根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及用于治療、預(yù)防、抑制或減輕受試者(優(yōu)選為人患者)過(guò)敏性疾病(例如哮喘)及其影響的治療方法。在某些實(shí)施方案中，所治療的是特應(yīng)性支氣管哮喘(atopicbronchialasthma)。本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑化合物包含式A的免疫調(diào)節(jié)劑<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>在式A中，n是l或2，R是氫、?；?、垸基或肽片段，且X是芳族氨基酸或雜環(huán)氨基酸或其衍生物。優(yōu)選地，X為L(zhǎng)-色氨酸或D-色氨酸。作為"X"的芳族氨基酸或雜環(huán)氨基酸的適當(dāng)衍生物為酰胺、單(d-C6)或雙(CrC6)烷基取代的酰胺、芳基酰胺和(CrC6)烷基酯或芳基酯。作為"R"的適當(dāng)?；蜊鶠閘至約6個(gè)碳的支鏈或直鏈烷基基團(tuán)、2至約IO個(gè)碳原子的酰基基團(tuán)，以及封端基團(tuán)，如芐氧羰基和叔丁氧羰基。優(yōu)選地，式A中所示的CH基團(tuán)的碳原子具有立體構(gòu)型，當(dāng)n為2時(shí)，其立體構(gòu)型不同于X的立體構(gòu)型。優(yōu)選的實(shí)施方案利用化合物，如y-D-谷氨酰-L-色氨酸、y-L-谷氨酰-L-色氨酸、Y-L-谷氨酰-Nm-甲酰-L-色氨酸、N-甲基-Y-L-谷氨酰-L-色氨酸、N-乙酰-Y-L-谷氨酰-L-色氨酸、Y-L-谷氨酰-D-色氨酸、p-L-天冬氨酰-L-色氨酸和卩-D-天冬氨酰-L-色氨酸。特別優(yōu)選的實(shí)施方案利用Y-D-谷氨酰-L-色氨酸，有時(shí)稱(chēng)為SCV-07。這些化合物、制備這些化合物的方法、這些化合物的藥學(xué)上可接受的鹽和其藥物制劑公開(kāi)在美國(guó)專(zhuān)利第5,916,878號(hào)，該專(zhuān)利通過(guò)引用并入本文。SCV-07，即Y-D-谷氨酰-L-色氨酸，是具有？谷氨?；蛘咛於滨；囊活?lèi)免疫調(diào)節(jié)藥物中的一種，其由俄國(guó)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)并由美國(guó)?？她堉扑幑?SciClonePharmaceuticalsInc.)在幾個(gè)適應(yīng)癥中檢測(cè)了其功效。SCV-07具有多種體內(nèi)和體外免疫調(diào)節(jié)活性。SCV-07提高了Con-A誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增殖，增加了Con-A誘導(dǎo)的白介素-2(IL-2)生產(chǎn)和脾臟淋巴細(xì)胞的IL-2受體表達(dá)，并刺激骨髓細(xì)胞上的Thy-1.2表達(dá)。在體內(nèi)，SCV-07對(duì)受5-FU免疫抑制的動(dòng)物和用綿羊紅血細(xì)胞免疫的模型具有強(qiáng)免疫刺激作用。式A的化合物可以以任何有效劑量施用，如約0.001-lOmg范圍內(nèi)的劑量?？梢悦啃瞧谝淮位蚨啻蔚厥┯脛┝?，如以天為基礎(chǔ)，劑量每天施用一次或多次?？梢酝ㄟ^(guò)任何合適的方法施藥，包括通過(guò)口服、鼻部、透皮、舌下施藥，通過(guò)注射、定期輸注、連續(xù)輸注等施用?？赏ㄟ^(guò)肌肉注射施用所述劑量，當(dāng)然也可以使用其它形式的注射和輸注，可以應(yīng)用其它的施藥形式，如經(jīng)口部或鼻部吸入或口服。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以以約0.001-10mg范圍內(nèi)的劑量，更優(yōu)選約0.01-lmg范圍內(nèi)的劑量，最優(yōu)選約O.lmg的劑量施用式A的化合物。劑量還可以以微克/千克計(jì)算，所述劑量在約0.00001-100mg/kg的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在約0.0001-lmg/kg的范圍內(nèi)，更優(yōu)選約0.001-0.01mg/kg。SCV-07含有通過(guò)化學(xué)合成獲得并通過(guò)高效液相色譜純化為均一性的活性成分二肽fD-Glu-L-Trp("D-谷氨酰-L-色氨酸)(RU2091389,1997;RU2120298，1998)。所述制劑之前用于傳染病中以及外科手術(shù)后免疫力的恢復(fù)。所述制劑在0.00001mg/kg體重-0.01mg/kg體重的低劑量時(shí)具有免疫刺激作用，即其在極低濃度時(shí)發(fā)揮其作用。為了治療過(guò)敏性疾病，以藥典許可的劑量施用所述制劑。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)向個(gè)體施用的形式以及疾病的特征，所述制劑的日劑量為0.1mg-1.5mg。也可能以較低劑量使用所述制劑，但會(huì)降低治療效果，而從經(jīng)濟(jì)上來(lái)說(shuō)，以大于1.5mg的劑量使用所述制劑也不適宜。所述制劑的劑量在超出應(yīng)用劑量至少100,000倍時(shí)并沒(méi)有毒性。當(dāng)通過(guò)腸胃外使用(肌內(nèi)或腹膜內(nèi))時(shí)，在某些實(shí)施方案中以溶解有活性成分(Y-D-Glu-L-Trp:100嗎)和賦形劑(D-甘露醇9.0mg，氯化鈉l.Omg)的體積為lml的等滲氯化鈉溶液的形式使用所述制劑。在某些實(shí)施方案中，所述單劑量為0.1mg(0.001mg/kg)。在某些實(shí)施方案中以5-10次注射為一療程的形式利用所述制劑進(jìn)行治療。當(dāng)經(jīng)口使用時(shí)，在某些實(shí)施方案中以包含0.35mg或1.5mg活性成分的片劑的形式使用所述制劑。在某些實(shí)施方案中所述制劑每天使用一次或兩次，并持續(xù)l-2周。具有取代、缺失、延長(zhǎng)、替換或其它修飾部分并且具有與SCV-07基本相似的生物活性的生物活性類(lèi)似物也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)，例如與SCV-07具有足夠同源性而使其以與SCV-07具有基本相同的方式發(fā)揮基本相同活性的SCV-07衍生肽。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，可以給患者施用式A的化合物從而使該患者的循環(huán)系統(tǒng)在治療或預(yù)防期間基本持續(xù)地保持有效量的式A的化合物。本發(fā)明的實(shí)施方案包括使受試者的循環(huán)系統(tǒng)在至少約6、10、12小時(shí)或更長(zhǎng)的治療期內(nèi)基本持續(xù)地保持有效量的式A化合物，當(dāng)然更長(zhǎng)的治療期也在本發(fā)明的預(yù)期之中。在其它實(shí)施方案中，治療期至少為約l天，甚至多天，如一星期或更長(zhǎng)。然而，可以預(yù)期，使患者循環(huán)系統(tǒng)在治療期間基本持續(xù)地保持有效量的式A化合物的上述治療可以被持續(xù)時(shí)間相似或不同的非治療期隔開(kāi)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，在治療期間可以通過(guò)例如靜脈內(nèi)輸注給患者連續(xù)輸注式A化合物，從而在該患者的循環(huán)系統(tǒng)中基本持續(xù)地保持有效量的式A化合物。所述輸注可以以任何合適的方式進(jìn)行，如通過(guò)微量泵。或者，也可以維持式A化合物的注射方案，從而在該患者的循環(huán)系統(tǒng)中基本持續(xù)地保持有效量的式A化合物。合適的注射方案可以包括每1、2、4、6等小時(shí)注射一次，從而使該患者的循環(huán)系統(tǒng)在治療期間基本持續(xù)地保持有效劑量的免疫調(diào)節(jié)劑化合物肽。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，在至少約1小時(shí)的治療期中連續(xù)輸注式A化合物，當(dāng)然可以預(yù)期在連續(xù)輸注式A化合物中，給藥可以持續(xù)長(zhǎng)得多的時(shí)間。更優(yōu)選地，連續(xù)輸注進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間，如至少大約6、8、10、12小時(shí)或更長(zhǎng)的時(shí)間。在其它實(shí)施方案中，連續(xù)輸注至少大約l天，甚至數(shù)天，如一周或更長(zhǎng)。在某些實(shí)施方案中，式A的化合物存在于藥學(xué)上可接受的液體載體例如注射用水、生理濃度的鹽水或類(lèi)似物中。可以通過(guò)常規(guī)的劑量滴定試驗(yàn)確定式A化合物的有效量。式A化合物還可以與其它治療哮喘的藥物一起施用。通過(guò)以下非限制性實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例l:特應(yīng)性支氣管哮喘的治療SCV-07是對(duì)免疫系統(tǒng)具有廣譜活性并且尤其能夠增強(qiáng)IL-2和干擾素-Y產(chǎn)生的合成免疫調(diào)節(jié)劑。這種活性明顯來(lái)自T輔助細(xì)胞的平衡在所述制劑影響下向I型T輔助細(xì)胞方向的移動(dòng)。本發(fā)明的目的是研究SCV-07對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性過(guò)敏性哮喘的作用。為此目的，本發(fā)明人使用了吸入施用過(guò)敏原的卵白蛋白致敏哮喘模型。在對(duì)動(dòng)物用過(guò)敏原進(jìn)行初次全身免疫從而模擬預(yù)敏化生物體狀態(tài)后，給所述動(dòng)物施用SCV-07。材料和方法構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性過(guò)敏性哮喘的模型將雌性無(wú)病原Balb/C系小鼠("Pushchtino"laboratoryanimalbreeders)在恒溫、12小時(shí)晝/夜循環(huán)的SPF-動(dòng)物房條件下飼養(yǎng)，并提供無(wú)菌飼料和水，供其隨意取食。兩套試驗(yàn)中分別使用在試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)為6-8周齡和18-20周齡的小鼠。以每只小鼠8的劑量使用基于硫酸銨的佐劑中的卵白蛋白溶液(Sigma)對(duì)動(dòng)物免疫兩次，其間的間隔為5天。初次免疫后第6天至第11天，每天一次經(jīng)腹膜內(nèi)施用劑量為0.1呢/kg或1.0嗎/kgSCV-07的200(il體積的PBS溶液。在同日向?qū)φ战M施用生理鹽水。每組包含6-10只動(dòng)物。在初次免疫后第12、16和20天，將動(dòng)物置于密封箱內(nèi)，利用超聲霧化器LD-207U(LittleDoctor)在該密封箱內(nèi)產(chǎn)生含1%卵白蛋白(OvA)的PBS溶液氣霧劑，并與空氣連續(xù)混合，持續(xù)1分鐘。動(dòng)物接觸所述氣霧劑的時(shí)間為15分鐘。在最后一次接觸氣霧劑24小時(shí)后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性過(guò)敏性哮喘的嚴(yán)重度分析。根據(jù)支氣管肺泡灌洗液的細(xì)胞組成、組織學(xué)研究和抗原特異性IgE抗體的滴度測(cè)定，對(duì)實(shí)驗(yàn)性過(guò)敏性哮喘在使用SCV-07期間的嚴(yán)重度變化進(jìn)行分析。通過(guò)在腹膜內(nèi)施用致死量的巴比妥鈉處死小鼠。利用lmLPBS溶液經(jīng)氣管清洗肺部，獲得支氣管肺泡灌洗液(BAL)。通過(guò)離心沉淀BAL9細(xì)胞，重懸沉淀，在Goryaev小室中計(jì)算細(xì)胞濃度，并制備涂片。將涂片干燥、固定，并用Romanovskii染料染色。在光學(xué)顯微鏡下利用油浸法(目鏡:x16，物鏡x100)對(duì)支氣管肺泡灌洗液的細(xì)胞組成進(jìn)行分析。觀察不少于5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每200個(gè)細(xì)胞中的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量。將每種細(xì)胞群的細(xì)胞相對(duì)數(shù)量表示為占細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù)。在采集支氣管肺泡灌洗液后，將肺部在4%的多聚甲醛中固定3-7天，通過(guò)醇(2%celluidine-蓖麻油)和氯仿逐漸增加的Peterfi溶液，并傾入石蠟中。制備厚度為5pm的切片。用蘇木精-曙紅對(duì)所述切片進(jìn)行染色以評(píng)價(jià)細(xì)胞浸潤(rùn)的強(qiáng)度，并用Schiff-碘酸進(jìn)行染色以計(jì)算杯狀細(xì)胞的數(shù)量。利用ScionImage程序包通過(guò)形態(tài)度量的方式對(duì)支氣管周?chē)?rùn)和血管周?chē)?rùn)進(jìn)行定量評(píng)價(jià)。在每只動(dòng)物的肺切片上分析三條支氣管和三條血管。計(jì)算含支氣管或血管的組織和其周?chē)?rùn)的面積與血管或支氣管本身的面積之間的差異，作為浸潤(rùn)面積。計(jì)算浸潤(rùn)面積與血管或支氣管面積的比例，作為浸潤(rùn)的指標(biāo)。在分析中，實(shí)驗(yàn)組包括的支氣管和血管面積方面相當(dāng)(組間差異不顯著，p>0.6)。對(duì)于每只動(dòng)物的肺切片，在不少于5個(gè)視野中計(jì)算支氣管切片上杯狀細(xì)胞和上皮細(xì)胞的數(shù)量，并將其表示為占細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù)。在分析中，實(shí)驗(yàn)組包括的支氣管度量方面相當(dāng)(支氣管中細(xì)胞數(shù)量的組間差異不顯著，p>0.5)。從眼后窩竇(retro-orbitalsinus)采集外周血。根據(jù)以下方案，利用固相IFA測(cè)定血清和支氣管肺泡灌洗液中的抗-OvAIgE滴度。按照生產(chǎn)商推薦的稀釋度向用于IFA的96-孔平板(CorningCostar)中加入生物素標(biāo)記的抗小鼠IgE的大鼠抗體(Caltag)(100pL/L)，在室溫下孵育1小時(shí)，并清洗。然后加入連續(xù)稀釋的血清樣品或BAL，在室溫下孵育l小時(shí)，并清洗。隨后加入用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的OvA，在振蕩器上于室溫下孵育1小時(shí)，清洗，加入過(guò)氧化物酶的底物(OPD，Sigma)并孵育15分鐘。加入1MH2S04終止反應(yīng)，并使用Victor2分光光度計(jì)(Wallac)在450nm的波長(zhǎng)對(duì)平板進(jìn)行分析。為了定量比較減去背景后抗原特異性IgE的滴度，發(fā)明人計(jì)算了動(dòng)物對(duì)照組樣品在每個(gè)稀釋度的平均光密度，并將試驗(yàn)中來(lái)自所有動(dòng)物樣品在相應(yīng)稀釋度的光密度表示為占上述所得數(shù)值的百分?jǐn)?shù)。利用Windowsv.13的MicrosoftExcel和SPSS程序?qū)Y(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。利用Kholmogorov-Smimov標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算正態(tài)分布。為了評(píng)價(jià)正態(tài)分布值的組間差異顯著性，發(fā)明人使用具有不同偏差的雙側(cè)Student檢驗(yàn)，對(duì)于非正態(tài)分布的差異，使用Mann-Whitney檢驗(yàn)。當(dāng)p〈0.05時(shí)，認(rèn)為差異顯著。除非另有說(shuō)明，將數(shù)據(jù)用平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差的方式表示。根據(jù)所獲得的結(jié)果，在對(duì)年幼動(dòng)物(試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)為6-8周齡)的試驗(yàn)中，BAL細(xì)胞組成的分析沒(méi)有顯示出SCV-07的顯著作用。所有組中BAL的總體細(xì)胞性質(zhì)基本相同(對(duì)照組為2.00±0.34百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，接受0.1pg/kg制劑的組為1.96±0.99百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，接受1pg/kg制劑的組為2.21±1.16百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞)。通過(guò)比較BAL中各白細(xì)胞群的相對(duì)百分?jǐn)?shù)，發(fā)明人注意到接受l嗎/kgSCV-07的組中，嗜酸性粒細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)顯著低于對(duì)照組動(dòng)物，而巨噬細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)則顯著高于對(duì)照組動(dòng)物(見(jiàn)表1)。BAL中各個(gè)細(xì)胞群的絕對(duì)細(xì)胞數(shù)量在組間沒(méi)有顯著差異。表l.BAL細(xì)胞的百分組成(6-8周齡動(dòng)物)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*與對(duì)照組相比，p<0.05在18-20周齡動(dòng)物的試驗(yàn)中，接受SCV-07的組中BAL細(xì)胞組成的變化各不相同。發(fā)明人注意到，接受O.lpg/kg所述制劑的組，其灌洗液中細(xì)胞總數(shù)顯著減少(1.12士0.15百萬(wàn)，其與對(duì)照組2.03士0.78百萬(wàn)相比，p<0.05)，而在接受1|ig/kgSCV-07的組中，該指標(biāo)具有降低的明顯趨勢(shì)(1.32±0.23百萬(wàn))。盡管白細(xì)胞各個(gè)亞群的百分含量沒(méi)有顯著差異，但分析絕對(duì)值發(fā)現(xiàn)，接受O.lpg/kgSCV-07組的嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量顯著減少，而接受l.Olag/kg所述制劑的組中的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)li胞、嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量也顯著減少(見(jiàn)表2，圖1，其中SCV-07表示為SCV-07)。表2BAL細(xì)胞的亞群組成(18-20周齡動(dòng)物)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*與對(duì)照組相比，p<0.05在6-8月齡動(dòng)物[sic]的血清和支氣管肺泡灌洗液中，模型中使用的IgE抗原的特異滴度的測(cè)量值顯示，與對(duì)照組相比，接受0.1pg/kgSCV-07的組的血清滴度顯著降低。在接受1pg/kgSCV-07的小鼠中，血清和支氣管肺泡液中抗-OvAIgE的滴度均顯著降低(見(jiàn)表3，圖2，其中SCV-07表示SCV-07)。表3.抗-OvAIgE的滴度(6-8周齡動(dòng)物)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*與對(duì)照組相比，p<0.05在使用18-20周齡小鼠的試驗(yàn)中，發(fā)明人還觀察到，在使用SCV-07后IgE特異性滴度的下降趨勢(shì)，但該指標(biāo)在所有組中的變化性非常高，且差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不顯著(見(jiàn)表4)。表4.抗-OvAIgE的滴度(18-20周齡動(dòng)物)動(dòng)物組指標(biāo)對(duì)照SCV-070.1pg/kgSCV-071嗎/kg血清中IgE的滴度，稀釋度1:400，占對(duì)照組平均值的百分?jǐn)?shù)100±4492±4479±46BAL中IgE的滴度，稀釋度1:32，占對(duì)照組平均值的百分?jǐn)?shù)100±9185±70101±51小鼠切片的形態(tài)分析表明，在接受0.1pg/kgSCV-07的動(dòng)物的支氣管上皮中，杯狀細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)降低2倍以上，與對(duì)照組相比差異顯著(見(jiàn)表5)。目前尚未完成支氣管周?chē)?rùn)和血管周?chē)?rùn)強(qiáng)度的形態(tài)度量評(píng)價(jià)。表5.支氣管上皮中杯狀細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(6-8周齡動(dòng)物)動(dòng)物組指標(biāo)對(duì)照SCV-070.1嗎/kgSCV-071昭/kg杯狀細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù)(中間值，最小值-最大值)39.3(3-85)15.2*(4陽(yáng)卯)36.5(3-92)*與對(duì)照組相比，p<0.05支氣管周?chē)脱苤車(chē)?rùn)強(qiáng)度的形態(tài)度量評(píng)價(jià)可以使接受SCV-07的兩個(gè)組的支氣管周?chē)?rùn)的降低獲得可信的證明。在接受SCV-07的組中，血管周?chē)?rùn)強(qiáng)度也具有降低的明顯趨勢(shì)，然而由于癥狀的高變化性，與對(duì)照組的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不可信(見(jiàn)表6)。表6.肺組織的浸潤(rùn)強(qiáng)度動(dòng)物組指標(biāo)對(duì)照SCV-070,1嗎/kgSCV-071嗎/kg支氣管周?chē)?rùn)指標(biāo)，常規(guī)單位0.52±0.230.39±0.19*0.35±0.14**血管周?chē)?rùn)指標(biāo)，常規(guī)單位2.46±2.221.67±1.081,48±1.02*與對(duì)照組相比，p<0.05**與對(duì)照組相比，p<0.0113結(jié)論所得結(jié)果表明，在使用SCV-07的過(guò)程中，觀察到過(guò)敏性哮喘模型的試驗(yàn)進(jìn)程(experimentalprocess)嚴(yán)重度降低，特別是支氣管腔內(nèi)白細(xì)胞的出現(xiàn)以及支氣管周?chē)?rùn)減少，支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞減少，血清和灌洗液中抗原特異性IgE的數(shù)量下降，和支氣管上皮中形成粘膜的杯狀細(xì)胞的數(shù)量也下降。實(shí)施例2.SCV-07對(duì)Thl和Th2克隆的細(xì)胞因子生產(chǎn)的作用以每天5次腹膜內(nèi)注射的形式將0.1|ig/kg體重和1.0)ig/kg體重劑量的SCV-07施用于完整的野生型小鼠。此后，分離脾細(xì)胞，通過(guò)用5pg/mL劑量的伴刀豆球蛋白A刺激細(xì)胞從而在培養(yǎng)基中誘導(dǎo)細(xì)胞因子合成。通過(guò)免疫酶定量分析測(cè)定合成細(xì)胞因子的水平。試驗(yàn)結(jié)果示于圖l中，其顯示在腹膜內(nèi)施用SCV-07后，有絲分裂原誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生白介素-4和干擾素-Y。從圖1可以明顯看出，ConA誘導(dǎo)產(chǎn)生的其它兩種細(xì)胞因子[sic]-IFN-Y和IL-4的變化本質(zhì)上成倒數(shù)關(guān)系。觀察到，在SCV-07(1嗎/kg)影響下，由脾細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4減少2倍，而產(chǎn)生的IFN-y增加幾乎5倍。這些數(shù)據(jù)表明，SCV-07不僅刺激脾T細(xì)胞的功能應(yīng)答，強(qiáng)化IL-2的產(chǎn)生，同時(shí)還主要通過(guò)激活I(lǐng)型T輔助細(xì)胞來(lái)影響T輔助細(xì)胞的極化。實(shí)施例3.用SCV-07治療支氣管哮喘患者B-skii，生于1952年，報(bào)告主述每天出現(xiàn)呼吸困難6-7次，咳嗽并伴有難以咳出的痰、呼吸短促和鼻塞。從其病史可以得知，B-skii于1985年患上支氣管哮喘，曾經(jīng)通過(guò)緊急醫(yī)療服務(wù)在過(guò)敏科(AllergologicalDepartment)接受數(shù)次住院治療，同時(shí)伴有疾病的惡化。自1997年起，他一直接受全身應(yīng)用糖皮質(zhì)激素(脫氫皮質(zhì)醇，每天2片-維持劑量)。他還服用BeklazomLD250(高達(dá)1000(ig/天)、Flixotide250(達(dá)1000(ag/天)、長(zhǎng)效支氣管治療齊U(prolongedbroncholytics)(Serevent25jag/單位，50|ag/s)、Teotard200(2k/天，400mg/天)。在疾病發(fā)作時(shí)，使用沙丁胺醇(Ventolin)進(jìn)行治療。他曾在1994年到當(dāng)?shù)剡^(guò)敏反應(yīng)局(MunicipalAllergyO伍ce)接受了變態(tài)反應(yīng)的檢查，并找到了家居過(guò)敏原(家居灰塵、家居塵螨)；考慮到疾病的嚴(yán)重時(shí)期，沒(méi)有進(jìn)行灰塵ASIT。最近一次惡化是在2周前，當(dāng)時(shí)在基礎(chǔ)治療的背景下發(fā)生呼吸困難，并用P-2激動(dòng)劑(短期)難以進(jìn)行治療，支氣管痙攣和呼吸短促增加。他在第二GUZ醫(yī)院(GUZHospitalNo.2)的過(guò)敏科進(jìn)行住院治療，并且對(duì)門(mén)診治療的沒(méi)有響應(yīng)。按材料目錄追蹤過(guò)敏癥病理學(xué)的遺傳性。過(guò)敏史藥物-陰性；食物-蜂蜜、柑橘、西瓜、甜瓜(鼻塞、呼吸困難發(fā)作、咳嗽)；家居(家居灰塵)-呼吸困難發(fā)作、咳嗽、鼻塞、鼻液溢(rhinorrhea);表皮-陰性；灰塵-鼻炎的季節(jié)性惡化、結(jié)膜炎、連續(xù)10年在夏-秋季(7月-IO月)發(fā)生呼吸困難的頻率增加；昆蟲(chóng)-陰性；檢査表示處于平均的嚴(yán)重度狀態(tài)。導(dǎo)致性患者姿勢(shì)(坐姿)。皮膚表面干凈、蒼白、干燥。皮下淋巴結(jié)沒(méi)有增大。沒(méi)有觸及甲狀腺。鼻部呼吸嚴(yán)重受阻，從鼻腔分離出少量粘液；不能察覺(jué)氣味。結(jié)膜-粉色。鼻粘膜(在鼻鏡檢查過(guò)程中)-蒼白、浮腫?？谇徽衬?粉色。呼氣特征的呼吸困難。呼吸頻率=24次/分鐘。形成桶狀胸腔。叩診-肺部聲音的鼓性叩響(capsularresonance)。聽(tīng)診-大量干性喂音，在整個(gè)肺野中傳播。心音有節(jié)律。HR=P5=78/分鐘。BP=130/85mmHg。舌上覆有白色舌苔。腹部柔軟、無(wú)痛。肝部沿肋弓邊緣。腎的區(qū)域沒(méi)有變化，兩側(cè)均為Pasternak綜合征陰性。入院時(shí)進(jìn)行以下檢査常規(guī)血液分析紅細(xì)胞-5.07'1012/L，血紅蛋白二167g/L，白細(xì)胞=11.6'109/L，ESR=5mm/h，B=1%，E=3%，桿狀核細(xì)胞=10%，分節(jié)核細(xì)胞=70%，淋巴細(xì)胞=11%，MON=5%。常規(guī)的唾液分析顏色-灰色，特性-粘液狀，狀態(tài)-粘液狀，扁平上皮細(xì)胞-10-12x，肺泡上皮細(xì)胞-3-5x，L-10-12x，紅細(xì)胞-無(wú)，杯狀細(xì)胞-沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。/L，ALT-0.24，AST-0.16mmol/h/L，尿素-5.12mmol/L，肌酸酐-0.108mmol/L，L-淀粉酶-7.0mmol/L。激素狀態(tài)血清皮質(zhì)醇-39.8nmol/L免疫狀態(tài)的評(píng)價(jià)TSIK-40相對(duì)單位NST-94/158/1.7CD3+-53%IgG匿8.74CD4+-34%IgA-0.67CD8+-15%IgM-1.39CD16+-12%IgE畫(huà)l130.6CD20+-18%CD25+-1.3%EKG:竇性心律。HR^76次搏動(dòng)/分鐘視覺(jué)無(wú)病變FVD:FVC=66%，F(xiàn)EV=52%，F(xiàn)EV/FVC=61%，MOC75=37%，MOC50=34%，MOC25=51%。PTM:L/exp-2.0L/sL/exp-1.0Us。胸部X-射線肺野氣腫，肺硬化在下級(jí)肺泡(lowercompartments)擴(kuò)散。ENT會(huì)診診斷持續(xù)過(guò)敏性鼻炎。慢性咽炎。對(duì)該患者的診斷如下DS:支氣管哮喘，持久性、嚴(yán)重期、激素依賴、惡化。并發(fā)癥DN2。肺氣腫、肺硬化。并發(fā)癥持續(xù)過(guò)敏性鼻炎。花粉熱，沒(méi)有惡化。給所述患者開(kāi)具以下治療1.在呼吸困難發(fā)作期間通過(guò)噴霧器施用Ventolin,持續(xù)2天，然后在呼吸困難期間施用Astalin(DAI)，每天不多于3-4次；2.靜脈內(nèi)滴注1.含脫氫皮質(zhì)醇90nu-60nu-30nu的200.0mL生理鹽水；2.氨茶石咸2.40/0-10.0-5.OmL。3.肝素5000單位。4.Be露ort200(800嗎/天)。5.脫氫皮質(zhì)醇4t/day(8'.0Q，12:00)166.通過(guò)噴霧器施用Lazolvan，然后是Ambrohexal1t/3次/天。在急性癥狀減弱期間(入院治療的第8天)，處方每天一次肌內(nèi)注射[sic]含O.lmgSCV-07的l.OmL生理鹽水的量，共5天。在療程結(jié)束后(5次肌內(nèi)注射)，觀察到患者自我感覺(jué)顯著改善、心情良好，沒(méi)有觀察到副作用。所述制劑耐受性良好，體溫在正常值范圍內(nèi)。在動(dòng)態(tài)條件下對(duì)患者進(jìn)行另一次檢査(第5次肌內(nèi)注射SCV-07后24小時(shí))全血液分析紅細(xì)胞-5.12.1012/1^，HB-159g/L，白細(xì)胞匿9.7-109/L，ESR-6mm/h，b-，e-2%，桿狀核細(xì)胞-5%，分節(jié)核細(xì)胞-67%，淋巴細(xì)胞-20%，M-6%。血液生物化學(xué)糖-5.7;總膽紅素-8.9，ALT■0.12，AST-0.13，尿素-5.12，肌酸酐-0.073常規(guī)的唾液分析特性-粘液似的、顏色為灰色、粘度均勻，視野中扁平上皮細(xì)胞7-8，肺泡上皮細(xì)胞-無(wú)，白細(xì)胞-1-2x激素狀態(tài)皮質(zhì)醇-72.4免疫狀態(tài)的評(píng)價(jià)CD4+-36IgG-11.5CD3+-52IgA-1.11CD8+-15IgM-0.9CD16+-7IgE-672.1NST-100/163CD20+-11k-1.6CD25+-1.3TSIK-77在患者中觀察到疾病的積極動(dòng)態(tài)呼吸困難發(fā)作、咳嗽、鼻炎消除，呼吸短促減少(至16次/分鐘)、鼻塞消失，患者開(kāi)始感覺(jué)到氣味。在第15天，患者以良好的狀態(tài)出院，同時(shí)皮質(zhì)類(lèi)固醇治療減至維持劑量(每天2片脫氫皮質(zhì)醇)，并建議進(jìn)行基礎(chǔ)治療且在1月內(nèi)復(fù)査。實(shí)施例4.使用SCV-07以增強(qiáng)花粉熱的特異免疫治療的有效性?；颊逷-naM.N.,45歲，首次會(huì)診的日期2004年10月。診斷經(jīng)實(shí)驗(yàn)室確證為對(duì)樹(shù)花粉敏感的花粉熱，鼻結(jié)膜型，非發(fā)病季節(jié)時(shí)緩解。實(shí)驗(yàn)室初步檢査的結(jié)果中度嗜酸性粒細(xì)胞增多(7%)，中度高IgE免疫球蛋白血癥(165ME/mL)，白樺花粉和榛樹(shù)花粉過(guò)敏原特異性IgE的血清水平高(MAST-class3)，免疫調(diào)控指標(biāo)降低(0.88)。從2004年11月末至2005年3月中旬，根據(jù)以下方案利用類(lèi)變應(yīng)原("Puretal-tree")對(duì)花粉熱患者進(jìn)行特異性免疫治療(SIT):最初，每周一次皮下施用單劑量0.025mL的類(lèi)變應(yīng)原，在治療過(guò)程中逐步提高后續(xù)劑量，直至達(dá)到0.5mL(0.025mL-0.05mL，-0.1mL-0.2mL-0.3mL-0.4mL-0.5mL)的單劑量，后續(xù)劑量維持該劑量。此后花粉熱的季節(jié)性惡化周期(2005年4月-6月)的性質(zhì)表明SIT的有效性極低嚴(yán)重的鼻結(jié)膜癥狀仍然需要使用基本劑量方案的全身經(jīng)口抗組胺劑(Erius)和局部類(lèi)固醇治療(Nasonex)?？紤]到以上狀況，在2005年10月，為了提高SIT的臨床有效性，在初發(fā)或預(yù)期條件下，按照以下療程經(jīng)口施用免疫刺激制劑"SCV-07":1.5mg，每天一次，連續(xù)施用10天。"SCV-07"療程完成后，花粉熱患者從2005年11月中旬至2006年3月中旬按照之前的方案接受利用類(lèi)變應(yīng)原"Puretal-tree"的另一個(gè)SIT療程。針對(duì)"SCV-07"療程和SIT療程開(kāi)端之間的時(shí)間間隔為15天。此后花粉熱季節(jié)性惡化周期(2006年4月-6月)的性質(zhì)證明所實(shí)施的SIT的有效性顯著提高季節(jié)性鼻結(jié)膜癥狀近乎消失，在樹(shù)授粉的季節(jié)中，對(duì)患者既沒(méi)有使用抗組胺制劑也沒(méi)有使用局部類(lèi)固醇。所得結(jié)果表明使用"SCV-07"預(yù)防和治療過(guò)敏性疾病的有效性。針對(duì)該目標(biāo)，所述制劑的無(wú)害性和其相對(duì)低的成本使其有望作為獨(dú)立治療劑和在綜合治療中廣泛使用。實(shí)施例5:SCV-07在過(guò)敏性疾病的豚鼠模型中的有效性概述哮喘為肺部疾病，特征為支氣管收縮、炎性細(xì)胞(尤其是嗜酸性粒細(xì)胞)向肺部浸潤(rùn)、氣道高反應(yīng)性以及粘液分泌增加。可以在豚鼠中構(gòu)建過(guò)敏性哮喘模型，其具有針對(duì)過(guò)敏原的明顯且快速的支氣管收縮反應(yīng)以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并在接觸過(guò)敏原后24小時(shí)出現(xiàn)肺損傷。本研究的目的是測(cè)定在過(guò)敏原激發(fā)后，SCV-07是否能夠減少炎性細(xì)胞向肺部的浸潤(rùn)。通過(guò)腹膜內(nèi)注射卵白蛋白使豚鼠致敏化。在第17-21天，用PBS載體、1ug/kgSCV-07或10ug/kgSCV-07經(jīng)腹膜內(nèi)處理所述豚鼠。在第21天，用抗組胺劑對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行預(yù)處理，以降低可能致死的快速支氣管收縮反應(yīng)。隨后，使動(dòng)物接觸氣霧化卵白蛋白以引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)。對(duì)照動(dòng)物用卵白蛋白使致敏化并用鹽水氣霧劑作為對(duì)照進(jìn)行激發(fā)。SCV-07治療降低動(dòng)物在快速過(guò)敏反應(yīng)過(guò)程中的咳嗽、呼吸困難和整體疼痛；肺組織中的固有嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞減少；過(guò)敏性肺損傷降低，表現(xiàn)為滲漏到支氣管肺泡灌洗液中的紅細(xì)胞顯著減少；并沒(méi)有明顯抑制炎性細(xì)胞向過(guò)敏肺的浸潤(rùn)或卵白蛋白特異性抗體的產(chǎn)生。結(jié)論顯示SCV-07有望降低急性過(guò)敏反應(yīng)和隨后的肺損傷，但在抑制炎性細(xì)胞向過(guò)敏肺的浸潤(rùn)方面無(wú)效。將來(lái)的研究應(yīng)當(dāng)檢測(cè)SCV-07抑制過(guò)敏原誘導(dǎo)的支氣管收縮的能力。此外，基于SCV-07預(yù)防紅細(xì)胞滲漏的作用，應(yīng)當(dāng)評(píng)價(jià)其預(yù)防過(guò)敏原誘導(dǎo)的微血管滲透性改變和肥大細(xì)胞調(diào)節(jié)因子釋放的能力。縮寫(xiě)EPO嗜酸性粒細(xì)胞過(guò)氧化物酶MPO髓過(guò)氧化物酶WBC白細(xì)胞RBC紅細(xì)胞BAL支氣管肺泡灌洗液NSS生理鹽水溶液PBS磷酸鹽緩沖液OVA卵白蛋白ip腹膜內(nèi)背景軼事證據(jù)表明患有慢性哮喘的人由于其它適應(yīng)癥而接受SCV-07時(shí)，能夠減少其哮喘用救急藥的使用。假設(shè)患者對(duì)口2激動(dòng)劑的使用減少表明，SCV-07削弱了氣道高反應(yīng)性和/或過(guò)敏原誘導(dǎo)的早期和晚期支氣管收縮。對(duì)小鼠哮喘模型的研究還表明，在過(guò)敏原激發(fā)后細(xì)胞浸潤(rùn)可略有減少(SciClonecommunication)。目的測(cè)定SCV-07是否緩解豚鼠哮喘模型的哮喘癥狀。具體目標(biāo)測(cè)定在致敏后但在過(guò)敏原激發(fā)前對(duì)豚鼠哮喘模型施用SCV-07是否減少細(xì)胞浸潤(rùn)。材料和方法動(dòng)物雌性Dunkin畫(huà)Hartley豚鼠(200-350g)購(gòu)自CharlesRiver,Kingston,NewYorkfacility,BarrierK81。將動(dòng)物運(yùn)送至明尼蘇達(dá)州德盧斯市(Duluth，Minnesota),并在試驗(yàn)開(kāi)始前將其在本發(fā)明人的動(dòng)物房中飼養(yǎng)5-7天。試驗(yàn)處理組列于表7中。表7:試驗(yàn)處理組<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>在約6個(gè)月的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行5次獨(dú)立試驗(yàn)，每次試驗(yàn)8-10只動(dòng)物。第一次試驗(yàn)由4只PBSNSS動(dòng)物和4只PBSOVA動(dòng)物構(gòu)成，以保證試驗(yàn)系統(tǒng)正常運(yùn)作和OVA激發(fā)動(dòng)物發(fā)展出明顯的嗜酸性粒細(xì)胞增多癥狀。隨后的4次試驗(yàn)包含來(lái)自所述6個(gè)處理組中每組的大概1-3只動(dòng)物，并且每個(gè)處理組的最終N為7-8只動(dòng)物，如表7中所示。試驗(yàn)過(guò)程在第0天用50mg/kgOVA經(jīng)腹膜內(nèi)致敏化動(dòng)物。在第17、18、19和20天，在上午8點(diǎn)至10點(diǎn)之間通過(guò)腹膜內(nèi)注射向動(dòng)物施用PBS、1ug/kgSCV-07或10ug/kgSCV-07(肽處理)。在第21天的上午8點(diǎn)-10點(diǎn)之間，在用OVA或鹽水(NSS)氣霧劑激發(fā)前2小時(shí)向動(dòng)物施用肽。在用OVA或NSS氣霧劑激發(fā)前30分鐘，通過(guò)腹膜內(nèi)注射向每只動(dòng)物施用抗組胺劑(6.1mg/kg馬來(lái)酸吡納明)以預(yù)防由于伴隨氣霧劑OVA激發(fā)的過(guò)敏性反應(yīng)而導(dǎo)致的死亡。利用DeVilbissModel35B超聲噴霧器，使在樹(shù)脂玻璃室(22X22X29cm)中的成對(duì)動(dòng)物接觸1%OVA溶液噴霧劑或NSS噴霧劑5分鐘。在總共5分鐘氣霧化過(guò)程中觀察動(dòng)物，并記錄下評(píng)論。在激發(fā)后的22-24小時(shí)內(nèi)，處死動(dòng)物。通過(guò)心臟穿刺采血，灌洗，并摘取肺葉以測(cè)量細(xì)胞浸潤(rùn)。在OVA或NSS激發(fā)和安樂(lè)死時(shí)，動(dòng)物體重變化范圍在約350-550g，平均重量約420g。該試驗(yàn)方法與之前公開(kāi)的研究中使用的方法相似(RegalandFraser,1996;Regaletal.,2000)。細(xì)胞浸潤(rùn)的測(cè)定利用戊巴比妥(100-200mg/kg)使動(dòng)物安樂(lè)死，通過(guò)心臟穿刺采血，并利用室溫的PBS灌洗。實(shí)施氣管插管，并向氣管插管中引入4體積的PBS，并將其溫和取出，以獲得支氣管肺泡灌洗液(BAL)?？偣嘞匆后w積為60ml/kg。將BAL離心以沉淀細(xì)胞，將BAL細(xì)胞沉淀重懸在1.0mlPBS中，以測(cè)定每只動(dòng)物BAL中回收的白細(xì)胞(WBC)總數(shù)。將BAL上清液在-70。C冷凍以利用Lowryetal.(1951)的方法測(cè)定BAL上清液中回收的總蛋白。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，利用Turk's溶液在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中對(duì)BAL中總白細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。由使用改良Wrights'染料(DiffQuik,AmericanScientificProducts,McGrawPark,IL)染色的BAL細(xì)胞(3X1()4細(xì)胞)的細(xì)胞離心涂片(cytospinpreparation)獲得分類(lèi)計(jì)數(shù)(differentialcount)。計(jì)數(shù)400個(gè)細(xì)胞，經(jīng)鑒別為嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞。利用BAL細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)和白細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)算從每只動(dòng)物BAL回收的各細(xì)胞類(lèi)型的總數(shù)。為了估測(cè)肺組織中嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)量，分別對(duì)左肺葉進(jìn)行處理以測(cè)定嗜酸性粒細(xì)胞過(guò)氧化物酶(EPO)的活性，對(duì)右肺葉進(jìn)行處理以測(cè)定髓過(guò)氧化物酶(MPO)的活性(Fraseretal.，1995)。剩余的肺在8(TC干燥3-5天，以測(cè)定干重(g)。灌洗后勻質(zhì)化左肺尾葉的EPO活性表示為總OD/分鐘。灌洗后均質(zhì)化右肺尾葉的MPO活性表示為酶活性的總單位數(shù)。1ug/mlSCV-07沒(méi)有抑制EPO或MPO試驗(yàn)。如前所述(Fraseretal.,1995)，通過(guò)測(cè)定裂解RBC后重懸的BAL細(xì)胞沉淀的OD412，對(duì)BAL中RBC的數(shù)量進(jìn)行定量。同時(shí)測(cè)定BAL上清液的OD412，以估測(cè)在灌洗過(guò)程中以及在重懸細(xì)胞以進(jìn)行計(jì)數(shù)之前被裂解RBC的數(shù)量。0.3ug/mlSCV-07不影響體外OD412的測(cè)量。OVA特異性IgG1按照之前的闡述(Fraseretal.，1998;Regaletal.,2000)，通過(guò)ELISA測(cè)定血清中的OVA特異性IgG1。數(shù)據(jù)表示為樣品中OVA特異性IgG1的濃度除以標(biāo)準(zhǔn)品中OVA特異性IgG1的濃度(將該濃度定義為1)。通過(guò)使OVA致敏化豚鼠的血清混合物通過(guò)蛋白A瓊脂糖凝膠柱來(lái)制備IgG標(biāo)準(zhǔn)品。用NSS透析回收的IgGl，并將其等分以作為試驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)品使用。試劑SCV-07由SciClone將200mgSCV-07運(yùn)送至德盧斯市并保存于-70。C。在實(shí)驗(yàn)室避光稱(chēng)量所述化合物并避光保存。制備含20ug/ml和2ug/mlSCV-07的PBS儲(chǔ)備液，并于以1ml的體積等分保存在-7(TC冰箱中的聚丙烯試管(Sarstedttubes;Ref72.694.105)中。同樣將用于制備SCV-07溶液的PBS等分，并進(jìn)行冷凍以作為對(duì)照PBS注射劑(PBS目錄號(hào)Gibco10010，無(wú)鈣或鎂，經(jīng)測(cè)定內(nèi)毒素小于0.03EU/ml)。在使用的當(dāng)天解凍等分試樣，并在襯箔包裹的試管中避光放置在冰上。如果當(dāng)天沒(méi)有完全使用，將其避光儲(chǔ)存在冰箱中并于次日用完，否則將其丟棄。給動(dòng)物施用0.5ml/kgPBS和2ug/mlSCV-07或20ug/mlSCV-07,從而獲得SCV1(1ug/kg)或SCV10(10ug/kg)的遞送劑用于致敏化的OVA制備100ml含25mg/ml卵白蛋白(A5503，Sigma)的鹽水(Baxter,無(wú)菌，無(wú)熱源)溶液。將含4ml等分試樣的Nunc低溫保存管(Cat337516)在-70"C冷凍。利用21g針通過(guò)腹膜內(nèi)向動(dòng)物施用2ml/kg該OVA溶液，從而獲得50mg/kg的最終遞送劑量。利用OVA對(duì)該試驗(yàn)中的所有動(dòng)物進(jìn)行致敏化。用于氣霧劑激發(fā)的OVA在氣霧劑激發(fā)當(dāng)天制備含1%OVA的室溫NSS(Baxter,無(wú)菌，無(wú)熱源)溶液。統(tǒng)計(jì)分析對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，以均衡變量并允許構(gòu)建正態(tài)參數(shù)模型。對(duì)于OVA特異性IgG1的數(shù)值，在統(tǒng)計(jì)分析前，將所有的數(shù)值加0.01的常數(shù)以使極小數(shù)值對(duì)對(duì)數(shù)分度中變量的影響最小化。所有圖中的數(shù)值表示為7-8個(gè)數(shù)值的幾何平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)。利用ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并使用JMP軟件(SASInstituteInc.,Cary，N.C，USA)進(jìn)行對(duì)比檢驗(yàn)。將在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性定義為p<0.05。結(jié)果SCV-07對(duì)OVA氣霧劑產(chǎn)生的快速反應(yīng)的影響在OVA氣霧化的過(guò)程中觀察動(dòng)物，并將所記錄的評(píng)論總結(jié)于表8中。試驗(yàn)者沒(méi)有對(duì)處理進(jìn)行盲測(cè)。如表8左欄所示，用NSS氣霧劑激發(fā)的動(dòng)物表現(xiàn)正常且沒(méi)有記錄到呼吸譜或運(yùn)動(dòng)的變化。一般而言，用OVA致敏化和激發(fā)動(dòng)物，用抗組胺劑預(yù)處理的動(dòng)物將不死于過(guò)敏原激發(fā)，但將出現(xiàn)呼吸困難，并時(shí)常地咳嗽和喘息。PBSOVA處理組的所有7只動(dòng)物都出現(xiàn)預(yù)期的可見(jiàn)反應(yīng)。值得注意的發(fā)現(xiàn)是，SCV1OVA和SCV10OVA處理組中沒(méi)有對(duì)OVA氣霧劑作出明顯反應(yīng)的動(dòng)物數(shù)。這些數(shù)據(jù)表明，1ug/kg或10ug/kg的SCV-07預(yù)處理對(duì)過(guò)敏原敏化和激發(fā)的快速過(guò)敏影響具有保護(hù)作用。明顯的推論是SCV-07削弱了由過(guò)敏原激發(fā)引起的快速支氣管收縮。該觀測(cè)結(jié)果明確地預(yù)示了隨后的試驗(yàn)。表8在豚鼠(46只動(dòng)物)的氣霧化過(guò)程中記錄的評(píng)論<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>SCV-07對(duì)OVA-誘導(dǎo)的細(xì)胞向肺浸潤(rùn)的影響利用OVA使所有動(dòng)物致敏化，并測(cè)定SCV-07對(duì)用NSS氣霧劑激發(fā)的動(dòng)物(陰性對(duì)照，無(wú)過(guò)敏反應(yīng))的影響和對(duì)用OVA氣霧劑激發(fā)的動(dòng)物的影響。通過(guò)測(cè)量勻質(zhì)化肺中嗜酸性粒細(xì)胞過(guò)氧化物酶，對(duì)肺組織中的嗜酸性粒細(xì)胞進(jìn)行估測(cè)，并且通過(guò)測(cè)量髓過(guò)氧化物酶對(duì)肺組織中的嗜中性粒細(xì)胞進(jìn)行估測(cè)(圖4)。本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室和其他實(shí)驗(yàn)室之前的研究已證實(shí)這些測(cè)量值可用于估測(cè)組織中的炎性細(xì)胞。此外，本發(fā)明人測(cè)定了氣道中存在的白細(xì)胞的數(shù)量和類(lèi)型，即BAL細(xì)胞(圖5-6)。SCV-07對(duì)肺中固有細(xì)胞的影響首先采用ANOVA的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與僅用NSS氣霧劑激發(fā)的對(duì)照動(dòng)物(n=24)對(duì)比，以確定SCV-07是否對(duì)肺組織或氣道中的固有嗜酸性粒細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞具有顯著影響。如圖4所示，1ug/kgSCV-07顯著降低了用NSS氣霧劑激發(fā)的動(dòng)物的MPO，10ug/kgSCV-07顯著降低了EPO(*與PBSNSS對(duì)照相比，p<0.05)。這些數(shù)據(jù)表明，SCV-07處理顯著降低了肺組織中固有嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)量(圖4)。然而，在用NSS激發(fā)的對(duì)照動(dòng)物的BAL中，SCV-07沒(méi)有對(duì)細(xì)胞組成造成顯著影響(圖5，NSS)。SCV-07對(duì)OVA-誘導(dǎo)的細(xì)胞浸潤(rùn)的影響如圖4和5所示，ANOVA分析表明OVA對(duì)肺EPO和所有BAL細(xì)胞類(lèi)型具有顯著的整體效果。利用OVA激發(fā)，肺MPO沒(méi)有顯著增加，這與本發(fā)明人之前的結(jié)果一致。由于利用SV-07處理改變了固有嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，本發(fā)明人進(jìn)行ANOVA對(duì)比檢驗(yàn)(從PBSNSS到PBSOVA的變化)vs(從SCV1NSS到SCV1OVA的變化)(從PBSNSS到PBSOVA的變化)vs(從SCV10NSS到SCV10OVA的變化)如圖4所示，利用10ug/kgSCV-07處理后肺EPO的變化大于用PBS處理后的變化(#)。肺MPO的變化沒(méi)有隨SCV-07處理而改變。就BAL細(xì)胞而言，BAL嗜中性粒細(xì)胞的變化隨SCV-07處理而改變。這些區(qū)別在某種程度上是由于SCV-07處理后固有嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的減少造成的。用百分?jǐn)?shù)表示的細(xì)胞分類(lèi)也示于圖6A-6C中，以與在小鼠哮喘模型(SciClonedoc43-10718)中的SCV-07研究進(jìn)行比較。在用OVA氣霧劑激發(fā)的SCV-07處理的動(dòng)物中，BAL中嗜酸性粒細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)有減少的趨勢(shì)(圖6A)。然而，BAL中嗜酸性粒細(xì)胞的總數(shù)沒(méi)有改變(圖5B)。SCV-07對(duì)OVA-誘導(dǎo)的肺損傷和/或微血管滲透性變化的影響已知過(guò)敏原激發(fā)引起肺中微血管滲透性的增加并可引起紅細(xì)胞向氣道中滲漏的肺損傷。這些事件中的任一個(gè)都可能由于血漿蛋白或間質(zhì)液向氣道的滲漏而引起B(yǎng)AL中蛋白含量提高。通過(guò)測(cè)定BAL中RBC(圖7A-7B)和BAL液體中的總蛋白含量(圖7C)評(píng)估肺損傷和/或微血管滲透性的變化。通過(guò)裂解細(xì)胞沉淀并測(cè)定所釋放血紅蛋白的00412來(lái)估測(cè)BAL中的RBC數(shù)量(圖7A)。此外，還測(cè)定了BAL上清液中的OD^以估測(cè)在灌洗前或灌洗過(guò)程中以及重懸細(xì)胞以進(jìn)行計(jì)數(shù)前被裂解的RBC數(shù)量(圖7B)。從圖7可以看出，用PBS處理的動(dòng)物的OVA激發(fā)顯著提高了BAL中RBC的數(shù)量以及BAL中的總蛋白量。從NSS到OVA的變化的ANOVA對(duì)比表明，1ug/kg或10ug/kgSCV-07都顯著消減BAL中RBC的數(shù)量(#，圖7A)。此外，SCV-07還顯著降低了BAL上清液的OD412，這表明在收集灌洗液的過(guò)程中被裂解的RBC顯著減少^，圖7B)。SCV-07處理沒(méi)有使BAL液體中的總蛋白受到影響(圖7C)。SCV-07對(duì)血清OVA-特異性IgG1抗體的影響參與豚鼠肺過(guò)敏反應(yīng)的肥大細(xì)胞致敏抗體包括IgE和IgGl抗體二者。在沒(méi)有佐劑存在的情況下用OVA致敏的豚鼠主要產(chǎn)生OVA特異性IgG1抗體。本實(shí)驗(yàn)室之前的研究已經(jīng)確定，在本研究中用于致敏動(dòng)物的方法不可能引起OVA特異性IgE的產(chǎn)生(Fraseretal.，1995;RegalandFmser，1996)。為了確保SCV-07處理觀察到的任何影響都不是由于所產(chǎn)生的OVA特異性IgG1抗體的改變而引起的，通過(guò)ELISA測(cè)定了血清中的濃度(圖8)。由于在本研究中所有動(dòng)物都用OVA致敏化，在所有組中都可以測(cè)到OVA特異性IgG1抗體。SCV-07處理或OVA激發(fā)都沒(méi)有對(duì)OVA特異性IgG1抗體在血清中的濃度造成顯著影響。一般性結(jié)論和討論哮喘的控制是重要的衛(wèi)生保健問(wèn)題最近的研究清楚地表明，利用目前的藥物并不能對(duì)多數(shù)哮喘癥進(jìn)行很好地控制?，F(xiàn)實(shí)世界哮喘控制和治療的評(píng)價(jià)(RealworldEvaluationofAsthmaControlandTreatment,REACT)研究表明，未受控制的哮喘非常普遍。他們的結(jié)果證明，55%使用標(biāo)準(zhǔn)哮喘藥的患者患有未受控制的哮喘。盡管這些患者中的絕大多數(shù)都進(jìn)行了健康護(hù)理，但仍發(fā)生未受控制的哮喘(Petersetal.,2007)。還不清楚這種對(duì)哮喘控制的缺乏是否是由于沒(méi)有按照最佳方案使用現(xiàn)有藥劑，或者由于現(xiàn)有藥劑在許多哮喘患者中沒(méi)有靶向正確的介體和/或事件的事實(shí)。因此，仍需要新型的哮喘療法，不論其靶向?qū)^(guò)敏原的快速反應(yīng)還是靶向由接觸過(guò)敏原產(chǎn)生的更多慢性炎性作用。當(dāng)然，有證據(jù)表明，在快速過(guò)敏反應(yīng)中釋放的介體可以引發(fā)導(dǎo)致炎性疾病的更多慢性作用的事件(Paul，1999)。本研究在豚鼠模型中的主要發(fā)現(xiàn)快速過(guò)敏反應(yīng)觀察到對(duì)豚鼠的SCV-07治療使見(jiàn)于OVA氣霧劑激發(fā)的快速過(guò)敏反應(yīng)過(guò)程中的動(dòng)物咳嗽、呼吸困難和一般疼痛減少。之前關(guān)于小鼠模型的研究并沒(méi)有報(bào)道關(guān)于與氣霧劑過(guò)敏原激發(fā)過(guò)程中的快速過(guò)敏反應(yīng)的任何發(fā)現(xiàn)。通常，與豚鼠相比，對(duì)過(guò)敏原激發(fā)作出應(yīng)答的小鼠的肺功能變化很小，并且小鼠不需要抗組胺劑預(yù)處理來(lái)防止快速過(guò)敏反應(yīng)過(guò)程中的死亡。本發(fā)明人關(guān)于SCV-07對(duì)豚鼠模型中快速反應(yīng)的作用的觀察結(jié)果表明，SCV-07對(duì)過(guò)敏性疾病具有在臨床上非常有用的特性。應(yīng)該進(jìn)一步研究SCV-07治療對(duì)皮膚和肺中的快速過(guò)敏反應(yīng)的效用。過(guò)敏性肺部炎癥豚鼠對(duì)過(guò)敏原致敏化和激發(fā)做出響應(yīng)，在過(guò)敏原激發(fā)后24小時(shí)內(nèi)炎性細(xì)胞向肺浸潤(rùn)。檢測(cè)總細(xì)胞數(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)，5天的SCV-07預(yù)治療沒(méi)有抑制嗜酸性粒細(xì)胞向豚鼠肺部的浸潤(rùn)的改變(圖5)。SCV-07傾向于降低過(guò)敏原激發(fā)后BAL中集聚的嗜酸性粒細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(圖6)。然而，這種降低沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性。氣道中細(xì)胞類(lèi)型的百分?jǐn)?shù)具有臨床重要性還是氣道中細(xì)胞類(lèi)型的總數(shù)是進(jìn)行評(píng)價(jià)的重要變量尚存在爭(zhēng)論。對(duì)這二者中的任一個(gè)進(jìn)行的評(píng)價(jià)都得到相同的結(jié)論(圖5-6)。SCV-07治療并沒(méi)有明顯抑制過(guò)敏原誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞向豚鼠肺的浸潤(rùn)。然而，SCV-07治療明顯降低了對(duì)照動(dòng)物的肺總EPO和MPO，這表明所述化合物影響正常狀態(tài)的肺中的固有嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)量。在這一發(fā)現(xiàn)之后需要對(duì)不同處理組豚鼠的肺進(jìn)行組織病理學(xué)檢查以確定單獨(dú)的SCV-07處理是否改變固有細(xì)胞的數(shù)量。之前用SCV-07在過(guò)敏和哮喘模型系統(tǒng)中的研究有限。本發(fā)明人回顧了在小鼠哮喘模型中對(duì)SCV-07的研究(SciCloneDoc43-10718)。在所述小鼠研究中，利用OVA對(duì)兩組不同年齡的小鼠進(jìn)行致敏化和激發(fā)，并報(bào)道了細(xì)胞浸潤(rùn)。在兩組不同年齡的小鼠中進(jìn)行研究的基本原理并不清楚。在本發(fā)明利用豚鼠的研究中，僅對(duì)一個(gè)年齡組進(jìn)行了評(píng)價(jià)。本發(fā)明人使用200-350g雌性豚鼠，這是因?yàn)榇饲鞍l(fā)明人在年幼和成年、雄性和雌性豚鼠中的研究表明該性別和年齡的動(dòng)物恒定地產(chǎn)生強(qiáng)的過(guò)敏性肺部炎癥(Regaletal.,2006)。這些動(dòng)物在研究過(guò)程中積極生長(zhǎng)，并且該體重范圍內(nèi)的動(dòng)物通常用于豚鼠過(guò)敏性炎癥模型。在所報(bào)道的小鼠研究中，報(bào)道了6-8周小鼠的BAL中嗜酸性粒細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)的降低適度，且總細(xì)胞數(shù)沒(méi)有變化。在18-20周齡動(dòng)物中，利用SCV處理沒(méi)有觀察到細(xì)胞類(lèi)型百分?jǐn)?shù)的變化，但SCV-07使18-20周齡動(dòng)物BAL中的總嗜酸性粒細(xì)胞減少。在所述小鼠研究中，沒(méi)有報(bào)道來(lái)自未致敏動(dòng)物或被致敏但未用氣霧劑OVA激發(fā)的動(dòng)物的BAL的細(xì)胞分類(lèi)或細(xì)胞總數(shù)。正常的豚鼠在肺中具有固有的嗜酸性粒細(xì)胞群，然而在正常小鼠肺中嗜酸性粒細(xì)胞并非如此明顯。在本發(fā)明人的研究中，由于SCV-07處理對(duì)基線EPO和MPO測(cè)量的影響，利用適當(dāng)?shù)膶?duì)照肽預(yù)處理組對(duì)NSS和OVA氣霧劑間變量的改變進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析是重要的。對(duì)于小鼠數(shù)據(jù)無(wú)此類(lèi)比較可獲得。肺損傷或微血管滲透性的變化豚鼠肺中的嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)伴隨著24小時(shí)后BAL中紅細(xì)胞數(shù)量的增加。很明顯，SCV-07顯著抑制了該事件(圖7)。根據(jù)本發(fā)明人的研究設(shè)計(jì)不能確定這反映了觀察到的動(dòng)物快速過(guò)敏反應(yīng)的削弱(最初5分鐘)，還是反映了在快速反應(yīng)后且在最初24小時(shí)內(nèi)肺中發(fā)生的損傷。然而，SCV-07處理后BAL中RBC數(shù)量的明顯差異表明，所述化合物具有非常明顯的保護(hù)作用。該保護(hù)作用具有非常重要的臨床意義，應(yīng)該在其后進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)。體液免疫反應(yīng)在利用OVA起始致敏后17天開(kāi)始SCV-07治療，這樣初次免疫應(yīng)答不可能受到肽處理的影響。過(guò)敏原激發(fā)后，在灌洗時(shí)測(cè)定OVA特異性IgG1的血清濃度。與期望相同，處理組中IgG1的血清水平?jīng)]有顯著差異。這表明，在過(guò)敏反應(yīng)中觀察到的任何變化都不可能是由介導(dǎo)該應(yīng)答的親細(xì)胞抗體的可用性差異導(dǎo)致的。這在某種程度上與小鼠研究不同，在小鼠研究中，在用SCV-07處理的小鼠中觀察對(duì)OVA-特異性IgE的小但顯著的作用。然而在小鼠模型中SCV-07處理不同，其在第二次致敏注射OVA加氫氧化鋁(alum)后僅一天即開(kāi)始。研究的優(yōu)勢(shì)和局限性豚鼠過(guò)敏性肺部炎癥模型是否反映了人哮喘癥一直備受爭(zhēng)議。豚鼠模型的優(yōu)點(diǎn)在于易于發(fā)生嗜酸性粒細(xì)胞向肺部的浸潤(rùn)。另外，豚鼠易于在沒(méi)有佐劑的情況下產(chǎn)生針對(duì)OVA的抗體。缺點(diǎn)在于豚鼠不像人那樣易于產(chǎn)生IgE抗體，而是產(chǎn)生親細(xì)胞的IgGl抗體。與人一樣，豚鼠對(duì)過(guò)敏原激發(fā)產(chǎn)生明顯的快速支氣管收縮反應(yīng)，而該反應(yīng)在小鼠模型中很小且持續(xù)時(shí)間短。此外，本發(fā)明人的模型中，必須用抗組胺劑對(duì)豚鼠進(jìn)行預(yù)處理，否則在5分鐘氣霧劑處理過(guò)程中會(huì)有高達(dá)50%的豚鼠死亡。因此，該額外的藥物處理可能使解釋復(fù)雜化。EPO和MPO的測(cè)量分別提供了肺葉中總嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的圖譜，但沒(méi)有提供關(guān)于這些細(xì)胞位置的信息。隨后的組織病理學(xué)觀察對(duì)于檢測(cè)炎性細(xì)胞的位置并確認(rèn)所述生化結(jié)果是必要的。在快速反應(yīng)過(guò)程中記錄的評(píng)論表明，SCV-07保護(hù)動(dòng)物使其不產(chǎn)生由于接觸過(guò)敏原而導(dǎo)致的快速支氣管收縮反應(yīng)。不過(guò)，在這一令人感興趣的觀察結(jié)果之后需要進(jìn)行肺功能測(cè)量。結(jié)論在該有效的哮喘豚鼠模型中，SCV-07顯示出降低快速過(guò)敏反應(yīng)和隨后的肺損傷的功效，但對(duì)于阻止炎性細(xì)胞向過(guò)敏性肺部的浸潤(rùn)無(wú)效。進(jìn)一步的研究應(yīng)檢測(cè)SCV-07抑制過(guò)敏原誘導(dǎo)的支氣管收縮的能力。此外，基于SCV-07對(duì)肺損傷的保護(hù)作用，應(yīng)當(dāng)評(píng)價(jià)其對(duì)在皮膚和肺中阻止過(guò)敏原誘導(dǎo)的微血管滲透性變化以及肥大細(xì)胞介體釋放變化的能力。參考文獻(xiàn)FraserDG，RegalJF,andArndtML:Trimelliticanhydride-inducedallergicresponseinthelung:Roleofthecomplementsystemincellularchanges.J.PharmacolexpTher273:793-謝，1995.FraserDG，GrazianoFM,LarsenCPandRegalJF:TheroleofIgGIandlgG2intrimelliticanhydride-inducedallergicresponseintheguineapiglung.ToxicologyandAppliedPharmacology150:218-227,1998.LarsenCPandRegalJF:Trimelliticanhydride-inducedcellularinfiltrationintoguineapiglungvarieswithagebutnotgender,lntArch.AllergyImmunol127:63-72，2002.LowryOJ，RosebroughNJ,FairAL，RandallPJ:ProteinmeasurementwiththeFolinphenolreagent.JBiolChem1951;193:265-275.PaulWE:FundamentalImmunology,4thedition,1999.Lippincott-RavenPublishers,Philadelphia.PetersSP,JonesCA,HaselkomT，MinkDR，ValacerDJ，andWeissST:national^Web-basedsurvey.JAllergyClinImmunol119:1454-1461,2007.RegalJFandFraserDG:Systemiccomplementsystemdepletiondoesnotinhibitcellularaccumulationinantihistaminepretreatedallergicguineapiglung，lntArchAllergyImmunol109:150-160,1996.RegalJF，F(xiàn)raserDG，WeeksCD,GreenbergNA:Dietaryphytoestrogenshaveantiinflammatoryactivityinaguineapigmodelofasthma.PSEBM223:372-378，2000.RegalJF，RegalRR，MeehanJL,MohrmanME:Primarypreventionofasthma:Ageandsexinfluencesensitivitytoallergen-inducedairwayinflammationandcontributetoasthmaheterogeneityinguineapigs,lntArchAllergyImmunol141:241-256,2006.權(quán)利要求1.用于治療、預(yù)防、抑制或減輕受試者的過(guò)敏性疾病或其影響的治療方法，其包括向所述受試者施用有效量的式A的免疫調(diào)節(jié)劑化合物，其中，n是1或2，R是氫、?；?、烷基或肽片段，且X是芳族氨基酸或雜環(huán)氨基酸或其衍生物。2.如權(quán)利要求1所述的方法，3.如權(quán)利要求1所述的方法，4.如權(quán)利要求1所述的方法，5.如權(quán)利要求4所述的方法，6.如權(quán)利要求1所述的方法，所述化合物。7.如權(quán)利要求1所述的方法，述化合物。8.如權(quán)利要求1所述的方法，劑量施用所述化合物。9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中以約0.001-lmg/kg受試者體重的劑量施用所述化合物。10.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述化合物為SCV-07。11.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述化合物為SCV-07。12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中SCV-07的施用是以等滲溶液形式通過(guò)腸胃外給予日劑量為約0.01-lmgY-D-谷氨酰-L-色氨酸而實(shí)現(xiàn)。13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中以至多約1.5mg的日劑量經(jīng)口施用SCV-07。14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在約5-14天的療程中每天一次施用SCV-07。全文摘要本發(fā)明涉及治療、預(yù)防、抑制或減輕受試者的過(guò)敏性疾病或其影響的方法，其包括向所述受試者施用有效量的包含芳族氨基酸殘基或雜環(huán)氨基酸殘基或其衍生物的免疫調(diào)節(jié)劑化合物。優(yōu)選地，所述免疫調(diào)節(jié)劑化合物為包含D-色氨酸殘基或L-色氨酸殘基的二肽。文檔編號(hào)A61K38/00GK101678069SQ200880016455公開(kāi)日2010年3月24日申請(qǐng)日期2008年5月13日優(yōu)先權(quán)日2007年5月17日發(fā)明者亞歷山大·A·科洛博夫,安德雷·S·辛比爾采夫申請(qǐng)人:?？她堉扑幑?