來自非哺乳動(dòng)物組織的脫細(xì)胞化的生物材料的制作方法
【專利說明】來自非哺乳動(dòng)物組織的脫細(xì)胞化的生物材料
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)根據(jù)35USC § 119 (e)要求于2013年1月9日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng) 61/750, 555的權(quán)益，其全部內(nèi)容通過引用以其整體并入本文。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 正在進(jìn)行組織工程學(xué)努力以產(chǎn)生用于替代生物學(xué)功能，通常是修復(fù)或替代整個(gè)組 織或其一部分的方法和材料。在這點(diǎn)上，傷口處理和皮膚修復(fù)是主要關(guān)注的領(lǐng)域，因?yàn)橛捎?疾病或損傷造成的皮膚完整性的損失可導(dǎo)致慢性的危及生命的并發(fā)癥。
[0005] 傷口愈合涉及細(xì)胞、生長因子和胞外基質(zhì)（ECM)成分之間復(fù)雜的相互作用，以在 損傷后重構(gòu)組織。已經(jīng)很好地表征了成年哺乳動(dòng)物組織中的傷口愈合過程，其可以被分為 三個(gè)階段-炎癥、增殖和重塑。
[0006] 通常，響應(yīng)于切口或創(chuàng)傷，身體輸送血液、血液制品以及蛋白質(zhì)到傷口處形成的空 隙（void)(也稱為腔或負(fù)空間（negative space))中。在早期的炎癥期間，在炎癥介質(zhì)的 影響下以及由于血管舒張，傷口滲出物開始形成。存在于凝結(jié)血液中的血纖蛋白和纖連蛋 白提供骨架（scaffold)，在該骨架之上，細(xì)胞（例如角質(zhì)形成細(xì)胞、血小板和白細(xì)胞）迀移 到傷口部位。吞噬并除去細(xì)菌和碎片，并且釋放出刺激成纖維細(xì)胞迀移和分裂的生長因子。
[0007] 隨后的傷口愈合階段涉及隨著稱為肉芽組織（由成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和新血管 構(gòu)成）的纖維結(jié)締組織替代血纖蛋白凝塊，新組織形成。在這個(gè)階段期間，新血管形成，成 纖維細(xì)胞增殖并通過分泌膠原蛋白和纖連蛋白產(chǎn)生臨時(shí)ECM。幾乎所有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞都 需要粘附到表面以使得增殖并正確地發(fā)揮功能。ECM實(shí)現(xiàn)了這一功能。最初，臨時(shí)ECM包 含III型膠原蛋白（一種迅速產(chǎn)生的較弱形式的膠原蛋白）的網(wǎng)絡(luò)。隨后其被更強(qiáng)的I型 膠原蛋白（其有助于瘢痕形成）所替代。與此同時(shí)，發(fā)生表皮的再上皮化。在此過程中，上 皮細(xì)胞增殖并由于在迀移細(xì)胞前緣的蛋白酶（例如金屬蛋白酶（MMP))和膠原酶幫助侵入 凝塊而迀移到新形成的組織之上。除了生長因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（細(xì)胞-細(xì)胞相互作用）和細(xì) 胞-ECM相互作用（來自細(xì)胞、整合素（細(xì)胞表面受體）、層粘連蛋白、膠原蛋白、纖連蛋白和 其他ECM蛋白質(zhì)之間相互作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)），這些酶還刺激細(xì)胞迀移進(jìn)入傷口以及ECM降 解。
[0008] 最后，在重塑階段中，膠原蛋白被重塑并沿著張力線（tension line)重新排列，并 且通過凋亡除去不再需要的細(xì)胞。隨著成纖維細(xì)胞通過其與ECM蛋白和生長因子的相互作 用轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，發(fā)生傷口收縮。然后，肌成纖維細(xì)胞與膠原蛋白、玻連蛋白和其他 ECM蛋白相互作用以收縮傷口。隨著重塑階段的進(jìn)行，纖連蛋白和透明質(zhì)酸被向組織提供強(qiáng) 度的膠原蛋白束所替代。
[0009] 通過對(duì)組織修復(fù)和再生應(yīng)用生物學(xué)、化學(xué)和工程學(xué)的原理，組織工程師們已經(jīng)開 發(fā)出用于促進(jìn)組織修復(fù)和再生過程的可移植產(chǎn)品。恢復(fù)受損組織的生物力學(xué)功能的能力提 出了真正的挑戰(zhàn)。作為回應(yīng)，已經(jīng)開發(fā)出模擬（在一定程度上）組織結(jié)構(gòu)和機(jī)械特性的合 成和生物學(xué)骨架產(chǎn)品兩者以促進(jìn)組織修復(fù)。對(duì)于受損的、病變的或缺失的組織，這樣的產(chǎn)品 充當(dāng)機(jī)械上和功能上的臨時(shí)替代物。
[0010] 理想地，可移植骨架產(chǎn)品應(yīng)支持細(xì)胞粘附、增殖和分化，并在新的組織形成之前作 為細(xì)胞臨時(shí)的合成胞外基質(zhì)（ECM)起作用。骨架材料應(yīng)為生物相容的、生物可降解的且表 現(xiàn)出低的抗原性。植入物應(yīng)該以與新組織形成大致相等的速率降解。一旦被植入，骨架必 須具有臨時(shí)提供結(jié)構(gòu)支持所必需的機(jī)械性能，直到形成新的組織。此外，骨架產(chǎn)品必須是 多孔的，從而為營養(yǎng)物傳輸和組織向內(nèi)生長提供合適的路徑。組織骨架還應(yīng)促進(jìn)快速愈合 并促進(jìn)在外觀和功能上均類似于正常宿主組織之新組織的發(fā)育或再生。為此，植入的骨架 產(chǎn)品應(yīng)該提供（i)生物活性刺激，例如，蛋白質(zhì)和分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以促進(jìn)細(xì)胞迀移、增殖和分 化，和（ii)用于這些過程的機(jī)械或結(jié)構(gòu)支持。
[0011] 現(xiàn)今，合成骨架的開發(fā)是一個(gè)活躍的研究領(lǐng)域。已由化合物（例如纖維狀聚合物、 明膠、磷灰石、和聚合物/陶瓷復(fù)合物、聚乳酸、膠原蛋白）制造了合成骨架。這些骨架被設(shè) 計(jì)為模擬天然存在的ECM的結(jié)構(gòu)并在骨組織工程方面顯示出一些成功。
[0012] 除了合成骨架產(chǎn)品之外，獲自哺乳動(dòng)物組織的生物學(xué)骨架是市售的，其可用作同 種異體移植物（來自相同物種供體的移植細(xì)胞或組織）或異種移植物（來自不同物種供體 的移植細(xì)胞或組織）。生物學(xué)骨架由哺乳動(dòng)物ECM構(gòu)成，所述哺乳動(dòng)物ECM是從例如多種 哺乳動(dòng)物包括人（活體供者或尸體）、豬、牛和馬的真皮、膀胱、小腸、間皮、心包、骨或羊膜 (aminiotic membrane)中收獲的。這些市售產(chǎn)品通常用于修復(fù)和重建受損的或缺失的組織 和器官，例如軟組織、腱、心臟組織、神經(jīng)組織、慢性傷口、硬腦膜、骨和角膜。
[0013] 除了由組織產(chǎn)生并進(jìn)行脫細(xì)胞化過程的胞外基質(zhì)，生物學(xué)骨架產(chǎn)品還可包含皮膚 細(xì)胞。其與傷口部位接觸以對(duì)作為傷口愈合過程一部分的細(xì)胞迀移和增殖提供機(jī)械支持。 此外，也可提供促進(jìn)傷口愈合過程的因子，例如生長因子或其他蛋白質(zhì)。認(rèn)為生物學(xué)骨架的 機(jī)械和材料性能以及宿主組織對(duì)這些生物材料的響應(yīng)受到材料的三維構(gòu)型和生產(chǎn)加工方 法的影響。還認(rèn)為生長因子、表面配體的表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和分布以及宿主先天免疫應(yīng)答的調(diào) 節(jié)都有助于用于組織修復(fù)或重建的生物學(xué)骨架的最終功能表現(xiàn)。Tottey等，Biomaterials 32 :128-36(2011) 〇
[0014] 在移植中使用人羊膜（AM)具有特別的優(yōu)勢，原因是其相對(duì)厚的基膜結(jié)構(gòu)，相關(guān) 的失活（devitalize)羊膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)以及相應(yīng)的生長因子譜和結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組成。 Meller 等，DtschArztebl Int' 1108:243-8(2011)。例如，AM 包含表皮生長因子（EGF) 和角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子（KGF)，這是用于促進(jìn)傷口愈合的重要生長因子。此外，存在于AM 中的層粘連蛋白和VII型膠原蛋白引起趨上皮效應(yīng)。AM也被認(rèn)為降低多種生長因子和促炎 性細(xì)胞因子的表達(dá)，同時(shí)釋放抗炎性細(xì)胞因子（例如IL-10、IL-1受體拮抗劑），從而調(diào)節(jié) 對(duì)于傷口愈合有利的炎癥反應(yīng)。AM是免疫豁免的（immumoprivileged)，而且，有可能由于 低的MHC I表達(dá)，所以AM組織的排斥是罕見的。這些特征使得AM成為例如關(guān)于眼表重建、 骨盆重建以及在潰瘍的治療，尤其是傷口愈合應(yīng)用中的理想基材（substrate)。
[0015] 然而，常規(guī)的組織骨架產(chǎn)品的使用也并不是沒有缺點(diǎn)。從人供體收獲的組織可產(chǎn) 生不希望的后果，例如與用于捐獻(xiàn)之皮膚的移除相關(guān)的供體部位的發(fā)病或感染。疾病傳播 風(fēng)險(xiǎn)和樣品間的變化是與生物學(xué)骨架產(chǎn)品相關(guān)的另外的缺點(diǎn)。此外，可能難以獲得覆蓋大 面積受損組織所必需的充分的組織成分。另外，常規(guī)的生物學(xué)材料和合成材料可能成本昂 貴，在許多情況下沒有效果并且可用性有限。
[0016] 因此，持續(xù)需要在移植中使用的合適的組織基材生物材料以促進(jìn)組織再生，同時(shí) 恢復(fù)功能。研究行業(yè)和醫(yī)學(xué)移植界兩者都將受益于這樣的產(chǎn)品，這樣的產(chǎn)品易于獲得，不對(duì) 供體或接受者造成額外的并發(fā)癥（例如需要額外的手術(shù)來收獲基材），并表現(xiàn)出反映自然 組織之生理化學(xué)、電化學(xué)和生物化學(xué)特性的所有或一些固有材料功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017] 本發(fā)明的生物材料是從有尾目動(dòng)物（urodele)的組織獲得的。"有尾目動(dòng) 物"在這里表示兩棲綱中的有尾目（order Urodela)(也稱為order Caudata)的蠑 觸（salamander)。按照系統(tǒng)發(fā)生，相關(guān)的科包括鈍口觸科（Ambystomatidae)、隱鮑 銳科（Cryptobranchidae)、兩棲銳科（Amphiumidae)、洞觸科（Proteidae)和暢觸科 (Sirenidae)。參見Wiens等，Syst. Biol. 54 :91-110 (2005)，其內(nèi)容通過引用以其整體并 入全文。因此，有尾目動(dòng)物種類包括，例如，太平洋大鯢（Pacific Giant Salamander)(中 國大鯢（Andrias davidianus))、虎紋鈍口觸（Ambystoma tigrinum)以及墨西哥鈍口觸 (Ambystoma mexicanum)。本發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)識(shí)到有尾目動(dòng)物的皮膚和ECM具有類似于AM特 征的所期望的特征，這使得它們成為用于異種移植之生物材料的一種理想來源。
[0018] 有尾目動(dòng)物ECM和組織再生
[0019] 作為兩棲動(dòng)物，大多數(shù)有尾目動(dòng)物在幼體狀態(tài)以水生動(dòng)物開始生活，并經(jīng)歷從具 有鰓的幼年形式到具有肺的陸生的呼吸空氣的成體形式的變態(tài)。在變態(tài)過程中，有尾目動(dòng) 物的身體特征改變以準(zhǔn)備在陸地上生活。這些改變包括尾鰭的再吸收、皮膚的增厚、真皮腺 體的發(fā)育和鰓的吸收。在此期間在大多數(shù)有尾目動(dòng)物中也發(fā)生性成熟。一些科的有尾目動(dòng) 物是"幼態(tài)持續(xù)的"，這意味著，這樣科中的個(gè)體可表現(xiàn)出幼體特征，例如鰓和鰭，甚至是在 達(dá)到性成熟后亦如此。事實(shí)上，幼態(tài)持續(xù)的有尾目動(dòng)物在其生命的整個(gè)時(shí)期內(nèi)往往保留其 水生的（幼體的）形式。因此，墨西哥蠑螈（Mexican Axolotl)通常在其整個(gè)成體生活中 保持幼態(tài)持續(xù)狀態(tài)，但是，在某些情況下，其可經(jīng)歷變態(tài)并轉(zhuǎn)變成陸生形式。
[0020] 蠑螈還因其再生切斷的身體部位的能力而聞名，這通常導(dǎo)致受損肢體或器官的結(jié) 構(gòu)和功能兩者的完全恢復(fù)。水生蠑螈在傷口愈合和肢體再生期間（這兩者都是無瘢痕過程 (scar-less process))經(jīng)歷迅速的再上皮化。類似地，變態(tài)的陸生蠑觸保留許多幼體的皮 膚特征，并且還表現(xiàn)出無瘢痕的傷口愈合，盡管愈合速率比其水生的預(yù)變態(tài)的對(duì)應(yīng)體要慢。
[0021] 在蠑螈中的愈合過程與在成年哺乳動(dòng)物中觀察到的不同。蠑螈的過程更類似于胎 兒和胚胎傷口的無瘢痕愈合過程。因此，這樣的傷口也表現(xiàn)出以比出生后的哺乳動(dòng)物的相 應(yīng)事件以更快的速率（是"增強(qiáng)的"）發(fā)生的再上皮化和基膜再形成（reformation)。
[0022] 此外，就蠑螈的皮膚由融合的外胚層的中胚層構(gòu)成方面而言，蠑螈的皮膚和皮下 結(jié)構(gòu)類似于羊膜/絨毛膜界面的結(jié)構(gòu)。蠑螈的皮膚也富含生長因子和抗微生物肽，類似于 AM。此外，蠑螈ECM是免疫豁免的，并且尤其包含膠原蛋白III和金屬蛋白酶的組織抑制劑 (??ΜΡ)，也類似于AM。
[0023