刺激毛發(fā)生長或防止毛發(fā)脫落的包括神經(jīng)干細(xì)胞的提取物的組合物及其制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于刺激毛發(fā)生長或防止毛發(fā)脫落的組合物及其制備方法，所述組合物含有神經(jīng)干細(xì)胞的提取物。更具體地，本發(fā)明涉及外胚層神經(jīng)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基或外胚層神經(jīng)干細(xì)胞的提取物的新用途，以及一種用于刺激毛發(fā)生長或防止毛發(fā)脫落的組合物，其中包含從人腦的腦室區(qū)分離的經(jīng)培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)的條件培養(yǎng)基或提取物。
【背景技術(shù)】
[0002]毛發(fā)遵循特定的毛發(fā)周期。將毛乳頭周圍的角質(zhì)細(xì)胞分裂和增殖的階段稱為“生長期”。生長期之后是退行期，其中毛發(fā)停止其生長并從毛乳頭分離。退行期后是休止期，其中角質(zhì)細(xì)胞不生長并且在一段時(shí)間后毛發(fā)會(huì)脫落。毛發(fā)周期由重復(fù)的生長期、退行期和休止期組成。成人的生長期通常因個(gè)體而不同，但已知的是，男性生長期為3-5年而女性為4-6年，并且約15%的毛發(fā)處于退行期和休止期。人類毛發(fā)遵循獨(dú)立的毛發(fā)周期，并在一側(cè)生長而會(huì)在另一側(cè)脫落，使得毛發(fā)的總數(shù)保持相同數(shù)量。此毛發(fā)脫落被稱為生理性毛發(fā)脫落。然而，除了正常的毛發(fā)周期的休止期以外，疾病、毛發(fā)護(hù)理產(chǎn)品(凝膠，蠟等)、壓力等可引起毛發(fā)脫落，并且在這種情況下，當(dāng)原因被去除時(shí)，毛發(fā)再次恢復(fù)生長。
[0003]禿頭并不意味著毛發(fā)脫落后不再生長。在禿頭的情況下，毛發(fā)逐漸變得更薄，并轉(zhuǎn)變成毫毛。隨著這種現(xiàn)象發(fā)展，在發(fā)根的毛乳頭變小。當(dāng)毛乳頭變小時(shí)，毛發(fā)的厚度也變薄，并且同時(shí)，毛發(fā)周期變得更短，新生長的毛發(fā)變得更薄。隨著禿發(fā)持續(xù)發(fā)展，毛發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)楹撩?，且毛發(fā)周期變短，使毛發(fā)脫落比生長快。此外，不同于已知是由自身免疫性疾病引起的斑禿，以及由內(nèi)分泌疾病、營養(yǎng)缺乏、藥物、或身體和心理壓力，如生育引起的臨時(shí)性毛發(fā)脫落，禿頭趨于被繼承，并且禿頭程度是多樣的。此外，已知的是禿頭與血液雄性激素(雄激素)相關(guān)聯(lián)。
[0004]目前，已知的是，當(dāng)在毛發(fā)脫落的初始階段使用口服藥物米諾地爾(Minoxidil)和口服藥物保法止(Propecia，非那雄胺成分)時(shí)，毛發(fā)脫落的進(jìn)展可以有一定延遲。然而，已經(jīng)發(fā)展到毛發(fā)脫落階段的毛發(fā)難以恢復(fù)到正常狀態(tài)，并且在這種情況下，可以考慮毛發(fā)移植。在毛發(fā)移植中，通過切口法或從耳部以上的側(cè)毛發(fā)和背部毛發(fā)(非切口法)收集約1000-3000根毛發(fā)，它們對激素較不敏感，并且移植所收集的毛發(fā)。然而，毛發(fā)移植的數(shù)量是有限的。
[0005]已知目前市售產(chǎn)品對防止毛發(fā)脫落起作用，但對毛發(fā)生長的效果不顯著。另外，當(dāng)停止使用這些產(chǎn)品時(shí)，問題再次出現(xiàn)。此外，這些產(chǎn)品是在成本方面有劣勢。
[0006]在最近幾年，已經(jīng)開發(fā)出利用干細(xì)胞，采用治療毛發(fā)脫落的基因和方法來治療毛發(fā)脫落。在涉及本發(fā)明的背景的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)中，韓國專利號10-0771171 (2007年10月29日授權(quán))公開了一種方法，包括分離并增殖毛囊干細(xì)胞，并允許細(xì)胞分化成毛囊細(xì)胞，以及用于治療禿發(fā)的組合物，并且韓國專利特開公開號10-2008-0097593(2008年11月6日公布)公開了通過適當(dāng)?shù)鼗旌现緛碓吹母杉?xì)胞與毛囊干細(xì)胞來制備的細(xì)胞治療劑。此外，韓國專利號10-1218101 (2013年1月3日授權(quán))公開了用于刺激毛發(fā)生長以及防止毛發(fā)脫落的組合物，它包含羊膜胎兒間充質(zhì)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基作為活性成分。然而，尚未見報(bào)道用于刺激毛發(fā)生長或防止毛發(fā)脫落的組合物，其含有神經(jīng)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基或神經(jīng)干細(xì)胞的提取物，并具有優(yōu)異的效果，。
[0007]因此，本發(fā)明人通過應(yīng)用人毛乳頭細(xì)胞(hDPC)的條件培養(yǎng)基或提取物，表征了神經(jīng)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基或神經(jīng)干細(xì)胞的提取物，并通過使用C57BL/6小鼠發(fā)現(xiàn)了條件培養(yǎng)基或提取物在體內(nèi)對刺激毛發(fā)生長或防止毛發(fā)脫落的效果，從而完成了本發(fā)明。
[0008][現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)]
[0009][專利文獻(xiàn)]
[0010]專利文獻(xiàn)1:韓國專利號10-0771171 (2007年10月29日)
[0011]專利文獻(xiàn)2:韓國專利公開號10-2008-0097593(2008年11月6日)
[0012]專利文獻(xiàn)3:韓國專利號10-1218101 (2013年1月3日)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于刺激毛發(fā)生長或防止毛發(fā)脫落的組合物，其含有神經(jīng)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基或神經(jīng)干細(xì)胞的提取物。
[0014]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備用于刺激毛發(fā)生長或防止毛發(fā)脫落的組合物的方法，該方法包括使用神經(jīng)干細(xì)胞。
[0015]本發(fā)明這些和其它的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將從以下的詳細(xì)說明、所附的權(quán)利要求書和附圖中變得更加清楚。
【附圖說明】
[0016]圖1示出為測量根據(jù)本發(fā)明的神經(jīng)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和神經(jīng)干細(xì)胞的提取物各自的總蛋白質(zhì)含量所執(zhí)行的Brad-ford測定法的結(jié)果。
[0017]圖2a和2b示出通過WST-1測定法和相差顯微鏡，分析用根據(jù)本發(fā)明的神經(jīng)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和神經(jīng)干細(xì)胞的提取物各自進(jìn)行處理的毛乳頭細(xì)胞的活力和形態(tài)的結(jié)果。
[0018]圖3示出通過WST-1測定法分析用根據(jù)本發(fā)明的神經(jīng)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和神經(jīng)干細(xì)胞的提取物各自進(jìn)行處理的毛乳頭細(xì)胞的增殖的結(jié)果。
[0019]圖4a至4e示出qRT_PCR和RT-PCR的結(jié)果，表明用根據(jù)本發(fā)明的神經(jīng)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和神經(jīng)干細(xì)胞的提取物各自進(jìn)行處理時(shí)，在毛乳頭細(xì)胞中的各種生長因子和細(xì)胞因子(Wnt5a、BMP2、TGF-β 2等)的表達(dá)水平增加。
[0020]圖5a和5b示出qRT_PCR的結(jié)果，表明根據(jù)本發(fā)明的神經(jīng)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和神經(jīng)干細(xì)胞的提取物各自使誘導(dǎo)毛發(fā)周期的生長期的瘦素和細(xì)胞因子Shh(Sonichedgehog)的表達(dá)水平增加。
[0021]圖6a和6b示出qRT_PCR的結(jié)果，表明根據(jù)本發(fā)明的神經(jīng)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和神經(jīng)干細(xì)胞的提取物各自使誘導(dǎo)毛發(fā)周期的退行期的TGF-β 1(轉(zhuǎn)化生長因子β 1)和IL-6的表達(dá)水平被抑制。
[0022]圖7a和7b是照片，示出當(dāng)將根據(jù)本發(fā)明的神經(jīng)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和神經(jīng)干細(xì)胞的提取物各自施用至剃毛小鼠一定時(shí)間后，刺激剃毛小鼠的毛發(fā)生長。
[0023]圖8a至8c示出剃毛小鼠的毛發(fā)長度和重量，表明當(dāng)將根據(jù)本發(fā)明的神經(jīng)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和神經(jīng)干細(xì)胞的提取物各自施用至剃毛小鼠一定時(shí)間后，刺激剃毛小鼠的毛發(fā)生長。
[0024]圖9a和9b示出H&E (蘇木精和曙紅)染色的結(jié)果，表明當(dāng)應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的神經(jīng)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和神經(jīng)干細(xì)胞的提取物每種時(shí)，誘導(dǎo)毛囊的生長。
[0025]圖10a和10b示出免疫組織化學(xué)的結(jié)果，表明當(dāng)將根據(jù)本發(fā)明的神經(jīng)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和神經(jīng)干細(xì)胞的提取物各自施用至剃毛小鼠后，剃毛小鼠的細(xì)胞生長增加。
[0026]圖11示出qRT-PCR的結(jié)果，表明當(dāng)將根據(jù)本發(fā)明的神經(jīng)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和神經(jīng)干細(xì)胞的提取物各自施用至剃毛小鼠后，在剃毛小鼠組織中的毛乳頭細(xì)胞標(biāo)記物堿性磷酸酶(Akp)的表達(dá)增加。
[0027]圖12示出qRT-PCR的結(jié)果，表明當(dāng)將根據(jù)本發(fā)明的神經(jīng)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和神經(jīng)干細(xì)胞的提取物各自施用至剃毛小鼠后，在剃毛小鼠毛囊中的BMP家族(抑制干細(xì)胞分化)的表達(dá)水平降低。
[0028]圖13示出qRT-PCR的結(jié)果，表明當(dāng)將根據(jù)本發(fā)明的神經(jīng)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和神經(jīng)干細(xì)胞的提取物各自施用至剃毛小鼠后，Tmeffl (抑制BMP的表達(dá))的表達(dá)水平和TGF- β 2 (增加Tmeffl的表達(dá))的表達(dá)水平都增加。
[0029]圖14示出免疫組織化學(xué)的結(jié)果，表明當(dāng)將根據(jù)本發(fā)明的神經(jīng)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和神經(jīng)干細(xì)胞的提取物各自施用至剃毛小鼠后，在剃毛小鼠毛囊中由BMP降低所引起的干細(xì)胞(⑶34+)的分化程度。
【具體實(shí)施方式】
[0030]在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種用于刺激毛發(fā)生長或防止毛發(fā)脫落的組合物，其含有神經(jīng)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基或神經(jīng)干細(xì)胞的提取物。
[0031]在本發(fā)