專利名稱：昆蟲病原真菌及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及昆蟲病原真菌及其代謝物，包含所述昆蟲病原真菌或一種或多種其代謝物的組合物和這些昆蟲病原真菌和組合物作為生物控制劑的用途。也提供了使用昆蟲病原真菌球孢白僵菌(Beauveria bassiana)和包含所述真菌或一種或多種其代謝物的組合物用于植物病原昆蟲包括蚜蟲、薊馬、粉虱、粉蚧等等的生物控制的方法。
背景技術(shù)：
由病原體例如昆蟲導(dǎo)致的植物疾病是基于植物的農(nóng)業(yè)和工業(yè)的重要經(jīng)濟(jì)成本。損失可由收獲前后產(chǎn)品的損壞、植物自身的損失或由生長和生產(chǎn)能力的降低而引起。傳統(tǒng)上，通過應(yīng)用化學(xué)農(nóng)藥尋求對植物病原體的控制?；瘜W(xué)試劑的使用存在多個(gè)缺點(diǎn)。隨著時(shí)間的過去，病原體可以并已經(jīng)對化學(xué)試劑產(chǎn)生耐受性，由此導(dǎo)致抗性種群。實(shí)際上，農(nóng)藥抗性是對園藝工業(yè)生產(chǎn)力的最大挑戰(zhàn)。通過許多在生態(tài)學(xué)上重要的植物病原昆蟲具體說明這一問題。據(jù)報(bào)導(dǎo)，世界范圍的西花薊馬種群對大多數(shù)類型的農(nóng)藥具有抗性，包括以下示例高滅磷(acephate)、阿巴美丁(abamectin)、毒死蝶(chlorpyrifos)、硫丹(endosulfan)、滅多蟲(methorny 1) > 滅蟲威(methiocarb)、氧化樂果(omethoate)、定菌磷(pyrazophos)和氟胺氰菊酯 (tau-fluvalinate).新西蘭的洋蔥薊馬種群已經(jīng)對溴氰菊酯(Deltamethrin)產(chǎn)生抗性， 據(jù)報(bào)導(dǎo)地方種群對二嗪農(nóng)(diazinon)和敵敵畏(dichlorvos)具有抗性。據(jù)報(bào)導(dǎo)，美國的洋蔥薊馬對許多農(nóng)藥具有抗性(Grossman，1994)。據(jù)報(bào)導(dǎo)溫室粉虱已對有機(jī)氯、有機(jī)磷酸酯、 氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯殺蟲劑產(chǎn)生抗性(例如Georghiou 1981，Anis&Brennan 1982， Elhag&Horn 1983，Wardlow 1985 和 Hommesl986)。在較新的農(nóng)藥噻嗪酮(buprofezin)和伏蟲隆(teflubenzuron)中也報(bào)導(dǎo)了抗性(Gorman等人2000)?；瘜W(xué)殘留物也會(huì)造成環(huán)境危害和引起健康問題。在近20年中對生物控制例如微生物農(nóng)藥的興趣的復(fù)蘇直接來自由關(guān)注化學(xué)毒性引起的公眾壓力。生物控制提供了控制植物病原體的替代方式，其比現(xiàn)有方法潛在地更有效和具特異性，并且降低對化學(xué)品的依賴性。這些生物控制方法被視為農(nóng)藥的“天然”替代物，并具有更高的公眾接受度、降低的環(huán)境污染和增強(qiáng)的可持續(xù)性的優(yōu)點(diǎn)。生物控制的機(jī)制有多種。一種被證明有效的機(jī)制是使用拮抗性微生物例如細(xì)菌控制植物病原昆蟲。例如，蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)的大規(guī)模生產(chǎn)使此細(xì)菌殺蟲劑能夠用于控制新西蘭奧克蘭的基黃毒蛾(painted apple moth)。有關(guān)成功應(yīng)用昆蟲病原真菌的信息很少，它們的工業(yè)生產(chǎn)仍相對不成熟。在美國、 歐洲、非洲和俄羅斯已經(jīng)開發(fā)了使用蠟蚧霉(Lecanicillium muscarium)(以前被稱為蠟蚧輪枝孢(Verticillium lecanii))，球孢白僵菌和綠僵菌(Metarhizium anisopliae)作為生物控制劑(BCA)的昆蟲病原真菌應(yīng)用。然而，至今沒有一種候選菌被證明是理想的，這可能是由于無法在田間的環(huán)境變異性中迅速定植和/或存活。事實(shí)上，現(xiàn)有的候選菌似乎不能得到大量種植者的認(rèn)可，并可能被視為是不經(jīng)濟(jì)的。在一個(gè)國家中開發(fā)的昆蟲病原真菌對另一個(gè)國家的園藝學(xué)家例如由于管理限制常常是不可得的或者是延遲獲得的，從而使上述情況惡化。此外，許多非本土真菌可能不適于或不能夠在當(dāng)?shù)貤l件下存活或繁盛。 令人驚訝的，本申請人現(xiàn)在鑒定并分離了在任何以前的報(bào)導(dǎo)中均沒有提過作為有效BCA的白僵菌屬菌株。本申請人已確定此物種對控制植物病原昆蟲(包括但不限于薊馬、 蚜蟲和粉虱)高度有效并在田間成功存活和定植。 因此本發(fā)明的目的是提供對植物病原昆蟲的生物控制有用的白僵菌屬菌株，或至少提供給公眾一種有用的選擇。發(fā)明概述由此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供2008年9月23日在澳大利亞國家計(jì)量院(National Measurement Institute of Australia) (NMIA)以保藏號V08/025855保藏的球孢白僵菌真菌菌株K4B3的生物純培養(yǎng)物，或具有其鑒定特征的培養(yǎng)物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了可從本發(fā)明的真菌獲得的孢子。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了如上面定義的至少一種真菌和至少一種載體在制備組合物中的用途。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了來自如上面定義的至少一種真菌的孢子和至少一種載體在制備組合物中的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種真菌為具繁殖活力的形式和量。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含如上面定義的至少一種真菌和至少一種載體的組合物。優(yōu)選地，所述至少一種真菌為具繁殖活力的形式和量。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含可從本發(fā)明的至少一種真菌獲得的孢子和至少一種載體的組合物。優(yōu)選地，所述組合物為生物控制組合物，更優(yōu)選地所述生物控制組合物為昆蟲病
原組合物。優(yōu)選地，所述生物控制組合物包含至少一種農(nóng)業(yè)上可接受的載體。在另一個(gè)方面本發(fā)明提供了包含保藏號V08/025855的球孢白僵菌菌株K4B3的至少一種代謝物和至少一種載體的組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種代謝物為昆蟲病原劑，例如至少一種代謝物為分泌的代謝物，例如分泌的毒素。優(yōu)選地，所述至少一種載體為農(nóng)業(yè)上可接受的載體，更優(yōu)選地，其選自填料刺激劑 (filler stimulant)、抗結(jié)塊劑、濕潤劑、乳化劑和抗氧化劑，更優(yōu)選地所述組合物包含填料刺激劑、抗結(jié)塊劑、濕潤劑、乳化劑和抗氧化劑各至少一種。優(yōu)選地，所述填料刺激劑為碳水化合物來源，例如二糖，包括例如蔗糖、果糖、葡萄糖或右旋糖(dextrose)，所述抗結(jié)塊劑選自滑石、二氧化硅、硅酸鈣或高嶺土(kaelin clay)，所述濕潤劑為脫脂奶粉，所述乳化劑為基于大豆的乳化劑例如卵磷脂或基于植物的乳化劑例如甘油單/ 二酯(monodiglyceride)，和所述抗氧化劑為谷氨酸鈉或檸檬酸。優(yōu)選地，所述組合物為生物控制組合物，更優(yōu)選的為昆蟲病原組合物。更優(yōu)選地，所述生物控制組合物為在長于約2周，優(yōu)選地長于約1個(gè)月、約2個(gè)月、 約3個(gè)月、約4個(gè)月、約5個(gè)月，更優(yōu)選地長于約6個(gè)月的時(shí)期內(nèi)能夠支持真菌的繁殖活力或能夠保持昆蟲致病效力的穩(wěn)定組合物。在某些實(shí)施方案中，組合物包含真菌單菌株，球孢白僵菌菌株K4B3(匪IA No. V08/025855，在 2008 年 10 月 14 日保藏)。可選地，組合物包含所述真菌的多個(gè)菌株，但優(yōu)選地包含3種菌株或更少。合適地，組合物包含匪IA No. V08/025855和任何一種或多種選自下述的菌株菌株匪IA No. NM05/44593,菌株NMIA No. NM05/44594,菌株NMIA No. NM05/44595,菌株NM06/00007，菌株NM06/00008，菌株NM06/00009，菌株NM06/00010，和具有所述菌株中任一種的鑒定特征的菌株。優(yōu)選地，所述組合物為下述生物控制組合物，其包含具繁殖活力的形式和量的 NMIA No. V08/025855和選自下述的至少一種菌株蠟蚧霉菌株K4V1(NMIA No. NM05/44593) 或具有其鑒定特征的菌株；蠟蚧霉菌株K4V2(匪IA保藏號NM05/44594)或具有其鑒定特征的菌株；蠟蚧霉菌株K4V4(匪IA保藏號NM06/00007)或具有其鑒定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B1 (匪IA保藏號匪05/445卯)或具有其鑒定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B2(匪IA保藏號NM06/00010)或具有其鑒定特征的菌株；長孢蚧霉(Lecanicillium longisporum)菌株KT4L1 (匪IA保藏號NM06/00009)或具有其鑒定特征的菌株；和玫煙色擬青霉(Paecilomyces fumosoroseus)菌株 K4P1 (NMIA 保藏號 NM06/00008)或具有其鑒定特征的菌株，和至少一種農(nóng)業(yè)上可接受的載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物可另外包含球孢白僵菌菌株K4B3保藏號 V08/025855的至少一種代謝物。例如，組合物為下述生物控制組合物，其包含球孢白僵菌菌株K4B3保藏號V08/025855的至少一種代謝物和選自下述的至少一種菌株蠟蚧霉菌株K4V1 (匪IA No. NM05/44593)或具有其鑒定特征的菌株；蠟蚧霉菌株K4V2 (匪IA保藏號 NM05/44594)或具有其鑒定特征的菌株；蠟蚧霉菌株K4V4 (匪IA保藏號NM06/00007)或具有其鑒定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B1 (匪IA保藏號匪05/445卯)或具有其鑒定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B2(匪IA保藏號NM06/00010)或具有其鑒定特征的菌株；長孢蚧霉菌株KT4L1(NMIA保藏號NM06/00009)或具有其鑒定特征的菌株；和玫煙色擬青霉菌株 K4P1 (匪IA保藏號NM06/00008)或具有其鑒定特征的菌株，和至少一種農(nóng)業(yè)上可接受的載體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備組合物的方法，所述組合物包含球孢白僵菌 V08/025855，任選地和一種或多種如本文描述的其他昆蟲病原真菌，所述方法包括將本發(fā)明的所述昆蟲病原真菌的具繁殖活力的形式與至少一種農(nóng)業(yè)上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑組合。優(yōu)選地，所述其他真菌選自蠟蚧霉菌株K4V1 (匪IA保藏號匪05/4459；3)或具有其鑒定特征的菌株；蠟蚧霉菌株K4V2(匪IA保藏號NM05/44594)或具有其鑒定特征的菌株；蠟蚧霉菌株K4V4(匪IA保藏號NM06/00007)或具有其鑒定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B1 (匪IA保藏號匪05/445卯)或具有其鑒定特征的菌株；球孢白僵菌菌株 K4B2 (匪IA保藏號NM06/00010)或具有其鑒定特征的菌株；長孢蚧霉菌株KT4L1 (匪IA保藏號NM06/00009)或具有其鑒定特征的菌株；和玫煙色擬青霉菌株K4P1 (匪IA保藏號 NM06/00008)或具有其鑒定特征的菌株。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備生物控制組合物的方法，所述方法包括
提供球孢白僵菌K4B3 V08/025855的培養(yǎng)物，在適于產(chǎn)生至少一種代謝物的條件下維持所述培養(yǎng)物；和i)將該至少一種代謝物和載體組合，或ii)將該至少一種代謝物和本文描述的一種或多種昆蟲病原真菌組合，或iii)從球孢白僵菌K4B3 V08/025855中分離該至少一種代謝物，或iv) (i)至(iii)中的2項(xiàng)或更多項(xiàng)的任意組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，代謝物為分泌的代謝物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，代謝物為細(xì)胞內(nèi)代謝物。特別地在這些實(shí)施方案中，所述方法可另外包括在維持步驟之后的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞裂解步驟。在多個(gè)實(shí)施方案中通過離心或過濾進(jìn)行分離。在多個(gè)實(shí)施方案中，分離有效地去除多于約50%的球孢白僵菌K4B3V08/025855， 多于約55%，多于約60%，多于約65%，多于約70%，多于約75%，多于約80%，多于約 85%，多于約90%，多于約95%，多于約99%或約100%的球孢白僵菌K4B3 V08/025855。由此，在一個(gè)特別考慮的實(shí)施方案中，所述方法包括提供球孢白僵菌K4B3 V08/025855的培養(yǎng)物，在適于產(chǎn)生至少一種分泌的代謝物的條件下維持所述培養(yǎng)物和從球孢白僵菌K4B3 V08/025855中分離該至少一種分泌的代謝物。優(yōu)選地，載體為農(nóng)業(yè)上可接受的載體，優(yōu)選地所述至少一種載體選自填料刺激劑、 抗結(jié)塊劑、濕潤劑、乳化劑和抗氧化劑，更優(yōu)選地所述組合物包含填料刺激劑、抗結(jié)塊劑、濕潤劑、乳化劑和抗氧化劑之各至少一種。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的組合物在控制一種或多種植物病原昆蟲中的用途。優(yōu)選地，所述一種或多種植物病原昆蟲選自薊馬(纓翅目(Thysanoptera))，蚜蟲，木虱，介殼蟲或粉虱(半翅目(Hemiptera))，蛾和蝴蝶(鱗翅目(L印idoptera))的幼蟲禾口螨(包括瓦螨(varroa mite))。在另一個(gè)方面本發(fā)明提供了控制一種或多種植物病原昆蟲的方法，所述方法包括對植物或其周圍應(yīng)用具繁殖活力的形式和量的球孢白僵菌V08/025855，任選地和如本文描述的至少一種其他昆蟲病原真菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，可對植物或其周圍直接應(yīng)用昆蟲病原真菌的孢子。優(yōu)選地，所述孢子與水混合并如本文描述的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述至少一種其他真菌選自蠟蚧霉菌株K4V1 (匪IA保藏號NM05/44593) 或具有其鑒定特征的菌株；蠟蚧霉菌株K4V2(匪IA保藏號NM05/44594)或具有其鑒定特征的菌株；蠟蚧霉菌株K4V4(匪IA保藏號NM06/00007)或具有其鑒定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B1 (匪IA保藏號NM05/445%)或具有其鑒定特征的菌株；球孢白僵菌菌株 K4B2 (匪IA保藏號NM06/00010)或具有其鑒定特征的菌株；長孢蚧霉菌株KT4L1 (匪IA保藏號NM06/00009)或具有其鑒定特征的菌株；和玫煙色擬青霉菌株K4P1 (匪IA保藏號 NM06/00008)或具有其鑒定特征的菌株。在另一個(gè)方面本發(fā)明提供了控制一種或多種植物病原昆蟲的方法，所述方法包括對植物或其周圍應(yīng)用本發(fā)明的組合物。優(yōu)選地，所述組合物在應(yīng)用前與水混合至約0. 5gm/L至約3gm/L的終濃度，更優(yōu)選地至約lgm/L的終濃度。
優(yōu)選地，在應(yīng)用前混合干燥保護(hù)劑，更優(yōu)選R)rtime Plus ,至約lgm/L的終濃度。示例性濃度范圍為從約IxlO2至IxlO8孢子每ml，從約IxlO2至IxlO7孢子每ml， 優(yōu)選地從約IxlO3至hlO6，和更優(yōu)選IxlO4至hlO6孢子每ml。優(yōu)選地，所述組合物在應(yīng)用時(shí)每毫克包含至少IO7孢子，更優(yōu)選地，所述應(yīng)用通過噴霧進(jìn)行。優(yōu)選地，包含球孢白僵菌菌株K4B3(匪IA保藏號V08/025855)或具有其鑒定特征的培養(yǎng)物的組合物以約IxIOici至約IxlO15孢子每公頃的比例應(yīng)用，優(yōu)選約IxlO12至約IxlO14 孢子每公頃，更優(yōu)選約切1012至約IxlOw孢子每公頃，更優(yōu)選約1-3χ1013孢子每公頃。方便地，這樣的應(yīng)用比例可通過將所述組合物以約每毫克IO7孢子或更多配制，并以約每公頃的Ikg的比例應(yīng)用所述組合物而獲得。如本文描述的，這樣的應(yīng)用比例可通過將組合物溶解在大體積的農(nóng)業(yè)上可接受的溶劑(例如水)中方便地獲得。對本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在不背離如附加的權(quán)利要求中定義的本發(fā)明的范圍下，在本發(fā)明的構(gòu)建和不同實(shí)施方案和應(yīng)用中的許多改變是顯而易見的。本文的公開和說明書純粹是舉例說明性的且無意在任何意義上為限制性的。在此說明書中當(dāng)對專利說明書、其他外部文件或其他信息來源進(jìn)行參考時(shí)，這一般是為討論本發(fā)明特征提供背景。除非另外特別說明，對這些外部文件的參考不應(yīng)理解為承認(rèn)這些文件或這些信息來源在任何轄區(qū)中是現(xiàn)有技術(shù)或構(gòu)成本領(lǐng)域公知常識的一部分。附圖描述

圖1顯示了如本文中實(shí)施例4中描述的“白僵菌素-標(biāo)準(zhǔn)蛋氨酸”標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜掃描。顯示了被鑒定為白僵菌素、白僵菌素-F和類白僵菌素的峰。圖2顯示了如本文中實(shí)施例4中描述的來自球孢白僵菌K4B3菌株的提取物的質(zhì)譜掃描。發(fā)明詳述本發(fā)明部分涉及具有對抗植物病原昆蟲效力的球孢白僵菌菌株和這樣的真菌在控制所述植物病原昆蟲中的用途。定義詞語“昆蟲致病活性”和“昆蟲致病效力”在本文中可互換使用，指某些活性劑例如某些微生物拮抗一種或多種植物病原昆蟲的能力。優(yōu)選地，所述昆蟲致病效力是，優(yōu)選地在與昆蟲接觸的14天內(nèi)，更優(yōu)選7天內(nèi)，對一種或多種植物病原昆蟲造成寄生并使其失去能力，使其不育，阻礙其生長或殺死其的能力，更優(yōu)選地在7天內(nèi)殺死一種或多種植物病原昆蟲的能力。如本文使用的術(shù)語“生物控制劑”(BCA)指下述生物劑，其作為一種或多種植物病原體例如植物病原昆蟲的拮抗劑起作用，或能夠控制一種或多種植物病原體。拮抗作用可采用多種形式。在一種形式中，生物控制劑可簡單地起驅(qū)避劑的作用。在另一種形式中，生物控制劑可使環(huán)境不利于植物病原體。在另一種優(yōu)選的形式中，生物控制劑可寄生于植物病原體，使其失去能力，使其不育，阻礙其生長和/或殺死植物病原體。由此，拮抗機(jī)制包括但不限于抗生作用、寄生、不育和毒性。因此，作為一種或多種植物病原昆蟲的拮抗劑起作用的活性劑可被稱為具有昆蟲致病效力。此外，作為植物病原昆蟲拮抗劑的活性劑可被稱為昆蟲病原劑。
如本文使用的，“生物控制組合物”是包含或包括至少一種生物控制劑(其為一種或多種植物病原體的拮抗劑)的組合物。這些控制劑包括但不限于起驅(qū)避劑作用的活性劑，使環(huán)境不利于病原體的活性劑和使病原體失去能力、使其不育和/或殺死病原體的活性劑。由此，如本文使用的“昆蟲病原組合物”為包含或包括至少一種作為一種或多種植物病原昆蟲的拮抗劑的活性劑的組合物。這些組合物在本文中被認(rèn)為具有昆蟲致病效力。如本說明書中使用的術(shù)語“包含(comprising) ”指“至少部分由...組成”。當(dāng)在本說明書中解釋各條包括術(shù)語“包含”的陳述時(shí)，以所述術(shù)語為開端的那些特征之外的特征也可能存在。以相同的方式解釋相關(guān)術(shù)語例如“包含”和“包括”。如本文使用的術(shù)語“控制”(“control”或“controlling”)一般涵蓋在植物或其周圍之中或之上預(yù)防、降低或根除植物病原體感染或抑制這些感染的速度和程度，或減少植物病原體群體，其中對感染或群體的預(yù)防或降低相對未處理的感染或群體是統(tǒng)計(jì)上顯著的。也考慮治愈性處理。優(yōu)選地，通過在植物病原體群體中提高的死亡率實(shí)現(xiàn)這些控制。如本文使用的術(shù)語“代謝物”涵蓋本發(fā)明真菌所產(chǎn)生的任何物質(zhì)，或參與本發(fā)明真菌中發(fā)生的代謝反應(yīng)的任何物質(zhì)，包括本發(fā)明的昆蟲病原真菌分泌、排泄或產(chǎn)生的任何物質(zhì)。如本文使用的術(shù)語“植物”不僅涵蓋整株植物，還延及植物部分、插枝以及植物產(chǎn)物，包括根、葉、花、種子、莖、愈傷組織、堅(jiān)果和果實(shí)、鱗莖、塊莖、球莖、谷粒、插枝、根砧木或接穗，并包括任何植物材料，不管是種植前、生長中和收獲時(shí)或收獲后的?？赡軓谋景l(fā)明的應(yīng)用中獲利的植物覆蓋廣泛的農(nóng)業(yè)和園藝作物范圍。本發(fā)明的組合物還特別適用于在有機(jī)生產(chǎn)系統(tǒng)中應(yīng)用。當(dāng)在昆蟲病原劑例如昆蟲病原真菌菌株中使用時(shí)，詞語“保持昆蟲致病效力”和其語法上的等同物和衍生物旨在指，所述活性劑仍然具有有用的昆蟲致病活性。優(yōu)選地，保持的活性為原始活性的至少約 35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，99 或 100%， 并且可從這些數(shù)值的任意兩者之間選擇有用范圍(例如，從約35至約100%，從約50至約 100 %，從約60至約100 %，從約70至約100 %，從約80至約100 %，和從約90至約100 % )。 例如，在本發(fā)明中有用的具有特定菌株之鑒定特征的菌株應(yīng)當(dāng)保持昆蟲致病活性，即保持該特定菌株的昆蟲致病活性的至少約35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，99或 100%。由此，具有球孢白僵菌K4B3的鑒定特征的菌株，例如球孢白僵菌K4B3的同源物或突變體，應(yīng)當(dāng)保持球孢白僵菌K4B3的昆蟲致病活性的至少約35，40，45，50，55，60，65，70， 75，80，85，90，95，99或100%。類似地，本發(fā)明的優(yōu)選組合物能夠幫助維持其包含的昆蟲病原劑的昆蟲致病活性，并可被稱為保持昆蟲致病活性，理想地直到使用本文的方法對其進(jìn)行應(yīng)用前。如本文使用的，當(dāng)與本發(fā)明的組合物相關(guān)使用時(shí)，術(shù)語“穩(wěn)定的”指組合物能夠在數(shù)周內(nèi)，優(yōu)選約1、約2、約3、約4、優(yōu)選約5、更優(yōu)選約6個(gè)月或更長時(shí)間內(nèi)支持昆蟲病原真菌的繁殖活力或支持(例如昆蟲病原真菌的一種或多種代謝物的)昆蟲致病效力?！熬哂衃規(guī)定菌株的]鑒定特征的菌株”，或“具有[規(guī)定菌株的]鑒定特征的培養(yǎng)物”，包括規(guī)定菌株的同源物或突變體，與規(guī)定菌株緊密相關(guān)(即與其享有共同祖先)或來源于規(guī)定菌株，但通常與規(guī)定菌株在一種或多種基因型或表型特征上有差異。通常通過遺傳差異的評估，可鑒定突變體。通過評估遺傳、生化和形態(tài)差異程度和使用分類學(xué)方法，包括例如分支系統(tǒng)學(xué)的分析，可鑒定同源物。然而，具有[規(guī)定菌株的]鑒定特征的菌株，包括規(guī)定菌株的同源物或突變體，將保持昆蟲致病效力，可與其他細(xì)菌菌株區(qū)分，并可使用本文描述的技術(shù)鑒定為親本菌株的同源物或突變體。術(shù)語“周圍”，當(dāng)就接受本發(fā)明真菌、方法和組合物的植物對象而言使用時(shí)，包括鄰近或圍繞植物或其根、塊莖等等的土壤、水、落葉層和/或生長培養(yǎng)基，相鄰植物、所述植物的插枝、支持物、待對植物施用的水、和包衣，包括種衣劑。其還包括貯存、包裝或加工材料例如保護(hù)性包衣、盒子和包裝物，和種植、維持或收獲裝置。植物病原體的控制本發(fā)明認(rèn)識到許多國家包括例如美國、新西蘭和許多歐洲國家的園藝部門正面臨著植物病原有害昆蟲中增強(qiáng)的農(nóng)藥抗性的問題。在一些管理制度下由于管理壁壘造成新的化學(xué)殺蟲劑的可得性降低，這使情況惡化。使用昆蟲病原真菌作為生物控制劑為此問題提出了一種解決方案。根據(jù)生物控制劑使靶植物病原昆蟲或昆蟲群體失去能力或殺死靶植物病原昆蟲或昆蟲群體的能力，可選擇有效的生物控制劑。在有利條件下，植物病原昆蟲例如蚜蟲、薊馬和粉虱可感染植物及其周圍，包括土壤、落葉層、相鄰植物、支持物等等?？蓱?yīng)用昆蟲病原真菌，以使植物病原昆蟲失去能力和/或殺死植物病原昆蟲，由此防止或限制病原體的致病能力。這些昆蟲病原真菌在田間的有效性又依賴于其在各種氣候條件例如中斷的濕潤期和干燥下存活的能力。在某些管理制度下即使可能，昆蟲病原真菌的進(jìn)口常常是成問題的、代價(jià)高且不現(xiàn)實(shí)的。例如，因?yàn)楣芾砗土⒎ㄐ耘懦?，在給定國家以外可得的昆蟲病原真菌可能不能被該國家中的園藝學(xué)家得到。本發(fā)明因此認(rèn)識到鑒定和培養(yǎng)能夠在廣泛環(huán)境條件下茂盛生長的菌株具有明顯優(yōu)勢?？蓮沫h(huán)境中，包括例如從植物、其周圍和從所述植物的病原體中方便地獲得本發(fā)明真菌的分離株。在某些實(shí)施方案中，可從靶昆蟲或從待隨后應(yīng)用包含所述真菌的生物控制劑或包含所述真菌的組合物的植物物種(或周圍)中獲得所述真菌的分離株。測定所述真菌在不同條件，包括不同溫度和在不同培養(yǎng)基或其他基質(zhì)上的生長的方法是本領(lǐng)域熟知的。本文描述了測定真菌在不同溫度下的生長能力的示例方法，并描述了方法以測定一個(gè)給定分離株在給定溫度是死的還是休眠的。類似的，本文舉例說明了確立分離株是否能夠在給定人工培養(yǎng)基上生長的方法。 這些方法的使用公認(rèn)，分離株必須能夠以足夠量生長才能使其適于作為生物控制劑使用。 本文進(jìn)一步討論了培養(yǎng)足夠量的本發(fā)明真菌的方法。有效對抗植物病原昆蟲因而適用于本發(fā)明用途的真菌菌株，例如白僵菌菌株，可以被鑒定為這樣的菌株，相對于與該菌株或菌株的一種或多種代謝物進(jìn)行比較的對照處理，該菌株可以有效減少靶昆蟲物種群體達(dá)統(tǒng)計(jì)上顯著的量。這樣的菌株可以被認(rèn)為具有昆蟲致病效力。如本文描述的，靶昆蟲群體的減少可通過多種拮抗機(jī)制實(shí)現(xiàn)。例如，真菌可寄生于植物病原昆蟲、使其失去能力、使其不育和/或優(yōu)選地殺死植物病原昆蟲。真菌也可通過使環(huán)境，例如真菌所用于的植物或其周圍，不利于植物病原昆蟲，從而減少靶昆蟲的群體。在此實(shí)施方案中，可認(rèn)為真菌起驅(qū)避劑的作用并減少在植物或其周圍的附近中的靶昆蟲的有效群體。
優(yōu)選地，合適的菌株展示約5%的昆蟲致病效力，至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、更優(yōu)選至少約 50%的昆蟲致病效力，所述效力以與對照處理相比相關(guān)昆蟲物種群體減少的百分比表示。 用于舉例說明，應(yīng)用了本文描述的方法鑒定有效對抗多種靶昆蟲的白僵菌分離株，而與本文描述的方法類似的程序可應(yīng)用于其他真菌和昆蟲物種。盡管昆蟲致病效力對于分離株被視為適用作生物控制劑是首要的必備條件，但真菌分離株應(yīng)具有適于用作生物控制劑的另外特征。例如，真菌應(yīng)當(dāng)能夠以存活的形式在合理的期限內(nèi)儲存，以便最終允許其以有效作為生物控制劑的形式和濃度施用到靶植物或其周圍。為了適于用作生物控制劑，當(dāng)對植物或其周圍應(yīng)用時(shí)真菌還應(yīng)當(dāng)能夠達(dá)到感染閾值。如本文使用的，感染閾值指真菌在靶植物或其周圍上進(jìn)行定植從而其后具有昆蟲致病效力所需要的真菌濃度?？梢岳斫?，為了得到感染閾值，一些真菌分離株可能需要以高達(dá)不現(xiàn)實(shí)或不可行的比例應(yīng)用。此外，無論其應(yīng)用的濃度或比例，一些真菌分離株可能不能達(dá)到感染閾值。當(dāng)以不低于IOltl孢子每公頃的比例應(yīng)用時(shí)或當(dāng)以不低于IO7孢子每毫克組合物的濃度應(yīng)用且所述組合物以約lkg/1000L/公頃的比例應(yīng)用時(shí)，合適的昆蟲病原真菌能夠達(dá)到感染閾值。確定感染閾值的方法是本領(lǐng)域熟知的，本文展示了該方法的示例。在某些實(shí)施方案中，可直接確定感染閾值，例如通過分析從靶植物、其周圍和/或所述植物的病原體中獲得的一種或多種樣品，并測定在所述樣品中或上的真菌的存在或量。在其他實(shí)施方案中可間接測定感染閾值，例如通過觀察一種或多種植物病原昆蟲群體的減少。也設(shè)想這些方法的組合。球孢白僵菌是攻擊未成熟和成年昆蟲兩者，包括例如蝗蟲、蚜蟲、薊馬、蛾和幾種其他物種，的土傳真菌。通?？蓮睦ハx尸體例如蚜蟲、螟和薊馬中分離球孢白僵菌，也可從土壤中分離球孢白僵菌。下面更詳細(xì)的描述本發(fā)明的昆蟲病原球孢白僵菌菌株K4B3。菌絲體易于在MEA上生長。菌落通常為白色，在邊緣變?yōu)槟逃蜕翜\黃色。極少見為微紅色。菌絲體的葉狀體(thallus)的底面將紅色色素注入瓊脂。分生孢子梗大量，自菌絲產(chǎn)生。1_2μπι寬，帶有成群的簇生產(chǎn)孢細(xì)胞3-6x 3-5 μ m,其可分支以產(chǎn)生更多產(chǎn)孢細(xì)胞，球形至瓶形，具有良好發(fā)育的長達(dá)20 μ m寬1 μ m的柄，曲膝狀具有寬達(dá)ι μ m的小齒。分生孢子2-3x 2-2. 5 μ m的透明球狀分生孢子。在深層培養(yǎng)中形成芽生孢子。疏水。在瓊脂上聚集，灰塵狀顆粒外觀。K4B3在瓊脂上產(chǎn)生極度簇集的顆粒狀聚集體。孢子聚集體的顏色在成熟時(shí)變?yōu)樯畹慕撇屎缟狞S色。將K4B3引入深層培養(yǎng)產(chǎn)生極紅的顏色和刺鼻的金屬氣味。球孢白僵菌菌株K4B3分離自一群死亡的蟬蛹。在實(shí)施例中描述了獲得此分離株所應(yīng)用的分離和選擇方法的細(xì)節(jié)。依據(jù)用于專利程序的布達(dá)佩斯條約，此球孢白僵菌分離株已在2008年10月14日保藏于澳大利亞國家計(jì)量院(匪IA，前身為澳大利亞政府分析實(shí)驗(yàn)室(Australian Government Analytical Laboratories) (AGAL), 1 Suakin Street, Pymble, New South Wales，澳大利亞。分離株已被給予保藏號V08/025855。由此，在一個(gè)方面本發(fā)明提供了球孢白僵菌菌株K4B3，匪IA No. V08/025855的生物純的培養(yǎng)物。類似地提供了具有菌株K4B3，匪IA NO.V08/025855的鑒定特征的白僵菌。球孢白僵菌菌株K4B3是特別有效的生物控制劑，其能夠在田間活過中斷的濕潤期、干燥、并定植于植物病原昆蟲、使其失去能力和殺死植物病原昆蟲，所述植物病原昆蟲例如但不限于蚜蟲、毛蟲(躅，caterpillar)、粉虱、蛾、瓦螨、蟬和薊馬。使用此球孢白僵菌分離株的芽生孢子或分生孢子組合物殺死粉虱、薊馬和蚜蟲的程度一般與種植者應(yīng)用的常用殺蟲劑一樣好。然而，昆蟲例如薊馬、粉虱和蚜蟲對這些殺蟲劑的抗性已成為對園藝工業(yè)的最大威脅。例如，西花薊馬的國外群體對大多數(shù)種類的農(nóng)藥具有抗性。以下農(nóng)藥在M小時(shí)生物測定試驗(yàn)中提供了不充分的控制高滅磷、阿巴美丁、毒死蜱、硫丹、滅多蟲、滅蟲威、氧化樂果、定菌磷和氟胺氰菊酯。在新西蘭，在北島和南島的洋蔥薊馬具有對溴氰菊酯的抗性，但僅在奧克蘭附近發(fā)現(xiàn)對二嗪農(nóng)和敵敵畏的抗性(Martin等人，準(zhǔn)備中)。據(jù)報(bào)導(dǎo)在美國洋蔥薊馬對許多農(nóng)藥具有抗性，但對合成的擬除蟲菊酯仍然敏感(Grossman 1994)。據(jù)來自南澳大利亞的報(bào)導(dǎo)，Kelly’ s柑橘類薊馬對毒死蜱具有抗性(Purvis 2002)。已有溫室粉虱的殺蟲劑抗性報(bào)導(dǎo)，但僅最近，才證明其對噻嗪酮的抗性 (fforkman&Martin 1995)。在國外，溫室粉虱已產(chǎn)生對有機(jī)氯、有機(jī)磷酸酯、氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯殺蟲劑的抗性(例如 Georghiou 1981，Anis&Brennan 1982，Elhag&Horn 1983， Wardlow 1985，和Hommes1986)。也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了對較新的殺蟲劑噻嗪酮和伏蟲隆的抗性 (Gorman 等人 2000)。因此顯而易見的，許多植物病原昆蟲已對許多殺蟲劑產(chǎn)生抗性；在這些和其他情況中，根據(jù)本發(fā)明選擇的球孢白僵菌分離株提供了用于昆蟲控制的有效替代方案。在植物疾病控制中的此有力活性結(jié)合未觀察到任何由球孢白僵菌K4B3或其一種或多種代謝物誘導(dǎo)的植物病原性，證明此分離株具有用作生物控制劑的期望屬性。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，可使用球孢白僵菌K4B3制備包含球孢白僵菌K4B3 的一種或多種代謝物的組合物，其中該一種或多種代謝物為昆蟲病原劑。如上所述，當(dāng)在有利條件下生長時(shí)球孢白僵菌K4B3的菌絲體是微紅色的，當(dāng)在瓊脂上生長時(shí)球孢白僵菌K4B3將紅色色素注入瓊脂。類似的，如在本文實(shí)施例1中描述的， 當(dāng)在深層培養(yǎng)中生長時(shí)，球孢白僵菌K4B3產(chǎn)生極紅的顏色和刺鼻的金屬氣味并將一種或多種有毒代謝物注入培養(yǎng)溶液。本文特別考慮了包含一種或多種該有毒代謝物的組合物。 一種示例性組合物包含培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基已用于生長或維持過球孢白僵菌K4B3，而不管之后是否已經(jīng)從培養(yǎng)基中去除球孢白僵菌K4B3。另一個(gè)示例性組合物為已經(jīng)用于生長或維持過球孢白僵菌K4B3的培養(yǎng)基、或已經(jīng)用于生長或維持過球孢白僵菌K4B3的培養(yǎng)基的提取物，該提取物具有本文圖2中所示圖所特征性的質(zhì)譜圖。由此，本發(fā)明提供了制備包含球孢白僵菌K4B3的一種或多種代謝物和特別是球孢白僵菌K4B3的一種或多種分泌性代謝物的組合物的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括在適于產(chǎn)生至少一種代謝物的條件下維持球孢白僵菌K4B3 V08/025855的培養(yǎng)物；和從球孢白僵菌K4B3V08/025855中分離該至少一種代謝物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含白僵菌素、白僵菌素-F和類白僵菌素中的一種或多種，優(yōu)選白僵菌素、白僵菌素-F和類白僵菌素中的2種或更多種。在一個(gè)實(shí)施方案中， 組合物為包含白僵菌素、白僵菌素-F和類白僵菌素的協(xié)同組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含低于約Imgr1的白僵菌素，低于約0. SmgL-1的白僵菌素，低于約0. IrngL"1的白僵菌素，低于約0. OSmgr1的白僵菌素，低于約0. OlmgL—1的白僵菌素，低于約0. OOSmgr1的白僵菌素，低于約0. OOlmgL"1的白僵菌素，低于約0. OOOSmgL"1 的白僵菌素，或低于約0. OOOlmgr1的白僵菌素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含低于約lmgL—1的白僵菌素-F，低于約0. SmgL"1 的白僵菌素-F，低于約0. ImgL-1的白僵菌素-F，低于約0. OSmgL—1的白僵菌素_F，低于約 0. OlmgL"1的白僵菌素-F，低于約0. OOSmgr1的白僵菌素-F，低于約0. 00ImgL"1的白僵菌素-F，低于約0. OOOSmgr1的白僵菌素-F，或低于約0. 000ImgL"1的白僵菌素-F。本發(fā)明的球孢白僵菌菌株K4B3可單獨(dú)使用，或與本文描述的其他昆蟲病原真菌組合使用。其他昆蟲病原真菌的示例在下面更詳細(xì)的描述。球孢白僵菌菌株K4B1從新西蘭Bombay的松林中的螟幼蟲中分離。根據(jù)用于專利程序的布達(dá)佩斯條約，此球孢白僵菌分離株已在2005年3月16日保藏于澳大利亞國家計(jì)量院，1 Suakin Street, Pymble, New South Wales，Australia。分離株已被給予保藏號 NM05/44595。球孢白僵菌分離株K4B1顯示了對成年薊馬的偏好，并也對未成年薊馬和薊馬蛹、 蚜蟲和粉蝶具有致病性。K4B1的分生孢子形成奶油色聚集體。球孢白僵菌分離株K4B2從新西蘭Aka Aka平原的向日葵上的鱗翅目幼蟲中分離。 根據(jù)用于專利程序的布達(dá)佩斯條約，此球孢白僵菌分離株已在2006年3月3日保藏于澳大利亞國家計(jì)量院。分離株已被給予保藏號NM06/00010。球孢白僵菌分離株K4B2展示了對毛蟲，包括大豆尺蠖幼蟲和白粉蝶和粘蟲幼蟲的偏好。此分離株也對未成年薊馬、成年薊馬和薊馬蛹、蚜蟲和粉虱具有致病性。K4B2的分生孢子形成黃色灰塵狀聚集體。NMIA No. NM05/44595,NMIA No. NM06/00010和其他合適的球孢白僵菌分離株可與本發(fā)明的球孢白僵菌菌株K4B3組合使用，或與球孢白僵菌K4B3的一種或多種代謝物組合使用，并為特別有效的生物控制劑，其能夠在田間活過中斷的濕潤期、干燥、并定植于植物病原昆蟲、使其失去能力和殺死植物病原昆蟲，所述植物病原昆蟲例如但不限于田間的蚜蟲、毛蟲、粉虱、蛾、瓦螨和薊馬。使用這些球孢白僵菌分離株殺死粉虱、薊馬和蚜蟲的程度一般與如上所述的常用殺蟲劑一樣好。針對這些殺蟲劑的抗性已產(chǎn)生；在這些和其他情況中，根據(jù)本發(fā)明選擇的球孢白僵菌分離株提供了用于昆蟲控制的有效替代方案。在植物疾病控制中的此有力活性結(jié)合未觀察到任何由球孢白僵菌引起的植物病原性，證明這些物種的分離株具有用作生物控制劑的期望屬性。蠟蚧霉是具有廣譜宿主(包括同翅類昆蟲和其他節(jié)肢動(dòng)物類型)的昆蟲病原真菌。蠟蚧霉被認(rèn)為是物種綜合體(species complex)，其包括具有不同形態(tài)學(xué)和生化特征的分離株。一般地可從昆蟲尸體例如蚜蟲、薊馬、粉虱和粉蚧中分離蠟蚧霉，也可從土壤中分離蠟蚧霉。分離株具有以下鑒定特征
菌絲體在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、麥芽提取物瓊脂(MEA)或燕麥粉瓊脂(OA) 上菌落為白色、奶油狀、薄、棉花狀，背面為無色至淺或深的黃色。分生孢子梗瓶梗單個(gè)地或直接地從菌絲體形成、或在3或4個(gè)直立分生孢子梗的輪(很像營養(yǎng)菌絲體)中形成。瓶梗精巧(delicate)，取決于菌株和培養(yǎng)物的年齡二者有不同尺寸。尺寸從8. 5-16x0. 8-1. 2μπι至30-40x2-2. 2μπι的范圍。分生孢子在粘質(zhì)基質(zhì)中單個(gè)地產(chǎn)生并在瓶梗頂?shù)念^上聚集。橢圓形至圓柱形，具有圓形末端，根據(jù)菌株而尺寸不同，尺寸從2. 3-3. 4x1-1. 3 μ m至7. 2-10x2. 1-2. 6 μ m。在深層培養(yǎng)中產(chǎn)生芽生孢子。親水。蠟蚧霉菌株K4V1從新西蘭Pukekohe的溫室番茄作物中的粉虱中分離。根據(jù)用于專利程序的布達(dá)佩斯條約，此蠟蚧霉分離株已在2005年3月16日保藏于澳大利亞國家計(jì)量院。分離株已被給予保藏號NM05/44593。K4V1具有另外的鑒定特征——在粉虱若蟲(whitefly scale)中60%分生孢子 1.0x1.0微米，在未成年薊馬(若蟲)中30%分生孢子2. 0x1.0微米，在薊馬蛹中10%分生孢子2. 5x1. 3微米。菌絲體的葉狀體的底面有稀疏皺紋，很容易從瓊脂中移出菌絲體葉狀體。蠟蚧霉菌株K4V2從新西蘭Ruakaka的黃瓜溫室中的粉虱中分離。根據(jù)用于專利程序的布達(dá)佩斯條約，此蠟蚧霉分離株已在2005年3月16日保藏于澳大利亞國家計(jì)量院。 分離株已被給予保藏號NM05/44594。K4V2具有另外的鑒定特征——50 %分生孢子2. 0x1. 5 μ m，30 %分生孢子 2. 0x1. Oym, 20 %分生孢子1. 0x1. Oym,對成年粉虱有致病性，而芽生孢子對蚜蟲有致病性。菌絲體葉狀體的底面時(shí)常皺折，很難從瓊脂表面移出菌絲體葉狀體。蠟蚧霉菌株K4V4從室外有機(jī)樹番茄(tamarillo)作物中分離。根據(jù)用于專利程序的布達(dá)佩斯條約，此蠟蚧霉分離株已在2006年3月3日保藏于澳大利亞國家計(jì)量院。分離株已被給予保藏號NM06/00007。K4V4具有另外的鑒定特征——50%分生孢子1. 0x0. 5 μ m，對粉虱若蟲(whitefly scale)和成蟲有致病性，在低濕度65-75%、高溫度非常具攻擊性。通常v. 1 > 75%。50%分生孢子0. 5x0. 5 μ m。菌絲體葉狀體的底面稀疏皺折，菌絲體葉狀體擴(kuò)散奶黃色至淺橙色色素在培養(yǎng)基中。NMIA No. NM05/44593, NMIA No. NM05/44594, NMIA No. NM06/00007 和其他合適的蠟蚧霉分離株可與本發(fā)明的球孢白僵菌菌株K4B3組合使用，或與球孢白僵菌K4B3的一種或多種代謝物組合使用，并為特別有效的生物控制劑，其能夠在田間活過中斷的濕潤期、干燥、并定植于植物病原昆蟲、使其失去能力和殺死植物病原昆蟲，所述植物病原昆蟲例如但不限于蚜蟲、粉虱、粉蚧、瓦螨和薊馬。使用這些蠟蚧霉分離株殺死粉虱、薊馬和蚜蟲的程度一般與如上所述的常用殺蟲劑一樣好。對這些殺蟲劑的抗性已產(chǎn)生；在這些和其他情況中， 根據(jù)本發(fā)明選擇的蠟蚧霉分離株提供了用于昆蟲控制的有效替代方案。在植物疾病控制中的此有力活性結(jié)合未觀察到任何由蠟蚧霉引起的植物病原性，證明這些物種的分離株具有用作生物控制劑的期望屬性。長孢蚧霉是對蚜蟲特別具有致病性的昆蟲病原真菌。長孢蚧霉菌株KT4L1從新西蘭奧克蘭Franklin的大麥圍銀行植物(Banker plant)中的蚜蟲中分離。根據(jù)用于專利程序的布達(dá)佩斯條約，此長孢蚧霉分離株已在2006年3月3日保藏于澳大利亞國家計(jì)量院。 分離株已被給予保藏號NM06/00009。分離株KT4L1具有以下鑒定特征100%分生孢子6.0x2. 1 μ m，菌絲體葉狀體為灰白色至黃色，非常粗糙地生長，在一致性上可將其描述為凸凹不平的。菌絲體葉狀體將淺紅褐色色素?cái)U(kuò)散至瓊脂。匪IA NO.NM06/00009和其他合適的長孢蚧霉分離株可與本發(fā)明的球孢白僵菌菌株K4B3組合使用，或與球孢白僵菌K4B3的一種或多種代謝物組合使用，并為特別有效的生物控制劑，其能夠在田間活過中斷的濕潤期、干燥、并定植于植物病原昆蟲、使其失去能力和殺死植物病原昆蟲，所述植物病原昆蟲例如但不限于蚜蟲。使用這些長孢蚧霉分離株的芽生孢子或分子孢子組合物殺死蚜蟲的程度一般與種植者應(yīng)用的常用殺蟲劑一樣好。如上所述，許多植物病原昆蟲已對多種殺蟲劑產(chǎn)生抗性；在這些和其他情況中，根據(jù)本發(fā)明選擇的長孢蚧霉分離株提供了用于昆蟲控制的有效替代方案。在植物疾病控制中的此有力活性結(jié)合未觀察到任何由長孢蚧霉引起的植物病原性，證明這些物種的分離株具有用作生物控制劑的期望屬性。玫煙色擬青霉是在感染和死亡的昆蟲和一些土壤中發(fā)現(xiàn)的昆蟲病原真菌。玫煙色擬青霉一般感染粉虱、薊馬、蚜蟲和毛蟲。滿足上面要求的玫煙色擬青霉K4P1菌株從新西蘭Rimciman的卷心菜中存在的小菜蛾幼蟲中分離。根據(jù)用于專利程序的布達(dá)佩斯條約，此玫煙色擬青霉分離株已在2006年 3月3日保藏于澳大利亞國家計(jì)量院。分離株已被給予保藏號NM06/00008。玫煙色擬青霉菌株K4P1具有以下鑒定特征在昆蟲中的生長產(chǎn)生簡單的單絲(mononematous)分生孢子?；蛎黠@但疏松的束絲。束絲直立，長達(dá)3cm并可分支，看上起灰塵狀，帶有分生孢子。在瓊脂中的生長在麥芽瓊脂(MA)和PDA上，室溫)生長速度中度，14天內(nèi)4-8cm，具有氈狀基底(basal felt)，氈狀基底上具有規(guī)則或不規(guī)則的凸起叢毛狀過度生長，或可以是較薄的、灰塵狀和顆粒狀，并產(chǎn)生明確的孢梗束，當(dāng)首次分離時(shí)為粉末狀的。最初為白色，保持白色或變?yōu)樯钌顪\淺的粉紅色，隨年齡增長，可變?yōu)榈疑I養(yǎng)菌絲壁光滑，透明，1-5-3. 5μπι直徑。分生孢子結(jié)構(gòu)傾向于復(fù)雜，由自氈狀基底或自氣生菌絲產(chǎn)生的直立分生孢子梗組成。分生孢子梗單個(gè)地產(chǎn)生或一起地產(chǎn)生以形成束絲，達(dá)IOOym長xl. 5-2 C3) μ m直徑。壁光滑，透明，帶有分支輪，上又帶有3-6個(gè)瓶梗的輪生體，偶爾瓶梗在與分支相同的水平上在同一輪中產(chǎn)生。有時(shí)候輪生形式被破壞，單枝不規(guī)則地生在分生孢子梗上。瓶梗5-7x2. 5(3) μπι，具有膨大的基底，其逐漸變細(xì)為約0. 5 μ m直徑的細(xì)長頸。分生孢子圓柱形至紡錘形，具有圓形末端，光滑，透明，鏈生，2-4x1-2 μ m,偶爾長達(dá) 5 μ m。在昆蟲上產(chǎn)孢器官趨向更緊密，分支和瓶梗膨脹，略微更短和更圓， 3. 5-6x1-2. 5 μ m0分生孢子和培養(yǎng)中的一樣。匪IA NO.NM06/00008和其他合適的玫煙色擬青霉分離株可與本發(fā)明的球孢白僵菌菌株K4B3組合使用，或與球孢白僵菌K4B3的一種或多種代謝物組合使用，并為特別有效的生物控制劑，其能夠在田間活過中斷的濕潤期、干燥、并定植于植物病原昆蟲、使其失去能力和殺死植物病原昆蟲，所述植物病原昆蟲例如但不限于粉虱、瓦螨和鱗翅目幼蟲。使用芽生孢子或分生孢子組合物通過這些玫煙色擬青霉分離株殺死粉虱、瓦螨、薊馬和蚜蟲的程度一般與種植者應(yīng)用的常用殺蟲劑一樣好。如上所述，許多植物病原昆蟲已對多種殺蟲劑產(chǎn)生抗性；在這些和其他情況中，根據(jù)本發(fā)明選擇的玫煙色擬青霉分離株提供了用于昆蟲控制的有效替代方案。在植物疾病控制中的此有力活性結(jié)合未觀察到任何由玫煙色擬青霉引起的植物病原性，證明這些物種的分離株具有用作生物控制劑的期望屬性。在另一個(gè)方面本發(fā)明提供了包含球孢白僵菌菌株K4B3或球孢白僵菌K4B3的一種或多種代謝物、或包含球孢白僵菌K4B3和球孢白僵菌K4B3的一種或多種代謝物二者、和任選地一種或多種其他昆蟲病原真菌、以及至少一種載體的組合物。組合物可包括多種昆蟲病原真菌菌株，在某些實(shí)施方案中，可利用多個(gè)菌株靶向多個(gè)植物病原物種，或單個(gè)植物病原體的多種不同發(fā)育階段，或甚至上述之組合。例如，可使用一種真菌菌株靶向植物病原昆蟲的蛹形式，而可用另一種真菌菌株靶向所述植物病原昆蟲的成年形式，其中兩種菌株都包含在本發(fā)明的組合物中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選3 種或更少種菌株，常常優(yōu)選單菌株。合適地，組合物包含選自以下的真菌蠟蚧霉菌株K4V1 (匪IA No. NM05/44593) 或具有其鑒定特征的菌株；蠟蚧霉菌株K4V2(匪IA保藏號NM05/44594)或具有其鑒定特征的菌株；蠟蚧霉菌株K4V4(匪IA保藏號NM06/00007)或具有其鑒定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B1 (匪IA保藏號NM05/445%)或具有其鑒定特征的菌株；球孢白僵菌菌株 K4B2(匪IA保藏號NM06/00010)或具有其鑒定特征的菌株；長孢蚧霉菌株KT4L1 (匪IA保藏號NM06/00009)或具有其鑒定特征的菌株；和玫煙色擬青霉菌株K4P1 (匪IA保藏號 NM06/00008)或具有其鑒定特征的菌株。特別考慮包含球孢白僵菌K4B3的一種或多種代謝物和蠟蚧霉菌株 K4V1 (NM05/44593)或具有其鑒定特征的菌株的組合物，包含球孢白僵菌K4B3的一種或多種代謝物和蠟蚧霉菌株K4V2(NM05/44594)或具有其鑒定特征的菌株的組合物，和包含球孢白僵菌K4B3的一種或多種代謝物和蠟蚧霉菌株K4Vl(NM05/4459;3)或具有其鑒定特征的菌株二者的組合物，包含球孢白僵菌K4B3的一種或多種代謝物和蠟蚧霉菌株 K4V2 (NM05/44594)或具有其鑒定特征的菌株的組合物。包含昆蟲病原真菌的組合物的示例是本領(lǐng)域熟知的，包括在例如Mycotech公司的W095/10597(以PCT/US94/11542公開)，由農(nóng)業(yè)部長代表的美國的W02003/043417 (以 PCT/US2002/037218公開)，McCabe等人的美國專利號4，530, 834和Wright等人的美國專利申請?zhí)?0/657，982(以US 2004/0047841公開)中描述的那些，這些專利文獻(xiàn)在本文中分別以其整體引入作為參考。為了適于對植物或其周圍應(yīng)用，所述至少一種載體為農(nóng)業(yè)上可接受的載體，更優(yōu)選地，其選自填料刺激劑、抗結(jié)塊劑、濕潤劑、乳化劑和抗氧化劑，更優(yōu)選地所述組合物包含填料刺激劑、抗結(jié)塊劑、濕潤劑、乳化劑和抗氧化劑之各至少一種。優(yōu)選地，所述填料刺激劑為碳水化合物源，例如二糖，包括例如蔗糖、果糖、葡萄糖或右旋糖，所述抗結(jié)塊劑選自滑石、二氧化硅、硅酸鈣或高嶺土，所述濕潤劑為脫脂奶粉，所述乳化劑為基于大豆的乳化劑
18例如卵磷脂或基于植物的乳化劑例如甘油單/ 二酯(monodiglyceride)，和所述抗氧化劑為谷氨酸鈉或檸檬酸。然而，也可用本領(lǐng)域熟知的其他實(shí)施替換，條件是能夠維持組合物支持真菌生活力的能力。優(yōu)選地，所述組合物為生物控制組合物。為了有效地作為生物控制劑，組合物中存在的本發(fā)明昆蟲病原真菌或其一種或多種代謝物的所需濃度可取決于最終用途、植物的生理?xiàng)l件；病原體感染的類型(包括昆蟲物種)、濃度和程度；溫度、季節(jié)、濕度、在生長季中的階段和植物的年齡；正在應(yīng)用的傳統(tǒng)殺蟲劑或其他處理(包括殺真菌劑)的數(shù)量和種類； 和植物處理(例如去葉和修剪)而變化，在配制組合物時(shí)這些因素都要考慮。為了用作生物控制劑，當(dāng)在組合物中存在時(shí)，本發(fā)明的昆蟲病原真菌應(yīng)當(dāng)為具繁殖活力的形式。如本文使用的術(shù)語“具繁殖活力的”包括真菌的菌絲體和孢子形式。例如， 對于大多數(shù)目的，期望真菌菌株以孢子(分生孢子或芽生孢子)的形式摻入組合物。可從本發(fā)明的所有真菌菌株中獲得孢子，并且可使用本領(lǐng)域的技術(shù)產(chǎn)生孢子。從本發(fā)明的真菌菌株獲得的孢子構(gòu)成本發(fā)明的另一個(gè)方面。組合物中的真菌孢子的濃度將取決于組合物所要投入的應(yīng)用。示例性濃度范圍為約IxlO6至IxlO12孢子每毫升，優(yōu)選從約IxlO7至hlO"1， 和更優(yōu)選IxlO7至IxlO8孢子每毫升。理論上，一個(gè)感染單位應(yīng)當(dāng)足夠感染宿主，但在實(shí)際情況下需要最低感染單位數(shù)以起始感染。在化學(xué)農(nóng)藥中常規(guī)使用的致死劑量(LD)的概念對微生物農(nóng)藥是不適用的，在后者中昆蟲致病效力依賴于昆蟲病原真菌在植物或其周圍中的定植。感染劑量(ID)或感染濃度(IC)的概念更精確或合適。ID或IC指起始感染所需的實(shí)際感染單位數(shù)或暴露于病原體后導(dǎo)致死亡的感染單位數(shù)。因此，在田間或溫室中針對病原體應(yīng)用的感染單位數(shù)將影響控制程度。重要的是在正確的時(shí)間合適地位置應(yīng)用期望濃度的抗植物病原細(xì)菌，以取得對害蟲的良好控制這被稱為“感染閾值”。顯而易見地，為了應(yīng)用而配制的組合物中的真菌孢子濃度可低于為了例如儲存而配制的組合物中的濃度。申請人已測定了在使用本發(fā)明的昆蟲病原真菌的情況下，當(dāng)以約 IL每公頃的比例應(yīng)用時(shí)，感染閾值出現(xiàn)在約IO7孢子每毫升噴灑溶液。由此，在一個(gè)示例中，為了應(yīng)用而配制的組合物優(yōu)選地具有至少約IO7孢子每毫升的濃度。在另一個(gè)示例中， 為了儲存而配制的組合物(例如，能夠配制為適于應(yīng)用的組合物的組合物，如可濕潤粉末) 將優(yōu)選地具有約IOltl孢子每毫升的濃度。顯而易見地，為了儲存和之后配制為適于應(yīng)用的組合物而配制的組合物中，孢子濃度必須足夠高以允許所述用于應(yīng)用的組合物也具有足夠濃度從而能夠應(yīng)用以達(dá)到感染閾值。優(yōu)選地，組合物為在長于約2周，優(yōu)選地長于約1個(gè)月、約2個(gè)月、約3個(gè)月、約4 個(gè)月、約5個(gè)月，更優(yōu)選地長于約6個(gè)月的時(shí)期內(nèi)能夠支持真菌的繁殖活力或昆蟲致病效力的穩(wěn)定組合物。為適于用作生物控制組合物，組合物優(yōu)選地能夠在長于約6個(gè)月的時(shí)期內(nèi)支持真菌的繁殖活力或昆蟲致病效力。使用本領(lǐng)域熟知的傳統(tǒng)固體基質(zhì)和液體發(fā)酵技術(shù)，可將本發(fā)明的昆蟲病原真菌培養(yǎng)至足夠量以允許用作生物控制劑。例如，使用營養(yǎng)膜、深層培養(yǎng)和稻基質(zhì)培養(yǎng)技術(shù)(rice substrate growing teniques)，可大量產(chǎn)生選定菌株的孢子用于田間應(yīng)用。類似的，使用這些培養(yǎng)技術(shù)可產(chǎn)生足夠量的本發(fā)明真菌的代謝物，在本文的實(shí)施例中展示了示例性技術(shù)。一般在需氧條件和滿足生物生長的任何溫度，進(jìn)行生長。例如，對球孢白僵菌，優(yōu)選從10至32°C，優(yōu)選25至30°C，和最優(yōu)選23°C的溫度范圍。生長培養(yǎng)基的pH為弱酸至中性， 即約5. 0至7. 0，最優(yōu)選5. 5。培養(yǎng)時(shí)間足夠分離株達(dá)到穩(wěn)定生長期，當(dāng)在23°C培養(yǎng)時(shí)約21 天，在正常光周期下發(fā)生。可通過本領(lǐng)域熟知的方法例如通過傳統(tǒng)過濾或沉淀方法(例如離心)收獲孢子， 或使用氣旋系統(tǒng)收獲干燥。孢子可被立即使用或儲存，在0°c至6°C，優(yōu)選2°C冷藏，時(shí)間長至它們保持繁殖活力。然后一般優(yōu)選，當(dāng)不摻入本發(fā)明的組合物時(shí)，在收獲2周內(nèi)進(jìn)行使用。類似的，當(dāng)需要時(shí)，可使用本領(lǐng)域熟知的方法，例如通過傳統(tǒng)過濾或沉淀方法(例如離心)，組合(例如，對細(xì)胞內(nèi)代謝物)或不組合(例如，對分泌至生長培養(yǎng)基的代謝物) 一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞裂解步驟，從球孢白僵菌K4B3中分離球孢白僵菌K4B3的一種或多種代謝物。本發(fā)明的組合物可還包括一種或多種載體，優(yōu)選一種或多種農(nóng)業(yè)上可接受的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中載體例如農(nóng)業(yè)上可接受的載體可為固體或液體。本文中有用的載體包括一般用于配制農(nóng)用組合物的任何物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，農(nóng)業(yè)上可接受的載體可選自填料、溶劑、賦形劑、表面活性劑、 懸浮劑、展著劑/粘著劑(黏合劑)、消泡劑、分散劑、濕潤劑、減少漂移劑(drift reducing agent)、輔助劑、助劑或其混合物。可通過已充分建立的操作，將本發(fā)明的組合物配制為例如濃縮物、溶液、噴霧劑、 氣霧劑、浸浴劑(immersion bath)、浸蘸劑(dip)、乳劑、可濕潤的粉末、可溶粉末、懸浮濃縮物、粉劑(dust)、顆粒、水可分散的顆粒、微囊、糊劑、凝膠和其他制劑類型。這些操作包括混合和/或研磨活性成分和農(nóng)業(yè)上可接受的載體物質(zhì)，例如填料、 溶劑、賦形劑、表面活性劑、懸浮劑、展著劑/粘著劑(黏合劑)、消泡劑、分散劑、濕潤劑、減少漂移劑、輔助劑、助劑。在一個(gè)實(shí)施方案中固體載體包括但不限于礦物土例如硅酸、硅膠、硅酸鹽、滑石、 高嶺土、無水硅酸鋁白土、石灰?guī)r、石灰、白堊、紅玄武土、黃土、粘土、白云石、硅藻土、氧化鋁硫酸鈣、硫酸鎂、氧化酶、磨碎的塑料、肥料例如硫酸銨、磷酸銨、硝酸銨和尿素，和植物產(chǎn)物例如谷物粗粉、樹皮粗粉、木材粗粉和堅(jiān)果殼粗粉、纖維質(zhì)粉末等等。以下適用作顆粒劑的固體載體壓碎或分級分離的天然巖石例如方解石、大理石、浮石、海泡石和白云石；無機(jī)或有機(jī)粗粉的合成顆粒；有機(jī)材料例如鋸末、椰殼、玉米芯、玉米殼或煙草桿的顆粒；硅藻土、磷酸三鈣、粉狀軟木或活性炭黑；水溶性聚合物、樹脂、蠟；或固體肥料。如果需要，固體組合物可包含一種或多種相容的濕潤劑、分散劑、乳化劑或著色劑，當(dāng)為固體時(shí)其也可充當(dāng)稀釋劑。在一個(gè)實(shí)施方案中載體也可為液體，例如水；醇，特別是丁醇或乙二醇，以及它們的醚或酯，特別是醋酸甲基乙二醇酯；酮，特別是丙酮、環(huán)己酮、甲基乙基酮、甲基異丁基酮或異佛爾酮；石油餾分例如石蠟或芳香烴，特別是二甲苯或烷基萘；礦物或植物油；脂肪族氯化烴，特別是三氯乙烷或二氯甲烷；芳香族氯化烴，特別是氯苯；水溶性或強(qiáng)極性溶劑例如二甲基甲酰胺、二甲亞砜或N-甲基吡咯烷酮；液化的氣體；等等，或它們的混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，表面活性劑包括非離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑和/或兩性表面活性劑，并促進(jìn)聚集物在噴灑時(shí)保留在溶液中的能力。
展著劑/粘著劑促進(jìn)本發(fā)明的組合物粘附在植物表面的能力。表面活性劑、展著劑/粘著劑的示例包括但不限于Tween和Triton (Rhom and Hass Company), Fortune , Pulse, C. Daxoil , Codacide oil ，D_C. Tate ，Supamet Oil, Bond ,Penetrant, Glowelt 禾Π Freeway, Citowett , Fortune Plus , Fortune Plus Lite, Fruimec, Fruimec lite，芳族磺酸例如木質(zhì)素磺酸、酚磺酸、萘磺酸和二丁基萘磺酸和脂肪酸的堿金屬、堿土金屬和銨鹽，烷基和烷基芳基磺酸鹽，和烷基、月桂基醚和脂肪醇硫酸鹽，和硫酸化的十六醇、十七醇和十八醇的鹽，脂肪醇乙二醇醚的鹽，磺酸化的萘和萘衍生物和甲醛的縮合產(chǎn)物，萘或萘磺酸和酚及甲醛的縮合產(chǎn)物，聚氧乙烯辛基酚醚，乙氧基化異辛基酚，乙氧基化辛基酚和乙氧基化壬基酚，烷基酚聚乙二醇醚，三丁基苯基聚乙二醇醚，烷基芳基聚醚醇，異十三烷基醇，脂肪醇環(huán)氧乙烷縮合物，乙氧基化蓖麻油，聚氧乙烯烷基醚，乙氧基化聚氧丙烯，月桂醇聚乙二醇醚縮醛，山梨糖醇酯，木質(zhì)素亞硫酸鹽廢液和甲基纖維素。當(dāng)選擇包含時(shí)，一種或多種農(nóng)用表面活性劑例如Tween期望地根據(jù)已知方案包括在組合物中。濕潤劑降低組合物中水的表面張力，因此增加給定量的組合物可應(yīng)用的表面區(qū)域。濕潤劑的示例包括但不限于聚丙烯酸的鹽，木質(zhì)素磺酸鹽，酚磺酸或萘磺酸的鹽，環(huán)氧乙烷和脂肪醇或脂肪酸或脂肪酯或脂肪胺的縮聚物，取代的酚(特別是烷基酚或芳基酚)， 磺基琥珀酸酯的鹽，牛磺酸衍生物(特別是烷基?；撬猁})，環(huán)氧乙烷和酚的縮聚物或醇的磷酸酯，脂肪酸和酚的酯，或上面的化合物的硫酸鹽、磺酸鹽或磷酸鹽功能衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中應(yīng)用本發(fā)明的化合物或組合物的優(yōu)選方法是通過手噴槍或商用鼓風(fēng)機(jī)噴灑稀釋的或濃縮的溶液。如上所述，本發(fā)明的組合物可單獨(dú)使用，或與一種或多種其他農(nóng)用試劑組合使用， 所述農(nóng)用試劑包括農(nóng)藥、殺昆蟲劑、殺螨劑、殺真菌劑(前提是這些殺真菌劑對本發(fā)明的真菌無害或無毒)、殺細(xì)菌劑、除草劑、抗生素、抗微生物劑、殺線蟲劑、滅鼠劑、昆蟲病原體、信息素、引誘劑、植物生長調(diào)節(jié)劑、植物激素、昆蟲生長調(diào)節(jié)劑、化學(xué)不育劑、微生物害蟲控制劑、驅(qū)避劑、病毒、誘食劑、植物營養(yǎng)素、植物肥料和生物控制。當(dāng)與其他農(nóng)用試劑組合使用時(shí)，2種試劑的施用可為分開的、同時(shí)的或順序的。這些農(nóng)用試劑的具體示例是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且許多可容易的購買到。植物營養(yǎng)素的示例包括但不限于氮、鎂、鈣、硼、鉀、銅、鐵、磷、錳、鉬、鈷、硼、銅、 硅、硒、鎳、鋁、鉻和鋅。抗生素的示例包括但不限于土霉素和鏈霉素。殺真菌劑的示例包括但不限于以下種類的殺真菌劑羧酰胺類、苯并咪唑類、三唑類、羥基吡啶類、二甲酰胺類、苯基酰胺類、噻二唑類、氨基甲酸酯類、氰基肟類、肉桂酸衍生物、嗎啉類、咪唑類、β -甲氧基丙烯酸酯類和吡啶類/嘧啶類。殺真菌劑的其他示例包括但不限于天然殺真菌劑、有機(jī)殺真菌劑、基于硫的殺真菌劑、銅/鈣殺真菌劑和植物宿主防御的誘導(dǎo)物。天然殺真菌劑的示例包括但不限于全乳、乳清、脂肪酸或酯化的脂肪酸。有機(jī)殺真菌劑的示例包括但不限于通過有機(jī)認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)的任何殺真菌劑例如生物控制劑、天然產(chǎn)物、誘導(dǎo)物(其中一些也可被歸為天然產(chǎn)物)和硫和銅殺真菌劑(限于局限的使用)?；诹虻臍⒄婢鷦┑氖纠秊镵umulus DF(BASF,Germany)。銅殺真菌劑的示例為Kocide 2000 DF (Griffin Corporation, USA) 誘導(dǎo)物的示例包括但不限于殼聚糖、BioruBABA (DL-3-氨基-正丁酸，β -氨基丁酸)禾口 Milsana (Western Farm Service, Inc. , USA)。在某些實(shí)施方案中可應(yīng)用非有機(jī)殺真菌劑。非有機(jī)殺真菌劑的示例包括但不限于Bravo (用于葫蘆的PM控制)；SupershielcTaates，NZ)(用于玫瑰上的葡萄孢和PM控制)；Topas 200EW(用于葡萄和葫蘆的PM控制)；Flint (用于蘋果和葫蘆的PM控制)；Amistar WG (用于谷類的銹菌和 PM 控制)；和 Captan ，Dithane , Euparen , Rovral , Scala , Shirlan , Switch 和 Teldor (用于葡萄的葡萄孢控制)。農(nóng)藥的示例包括但不限于腈嘧菌酯(azoxystrobin)，雙苯三唑醇(bitertanol)， 萎銹靈(carboxin), Cu2O,清菌脲(cymoxanil),環(huán)唑酉享(cyproconazole),環(huán)丙啼唆 (cyprodinil), dichlofluamid, 醚唑(difenoconazole),烯唑酉享(diniconazole)， 氧唑菌(印oxiconazole)，拌種咯(fenpiclonil)，氟巧悉菌(fludioxonil)， fluquiconazole，氟硅唑(flusilazole)，粉唑醇(flutriafol)，呋氨丙靈(furalaxyl), 雙胍鹽(guazatin),己唑酉享(hexaconazole), 土菌消(hymexazol),烯菌靈(imazalil), 酰胺菌(imibenconazole)，環(huán)戊唑醇(ipconazole)，亞胺菌(kresoxim—methyl)，代森猛鋅(mancozeb)，甲霜靈(metalaxyl), R-甲霜靈，環(huán)戊唑菌(metconazole), 噴’霜靈(oxadixyl),禾S 癌酉旨(pefurazoate)，戊菌唑(penconazole)，戊菌隆(pencycuron), 丙氯靈(prochloraz),丙環(huán)唑(propiconazole), pyroquilone, SSF-109,螺嘴茂胺 (spiroxamine)，戊唑酉享(tebuconazole)，涕必靈(thiabendazole), tolifluamid，唑菌嗪 (triazoxide),三唑酮(triadimefon),唑菌酉享(triadimenol),氟菌唑(triflumizole),戊叉唑菌(triticonazole)和烯效唑(!miconazole)。非本發(fā)明真菌菌株的生物控制劑的示例是包含奧德曼細(xì)基格孢(Ulocladium oudemansii)的 BotryZen 生物控制劑。組合物也可包含廣泛的用于增強(qiáng)活性成分的添加劑例如穩(wěn)定劑和滲透劑和用于改善孢子活力、萌芽和生存性的所謂“應(yīng)激”(stressing)添加劑例如氯化鉀、甘油、氯化鈉和葡萄糖。添加劑也可包括幫助維持微生物在長期儲存中的存活力的組合物，例如未精煉的玉米油和所謂的反相乳液(在外側(cè)包含油和蠟的混合物，在內(nèi)側(cè)包含水、海藻酸鈉和分生孢子)。重要的是使用的任何添加劑以不影響生物控制劑的有效性的量存在。US 5780023提供了包括載體、防腐劑、表面活性劑和濕潤劑、展著劑和營養(yǎng)素的合適組合物的示例，在本文中以其整體引入作為參考。申請人:也已確定許多常用殺真菌劑不會(huì)不利地影響本發(fā)明的昆蟲病原真菌。本發(fā)明的組合物因此也可包括這些殺真菌劑?？蛇x地，在控制程序中本發(fā)明組合物可聯(lián)合此類殺真菌劑但是分開地使用。本發(fā)明還提供了制備包含一種或多種本發(fā)明的昆蟲病原真菌的組合物的方法，所述方法包括獲得所述昆蟲病原真菌的具繁殖活力的形式，和將所述昆蟲病原真菌的所述具繁殖活力的形式與至少一種農(nóng)業(yè)上可接受的載體組合?？蓪⒔M合物制備為多種形式。一種制品包含可撒在植物或其周圍上的粉末形式的本發(fā)明組合物。在另一種形式中，組合物與稀釋劑例如水混合以形成噴霧劑、泡沫、凝膠或浸蘸劑并使用已知的方案合適地應(yīng)用。在目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用加壓噴霧器以約 lgm/L或約1至3kg/ha在每公頃不低于1000L的水中將如上述配制的球孢白僵菌組合物與水混合。優(yōu)選地，以約lml/L將i^rtime Plus 加入組合物作為紫外線和干燥防護(hù)劑?？梢砸灶愃频姆绞綉?yīng)用包含蠟蚧霉、長孢蚧霉或玫煙色擬青霉的組合物。也可以按需要使用為其他應(yīng)用方法例如注射、擦或刷而配制的組合物，其可為任何已知的本領(lǐng)域方法。對植物周圍或環(huán)境例如土壤、水間接應(yīng)用組合物或?qū)⑵渥鳛榉N子包衣是潛在可能的。如上面討論的，包含本發(fā)明昆蟲病原真菌或其一種或多種代謝物的組合物作為有效生物控制劑應(yīng)用的濃度將取決于最終用途、植物的生理?xiàng)l件；病原體感染的類型(包括昆蟲物種)、濃度和程度；溫度、季節(jié)、濕度、在生長季中的階段和植物的年齡；正在應(yīng)用的常規(guī)殺蟲劑或其他處理(包括殺真菌劑)的數(shù)量和類型；和植物處理(例如葉的采摘和修剪)而變化。例如，在某些應(yīng)用中，可以以約IxIOici至約IxlO15孢子每公頃，優(yōu)選從約IxlO12至約IxlOw孢子每公頃，更優(yōu)選從約切1012至約IxlOw孢子每公頃，更優(yōu)選約1-3χ1013孢子每公頃的比例，應(yīng)用包含球孢白僵菌的組合物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了控制一種或多種植物病原昆蟲的方法，所述方法包括對植物或其周圍應(yīng)用球孢白僵菌菌株K4B3的具繁殖活力的形式和量。在一個(gè)實(shí)施方案中，球孢白僵菌菌株K4B3與如本文描述的一種或多種其他昆蟲病原真菌聯(lián)合應(yīng)用。優(yōu)選地，所述一種或多種其他真菌選自蠟蚧霉菌株K4V1 (匪IA No. NM05/44593) 或具有其鑒定特征的菌株；蠟蚧霉菌株K4V2(匪IA保藏號NM05/44594)或具有其鑒定特征的菌株；蠟蚧霉菌株K4V4(匪IA保藏號NM06/00007)或具有其鑒定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B1 (匪IA保藏號NM05/445%)或具有其鑒定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B2(匪IA保藏號NM06/00010)或具有其鑒定特征的菌株；長孢蚧霉菌株KT4L1 (匪IA 保藏號NM06/00009)或具有其鑒定特征的菌株；和玫煙色擬青霉菌株K4P1 (匪IA保藏號 NM06/00008)或具有其鑒定特征的菌株。此外，盡管可在控制方法中應(yīng)用具有對抗一種或多種植物病原昆蟲物種之活性的多種本發(fā)明昆蟲病原真菌菌株，但通常在方法中使用3種或更少的菌株。也考慮在一個(gè)作物周期中的相同或不同時(shí)間重復(fù)應(yīng)用。可在季節(jié)的早期或晚期應(yīng)用本發(fā)明的昆蟲病原真菌和包含本發(fā)明的昆蟲病原真菌或其一種或多種代謝物的組合物。 這可為在開花時(shí)間內(nèi)(over flowering)或在結(jié)果期期間。也可在臨收獲前或收獲后立即應(yīng)用本發(fā)明的昆蟲病原真菌和包含本發(fā)明的昆蟲病原真菌或其一種或多種代謝物的組合物， 以迅速定植壞死的或開始衰老的葉、果、莖、機(jī)收稈等等，從而防昆蟲定植。也可對冬季的休眠植物應(yīng)用本發(fā)明的昆蟲病原真菌或本發(fā)明的組合物，以延緩昆蟲在休眠組織上的生長。應(yīng)用可在裂芽(bud burst)前或后和收獲前和后的時(shí)間。然而，優(yōu)選在開花和收獲之間進(jìn)行處理。為了增加效力，優(yōu)選多次應(yīng)用(例如，在開花階段到結(jié)果階段的期間應(yīng)用 2至6次)本發(fā)明的昆蟲病原真菌或本發(fā)明的組合物。也應(yīng)考慮在雨后重復(fù)應(yīng)用本發(fā)明的昆蟲病原真菌或組合物。使用昆蟲感染性預(yù)測模型或感染分析數(shù)據(jù)，也可安排BCA應(yīng)用的時(shí)間以針對昆蟲感染風(fēng)險(xiǎn)期。
在目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，以溶液的形式應(yīng)用本發(fā)明的昆蟲病原真菌或包含本發(fā)明的昆蟲病原真菌或其一種或多種代謝物的組合物，例如如上所述的，使用加壓噴霧器。應(yīng)當(dāng)對植物部分輕輕地噴灑直至溶液即將流下前的程度?？蓪χ参锖?或其周圍的任何部分進(jìn)行應(yīng)用，例如對全部植物冠層，對冠層中花和正在成熟的果集中的區(qū)域，或?qū)χ参锴o和/ 或?qū)Ω?、塊莖附近或周圍的土壤、水或生長培養(yǎng)基等等。 優(yōu)選地包含昆蟲病原真菌的組合物是穩(wěn)定的。如本文使用的，術(shù)語“穩(wěn)定的”指組合物能夠在數(shù)周內(nèi)，優(yōu)選約1、約2、約3、約4、優(yōu)選約5、更優(yōu)選約6個(gè)月或更長時(shí)間內(nèi)支持所述真菌的繁殖活力。優(yōu)選地，組合物是穩(wěn)定的，不需要在特殊條件下儲存，例如冷藏或冷凍。應(yīng)用的組合物將控制植物病原昆蟲。植物病原昆蟲對許多收獲前和收獲后疾病負(fù)責(zé)，其攻擊植物部分并降低感染植物的生長速度、開花、結(jié)果、產(chǎn)量并可引起感染植物的死亡。如本文使用的，植物病原昆蟲包括其自身為植物病原體的昆蟲和可作為其他植物病原體例如植物病原真菌和細(xì)菌的載體的昆蟲。顯而易見地，通過控制作為其他植物病原體載體的宿主昆蟲可減少植物疾病的發(fā)病率和/或嚴(yán)重度。下表1顯示了感染在新西蘭生長的多種重要園藝作物的主要植物病原昆蟲。表1.主要昆蟲害蟲
權(quán)利要求
1.在澳大利亞國家計(jì)量院以保藏號V08/025855保藏的球孢白僵菌真菌菌株K4B3的生物純培養(yǎng)物，或具有其鑒定特征的培養(yǎng)物。
2.可從權(quán)利要求1的真菌獲得的孢子。
3.權(quán)利要求2的孢子，其為分生孢子或芽生孢子。
4.權(quán)利要求1的真菌和至少一種載體在制備組合物中的用途。
5.來自權(quán)利要求1的真菌的孢子和至少一種載體在制備組合物中的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或權(quán)利要求5的用途，其中所述組合物為生物控制組合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中所述生物控制組合物為昆蟲致病組合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求4至7中任一項(xiàng)的用途，其中所述組合物包含至少一種農(nóng)業(yè)上可接受的載體。
9.一種制備組合物的方法，包括組合權(quán)利要求1的真菌的具繁殖活力的形式和至少一種載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其還包括至少一種選自以下的真菌蠟蚧霉菌株K4V1(澳大利亞國家計(jì)量院保藏號匪05/4459；3)或具有其鑒定特征的菌株；蠟蚧霉菌株K4V2(澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM05/44594)或具有其鑒定特征的菌株；蠟蚧霉菌株K4V4(澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM06/00007)或具有其鑒定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B1 (澳大利亞國家計(jì)量院保藏號匪05/445卯)或具有其鑒定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B2(澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM06/00010)或具有其鑒定特征的菌株；長孢蚧霉菌株KT4L1 (澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM06/00009)或具有其鑒定特征的菌株；和玫煙色擬青霉菌株 K4P1 (澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM06/00008)或具有其鑒定特征的菌株。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或權(quán)利要求10的方法，其中所述至少一種載體為農(nóng)業(yè)上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求9至11之任一項(xiàng)的方法，其中所述至少一種載體選自填料刺激劑、抗結(jié)塊劑、濕潤劑、乳化劑和抗氧化劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述組合物包含填料刺激劑、抗結(jié)塊劑、濕潤劑、乳化劑和抗氧化劑之各至少一種。
14.根據(jù)權(quán)利要求9至13之任一項(xiàng)的方法，其中產(chǎn)生的組合物為生物控制組合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中生物控制組合物為昆蟲病原組合物。
16.包含球孢白僵菌菌株K4B3和至少一種載體的組合物。
17.包含可從球孢白僵菌菌株K4B3獲得的孢子和至少一種載體的組合物。
18.包含球孢白僵菌菌株K4B3的一種或多種代謝物和至少一種載體的組合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求16或18的組合物，其中所述至少一種載體為農(nóng)業(yè)上可接受的載體。
20.根據(jù)權(quán)利要求16至19中任一項(xiàng)的組合物，其中所述至少一種載體選自填料刺激劑、抗結(jié)塊劑、濕潤劑、乳化劑和抗氧化劑。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的組合物，其中所述組合物包含填料刺激劑、抗結(jié)塊劑、濕潤劑、 乳化劑和抗氧化劑之各至少一種。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21的組合物，其中所述填料刺激劑為葡萄糖，所述抗結(jié)塊劑為二氧化硅，所述濕潤劑為脫脂奶粉，所述乳化劑為卵磷脂，和所述抗氧化劑為谷氨酸鈉。
23.根據(jù)權(quán)利要求16至22中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物為生物控制組合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的組合物，其中所述生物控制組合物為昆蟲致病組合物。
25.根據(jù)權(quán)利要求16至M中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物為能夠在長于約2周的時(shí)期內(nèi)支持所述真菌的繁殖活力的穩(wěn)定組合物。
26.根據(jù)權(quán)利要求16至25中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物為能夠在長于約1個(gè)月的時(shí)期內(nèi)支持所述真菌的繁殖活力的穩(wěn)定組合物。
27.根據(jù)權(quán)利要求16至沈中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物為能夠在長于約3個(gè)月的時(shí)期內(nèi)支持所述真菌的繁殖活力的穩(wěn)定組合物。
28.根據(jù)權(quán)利要求16至27中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物為能夠在長于約6個(gè)月的時(shí)期內(nèi)支持所述真菌的繁殖活力的穩(wěn)定組合物。
29.根據(jù)權(quán)利要求16至觀中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物還包含至少一種選自以下的菌株蠟蚧霉菌株K4V1(澳大利亞國家計(jì)量院保藏號匪05/4459；3)或具有其鑒定特征的菌株；蠟蚧霉菌株K4V2(澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM05/44594)或具有其鑒定特征的菌株；蠟蚧霉菌株K4V4(澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM06/00007)或具有其鑒定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B1(澳大利亞國家計(jì)量院保藏號匪05/445卯)或具有其鑒定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B2(澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM06/00010)或具有其鑒定特征的菌株；長孢蚧霉菌株KT4L1(澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM06/00009)或具有其鑒定特征的菌株；和玫煙色擬青霉菌株K4P1 (澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM06/00008)或具有其鑒定特征的菌株。
30.根據(jù)權(quán)利要求16至觀中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物還包含選自以下的任何兩種或更多種菌株蠟蚧霉菌株K4V2 (澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM05/44594)或具有其鑒定特征的菌株；蠟蚧霉菌株K4V4(澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM06/00007)或具有其鑒定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B1 (澳大利亞國家計(jì)量院保藏號匪05/445卯)或具有其鑒定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B2(澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM06/00010)或具有其鑒定特征的菌株；長孢蚧霉菌株KT4L1(澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM06/00009)或具有其鑒定特征的菌株；和玫煙色擬青霉菌株K4P1 (澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM06/00008) 或具有其鑒定特征的菌株。
31.權(quán)利要求四或30的組合物，其中菌株是，或組合物包括，蠟蚧霉菌株K4V1(澳大利亞國家計(jì)量院保藏號匪05/4459；3)或具有其鑒定特征的菌株。
32.權(quán)利要求四或30的組合物，其中菌株是，或組合物包括，蠟蚧霉菌株K4V2(澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM05/44594)或具有其鑒定特征的菌株。
33.權(quán)利要求四或30的組合物，其中菌株是，或組合物包括，蠟蚧霉菌株K4V4(澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM06/00007)或具有其鑒定特征的菌株
34.權(quán)利要求四或30的組合物，其中菌株是，或組合物包括，球孢白僵菌菌株K4B1(澳大利亞國家計(jì)量院保藏號匪05/445卯)或具有其鑒定特征的菌株
35.權(quán)利要求四或30的組合物，其中菌株是，或組合物包括，球孢白僵菌菌株K4B2(澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM06/00010)或具有其鑒定特征的菌株
36.權(quán)利要求四或30的組合物，其中菌株是，或組合物包括，長孢蚧霉菌株KT4L1(澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM06/00009)或具有其鑒定特征的菌株
37.權(quán)利要求四或30的組合物，其中菌株是，或組合物包括，玫煙色擬青霉菌株K4P1 (澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM06/00008)或具有其鑒定特征的菌株
38.球孢白僵菌菌株K4B3在控制一種或多種植物病原昆蟲中的用途。
39.可從球孢白僵菌菌株K4B3獲得的孢子在控制一種或多種植物病原昆蟲中的用途。
40.權(quán)利要求16至37中任一項(xiàng)的組合物在控制一種或多種植物病原昆蟲中的用途。
41.根據(jù)權(quán)利要求38至40中任一項(xiàng)的用途，其中所述一種或多種植物病原昆蟲選自薊馬、蚜蟲、粉虱、毛蟲和瓦螨。
42.控制一種或多種植物病原昆蟲的方法，所述方法包括對植物或其周圍應(yīng)用球孢白僵菌菌株K4B3的具繁殖活力的形式和量。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述具繁殖活力的形式為孢子。
44.控制一種或多種植物病原昆蟲的方法，所述方法包括對植物或其周圍應(yīng)用權(quán)利要求16至37中任一項(xiàng)的組合物。
45.根據(jù)權(quán)利要求42至權(quán)利要求44中任一項(xiàng)的方法，其中應(yīng)用或所述組合物包含至少一種選自以下的另外真菌蠟蚧霉菌株K4V1(澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM05/44593) 或具有其鑒定特征的菌株；蠟蚧霉菌株K4V2(澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM05/44594)或具有其鑒定特征的菌株；蠟蚧霉菌株K4V4(澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM06/00007)或具有其鑒定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B1 (澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM05/44595)或具有其鑒定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B2(澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM06/00010) 或具有其鑒定特征的菌株；長孢蚧霉菌株KT4L1 (澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM06/00009) 或具有其鑒定特征的菌株；和玫煙色擬青霉菌株K4P1(澳大利亞國家計(jì)量院保藏號 ΝΜ06/00008)或具有其鑒定特征的菌株。
46.根據(jù)權(quán)利要求42至45中任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物在應(yīng)用前與水混合至約 lgm/L至約3gm/L的終濃度，更優(yōu)選地至約lgm/L的終濃度。
47.根據(jù)權(quán)利要求42至46中任一項(xiàng)的方法，其中在應(yīng)用前將干燥防護(hù)劑混合至約 lml/L的終濃度。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中所述干燥防護(hù)劑為植物油。
49.根據(jù)權(quán)利要求42至48中任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物在應(yīng)用時(shí)包含至少IO7真菌孢子每微克。
50.根據(jù)權(quán)利要求42至49中任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物包含真菌孢子且所述組合物以約IxIOici至約IxlO15真菌孢子每公頃的比例應(yīng)用。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述組合物以約IxlO12至約IxlOw孢子每公頃的比例應(yīng)用。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中所述組合物以約切1012至約IxlOw孢子每公頃的比例應(yīng)用。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的方法，其中所述組合物以約1-3χ1013孢子每公頃的比例應(yīng)用。
54.根據(jù)權(quán)利要求42至53中任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物包含蠟蚧霉菌株K4V1(澳大利亞國家計(jì)量院保藏號匪05/4459；3)或具有其鑒定特征的培養(yǎng)物；蠟蚧霉菌株K4V2(澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM05/44594)或具有其鑒定特征的培養(yǎng)物；和/或蠟蚧霉菌株 K4V4(澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM06/00007)或具有其鑒定特征的培養(yǎng)物。
55.根據(jù)權(quán)利要求42至M中任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物包含長孢蚧霉菌株KT4L1 (澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM06/00009)或具有其鑒定特征的培養(yǎng)物。
56.根據(jù)權(quán)利要求42至M中任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物包含玫煙色擬青霉菌株 K4P1 (澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM06/00008)或具有其鑒定特征的菌株。
57.根據(jù)權(quán)利要求42至M中任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物包含球孢白僵菌菌株 K4B1 (澳大利亞國家計(jì)量院保藏號匪05/445卯)或具有其鑒定特征的培養(yǎng)物和/或球孢白僵菌菌株K4B2 (澳大利亞國家計(jì)量院保藏號NM06/00010)或具有其鑒定特征的培養(yǎng)物。
58.根據(jù)權(quán)利要求42至57中任一項(xiàng)的方法，其中所述應(yīng)用通過噴霧進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明提供了昆蟲病原性球孢白僵菌菌株，包含該昆蟲病原真菌菌株或所述菌株的代謝物的組合物，和所述昆蟲病原真菌菌株和組合物作為生物控制劑的用途。也提供了使用昆蟲病原球孢白僵菌真菌菌株或其一種或多種代謝物和任選地聯(lián)合其他昆蟲病原真菌，包括選自蚧霉屬物種、玫煙色擬青霉的菌株的真菌，以及包含所述真菌或其代謝物的組合物用于生物控制植物病原昆蟲的方法。
文檔編號C12N1/14GK102341493SQ200980149822
公開日2012年2月1日 申請日期2009年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月14日
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