專利名稱：人抗狂犬病抗體及其用途的制作方法
人抗狂犬病抗體及其用途本申請是中國發(fā)明專利申請No. 200680007172. 5的分案申請。相關(guān)信肩、本申請要求2005年2月2日提交的美國臨時專利申請60/649，512的優(yōu)先權(quán)，該專利申請的全部內(nèi)容引入本文作為參考。在本說明書全文中引用的任何專利、專利申請和參考文獻(xiàn)的內(nèi)容均全文弓I入本文作為參考。
背景技術(shù)：
狂犬病是一種由彈狀病毒科(狂犬病毒屬(lyssavirus))的RNA病毒感染引起的急性進(jìn)行性腦炎。盡管在發(fā)達(dá)國家中人類狂犬病死亡極少(在美國每年通常不到5例死亡)，但是在(例如)印度報告了相當(dāng)多的死亡例數(shù)，在印度有50，000人死于該病，并且有超過500，000人得到治療。甚至在美國，每年也有15，000到40，000人接受抗狂犬病治療。一般來說，狗是該病的主要宿主，但是其他哺乳動物如浣熊、臭鼬、蝙蝠和狐貍也是常見的宿主。該病毒從動物宿主向人的傳播通常是通過咬傷或抓傷穿過皮膚而發(fā)生的。由于狂犬病在人類中幾乎總是致命的，甚至懷疑感染也必須用積極的接觸后治療方案來治療。人類狂犬病的接觸后治療包括適當(dāng)?shù)膫谔幚怼⒖箍袢⊙迕庖咔虻鞍捉櫟絺趦?nèi)和傷口周圍的局部給藥、以及通常在幾天和幾周內(nèi)給予多劑量的狂犬病疫苗(關(guān)于狂犬病預(yù)防的綜述，參見，例如，Rupprecht和Gibbons等人,N Engl J Med 351 :25(2004))。適當(dāng)?shù)膫谔幚砜梢詼p少存活的進(jìn)入患者的病毒量。抗狂犬病血清免疫球蛋白浸潤該區(qū)域可以與狂犬病病毒結(jié)合，并且有助于清除狂犬病病毒，由此減少病毒載量(通過被動免疫)。給予多劑量的狂犬病疫苗(主動免疫)的方式通常是在第一次給藥后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，可使患者產(chǎn)生有效的主動免疫，包括體液和細(xì)胞應(yīng)答。當(dāng)前抗狂犬病血清免疫球蛋白的來源是從被接種的人類供體的血液中獲得的?？箍袢⊙迕庖咔虻鞍椎钠渌麃碓矗珩R或鼠，被認(rèn)為是不可接受的。當(dāng)前狂犬病疫苗的來源是在細(xì)胞系中產(chǎn)生以及化學(xué)滅活并凍干。盡管這些藥劑如果及時施用是非常有效的，但是仍然存在一定的障礙。例如，這些抗狂犬病藥劑的生產(chǎn)廠家極少，而且它們?nèi)匀惠^昂貴，特別是在最需要它們的發(fā)展中國家。另外，人抗狂犬病血清免疫球蛋白由于是從人類供體的血清中獲得的，因此必須高度純化以防止任何偶然物質(zhì)的傳播。而且，抗狂犬病疫苗需要勞動密集的細(xì)胞培養(yǎng)和大量的滅活和純化步驟。因此，需要改進(jìn)的治療和預(yù)防狂犬病感染的免疫療法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過提供特異性結(jié)合廣泛多種狂犬病病毒分離株并且抑制該病毒感染細(xì)胞的能力的重組完全人類的抗狂犬病單克隆抗體解決了上述問題。在一個實(shí)施方案中，這通過所述抗體在體外中和(即抑制或阻斷)狂犬病病毒的能力(例如通過RFFIT測定)得到了證明。在另一實(shí)施方案中，這通過抗體在受試者如動物或人體內(nèi)抑制狂犬病病毒感染力的能力得到了證明。
本發(fā)明的人單克隆抗體可以以實(shí)際上不受限制的量并且以高度純化的形式高效制備。因此，這些抗體適合預(yù)測、診斷和/或治療接觸或懷疑已經(jīng)接觸狂犬病的個體。本發(fā)明的抗體特別有利于狂犬病的接觸后預(yù)防(PEP)，因?yàn)樗鼈儾恍枰丝箍袢⊙迕庖咔虻鞍椎墓w來源。這些抗 體可以用本領(lǐng)域公知的用于制備人抗體的多種技術(shù)生產(chǎn)。例如，如在本文中例舉的，這些抗體可以在表達(dá)人免疫球蛋白基因片段的轉(zhuǎn)基因動物例如含有人Ig基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生。而且，這些抗體可以單獨(dú)施用，或者(例如)與抗狂犬病疫苗或其他抗體聯(lián)合施用，以提高感染狂犬病病毒的受試者(例如動物和人)的存活率。因此，本發(fā)明提供了幾個優(yōu)點(diǎn)，包括但不限于如下幾點(diǎn)-完全人類重組抗狂犬病抗體，用于預(yù)測、診斷和/或治療受試者中的狂犬病病毒或進(jìn)行狂犬病病毒接觸后預(yù)防(PEP)，例如防止或抑制受試者中由狂犬病病毒介導(dǎo)的發(fā)病率或死亡率；-組合物(例如藥物)和/或試劑盒，其中包含一種或多種完全人類重組抗狂犬病抗體，該抗體可以單獨(dú)使用或者與商售疫苗聯(lián)合使用，以治療受試者的狂犬病感染和/或進(jìn)行PEP ;和-改進(jìn)的被動免疫治療方法，用于治療感染狂犬病病毒(例如需要狂犬病病毒接觸后預(yù)防(PEP))的受試者，該方法可以單獨(dú)使用或者與主動免疫療法(狂犬病疫苗)聯(lián)合使用。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分與狂犬病病毒G糖蛋白特異性結(jié)合。特定抗體或其抗原結(jié)合部分與狂犬病病毒G糖蛋白N末端一半內(nèi)的表位特異性結(jié)合。其他一些特定抗體或其抗原結(jié)合部分與狂犬病病毒C末端結(jié)構(gòu)域內(nèi)的表位特異性結(jié)合。這些表位可以存在于例如狂犬病病毒G糖蛋白的氨基酸1-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-524 內(nèi)，或其任意間隔、部分或范圍內(nèi)。在一個實(shí)施方案中，該抗體或其抗原結(jié)合部分特異性結(jié)合狂犬病病毒G糖蛋白的N末端一半內(nèi)的表位，即大約在氨基酸殘基19-422之間。在另一實(shí)施方案中，狂犬病G糖蛋白的表位包含氨基酸殘基336-442。在一個實(shí)施方案中，狂犬病G糖蛋白包含氨基酸殘基336以及其變化，如取代或缺失。在一個相關(guān)實(shí)施方案中，狂犬病G糖蛋白的表位包含線性表位、構(gòu)象表位、不連續(xù)表位或這些表位的組合。在另一相關(guān)實(shí)施方案中，狂犬病G糖蛋白的表位由抗原位點(diǎn)I、抗原位點(diǎn)II、抗原位點(diǎn)III、抗原位點(diǎn)次要A、或這些抗原位點(diǎn)的組合例如抗原位點(diǎn)III和次要位點(diǎn)A組成。在另外一些實(shí)施方案中，人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分的特征為以小于約IOxlO-6M的Kd與狂犬病病毒特異性結(jié)合。在一個具體實(shí)施方案中，該抗體或其抗原結(jié)合部分以至少約10χ1(Γ7Μ、至少約10χ1(Γ8Μ、至少約10χ1(Γ9Μ、至少約ΙΟχΙΟ,Μ、至少約10χ1(ΓηΜ或至少約IOxlO-12M的Kd或甚至更有利的Kd與狂犬病病毒(例如，狂犬病病毒G糖蛋白)特異性結(jié)合。在各種其他實(shí)施方案中，該抗體或其抗原結(jié)合部分包含可變重鏈區(qū)，該可變重鏈區(qū)包含與克隆 17C7(SEQ ID NO :1)、6G11 (SEQ ID NO :15)、5G5、2B10 或 1E5產(chǎn)生的抗體的可變重鏈區(qū)氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或99%以上相同的氨基酸序列。
在另外一些實(shí)施方案中，該抗體或其抗原結(jié)合部分包含可變輕鏈區(qū)，該可變輕鏈區(qū)包含與克隆 17C7(SEQ ID NO :2)、6G11 (SEQ ID NO :16)、5G5、2B10 或 1E5產(chǎn)生的抗體的可變輕鏈區(qū)氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或99%以上相同的氨基酸序列。在再另外一些實(shí)施方案中，該抗體或其抗原結(jié)合部分包含可變重鏈區(qū)和可變輕鏈
區(qū)，該可變重鏈區(qū)包含與克隆 17C7 (SEQ ID NO :1)、6G11 (SEQ ID NO : 15)、5G5、2B10 或 1E5產(chǎn)生的抗體的可變重鏈區(qū)氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或99%以上相同的氨基酸序列，該可變輕鏈區(qū)包含與克隆17C7 (SEQ ID NO :2)、6G11 (SEQ ID NO :16)、5G5、2B10或1E5產(chǎn)生的抗體的可變輕鏈區(qū)氨基酸序列至少80 %、85 %、90 %、95 %、98 %、99 %或99 %以上相同的氨基酸序列。在某些其他實(shí)施方案中，該抗體或其抗原結(jié)合部分特異性結(jié)合與被克隆17C7、6G11、5G5、2B10或1E5產(chǎn)生的抗體結(jié)合的表位重疊的表位，和/或與克隆17C7、6G11、5G5、2B10或1E5產(chǎn)生的抗體競爭結(jié)合狂犬病病毒或其部分。該抗體或其抗原結(jié)合部分的可變重鏈和輕鏈區(qū)一般包括一個或多個互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)。這些⑶R包括⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)。在特定實(shí)施方案中，可變重鏈⑶R與克隆17C7(SEQ ID NOs :3，4，5)、6G11 (SEQ ID NO s : 17，18，19)、5G5、2B10 或 1E5 產(chǎn)生的抗體的⑶R(也示于表I中)至少80%、85%、90%、95%或99%或99%以上相同。在另外一些特定實(shí)施方案中，可變輕鏈 CDR 與克隆 17C7 (SEQ ID NOs :6，7，8)、6G11 (SEQ ID NOs =20,21,22)、5G5、2B10或1E5產(chǎn)生的抗體的可變輕鏈區(qū)CDR(也示于表2中)至少80%、85%、90%、95%或99%或99%以上相同。因此，本發(fā)明的特定抗體或部分包含可變重鏈區(qū)和可變輕鏈區(qū)，該可變重鏈區(qū)包含與克隆 17C7(SEQ ID NO s :3，4，5)、6G11 (SEQ ID NOs : 17，18，19)、5G5、2B10 或 1E5 產(chǎn)生的抗體的可變重鏈區(qū)⑶R至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或99%以上相同的一個或多個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，該可變輕鏈區(qū)包含與克隆17C7 (SEQ ID NOs :6，7，8)、6G11 (SEQID NOs :20, 21,22)、5G5、2B10或1E5產(chǎn)生的抗體的可變輕鏈區(qū)CDR至少80%、85%、90%、95 %、98 %、99 %或99 %以上相同的一個或多個⑶R。該抗體或其抗原結(jié)合部分的可變重鏈區(qū)也可以包括與克隆17C7 (SEQ ID NOs :3，4，5)、6G11(SEQ ID NO s : 17，18，19)、5G5、2B10 或 1E5 產(chǎn)生的抗體的可變重鏈區(qū)的 CDR 至少80%、85%、90%、95%或99%或99%以上相同的全部三個CDR，和/或與克隆17C7(SEQID NOs :6，7，8)、6G11(SEQ ID NOs :20，21，22)、5G5、2B10 或 1E5 產(chǎn)生的抗體的可變輕鏈區(qū)的CDR至少80%、85%、90%、95%或99%或99%以上相同的全部三個CDR。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，人抗體或其抗原結(jié)合部分(a)包括由人VH3-30-3或VH3-33基因編碼(即，是其產(chǎn)物)或衍生的重鏈可變區(qū)；和/或(b)包括由選自VkL6、Vk L11、Vk L13、Vk L15或Vk L19的人Vk基因編碼或衍生的輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明的人單克隆抗體包括全長抗體，例如包含效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(例如Fe結(jié)構(gòu)域)，以及抗體部分或片段，如單鏈抗體和Fab片段。該抗體還可以與多種治療劑(例如抗病毒藥或毒素)和/或標(biāo)記物連接。在另一方面，本發(fā)明提供了包含雜交瘤克隆17C7、6G11、5G5、2B10或1E5產(chǎn)生的抗體(在此也稱作“17C7”，“6G11”，“5G5”，“2B10”和“1E5”)的抗原結(jié)合部分的分離的多肽。
在另一方面，本發(fā)明提供了如下分離的核酸，其包括編碼與SEQ ID N0s:13或23至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或99%以上相同的抗體重鏈可變區(qū)的序列。本發(fā)明也提供了如下分離的核酸，其包括編碼與SEQ ID NO s :14或24至少75%、80%、85%、90^^95^^99%或99%以上相同的抗體輕鏈可變區(qū)的序列。本發(fā)明還提供了包括單獨(dú)(例如從一個或多個載體表達(dá))的任意上述核酸或其組合的表達(dá)載體，以及包含這種表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。適合表達(dá)本發(fā)明的抗體的宿主細(xì)胞包括多種真核細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、NSO細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞或植物細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供了組合物和試劑盒，其包括一種或多種如本文所述的分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，該抗體或其抗原結(jié)合部分與狂犬病病毒特異性結(jié)合并且抑制該病毒感染哺乳動物細(xì)胞的能力。該組合物或試劑盒還可以包括一種或多種與狂犬病病毒特異性結(jié)合的抗體(例如人單克隆或多克隆抗體)或其抗原結(jié)合部分。在一個實(shí)施方案中，多克隆抗體或其抗原結(jié)合部分與狂犬病病毒G糖蛋白特異性結(jié)合。在一個特定 實(shí)施方案中，該組合物或試劑盒包括以下兩者(a)與第一種狂犬病病毒分離株特異性結(jié)合的分離的人單克隆抗體；和(b)與第二種狂犬病病毒分離株特異性結(jié)合的分離的人單克隆抗體。本發(fā)明還提供治療受試者的狂犬病病毒病的方法，包括以有效抑制狂犬病病毒病例如狂犬病病毒介導(dǎo)的癥狀或發(fā)病率的量，給受試者施用如本文所述的(即，與狂犬病病毒特異性結(jié)合的)分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。本發(fā)明的人單克隆抗體或其部分(和包含該抗體或其部分的組合物)可以通過多種合適的方式給受試者給藥，例如靜脈內(nèi)(IV)、皮下(SC)、優(yōu)選肌肉內(nèi)(IM)。該抗體或其抗原結(jié)合部分可以單獨(dú)給藥或與另外一種治療劑例如第二種人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分聯(lián)合給藥。在一個實(shí)例中，該第二種人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分與第二種狂犬病病毒分離株特異性結(jié)合，該第二種狂犬病病毒分離株不同于與第一種抗體結(jié)合的分離株。在另一實(shí)例中，該抗體與另外一種藥物如抗病毒劑一起給藥。在另一實(shí)例中，該抗體與多克隆Y-球蛋白(例如人Y-球蛋白)一起給藥。在另一實(shí)例中，該抗體在狂犬病病毒疫苗之前、之后或同時給藥。另一方面，本發(fā)明提供了制備與狂犬病病毒特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合部分的方法。在一個實(shí)施方案中，該方法包括用包含狂犬病病毒例如活的或滅活的病毒的組合物免疫具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因非人動物，以及從該動物中分離抗體、抗體產(chǎn)生細(xì)胞或抗體編碼核酸?？袢〔《究梢酝ㄟ^(例如)化學(xué)處理和/或凍干來滅活。該方法可以進(jìn)一步包括評價該抗體與狂犬病病毒或狂犬病病毒G糖蛋白的
彡口口 本發(fā)明也提供了通過在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼人抗體的核酸(例如編碼抗體的抗原結(jié)合區(qū)部分的核酸)制備抗體或其抗原結(jié)合部分的方法。在另一方面，本發(fā)明提供了包含上述核酸的雜交瘤或轉(zhuǎn)染瘤。本發(fā)明還提供了一種制備表達(dá)與狂犬病病毒特異性結(jié)合的抗體的雜交瘤的方法，包括用包含狂犬病病毒或狂犬病病毒G糖蛋白的組合物免疫具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因非人動物；從該動物中分離脾細(xì)胞；由該脾細(xì)胞產(chǎn)生雜交瘤；以及選擇產(chǎn)生與狂犬病病毒或其狂犬病病毒蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體的雜交瘤。用人單克隆抗體治療人類具有幾個優(yōu)點(diǎn)。例如，這些抗體在人體中比非人抗體免疫原性更低。治療也很迅速，因?yàn)樵摽贵w一到達(dá)感染部位并直接中和致病的狂犬病病毒，即可發(fā)生狂犬病病毒滅活。人抗體也比非人抗體更有效地定位于人體肉的適當(dāng)部位。此外，該治療對于狂犬病病毒是特異性的，是重組和高度純化的，并且與傳統(tǒng)療法不同，避免了污染偶發(fā)物質(zhì)的潛在可能性。本發(fā)明涉及下述內(nèi)容第I項(xiàng).一種分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，它與狂犬病病毒特異性結(jié)合并且抑制該病毒感染細(xì)胞的能力。第2項(xiàng).第I項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分在快速熒光灶抑制試驗(yàn)(RFFIT)中中和狂犬病病毒。 第3項(xiàng).第I項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體在受試者體內(nèi)抑制狂犬
病病毒。第4項(xiàng).第I項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分防止或抑制受試者中狂犬病病毒介導(dǎo)的神經(jīng)元病理狀況；防止或抑制受試者中狂犬病病毒介導(dǎo)的腦脊髓炎；或防止或抑制受試者中狂犬病病毒介導(dǎo)的麻痹。第5項(xiàng).第I項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述狂犬病病毒是選自下組的分尚株CVS_11分尚株、ERA分尚株、Pasteur病毒分尚株、灰狐(德克薩斯州)分尚株、灰狐(亞利桑那州)分離株、北極狐(阿肯色州)分離株、臭鼬(北方中部)分離株、臭鼬(南方中部)分離株、浣熊分離株、叢林狼(德克薩斯州)分離株、狗(德克薩斯州)分離株、蝙蝠(赤蓬毛蝠；田納西州)分離株、蝙蝠(大棕蝠-鼠耳蝠；科羅拉多州)分離株、蝙蝠(鼠耳蝠；華盛頓)分離株、蝙蝠(灰蓬毛蝠；亞利桑那州)分離株、蝙蝠(東美油蝠；阿拉巴馬州)分離株、蝙蝠(巴西犬吻蝠；阿拉巴馬州)分離株、蝙蝠(銀毛蝠；華盛頓)分離株、蝙蝠(大棕蝠；賓夕法尼亞州)分離株、貓鼬(紐約/波多黎各)分離株、狗(阿根廷)分離株、狗(Sonora)分離株、狗(加蓬)分離株、狗(泰國)分離株、及其組合。第6項(xiàng).第I項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體與狂犬病病毒G蛋白或其片段內(nèi)的一個或多個表位特異性結(jié)合。第7項(xiàng).第6項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述表位位于狂犬病病毒G蛋白的氨基酸 19-524、19-439、19-422 或 336-342 之間。第8項(xiàng).第6項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述表位包括選自抗原位點(diǎn)I、抗原位點(diǎn)II、抗原位點(diǎn)III、抗原位點(diǎn)次要A及其組合的抗原位點(diǎn)。第9項(xiàng).第6項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述表位選自線性表位、構(gòu)象表位、不連續(xù)表位及其組合。第10項(xiàng).第I項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分以至少約 ΙχΚΓΜ'ΙχΙΟ Μ'ΙχΚ^Μ'ΙχΙΟ,Μ'ΙχΙΟΑΜ'ΙχΚΓ12。M 或更好的 Kd 與狂犬病病毒的 G蛋白或其片段特異性結(jié)合。第11項(xiàng).第I項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含可變重鏈區(qū)，該可變重鏈區(qū)包含與SEQ ID NO :1(17C7)或SEQ ID NO :15 (6G11)的可變重鏈區(qū)氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列。第12項(xiàng).第I項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含可變輕鏈區(qū)，該可變輕鏈區(qū)包含與SEQ ID NO :2(17C7)或SEQ ID NO :16 (6G11)的可變輕鏈區(qū)氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列。第13項(xiàng).第I項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含可變重鏈區(qū)，該可變重鏈區(qū)包含與SEQ ID NO :1(17C7)或SEQ ID NO :15 (6G11)的可變重鏈區(qū)氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。第14項(xiàng).第I項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含可變輕鏈區(qū)，該可變輕鏈區(qū)包含與SEQ ID NO :2(17C7)或SEQ ID NO :16 (6G11)的可變輕鏈 區(qū)氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。第15項(xiàng).第13項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分還包含可變輕鏈區(qū)，該可變輕鏈區(qū)包含與SEQ ID NO :2(17C7)或SEQ ID NO 16(6G11)的可變輕鏈區(qū)氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。第16項(xiàng).一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分,它與狂犬病病毒G糖蛋白上的表位特異性結(jié)合，該表位與被克隆17C7、6G11、5G5、2B10或1E5產(chǎn)生的抗體結(jié)合的表位重疊。第17項(xiàng).一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它與狂犬病病毒G糖蛋白上的表位特異性結(jié)合，該表位與被人血清免疫球蛋白或鼠單克隆抗體MAb 1112-1 (A. T. C. C.登記號HB 10751)結(jié)合的表位重疊。第18項(xiàng).第17項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分與人血清免疫球蛋白或鼠單克隆抗體MAb 1112-1 (A.T.C.C.登記號HB 10751)競爭結(jié)合狂犬病病毒G蛋白。第19項(xiàng).第I項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分的可變重鏈區(qū)包含與SEQ ID NOs :3-5 (17C7)中的一個或多個或與SEQ ID NOs :17_19(6G11)中的一個或多個至少80%相同的一個或多個互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)。第20項(xiàng).第I項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分的可變輕鏈區(qū)包含與SEQ ID NOs :6-8 (17C7)中的一個或多個或與SEQ ID NOs :20-22 (6G11)的一個或多個至少80%相同的一個或多個互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)。第21項(xiàng).第I項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分的可變重鏈區(qū)包含與SEQ ID NOs :3-5 (17C7)中的一個或多個或與SEQ ID NOs :17_19(6G11)中的一個或多個至少95%相同的一個或多個互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)。第22項(xiàng).第I項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分的可變輕鏈區(qū)包含與SEQ ID NOs :6-8 (17C7)中的一個或多個或與SEQ ID NOs :20-22 (6G11)中的一個或多個至少95%相同的一個或多個互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)。第23項(xiàng).第I項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中可變重鏈區(qū)包含與SEQ ID NOs 3-5(17C7)中的一個或多個或與SEQ ID NOs :17-19 (6G11)中的一個或多個的可變重鏈區(qū)⑶R至少80%相同的三個⑶R。第24項(xiàng).第I項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中可變輕鏈區(qū)包含與SEQ ID NOs 6-8(17C7)中的一個或多個或與SEQ ID NOs :22-22 (6G11)中的一個或多個的可變重鏈區(qū)⑶R至少80%相同的三個⑶R。
第25項(xiàng).一種與狂犬病病毒特異性結(jié)合的分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體或其抗原結(jié)合部分(a)包含由人VH3-30基因或VH3-33基因編碼或衍生的重鏈可變區(qū)；且(b)包含由選自Vk L6、Vk L11、V κ L13、V κ L15、或V κ L19的人Vk基因編碼或衍生的輕鏈可 變區(qū)。第26項(xiàng).第25項(xiàng)的抗體，其中重鏈可變區(qū)由VH3-33基因編碼或衍生，并且輕鏈可變區(qū)由Vk L13編碼或衍生。第27項(xiàng).第I項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體或其抗原結(jié)合部分抑制狂犬病病毒與哺乳動物細(xì)胞的結(jié)合。第28項(xiàng).第I項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分抑制狂犬病病毒G蛋白與哺乳動物細(xì)胞的結(jié)合。第29項(xiàng).第I項(xiàng)的抗體，其中所述抗體是全長抗體。第30項(xiàng).一種分離的多肽，其包含上述任一項(xiàng)的抗體的抗原結(jié)合部分。第31項(xiàng).第I項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含效應(yīng)結(jié)構(gòu)域。第32項(xiàng).第I項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含F(xiàn)e結(jié)構(gòu)域。第33項(xiàng).第I項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分是單鏈抗體。第34項(xiàng).第I項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分是Fab片段。第35項(xiàng).第I項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其還包含標(biāo)記或毒素。第36項(xiàng).一種組合物，其包含在藥學(xué)上可接受的載體中的上述任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分。第37項(xiàng).一種組合物，其包含兩種或多種上述任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體與狂犬病病毒的不同表位結(jié)合。第38項(xiàng).一種分離的核酸，其編碼與狂犬病病毒結(jié)合的人抗體的可變區(qū)，包含與SEQ ID Ν0:13 或 SEQ ID NO 14, SEQ ID NO :25 或 SEQ ID NO :27 至少 90%相同的序列。第39項(xiàng).一種表達(dá)載體，其包含第38項(xiàng)的核酸。第40項(xiàng).一種宿主細(xì)胞，其包含第38項(xiàng)的核酸。第41項(xiàng).一種狂犬病疫苗，其包含分離的狂犬病G糖蛋白或其片段。第42項(xiàng).一種試劑盒，其包括一種或多種如第I項(xiàng)所述的分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，和用于治療狂犬病病毒介導(dǎo)的疾病的說明。第43項(xiàng).一種治療受試者的狂犬病病毒疾病的方法，該方法包括以有效抑制狂犬病病毒疾病癥狀的量給受試者施用上述任一項(xiàng)的分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。第44項(xiàng).第43項(xiàng)的方法，其中所述受試者是人。第45項(xiàng).第43項(xiàng)的方法，其中給受試者靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下施用所述抗體或其抗原結(jié)合部分。
第46項(xiàng).第43項(xiàng)的方法，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分與第二治療劑聯(lián)合施用。第47項(xiàng).第46項(xiàng)的方法，其中所述第二治療劑是第二種人抗體或其抗原結(jié)合部分。第48項(xiàng).第46項(xiàng)的方法，其中所述第二治療劑是抗病毒劑。第49項(xiàng).第46項(xiàng)的方法，其中所述第二治療劑是狂犬病病毒疫苗。第50項(xiàng).第49項(xiàng)的方法，其中所述狂犬病病毒疫苗是狂犬病病毒G蛋白或其片段。 第51項(xiàng).一種適合治療哺乳動物中狂犬病病毒相關(guān)疾病或紊亂的組合物，其包含在藥學(xué)上可接受的載體中的第I項(xiàng)的人抗體或其抗原結(jié)合片段。第52項(xiàng).第51項(xiàng)的組合物，其中該組合物還包含第二種與狂犬病病毒結(jié)合的人抗體。第53項(xiàng).一種治療哺乳動物中狂犬病病毒相關(guān)疾病或紊亂的方法，包括給該哺乳動物施用兩種或多種與狂犬病病毒結(jié)合的抗體或其片段，使狂犬病病毒對細(xì)胞的感染力受到抑制。第54項(xiàng).第53項(xiàng)的方法，其中所述與狂犬病病毒結(jié)合的抗體或其片段是選自17C7、6G11、5G5、2B10或1E5的人單克隆抗體。第55項(xiàng).一種鑒定與狂犬病病毒或其糖蛋白特異性結(jié)合的抗體或其片段的方法，包括使該抗體接觸上述任一項(xiàng)的狂犬病G蛋白。第56項(xiàng).第55項(xiàng)的方法，其中所述抗體是人抗體血清、多克隆抗體或單克隆抗體。第57項(xiàng).第55項(xiàng)的方法，其中所述抗體與線性表位、構(gòu)象表位或其組合特異性結(jié)
口 ο第58項(xiàng).第55項(xiàng)的方法，其中確定所述抗體與一種以上的狂犬病病毒株具有交叉反應(yīng)性。第59項(xiàng).一種根據(jù)第54項(xiàng)的方法鑒定的抗體或其片段。第60項(xiàng).一種重組狂犬病G蛋白，其包含是線性表位、構(gòu)象表位或其組合的表位，并且在導(dǎo)入哺乳動物體內(nèi)時能夠誘導(dǎo)中和抗體。第61項(xiàng).第60項(xiàng)的糖蛋白，其中所述哺乳動物是人、靈長類動物或小鼠。第62項(xiàng).第61項(xiàng)的糖蛋白，其中所述小鼠是含有人免疫球蛋白序列的轉(zhuǎn)基因小鼠。通過下面的詳述和權(quán)利要求書，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將是顯而易見的。


圖I顯示重組抗狂犬病人抗體(即克隆17C7)的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。這些序列分別對應(yīng)于SEQ ID N0:1和2。標(biāo)出了各鏈的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)，其對應(yīng)于SEQ ID NOs :3、4 和 5(重鏈)和 6、7 和 8(輕鏈)。圖2顯示重組抗狂犬病人抗體(即克隆6G11)的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。這些序列分別對應(yīng)于SEQ ID N0:15和16。標(biāo)出了各鏈的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)，其對應(yīng)于SEQ ID NOs 17U8 和 19(重鏈)和 20,21 和 22 (輕鏈)。圖3是狂犬病病毒G重組糖蛋白的示意圖，示出了為表位作圖研究而分析的片段。通過免疫沉淀和免疫印跡法測定，確定人抗體17C7與氨基酸殘基19-422內(nèi)的表位結(jié)合。圖4顯示通過RFFIT測定，與人血清(hRIG)相比較，當(dāng)HuMab 17C7從I : 5連續(xù)稀釋到I : 390625時，中和狂犬病病毒。圖5，ERA-N和ERA-CO糖蛋白在293T細(xì)胞中表達(dá)，在密碼子優(yōu)化時容易表達(dá)(A)，在細(xì)胞表面上表達(dá)時能夠被17C7結(jié)合(B-D)。圖6顯示HuMab 17C7識別狂犬病G外功能區(qū)(A)，在非還原條件下(B)以及對于ERA株的G蛋白(C)識別。 圖7顯示根據(jù)ELISA⑷和免疫印跡法(B)，HuMab 17C7識別N336K和N336D突變ERA糖蛋白。圖8顯示HuMab 17C7中和細(xì)胞的ERA假病毒感染(A-B)，以及ERA G蛋白的各種突變在17C7結(jié)合方面的后果(C-D)。圖9顯示ERA G蛋白的各種突變在17C7結(jié)合方面的后果(A-B)。發(fā)明詳沭為了清楚地理解說明書和權(quán)利要求書，下面提供了如下定義。定義本文使用的術(shù)語“狂犬病病毒”是指由狂犬病病毒的RNA編碼的病毒體或其部分，例如蛋白質(zhì)部分，如狂犬病病毒G糖蛋白。術(shù)語“抗狂犬病病毒抗體”是與狂犬病病毒或狂犬病病毒產(chǎn)生的或相關(guān)的蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)或其他成分相互作用(例如結(jié)合)的抗體。“狂犬病病毒G糖蛋白抗體”是與狂犬病病毒的G糖蛋白或其片段結(jié)合的抗體。抗狂犬病病毒或G糖蛋白抗體可以結(jié)合表位，例如構(gòu)象或線性表位，或該病毒或其組分的部分或片段。術(shù)語“人抗體”是具有來源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。本文所述的人抗體可以包含不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機(jī)或位點(diǎn)特異性誘變或通過體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)?？箍袢〔《究贵w或其抗原結(jié)合部分可以單獨(dú)施用或與第二種藥劑聯(lián)合施用。受試者可以是感染了或懷疑感染了狂犬病病毒或具有狂犬病病毒介導(dǎo)的疾病的癥狀(例如神經(jīng)病理狀況、腦脊髓炎、或抗狂犬病免疫球蛋白血清滴度)的患者。這種治療可以用來治愈、康復(fù)、減輕、緩解、改變、矯正、改善、緩和、好轉(zhuǎn)或影響感染和與感染有關(guān)的疾病、疾病的癥狀或患該病的傾向。對于狂犬病病毒感染的臨床處理，“治療”通常被理解為在發(fā)病之前預(yù)防或防止可能產(chǎn)生的感染。有效治療狂犬病病毒感染的抗狂犬病病毒抗體的量或“治療有效量”是在單劑量或多劑量施用于受試者后有效抑制受試者的狂犬病病毒感染、疾病或其后遺癥的抗體量。該抗體或抗體片段的治療有效量可能根據(jù)諸如疾病狀態(tài)、創(chuàng)傷部位、狂犬病病毒株或分尚株、狂犬病病毒的動物載體、個體的年齡、性別和體重、以及該抗體或抗體部分在個體中引發(fā)所需應(yīng)答的能力等因素而不同。治療有效量也是抗體或抗體部分的治療有益效果超過任何毒性或不利效果的量?？贵w抑制可測量參數(shù)的能力可以在用于預(yù)測在人體中的效力的動物模型系統(tǒng)中評價。例如，如實(shí)施例中所述，抗狂犬病病毒抗體保護(hù)倉鼠免遭狂犬病病毒致死性攻擊的能力可以預(yù)測其在人體中的效力?；蛘?，也可以通過技術(shù)人員公知的試驗(yàn)在體外檢測該化合物調(diào)節(jié)狂犬病病毒/細(xì)胞相互作用例如結(jié)合、感染、毒力等的能力來評價抗體或抗體組合物的這種性質(zhì)。體外試驗(yàn)包括結(jié)合試驗(yàn)如ELISA和中和試驗(yàn)?？箍袢〔《究贵w有效預(yù)防疾病的量或該抗體的“預(yù)防有效量”是指在單劑量或多劑量施用于受試者后有效預(yù)防或延緩狂犬病病毒發(fā)病或復(fù)發(fā)或抑制其癥狀的量。但是，如果需要較長的保護(hù)間期，可以施用增加的劑量或更頻繁的給藥。例如表示兩種狀態(tài)之間量的差異的術(shù)語“拮抗”、“誘導(dǎo)”、“抑制”、“加強(qiáng)”、“提高”、“增加”、“降低”等是指兩種狀態(tài)之間的差異，例如統(tǒng)計學(xué)或臨床顯著的差異。術(shù)語“特異性結(jié)合”或“與...特異性結(jié)合”是指抗體與狂犬病病毒或其部分以至少IxlO-6M的親和力結(jié)合的能力，和/或與狂犬病病毒或其部分以至少兩倍于對非特異性抗原的親和力的親和力結(jié)合的能力?！翱贵w”是包含至少一個或兩個重(H)鏈可變區(qū)(在此縮寫為VH)和至少一個·或兩個輕(L)鏈可變區(qū)(在此縮寫為VL)的蛋白質(zhì)。VH和VL區(qū)可以進(jìn)一步再分為高變區(qū)，稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”(CDR)，高變區(qū)散布在被稱為“構(gòu)架區(qū)”(FR)的更加保守的區(qū)域中。構(gòu)架區(qū)和⑶R的范圍已經(jīng)準(zhǔn)確定義(參見，Kabat, E. A.等，Sequences of Proteinsof Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department ofHealth and HumanServices, NIH Publication No. 91-3242，1991，和 Chothia，C.等，J. Mol. Biol. 196 :901-917，1987，引入本文作為參考)。優(yōu)選地，每個VH和VL由三個CDR和四個FR組成，它們從氨基端到羧基端以如下順序排列FR1，CDRl，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，F(xiàn)R4。抗體的VH或VL區(qū)還可包括全部或部分重鏈或輕鏈恒定區(qū)。在一個實(shí)施方案中，該抗體是兩條免疫球蛋白重鏈和兩條免疫球蛋白輕鏈的四聚體，其中免疫球蛋白重鏈和輕鏈例如通過二硫鍵鏈間連接。重鏈恒定區(qū)包括三個結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3。輕鏈恒定區(qū)由一個結(jié)構(gòu)域CL組成。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗體相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)一般介導(dǎo)該抗體與宿主組織或因子(包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)第一成分(Clq))的結(jié)合。術(shù)語“抗體”包括IgA, IgG, IgE, IgD, IgM型(以及它們的亞型)的完整免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的輕鏈可以是K或λ型。術(shù)語“免疫球蛋白”是指由基本由免疫球蛋白基因編碼的一個或多個多肽組成的蛋白質(zhì)。公認(rèn)的人免疫球蛋白基因包括 K、λ、a (IgAl 和 IgA2)、Y (IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、δ (IgD)、ε (IgE)和μ (IgM)恒定區(qū)基因，以及眾多的免疫球蛋白可變區(qū)基因。全長免疫球蛋白“輕鏈”(約25Kd和214個氨基酸)的NH2-末端(約110個氨基酸)由可變區(qū)基因編碼，C00H-末端由K或λ恒定區(qū)基因編碼。全長免疫球蛋白“重鏈”(約50KD和446個氨基酸)類似地由可變區(qū)基因(約116個氨基酸)和上述其他恒定區(qū)基因之一如Y (編碼約330個氨基酸)編碼。術(shù)語“免疫球蛋白”包括具有來自人或非人來源的CDR的免疫球蛋白。免疫球蛋白的構(gòu)架可以是人、人源化或非人的構(gòu)架，例如經(jīng)修飾降低了在人體中的抗原性的鼠構(gòu)架，或合成構(gòu)架例如共有序列。成熟的免疫球蛋白/抗體可變區(qū)一般不含前導(dǎo)序列。免疫球蛋白/抗體根據(jù)它們的恒定區(qū)可以進(jìn)一步區(qū)別為不同類別(例如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)和亞類或同種型(例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)。本文使用的術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡稱為“抗體部分”或“部分”)是指與狂犬病病毒或其組分(例如G糖蛋白)特異性結(jié)合的抗體的一部分，例如這樣一種分子其中一條或多條免疫球蛋白鏈不是全長的，但是其與狂犬病病毒或其組分特異性結(jié)合。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”中所包括的結(jié)合部分的例子包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii)F(ab’ )2片段，即包含在鉸鏈區(qū)處通過二硫鍵連接的兩條Fab片段的雙價片段；(iii)由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(V)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward等(1989)Nature 341 544-546,1989);和(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其具有足以特異性結(jié)合(例如)可變區(qū)的抗原結(jié)合部分的構(gòu)架。輕鏈可變區(qū)的抗原結(jié)合部分和重鏈可變區(qū)的抗原結(jié)合部分，例如Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域VL和VH，可以利用重組方法通過合成連接體連接在一起，該連接體使它們能夠形成一條蛋白質(zhì)鏈，其中VL和VH區(qū)配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv);參見，例如 Bird 等(1988) Science242 :423-426 ；和 Huston 等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci.USA85 :5879-5883)。這樣的單鏈抗體也包括在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)。這些抗體部分用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)技 術(shù)獲得，并用與完整抗體相同的方法對這些部分進(jìn)行實(shí)用性篩選。術(shù)語“單特異性抗體”是指對特定靶標(biāo)例如表位表現(xiàn)出單一結(jié)合特異性和親和力的抗體。該術(shù)語包括“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”，后者在本文使用時是指具有單一分子組成的多種抗體或其部分的制劑。本文使用的術(shù)語“重組”抗體是指通過重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體，例如用轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞內(nèi)的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體，從重組組合抗體文庫中分離的抗體，從人免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)中分離的抗體，或通過包括將人免疫球蛋白基因序列剪接為其他DNA序列的任意其他方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。這些重組抗體包括人源化、CDR移植的、嵌合、體外(例如通過噬菌體展示)產(chǎn)生的抗體，并且可以任選地包含來源于人種系免疫球蛋白序列的恒定區(qū)。術(shù)語“基本相同”(或“基本同源”)是指第一氨基酸或核苷酸序列含有足夠數(shù)目的與第二氨基酸或核苷酸序列相同或等同(例如具有相似的側(cè)鏈，例如保守氨基酸置換)的氨基酸殘基或核苷酸，從而該第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有相似的活性。對于抗體來說，第二抗體與第一抗體具有相同的特異性并且具有第一抗體的至少50 %的親和力。兩個序列之間“同源性”的計算如下進(jìn)行。為了最佳比較目的將這些序列進(jìn)行比對(例如為了最佳比對可以在第一和第二氨基酸或核酸序列的一個或兩個中引入空位，并且為了比較目的可以忽略非同源序列)。為了比較目的而比對的參比序列的長度至少為參比序列長度的50%。然后比較相應(yīng)氨基酸位點(diǎn)或核苷酸位點(diǎn)處的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械奈稽c(diǎn)被與第二序列中相應(yīng)位點(diǎn)處相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時，這些分子在該位點(diǎn)處相同(此處所用的氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)?？紤]為了兩個序列之間進(jìn)行最佳比對所需要引入的空位的數(shù)目和每個空位的長度后，兩個序列之間的百分同一性是這兩個序列共有的相同位點(diǎn)的數(shù)目的函數(shù)。兩個序列之間的序列比較和百分同一性的確定可以用數(shù)學(xué)算法來實(shí)現(xiàn)。兩個氨基酸序列之間的百分同一性用已經(jīng)整合入GCG軟件包的GAP程序中的Needleman和Wunsch,J. Mol. Biol. 48 =444-453,1970的算法進(jìn)行確定，其中使用Blossum 62評分矩陣，空位罰分為12，空位延伸罰分為4，移碼空位罰分為5。本文使用的術(shù)語“在低嚴(yán)格性、中嚴(yán)格性、高嚴(yán)格性或極高嚴(yán)格性條件下雜交”描述了雜交和洗漆的條件。進(jìn)行雜交反應(yīng)的指南可見Current Protocols in MolecularBiology，J ohn Wiley & Sons,N. Y. 6. 3. 1-6. 3. 6，1989，在此引用作為參考。該文獻(xiàn)中描述了水性和非水性方法，可以使用其中任意一種。此處所指的具體雜交條件如下1)低嚴(yán)格性雜交條件約45°C下6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，隨后至少在50°C下用O. 2X SSC, O. 1%SDS洗滌兩次(對于低嚴(yán)格性條件，洗滌溫度可以提高至55°C) ；2)中嚴(yán)格性雜交條件約45°C下6X SSC，然后在60°C下用O. 2X SSC, O. 1% SDS洗滌一次或多次；3)高嚴(yán)格性雜交條件約45°C下6X SSC，隨后在65°C下用O. 2X SSC, O. 1% SDS洗滌一次或多次；4)極高嚴(yán)格性雜交條件在65°C下O. 5M磷酸鈉，7% SDS，隨后在65°C下用O. 2X SSC, I % SDS洗滌一次或多次。應(yīng)當(dāng)理解，此處所述的抗體及其抗原結(jié)合部分可以具有另外的保守或非必需氨基酸置換，這對多肽功能沒有實(shí)質(zhì)性影響。具體置換是否被耐受，即是否不會不利地影響需要的生物學(xué)性質(zhì)如結(jié)合活性，可以如Bowie等，Science，247 :1306-1310，1990所述確定?！氨Ｊ匕被嶂脫Q”是指將氨基酸殘基替換為具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基。具有相似側(cè)鏈的氨
基酸殘基家族在本領(lǐng)域中已經(jīng)定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷極性側(cè)鏈(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸?！胺潜匦琛卑被釟埢强赡芟鄬τ诙嚯娜缃Y(jié)合劑如抗體的野生型序列而改變，但基本不改變生物活性的殘基，而“必需”氨基酸殘基則導(dǎo)致這樣的改變。除非另外定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的同樣的含義。盡管下面描述了合適的方法與材料，但是在本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)中也可以使用與此處所述相似或等同的方法與材料。如有沖突，以本說明書包括定義為準(zhǔn)。另外，這些材料、方法和實(shí)施例都只是說明性的，不是限制性的。概述狂犬病病毒是引起人類致死性腦炎的RNA病毒。本文提供了用于治療和預(yù)防狂犬病病毒感染的動物、特別是人類受試者、更特別的是需要接觸后狂犬病治療或接觸后預(yù)防(PEP)的人的方法和組合物。該組合物包括識別狂犬病病毒的蛋白質(zhì)和其他分子組分(例如脂質(zhì)、碳水化合物、核酸)的抗體，包括識別狂犬病病毒G糖蛋白的抗體或其部分。特別是提供了重組完全人類單克隆抗體。在某些實(shí)施方案中，在表達(dá)人免疫球蛋白基因區(qū)段的小鼠中產(chǎn)生這些人單克隆抗體(下文描述)。也提供了抗狂犬病病毒抗體的組合。新方法包括給受試者施用可與狂犬病病毒結(jié)合的抗體(及其抗原結(jié)合部分)，以抑制受試者的狂犬病病毒介導(dǎo)的疾病。例如，本文所述的人單克隆抗狂犬病病毒抗體能夠中和狂犬病病毒并且抑制終末期狂犬病感染和腦炎。在其他實(shí)例中，可以施用抗狂犬病病毒抗體(例如抗狂犬病病毒G糖蛋白單克隆抗體)的組合，以抑制狂犬病病毒介導(dǎo)的疾病。人單克隆抗體可以在狂犬病感染的創(chuàng)傷部位局部給藥(浸潤)，任選地隨后給予抗狂犬病疫苗。I.抗體的產(chǎn)生免疫原
通常,用狂犬病病毒和/或狂犬病病毒表達(dá)的抗原免疫動物，以產(chǎn)生抗體。為了產(chǎn)生抗狂犬病病毒抗體，一般用滅活的狂犬病病毒免疫動物。例如，可以通過化學(xué)處理和/或凍干來滅活狂犬病病毒，幾種狂犬病病毒疫苗可以購買到。結(jié)合和中和狂犬病病毒的抗狂犬病病毒抗體能夠與狂犬病病毒的特定表位例如狂犬病病毒G糖蛋白相互作用。例如，抗狂犬病病毒G糖蛋白抗體能夠結(jié)合狂犬病病毒G糖蛋白的N末端區(qū)或C末端區(qū)或其蛋白質(zhì)或片段的內(nèi)部區(qū)域內(nèi)的表位(參見實(shí)施例4和圖5)或其組合。在一個實(shí)例中，結(jié)合和中和狂犬病病毒的抗體與狂犬病病毒G糖蛋白的氨基酸19-422內(nèi)的表位例如線性表位結(jié)合。在另一實(shí)例中，鑒定了一種抗體，該抗體與狂犬病病毒G糖蛋白的氨基酸19-422內(nèi)的線性表位和/或構(gòu)象表位結(jié)合。如本文所 述，這些表位也可以用來鑒定其他與狂犬病結(jié)合的抗體。在HuMAb小鼠中產(chǎn)生人單克隆抗體可以用無法用于多克隆抗體的方法產(chǎn)生單克隆抗體。多克隆抗血清在動物與動物之間不同，而單克隆制劑則表現(xiàn)出均一的抗原特異性。鼠系統(tǒng)可用于產(chǎn)生單克隆抗體，免疫方案、分離和融合脾細(xì)胞的技術(shù)和產(chǎn)生雜交瘤的方法和試劑是眾所周知的。單克隆抗體可以用多種技術(shù)產(chǎn)生，包括常規(guī)單克隆抗體方法，例如Kohler和Milstein，Nature, 256 :495，1975的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)?？偟膮⒁奌arlow, E.和Lane, D. Antibodies :A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1988。雖然這些標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是已知的，但是希望使用人源化或人抗體而不是鼠抗體來治療人類受試者，因?yàn)槿梭w會對來自小鼠和其他物種的抗體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。對鼠抗體的免疫應(yīng)答被稱為人抗鼠抗體或HAMA應(yīng)答(Schroff，R.等，Cancer Res.，45，879-885，1985)，是在人體中弓I起血清病并且導(dǎo)致鼠抗體從個體循環(huán)中被快速清除的情況。已經(jīng)證明人體中的免疫應(yīng)答是針對鼠免疫球蛋白的可變區(qū)和恒定區(qū)的。對于人體施用，人單克隆抗體比來源于其他動物的抗體和人多克隆抗體更安全。產(chǎn)生人單克隆抗體的一種有用的動物是表達(dá)人免疫球蛋白基因而不是其自身鼠免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。這種轉(zhuǎn)基因小鼠，例如“HuMAb ”小鼠，含有編碼非重排的人重鏈(μ和Y)和K輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座(minilocus)，并且具有使內(nèi)源μ和K鏈基因座失活的定向突變(參見，例如，Lonberg, N.等，Nature368(6474) :856_859，1994，和美國專利5，770，429)。因此，該小鼠表現(xiàn)為小鼠IgM或κ表達(dá)降低，而響應(yīng)于免疫，引入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變，產(chǎn)生高親和力的人IgGK單克隆抗體(Lonberg, N.等,見上；綜述見Lonberg, N. Handbook ofExperimental Pharmacology 113 :49-101,1994 ；Lonberg, N.和 Huszar, D. , Intern.Rev. Tmmunol.，13 :65-93,1995,和 Harding, F.和 Lonberg, N.，Ann. N. Y. Acad. Sci.，764 536-546，1995)。該轉(zhuǎn)基因小鼠的制備詳細(xì)描述于下面的文獻(xiàn)中Taylor, L.等，Nucleic AcidsResearch,20 :6287-6295,1992 ;Chen, J.等，International Immunology 5:647-656,1993 ；Tuaillon 等，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA90 :3720-3724,1993 ；Choi 等，NatureGenetics,4 :117-123,1993 ；Chen, J.等，EMBO J.，12 :821-830, 1993 ；Tuaillon 等，J. Tmmunol· , 152 :2912-2920,1994 ；Taylor, L.等，International Immunology,6 579-591,1994 ;和 Fishwild, D.等，Nature Biotechnology, 14 :845-851,1996。進(jìn)一步參見，美國專利5，545, 806 ;美國專利5，569，825，美國專利5,625, 126，美國專利5，633，425，美國專利5，661，016，美國專利5，770，429，美國專利5，789，650，美國專利5，814，318，美國專利5，874，299和美國專利5，877，397，均屬于Lonberg和Kay，以及PCT公布WO 01/14424，WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227，和 WO 92/03918。為了產(chǎn)生針對一種抗原的完全人類單克隆抗體,可以如Lonberg, N.等Nature,368(6474) :856-859,1994,Fishwild, D.等，Nature Biotechnology，14 :845_851，1996 和W098/24884所述用免疫原免疫HuMAb小鼠。優(yōu)選地，小鼠在第一次免疫時為6_16周齡。例如，可以用滅活狂犬病病毒的純化制劑腹膜內(nèi)免疫HuMAb小鼠。為了產(chǎn)生針對狂犬病病毒蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和/或碳水化合物分子的抗體，可以用活的、殺死的或不存活的滅活的和/或凍干的狂犬病病毒免疫小鼠。在另一實(shí)施方案中，狂犬病病毒G糖蛋白或其一個或多個片段可以用作免疫原。當(dāng)最初使用在弗氏完全佐劑中的抗原腹膜內(nèi)(IP)免疫，接著隔周用在弗氏不完全佐劑中的抗原腹膜內(nèi)免疫(最多共六次)時，HuMAb轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生最佳應(yīng)答。免疫應(yīng) 答可以在免疫方案進(jìn)程中用眼眶后取血獲得的血漿樣品進(jìn)行監(jiān)測。例如可以通過ELISA或流式細(xì)胞術(shù)篩查血漿，具有足夠效價的抗狂犬病病毒人免疫球蛋白的小鼠可用于融合。用抗原對小鼠靜脈內(nèi)加強(qiáng)免疫，3天后處死，并且取出脾臟。預(yù)期每種抗原可能需要進(jìn)行多個融合。每種抗原一般免疫數(shù)只小鼠。分離小鼠脾細(xì)胞，按照標(biāo)準(zhǔn)程序用PEG將其與小鼠骨髓瘤細(xì)胞系融合。然后對得到的雜交瘤進(jìn)行抗原特異性抗體產(chǎn)生的篩選。例如，使用50% PEG，將來自被免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸液與六分之一數(shù)目的P3X63-Ag8. 653非分泌小鼠骨髓瘤細(xì)胞(ATCC，CRL1580)融合。細(xì)胞以大約2X IO5接種于平底微量滴定板中，接著在含有20%胎克隆血清、18% “653”條件培養(yǎng)基、5% Origend GEN)、4mM L-谷氨酰胺、ImM丙酮酸鈉、5mMHEPES、0. 055mM 2-巰基乙醇、50單位/毫升青霉素、50mg/ml鏈霉素、50mg/ml慶大霉素和I X HAT (Sigma ;HAT在融合24小時后加入)的選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周。兩周后，在用HT替換了 HAT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。然后通過ELISA對各孔的上清液進(jìn)行人抗狂犬病病毒單克隆IgM和IgG抗體的篩選。將分泌抗體的雜交瘤再次平板接種，再次篩選，如果對于人IgG仍然是陽性，則通過有限稀釋將抗狂犬病病毒單克隆抗體亞克隆至少兩次。然后體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆，在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生少量抗體用于表征。在一個實(shí)施方案中，用來產(chǎn)生抗狂犬病病毒人抗體的轉(zhuǎn)基因動物含有至少一個、一般2-10個、有時25-50個或更多拷貝的W098/24884實(shí)施例12所述的轉(zhuǎn)基因(例如pHCl或pHC2)，與含有一個拷貝的W098/24884實(shí)施例5、6、8或14所述輕鏈轉(zhuǎn)基因的動物繁育，其后代與W098/24884實(shí)施例10所述的JH缺失的動物繁育，所述專利的內(nèi)容在此引用作為參考。對于這三種性狀中的每一個來說，這些動物培育為純合的。這些動物具有下列基因型單拷貝(每個染色體單倍體組)的未重排的人重鏈小基因座(W098/24884的實(shí)施例12描述)，單拷貝(每個染色體單倍體組)的未重排的人K輕鏈構(gòu)建體(W098/24884的實(shí)施例14描述)，和除去所有功能性JH區(qū)段的每個內(nèi)源小鼠重鏈基因座處的缺失(W098/24884的實(shí)施例10描述)。這些動物與對于JH區(qū)段缺失而言純合的小鼠(W098/24884的實(shí)施例10描述)繁育，產(chǎn)生對于JH區(qū)段缺失而言為純合的而對于人重鏈和輕鏈構(gòu)建體而言為半合的后代。給產(chǎn)生的動物注射抗原，用于產(chǎn)生針對這些抗原的人單克隆抗體。
從該動物中分離的B細(xì)胞對于人重鏈和輕鏈?zhǔn)菃翁禺愋缘?，因?yàn)樗鼈冎缓幸粋€拷貝的每種基因。此外，它們對于人或小鼠重鏈?zhǔn)菃翁禺愋缘模驗(yàn)橛捎谌鏦098/24884實(shí)施例9和12所述引入的跨過JH區(qū)的缺失，兩個內(nèi)源小鼠重鏈基因拷貝都無功能性。而且，大部分B細(xì)胞對于人或小鼠輕鏈?zhǔn)菃翁禺愋缘模驗(yàn)橐粋€拷貝的重排人κ輕鏈基因的表達(dá)將等位地和同型地排除在大部分B細(xì)胞中內(nèi)源小鼠κ和λ鏈基因的重排。在一個實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因小鼠將表現(xiàn)為產(chǎn)生具有重要的所有組成成分(repertoire)的免疫球蛋白，理想地基本類似于原始小鼠。因此，例如，在內(nèi)源Ig基因已經(jīng)滅活的實(shí)施方案中，總免疫球蛋白水平將為約O. l-10mg/ml血清，例如O. 5-5mg/ml或至少約1.0mg/ml。當(dāng)向轉(zhuǎn)基因小鼠中引入能夠?qū)崿F(xiàn)從IgM到IgG的轉(zhuǎn)換的轉(zhuǎn)基因時,成年小鼠血清IgG與IgM的比例優(yōu)選為約10 : I。在未成熟的小鼠中IgG與IgM的比例將更低。通常，超過約10%，例如約40-80%的脾和淋巴結(jié)B細(xì)胞將只表達(dá)人IgG蛋白質(zhì)。
轉(zhuǎn)基因小鼠中的所有組成成分理想地接近于非轉(zhuǎn)基因小鼠中所顯示的，通常高達(dá)至少約10%，優(yōu)選25-50%或更高。通常產(chǎn)生至少約一千種不同的免疫球蛋白(理想地為IgG)，優(yōu)選104-106或更多種，這主要取決于引入小鼠基因組中的不同V、J、D區(qū)的數(shù)目。一般地，免疫球蛋白對預(yù)先選擇的抗原表現(xiàn)出至少約io_6m、io_7m、io_8m、io_9m、10_1qM、10_nM、10_12M、10_13M、10_14M或更高、例如可達(dá)10_15M或更高的親和力。HuMAb小鼠能夠產(chǎn)生通過轉(zhuǎn)基因內(nèi)轉(zhuǎn)換重組而經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換(順式轉(zhuǎn)換)并且表達(dá)對該狂犬病病毒具有反應(yīng)性的免疫球蛋白的B細(xì)胞。該免疫球蛋白可以是人序列抗體，其中重鏈和輕鏈多肽由人轉(zhuǎn)基因序列編碼，該序列可包括通過體細(xì)胞突變和V區(qū)重組連接產(chǎn)生的序列，以及種系編碼序列。這些人序列免疫球蛋白可以被稱為與人VL或VH基因區(qū)段和人幾或JL區(qū)段編碼的多肽序列基本相同，盡管由于體細(xì)胞突變和不同的V-J和V-D-J重組連接而可能存在其他非種系序列。對于這些人序列抗體，每條鏈的可變區(qū)一般至少80%由人種系V、J基因區(qū)段編碼，對于重鏈，由D基因區(qū)段編碼。通常，至少85%的可變區(qū)由存在于轉(zhuǎn)基因上的人種系序列編碼。通常90%或95%或更多的可變區(qū)序列由存在于該轉(zhuǎn)基因上的人種系序列編碼。但是，由于通過體細(xì)胞突變和VJ和VDJ連接引入了非種系序列，人序列抗體通常具有一些不由人V、D或J基因區(qū)段編碼的可變區(qū)序列(較不常見地，恒定區(qū)序列)，如在小鼠種系中的人轉(zhuǎn)基因中所見到的。一般地，這些非種系序列(或各個核苷酸位點(diǎn))將在CDR中或CDR附近聚簇,或者在已知體細(xì)胞突變聚集的區(qū)域中聚簇。與狂犬病病毒結(jié)合的人序列抗體可以由同種型轉(zhuǎn)換產(chǎn)生，從而產(chǎn)生含有人序列Y鏈(如Y I、Y2或Y3)和人序列輕鏈(如K)的人抗體。這些同種型轉(zhuǎn)換的人序列抗體通常含有一個或多個體細(xì)胞突變，一般位于可變區(qū)中，通常在CDR的約10個殘基之中或之內(nèi)，這是抗原攻擊，特別是接著進(jìn)行第二(或后續(xù))抗原攻擊引起的B細(xì)胞親和成熟和選擇的結(jié)果。這些高親和力人序列抗體具有至少約1χ10_9Μ、一般至少5χ10_9Μ、通常高于ΙχΙΟ,Μ、有時為δχΙΟ,Μ至IxKTllM或更高的結(jié)合親和力抗狂犬病病毒抗體也能夠在包括非轉(zhuǎn)基因小鼠、人、兔和山羊的其他哺乳動物中產(chǎn)生?？箍袢〔《究贵w與狂犬病病毒特異性結(jié)合的人單克隆抗體包括本文所述的克隆17C7、6G11、5G5、2B10和1E5產(chǎn)生的抗體(分別稱為抗體克隆17C7、6G11、5G5、2B10和1E5)。具有與17C7、6G11、5G5、2B10或1E5的可變重鏈和輕鏈區(qū)至少80%相同的可變重鏈區(qū)和可變輕鏈區(qū)的抗體也可以與狂犬病病毒結(jié)合。在有關(guān)實(shí)施方案中，抗狂犬病病毒抗體包含，例如，與17C7、6G11、5G5、2B10或1E5的可變重鏈和/或可變輕鏈的⑶R至少80%相同的互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)。這些抗體克隆的可變重鏈區(qū)的⑶R在下面的表I中顯示。表I.可變重鏈⑶R氨基酸序列
抗體克隆 Γ11CDR氨基酸序列SEQ ID NO ~
~17C7HCDRl TYAMH3
~17C7HCDR2 WSYDGRTKDYADSVKG4
~17C7HCDR3 ERFSGAYFDY5
抗體克隆ICDR氨基酸序列SEQ ID NO ~
6G11HCDRl GFTFSSYG17
6G11HCDR2 VAVIL18
6G11HCDR3 ARIAPAGSAFDY19這些抗體克隆的可變輕鏈區(qū)的⑶R在下面的表2中顯示。表2.可變輕鏈⑶R氨基酸序列
克隆~Γ11 ~ CDR氨基酸序列SEQ ID NO ~
~17C7 LCDRl RASQSVSSYLA6
~17C7 LCDR2 DASNRAT7
~17C7 LCDR3 QQMNWP8
克隆 I CDR氨基酸序列SEQ ID NO ~
6G11 LCDRl QGISSV20
6G11 LCDR2 DAS21
6G11 LCDR3 QQFNSYPPT22CDR是免疫球蛋白中決定對特定抗原的特異性的部分。在某些實(shí)施方案中，具有序列變化(例如保守置換)的對應(yīng)于表I和表2中CDR的CDR可以與狂犬病病毒結(jié)合。例如，與狂犬病病毒結(jié)合的抗體(或其抗原結(jié)合部分)中可以存在其中CDR中的1、2、3、4或5個殘基或少于總殘基的20%被置換或缺失的⑶R。類似地，抗狂犬病病毒抗體可以具有含有共有序列的CDR，因?yàn)樵诙喾N抗體之間保守的基序可能對于結(jié)合活性至關(guān)重要。例如，本發(fā)明提供一種或多種⑶R區(qū)或公開的⑶R的衍生物的用途。這些衍生⑶R來源于公開的CDR或其部分，任選地在一個以上的氨基酸位置處改變。改變包括一個或多個如本文所述的氨基酸添加、缺失或取代。用于改變的殘基位置的例子包括確定為比其他氨基酸位置經(jīng)歷更多變異的氨基酸位置，例如，本領(lǐng)域公知的經(jīng)歷體細(xì)胞突變的位置?；蛘撸梢酝ㄟ^比較兩個或多個已知具有所需結(jié)合活性的序列，以及確定變化的CDR殘基和恒定的CDR殘基，來確定這些位置。例如，以下列出了 17C7和6G11重鏈和輕鏈可變區(qū)的比較(表3-4)，并示出了可以由此確定的CDR衍生或共有序列(表5-6)。表3.重鏈可變區(qū)的比較
權(quán)利要求
1.一種分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，它與狂犬病病毒G蛋白的抗原位點(diǎn)I、抗原位點(diǎn)II、抗原位點(diǎn)III、或抗原位點(diǎn)次要A內(nèi)的兩個或多個非重疊表位特異性結(jié)合，其中該抗體抑制狂犬病病毒感染細(xì)胞的能力。
2.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分在快速熒光灶抑制試驗(yàn)(RFFIT)中中和狂犬病病毒。
3.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體在受試者體內(nèi)抑制狂犬病病毒。
4.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分 防止或抑制受試者中狂犬病病毒介導(dǎo)的神經(jīng)元病理狀況； 防止或抑制受試者中狂犬病病毒介導(dǎo)的腦脊髓炎；或 防止或抑制受試者中狂犬病病毒介導(dǎo)的麻痹。
5.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述狂犬病病毒是選自下組的分離株CVS-Il分離株、ERA分離株、Pasteur病毒分離株、灰狐(德克薩斯州)分離株、灰狐(亞利桑那州)分離株、北極狐(阿肯色州)分離株、臭鼬(北方中部)分離株、臭鼬(南方中部)分離株、浣熊分離株、叢林狼(德克薩斯州)分離株、狗(德克薩斯州)分離株、蝙蝠(赤蓬毛蝠；田納西州)分離株、蝙蝠(大棕蝠-鼠耳蝠；科羅拉多州)分離株、蝙蝠(鼠耳蝠 ’華盛頓)分離株、蝙蝠(灰蓬毛蝠；亞利桑那州)分離株、蝙蝠(東美油蝠；阿拉巴馬州)分離株、蝙蝠(巴西犬吻蝠；阿拉巴馬州)分離株、蝙蝠(銀毛蝠；華盛頓)分離株、蝙蝠(大棕蝠；賓夕法尼亞州)分離株、貓鼬(紐約/波多黎各)分離株、狗(阿根廷)分離株、狗(Sonora)分離株、狗(加蓬)分離株、狗(泰國)分離株、及其組合。
6.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述表位位于狂犬病病毒G蛋白的氨基酸 19-524、19-439、19-422 或 336-342 之間。
7.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述表位選自線性表位、構(gòu)象表位、不連續(xù)表位及其組合。
8.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分以至少約IxlO-7M, IxlO-8M, IxlO-9M, IxlO-10M, IxlO-nM, IxKT12M 或更好的 Kd 與狂犬病病毒的 G 蛋白或其片段特異性結(jié)合。
9.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含可變重鏈區(qū)，該可變重鏈區(qū)包含與SEQ ID NO :1(17C7)或SEQ ID NO :15 (6G11)的可變重鏈區(qū)氨基酸序列至少80 %相同的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含可變輕鏈區(qū)，該可變輕鏈區(qū)包含與SEQ ID NO :2(17C7)或SEQ ID NO :16 (6G11)的可變輕鏈區(qū)氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列。
11.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含可變重鏈區(qū)，該可變重鏈區(qū)包含與SEQ ID NO :1(17C7)或SEQ ID NO :15 (6G11)的可變重鏈區(qū)氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。
12.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含可變輕鏈區(qū)，該可變輕鏈區(qū)包含與SEQ ID NO :2(17C7)或SEQ ID NO :16 (6G11)的可變輕鏈區(qū)氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。
13.權(quán)利要求13的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分還包含可變輕鏈區(qū)，該可變輕鏈區(qū)包含與SEQ ID NO :2(17C7)或SEQ ID NO :16 (6G11)的可變輕鏈區(qū)氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。
14.一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它與被一種抗體識別的表位特異性結(jié)合，該抗體包含分別如SEQ ID NO 2(17C7)或SEQ ID NO 16(6G11)所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列和如SEQ ID NO 1(17C7)或SEQ ID NO 15(6G11)所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列。
15.一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它與狂犬病病毒G糖蛋白上的表位特異性結(jié)合，該表位與被人血清免疫球蛋白或鼠單克隆抗體MAb 1112-1 (A.T.C.C.登記號HB10751)結(jié)合的表位重疊。
16.權(quán)利要求15的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分與人血清免疫球蛋白或鼠單克隆抗體MAb 1112-1 (A.T.C.C.登記號HB 10751)競爭結(jié)合狂犬病病毒G蛋白。
17.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分的可變重鏈區(qū)包含與SEQ ID NOs :3-5 (17C7)中的一個或多個或與SEQ ID NOs :17_19(6G11)中的一個或多個至少80%相同的一個或多個互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)。
18.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分的可變輕鏈區(qū)包含與SEQ ID NOs :6-8 (17C7)中的一個或多個或與SEQ ID NOs :20-22 (6G11)的一個或多個至少80%相同的一個或多個互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)。
19.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分的可變重鏈區(qū)包含與SEQ ID NOs :3-5 (17C7)中的一個或多個或與SEQ ID NOs :17-19 (6G11)中的一個或多個至少95%相同的一個或多個互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)。
20.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分的可變輕鏈區(qū)包含與SEQ ID NOs :6-8 (17C7)中的一個或多個或與SEQ ID NOs :20-22 (6G11)中的一個或多個至少95%相同的一個或多個互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)。
21.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中可變重鏈區(qū)包含與SEQID NOs 3-5(17C7)中的一個或多個或與SEQ ID NOs :17-19 (6G11)中的一個或多個的可變重鏈區(qū)⑶R至少80%相同的三個⑶R。
22.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中可變輕鏈區(qū)包含與SEQID NOs 6-8(17C7)中的一個或多個或與SEQ ID NOs :20-22 (6G11)中的一個或多個的可變重鏈區(qū)⑶R至少80%相同的三個⑶R。
23.上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體與抗原表位III和次要A內(nèi)的兩個或多個非重疊表位結(jié)合。
24.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體或其抗原結(jié)合部分 (a)包含由人VH3-30基因或VH3-33基因編碼的重鏈可變區(qū)；且 (b)包含由選自VkL6、Vk L11、Vk L13、Vk L15、或Vk L19的人Vk基因編碼的輕鏈可變區(qū)。
25.權(quán)利要求24的抗體，其中重鏈可變區(qū)由VH3-33基因編碼或衍生，并且輕鏈可變區(qū)由Vk L13編碼或衍生。
26.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體或其抗原結(jié)合部分抑制狂犬病病毒與哺乳動物細(xì)胞的結(jié)合。
27.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分抑制狂犬病病毒G蛋白與哺乳動物細(xì)胞的結(jié)合。
28.權(quán)利要求I的抗體，其中所述抗體是全長抗體。
29.一種分離的多肽，其包含上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的抗體的抗原結(jié)合部分。
30.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含效應(yīng)結(jié)構(gòu)域。
31.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含F(xiàn)e結(jié)構(gòu)域。
32.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分是單鏈抗體。
33.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分是Fab片段。
34.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合部分，其還包含標(biāo)記或毒素。
35.一種組合物，其包含在藥學(xué)上可接受的載體中的上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的抗體或其抗原結(jié)合部分。
36.一種組合物，其包含兩種或多種上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的抗體，其中所述抗體與狂犬病G糖蛋白的不同表位結(jié)合。
37.一種分離的核酸，其編碼與狂犬病病毒結(jié)合的人抗體的可變區(qū)，包含與SEQ ID NO:13 或 SEQ ID NO 14, SEQ ID NO :25 或 SEQ ID NO :27 至少 90%相同的序列。
38.一種表達(dá)載體,其包含權(quán)利要求37的核酸。
39.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求37的核酸。
40.一種狂犬病疫苗，其包含分離的狂犬病G糖蛋白或其片段。
41.一種試劑盒，其包括一種或多種如上述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，和用于治療狂犬病病毒介導(dǎo)的疾病的說明。
42.—種治療受試者的狂犬病感染的方法,該方法包括 以有效治療受試者的量給受試者施用上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分或組合物。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述受試者是人。
44.權(quán)利要求42的方法，其中給受試者靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下施用所述抗體或其抗原結(jié)合部分。
45.權(quán)利要求42的方法，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分與第二治療劑聯(lián)合施用。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述第二治療劑是第二種人抗體或其抗原結(jié)合部分。
47.權(quán)利要求45的方法，其中所述第二治療劑是抗病毒劑。
48.權(quán)利要求45的方法，其中所述第二治療劑是狂犬病病毒疫苗。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述狂犬病病毒疫苗是狂犬病病毒G蛋白或其片段。
50.一種鑒定與狂犬病病毒G蛋白的兩個或多個非重疊表位特異性結(jié)合的抗體或其片段的方法，該方法包括使該抗體接觸選自抗原位點(diǎn)I、抗原位點(diǎn)II、抗原位點(diǎn)III、或抗原位點(diǎn)次要A或其組合的抗原位點(diǎn)內(nèi)的表位，并且鑒定具有所述結(jié)合活性的抗體。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述抗體是人抗體血清、多克隆抗體或單克隆抗體。
52.權(quán)利要求50的方法，其中所述抗體與線性表位、構(gòu)象表位或其組合特異性結(jié)合。
53.權(quán)利要求50的方法,其中確定所述抗體與一種以上的狂犬病病毒株具有交叉反應(yīng)性。
54.一種根據(jù)權(quán)利要求53的方法鑒定的抗體或其片段。
55.一種組合物，其包含一種或多種肽，所述肽一起包含狂犬病病毒G蛋白的抗原位點(diǎn)I、抗原位點(diǎn)II、抗原位點(diǎn)III、或抗原位點(diǎn)次要A內(nèi)的兩個或多個非重疊表位，其中該組合物在導(dǎo)入哺乳動物體內(nèi)時能夠誘導(dǎo)中和抗體。
56.權(quán)利要求55的組合物，其中所述哺乳動物是人、靈長類動物或小鼠。
57.權(quán)利要求55的組合物，其中所述小鼠是含有人免疫球蛋白序列的轉(zhuǎn)基因小鼠。
58.一種分離的單克隆人抗體或其抗原結(jié)合部分，所述分離的單克隆人抗體或其抗原結(jié)合部分 (a)與特異性結(jié)合狂犬病病毒G蛋白并且抑制所述病毒感染細(xì)胞的能力的、下述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分競爭結(jié)合狂犬病病毒G蛋白，其中，所述分離的單克隆抗體包含如SEQ ID NO: 5所示的重鏈可變區(qū)⑶R3序列、如SEQ ID NO :8所示的輕鏈可變區(qū)CDR3序列、如SEQ ID NO 4所示的重鏈可變區(qū)CDR2序列、如SEQ ID NO 7所示的輕鏈可變區(qū)CDR2序列、如SEQ ID NO 3所示的重鏈可變區(qū)CDRl序列和如SEQ ID NO 6所示的輕鏈可變區(qū)⑶Rl序列，并且 (b)中和表8中列出的所有狂犬病病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供了與狂犬病病毒特異性結(jié)合的人單克隆抗體，其抗原結(jié)合部分，以及制備和應(yīng)用該抗體及其抗原結(jié)合部分治療受試者中狂犬病病毒的方法。
文檔編號A61K39/205GK102936284SQ201210409919
公開日2013年2月20日 申請日期2006年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月2日
發(fā)明者W·D·小托馬斯, D·安布羅西諾, R·曼德爾, S·舍恩霍夫, G·J·巴布科克, C·魯普雷希特 申請人:馬薩諸塞州大學(xué), 美國疾病控制與預(yù)防中心