抑制細胞生長的方法、對nek10變異基因具有rna干擾效應的核酸分子、以及抗癌劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于抑制細胞生長的方法、一種可用于作為抗癌劑的核酸分子和一種用于新的抗癌劑的篩選方法。在本發(fā)明中，對NEK10變異基因表達和NEK10變異蛋白活性的抑制效應是通過使用對NEK10變異基因具有RNA干擾效應的核酸分子轉染細胞而獲得的。本發(fā)明還提供了一種抗癌劑的篩選方法，該抗癌劑具有這種抑制效應作為標記。
【專利說明】抑制細胞生長的方法、對NEK10變異基因具有RNA干擾效應的核酸分子、以及抗癌劑
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于抑制細胞生長的方法、一種對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應的核酸分子、一種用于抑制NEKlO變異基因表達的組合物、一種抗癌劑和一種用于篩選抗癌劑的方法，所述組合物包含用于在細胞中表達所述核酸分子的表達載體以及所述核酸分子，所述抗癌劑具有所述核酸分子作為其活性成分。
【背景技術】
[0002]在現(xiàn)代日本，癌癥是死亡的首要原因，每年有超過30，000人死于癌癥。盡管在癌癥的檢測和治療上已經(jīng)取得了進展，但是與癌癥相關的死亡率居高不下。盡管分子靶向抗癌劑(如Gl ivec?和Herc印tin?)最近在癌癥化療使用中引起了關注，但是由于已經(jīng)證明它們在患者體內的療效是有限的，所以期望開發(fā)出新的分子靶向抗癌劑。
[0003]開始于1970年代的第一部分(first part),在構巢曲霉(Aspergillusnidulans)中發(fā)現(xiàn)了 NIMA激酶,并且在裂殖酵母(fission yeast)中發(fā)現(xiàn)了 Finl形式的NIMA激酶的同源物。NIMA激酶屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，并且已經(jīng)表明在細胞周期的M期發(fā)揮了重要的作用。也就是說，NIMA激酶明確地被確定為在進入M期、染色體凝集的控制、紡錘體的形成和胞質分裂中發(fā)揮了核心作用的分子(參見，例如，非專利文獻I )。
[0004]人類NIMA激酶的同源物由NEKl~NEKll形式的NIMA-相關激酶(NEK)組成，并且這些激酶構成了 NEK家族。到目前為止，所述NEK家族已知由細胞周期和信號轉導途徑中的重要分子組成。例如，已經(jīng)報道了 NEK家族成員的NEK2、NEK6、NEK7和NEK9以相同于NIMA激酶和Finl的方式參與了進入M期、染色體凝集的控制、紡錘體的形成和胞質分裂(參見，例如，非專利文獻2)。`
[0005]已經(jīng)報道，NEKlO在控制G2/M期檢查點(checkpoint)響應UV輻射中發(fā)揮了重要作用(參見，例如，非專利文獻3)。已經(jīng)報道，存在于NEKlO基因中的SNP參與了乳腺癌的發(fā)病(參見，例如，非專利文獻4和5)。然而，關于NEKlO是否參與了細胞生長(且特別是癌細胞的生長)是不清楚的。此外，推定為人類NEKlO變異體(variant)的分子被登記在NCBI數(shù)據(jù)庫中(登錄號:AK098832.1，被稱為人類NEKlO變異體)。盡管人類NEKlO變異體由于具有類似于NEK家族其它分子的激酶節(jié)段，從而也存在參與了細胞周期控制的可能性，但是它在體內具有何種類型的功能卻是未知的。
[0006]現(xiàn)有技術文獻
[0007]專利文獻
[0008]非專利文獻1:M.J.0 ’ Connell，et al.，Trends in CellBiology, 2003，Vol.13，pp.221-228
[0009]非專利文獻2:L.0，Regan, et al.，Cell Division, 2007，Vol.2，pp.25-36
[0010]非專利文獻3:L.S.Moniz，et al., Molecular and CellularBiology, 2011，Vol.31，pp.30-42[0011 ]非專利文獻 4:S.Ahmed, et al., Nature Genetics, 2009, Vol.41, pp.585-590
[0012]非專利文獻5:Α.C.Antoniou, et al., Cancer Research, 2010, Vol.70, pp.9742-9754
【發(fā)明內容】
[0013]本發(fā)明所解決的問題
[0014]本發(fā)明的一個目的是提供一種用于抑制細胞生長的方法、一種可用于作為抗癌劑的核酸分子和一種篩選新的抗癌劑的方法。
[0015]用于解決所述問題的手段 [0016]本發(fā)明的發(fā)明人認為，既然在小鼠中存在與人類NEKlO變異體具有同源性的分子并且NEKlO變異體是跨物種保守的，那么NEKlO變異體在細胞生長以及在細胞周期的控制中可能是重要的，由于NEKlO變異體的生物學功能是未知的，所以對其進行了廣泛的研究。結果，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當細胞中NEKlO變異體的表達被抑制時，細胞生長被抑制，并且對NEKlO變異mRNA (NEKlOsiRNA)具有RNA干擾效應的核酸對細胞(特別是對癌細胞)具有細胞生長抑制作用，從而導致完成了本發(fā)明。
[0017]也就是說，本發(fā)明采用以下所示的構成。
[0018](I) 一種用于抑制細胞生長的方法，其包含:
[0019]表達降低步驟,其用于降低NEKlO變異基因(variant gene)在細胞中的表達,或
[0020]活性降低步驟,其用于降低NEKlO變異蛋白(variant protein)在細胞中的活性。
[0021](2)上述⑴中描述的用于抑制細胞生長的方法，其中，所述表達降低步驟是用于使用選自由以下所構成的組中的至少一種類型轉染細胞的步驟:通過RNA干擾抑制NEK10變異基因的表達的核酸分子、所述核酸分子的前體、以及能夠表達所述核酸分子或所述前體的表達載體。
[0022](3)上述(2)中描述的用于抑制細胞生長的方法，其中，所述核酸分子是具有靶向NEK10變異基因的mRNA中的堿基序列的RNA干擾效應的siRNA，所述堿基序列由SEQ IDNO: 2或SEQ ID NO:4表示，以及
[0023]所述前體是具有靶向NEK10變異基因的mRNA中的堿基序列的RNA干擾效應的shRNA，所述堿基序列由SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:4表示。
[0024](4)上述(2)或(3)中描述的用于抑制細胞生長的方法，其中，所述核酸分子選自由下列所構成的組:
[0025](a)由正義 RNA (sense RNA)和反義 RNA (antisense RNA)的組合構成的 siRNA,該正義RNA由SEQ ID NO:2表示的堿基序列構成，并且該反義RNA由SEQ ID NO:3表示的堿基序列構成，
[0026](b)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，該正義RNA由SEQ ID NO: 4表示的堿基序列構成，且該反義RNA由SEQ ID NO: 5表示的堿基序列構成，
[0027](c)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，該正義RNA含有由SEQ ID NO: 2表示的堿基序列中的15~24個堿基的連續(xù)堿基序列(contiguous base sequence),并且該反義RNA含有與該正義RNA互補的堿基序列；并且該siRNA對NEK10變異基因具有RNA干擾效應，[0028](d)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，該正義RNA含有由SEQ ID NO:4表示的堿基序列中的15~24個堿基的連續(xù)堿基序列，并且該反義RNA含有與該正義RNA互補的堿基序列；并且該siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應，
[0029](e)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，該正義RNA含有由SEQ ID NO: 2表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列中的一個或多個堿基被替換、添加或缺失的堿基序列，并且該反義RNA含有與該正義RNA互補的堿基序列；并且該siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應，
[0030](f)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，該正義RNA含有由SEQ ID NO:4表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列中的一個或多個堿基被替換、添加或缺失的堿基序列，并且該反義RNA含有與該正義RNA互補的堿基序列；并且該siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應，和
[0031](g)其中(a)~(f)任一項中所描述的siRNA中的一個或多個堿基被修飾的siRNA,并且該siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應。
[0032](5)上述(2)~(4)任一項中描述的用于抑制細胞生長的方法，其中，所述前體在細胞中產(chǎn)生以下任一種:
[0033](a)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，該正義RNA由SEQ ID NO: 2表示的堿基序列構成， 并且該反義RNA由SEQ ID NO:3表示的堿基序列構成，
[0034](b)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，該正義RNA由SEQ ID NO: 4表示的堿基序列構成，且該反義RNA由SEQ ID NO:5表示的堿基序列構成，
[0035](c)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，該正義RNA含有由SEQ ID NO: 2表示的堿基序列中的15~24個堿基的連續(xù)堿基序列，并且該反義RNA含有與該正義RNA互補的堿基序列；并且該siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應，
[0036](d)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，該正義RNA含有由SEQ ID NO:4表示的堿基序列中的15~24個堿基的連續(xù)堿基序列，并且該反義RNA含有與該正義RNA互補的堿基序列；并且該siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應，
[0037](e)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，該正義RNA含有由SEQ ID NO: 2表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列中的一個或多個堿基被替換、添加或缺失的堿基序列，并且該反義RNA含有與該正義RNA互補的堿基序列；并且該siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應，
[0038](f)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，該正義RNA含有由SEQ ID NO:4表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列中的一個或多個堿基被替換、添加或缺失的堿基序列，并且該反義RNA含有與該正義RNA互補的堿基序列；并且該siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應，或
[0039](g)其中(a)~(f)任一項中所描述的siRNA中的一個或多個堿基被修飾的siRNA,并且該siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應。
[0040](6)上述⑵中所述的用于抑制細胞生長的方法，其中，所述前體是:
[0041](P) shRNA，其含有:
[0042]由SEQ ID NO: 2表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列，或其中在所述堿基序列中的一個或多個堿基被修飾、替換、添加或缺失的堿基序列，和[0043]由SEQ ID NO: 3表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列，或其中在所述堿基序列中的一個或多個堿基被修飾、替換、添加或缺失的堿基序列，
[0044]或
[0045](q) shRNA，其含有
[0046]由SEQ ID NO:4表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列，或其中在該堿基序列中的一個或多個堿基被修飾、替換、添加或缺失的堿基序列，和
[0047]由SEQ ID NO: 5表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列，或其中在該堿基序列中的一個或多個堿基被修飾、替換、添加或缺失的堿基序列；并且，
[0048]對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應的siRNA是在細胞中由(p)的shRNA或(q)的shRNA產(chǎn)生的。
[0049](7)上述⑴~(6)任一項中所描述的用于抑制細胞生長的方法，其中，所述細胞是癌細胞。
[0050](8) 一種核酸分子，其為:
[0051](a)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，該正義RNA由SEQ ID NO: 2表示的堿基序列構成，并且該反義RNA由SEQ ID NO:3表示的堿基序列構成，
[0052](b)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，該正義RNA由SEQ ID NO: 4表示的堿基序列構成，且該反義RNA由SEQ ID NO:5表示的堿基序列構成，
[0053](c)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，該正義RNA含有由SEQ ID NO: 2表示的堿基序列中的15~24個堿基的連續(xù)堿基序列，并且該反義RNA含有與該正義RNA互補的堿基序列；并且該siR NA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應，
[0054](d)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，該正義RNA含有由SEQ ID NO:4表示的堿基序列中的15~24個堿基的連續(xù)堿基序列，并且該反義RNA含有與該正義RNA互補的堿基序列；并且該siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應，
[0055](e)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，該正義RNA含有由SEQ ID NO: 2表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列中的一個或多個堿基被替換、添加或缺失的堿基序列，并且該反義RNA含有與該正義RNA互補的堿基序列；并且該siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應，
[0056](f)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，該正義RNA含有由SEQ ID NO:4表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列中的一個或多個堿基被替換、添加或缺失的堿基序列，并且該反義RNA含有與該正義RNA互補的堿基序列；并且該siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應，或
[0057](g)其中(a)~(f)任一項中所描述的siRNA中的一個或多個堿基被修飾的siRNA,并且該siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應。
[0058](9) 一種核酸分子，其為:
[0059](P) shRNA，其含有:
[0060]由SEQ ID N0:2表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列，或其中在該堿基序列中的一個或多個堿基被修飾、替換、添加或缺失的堿基序列，和
[0061]由SEQ ID N0:3表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列，或其中在該堿基序列中的一個或多個堿基被修飾、替換、添加或缺失的堿基序列，[0062]或
[0063](q) shRNA，其含有
[0064]由SEQ ID N0:4表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列，或其中在該堿基序列中的一個或多個堿基被修飾、替換、添加或缺失的堿基序列，和
[0065]由SEQ ID NO: 5表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列，或其中在該堿基序列中的一個或多個堿基被修飾、替換、添加或缺失的堿基序列；
[0066]并且，
[0067]其為用于在細胞中產(chǎn)生對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應的siRNA的前體。
[0068](10) 一種含有上述⑶或(9)所描述的核酸的表達載體,其能夠表達所述核酸。
[0069](11) 一種用于抑制NEKlO變異基因的表達的組合物，其包含選自由下列所構成的組中的一種或多種類型:
[0070]上述(8)中所描述的核酸分子，
[0071]上述(9)中所描述的核酸分子，和
[0072]上述(10)中所描述的表達載體。
[0073](12) 一種抗癌 劑，其含有選自由下列所構成的組中的一種或多種類型作為其活性成分:
[0074]上述(8)中所描述的核酸分子，
[0075]上述(9)中所描述的核酸分子，和
[0076]上述(10)中所描述的表達載體。
[0077](13) 一種用于篩選抗癌劑的方法，其使用對NEKlO變異基因的表達的抑制效應或對NEKlO變異蛋白的活性的抑制效應作為指標(indicator)。
[0078](14)上述(13)中所描述的用于篩選抗癌劑的方法，包括:
[0079]分別在存在和不存在候選物質的情況下培養(yǎng)NEKlO變異體表達細胞以獲得對NEKlO變異基因表達的抑制效應或對NEKlO變異蛋白活性的抑制效應的步驟，和
[0080]測量NEKlO變異mRNA (variant mRNA)在細胞中的表達水平或NEKlO變異蛋白的活性量、并且將在存在和不存在候選物質下的所述表達水平或活性量進行比較的步驟。
[0081]本發(fā)明的效果
[0082]根據(jù)本發(fā)明的用于抑制細胞生長的方法，通過作用于降低NEKlO變異基因活性的新途徑，從而能夠抑制細胞生長。此外，本發(fā)明的核酸分子是對NEKlO變異mRNA具有RNA干擾效應的物質，并且其優(yōu)選地在本發(fā)明的用于抑制細胞生長的方法中使用。也就是說，本發(fā)明的用于抑制細胞生長的方法以及核酸分子在癌癥治療中是非常有用的，并且甚至預期可以在使用常規(guī)的生長抑制方法不能獲得抗腫瘤效果的癌癥患者中表現(xiàn)出抗腫瘤效果。
[0083]另外，根據(jù)本發(fā)明的用于篩選抗癌劑的方法，可以獲得抗癌劑的新候選化合物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0084]圖1是示出了實施例1中各siRNA治療組的相對NEKlO變異mRNA表達水平的圖表，其以對照siRNA治療期間的NEKlO變異mRNA表達水平的值為100而作為基準。
[0085]圖2是示出了實施例1中各siRNA治療組的細胞生長速率的圖表，其以對照siRNA治療期間的細胞生長的值為100而作為基準?！揪唧w實施方式】
[0086]〈用于抑制細胞生長的方法〉
[0087]本發(fā)明的用于抑制細胞生長的方法的特征在于，包含用于降低NEKlO變異基因在細胞中的表達的表達降低步驟和/或用于降低NEKlO變異蛋白(由NEKlO變異基因編碼的蛋白質)在細胞中的活性的活性降低步驟?？梢酝ㄟ^抑制細胞中的NEKlO變異蛋白的功能來抑制細胞生長。這被認為是因為NEKlO變異蛋白在細胞中參與了細胞生長而發(fā)生的現(xiàn)象。對用于降低NEKlO變異蛋白的表達或降低NEKlO變異蛋白的活性的方法沒有特別的限制，并且可以使用用于降低細胞中的特定基因的表達或蛋白質的活性的任何已知的技術。
[0088]用于降低NEKlO變異蛋白的活性的方法的實例包括使用結合NEKlO變異蛋白的物質(例如NEKlO變異蛋白的抗體)轉染細胞，以及通過使該物質與細胞內的NEKlO變異蛋白結合來抑制NEKlO變異蛋白與其它生物分子的相互作用。對用于以結合NEKlO變異蛋白的物質轉染細胞的方法沒有特別的限制，并且可以直接通過注射等來使用所述物質以轉染細胞，或者可以使所述物質接觸細胞表面并通過胞吞作用(endocytosis)等來轉染細胞。此外，基于NEKlO變異蛋白的結構，預測NEKlO變異蛋白以與NEKlO蛋白質相同的方式具有激酶活性。因此，NEKlO變異蛋白的活性可以通過在細胞中表達為顯性陰性形式而抑制，在所述顯性陰性形式中，NEKlO變異蛋白的激酶活性位點已被缺失或替換。
[0089]另一方面，用于降低NEKlO變異基因的表達的方法的實例包括通過RNA干擾敲除(knock down)NEK10變異基因。更具體地說，使用誘導靶向NEKlO變異基因的mRNA (NEK10變異mRNA)的RNA干擾并導致細胞內的NEKlO變異mRNA降解的核酸分子轉染細胞，所述核酸分子如反義核酸、核酶核酸或雙鏈RNA (dsRNA)。
[0090]一般來說，RNA干擾是指通過向細胞中施用由dsRNA構成的小干擾RNA (siRNA)而抑制靶基因的表達的現(xiàn)象，該dsRNA由正義siRNA和反義siRNA形成，該正義siRNA由所述靶基因的mRNA序列的部分同源序列構成且所述反義siRNA由與其互補的序列構成，從而促使所述細胞中的siRNA分離成正義siRNA和反義siRNA，并且使得靶基因mRNA和反義siRNA形成雙鏈，然后通過Dicer酶降解所形成的dsRNA。除了使用siRNA轉染細胞之外，還可以以與siRNA相同的方式使用RNA干擾來抑制靶基因的表達，其通過使用作為siRNA前體的相對長鏈的dsRNA或發(fā)夾shRNA (小發(fā)夾RNA)轉染細胞、或通過表達siRNA或其前體的載體轉染細胞。另外，用于在體內通過siRNA來抑制靶基因的表達的方法也是已知的(P.Anton, et al., Nature, 2002, Vol.418, pp.38-39; L.David, et al., Nat.Genet., 2002, Vol.32, pp.107-108)。
[0091][對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應的核酸分子]
[0092]在本發(fā)明中，優(yōu)選地通過使用對NEK10變異基因具有RNA干擾效應的核酸分子(也稱為“RNAi核酸分子”)轉染細胞來降低NEK10變異基因的表達。只要RNAi干擾核酸分子對NEK10變異mRNA具有RN A干擾效應，對其就沒有特別限制，并且優(yōu)選siRNA。
[0093]在本發(fā)明中適合用于RNAi核酸分子的siRNA可以是用于NEK10變異mRNA任何區(qū)域的siRNA，只要其對所述區(qū)域具有RNA干擾效應。對NEK10變異mRNA的顆粒(particle)堿基序列具有RNA干擾效應的siRNA可以由本領域普通技術人員通過基于NEK10變異mRNA的堿基序列信息進行適當?shù)脑O計來制備。例如，人類NEK10變異mRNA的cDNA的堿基序列如SEQ ID NO:1所示。雖然在本發(fā)明中使用的siRNA優(yōu)選具有完全與NEKlO變異mRNA中的靶堿基序列互補的堿基序列，但是其可以含有一個或多個錯配，只要其具有RNA干擾效應即可。
[0094]只要本發(fā)明中使用的siRNA對NEKlO變異mRNA表現(xiàn)出RNA干擾效應，對其堿基對的長度就沒有特別限制。其一個實例siRNA中的正義RNA和反義RNA由15~30個堿基對組成，且優(yōu)選21~23個堿基對。
[0095]另外，本發(fā)明中使用的siRNA可以具有一個或多個經(jīng)修飾的堿基，只要其具有RNA干擾效應即可。這些修飾的實例包括甲基化、肌苷化(inosinylation)、dU形成、突光基團修飾和磷酸化。所述經(jīng)修飾的堿基可以存在于siRNA的正義RNA中、反義RNA中或兩者中。
[0096]本發(fā)明中使用的siRNA的末端結構可以是鈍端(blunt end)或突出端(overhanging end),只要其允許通過RNA干擾效應來調節(jié)NEKlO變異基因的表達即可。突出端的結構不僅可以包括其中3’-末端突出的結構，還可以包括其中5’-末端表現(xiàn)出前述RNA干擾效應的突出的結構。此外，雖然在先前報道的對其它基因表現(xiàn)出RNA干擾效應的眾多siRNA中突出堿基的數(shù)目為2~3個，但是本發(fā)明中使用的siRNA中的堿基數(shù)目僅需要能夠誘導RNA干擾效應即可，并且例如，突出堿基的數(shù)目可以為I~8個并且優(yōu)選2~4個。不需要這些突出堿基構成與NEKlO變異mRNA互補的(反義)或相同的(正義)序列。
[0097]對NEKlO變異mRNA具有RNA干擾效應的siRNA的實例包括靶向NEKlO變異mRNA中由SEQ ID N0:2表示的堿基序列的整個或部分長度的連續(xù)堿基序列的具有RNA干擾效應的siRNA，例如15~24個堿基的連續(xù)堿基序列，并且優(yōu)選18~20個堿基的連續(xù)堿基序列。另一個實例是靶向NEKlO變異mRNA中由SEQ ID N0:4表示的堿基序列的整個或部分長度的連續(xù)堿基序列的具有RNA干擾效應的siRNA，例如15~24個堿基的連續(xù)堿基序列，并且優(yōu)選18~20個堿基的連續(xù)堿基序列。
[0098]靶向NEKlO變異mRNA中由SEQ ID NO:2表示的堿基序列的整個長度或其部分長度的siRNA的具體實例包括:由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，該正義RNA由SEQ ID NO:2 (5’ -GAAAUCCUGUC`AGAUGAUAACUUCA-3’)表示的堿基序列構成，且該反義 RNA 由SEQ ID NO:3 (5’-UGAAGUUAUCA UCUGACAGGAUUUC-3’)表示的堿基序列構成；和由正義 RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，該正義RNA含有SEQ ID N0:2表示的堿基序列中的15~24個堿基的連續(xù)堿基序列，并且該反義RNA含有與前述正義RNA互補的堿基序列；并且所述siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應。另外，所述siRNA也可以是由正義RNA和反義RNA的組合構成的并且對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應的siRNA，該正義RNA含有SEQ ID N0:2表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列中的一個或多個堿基被替換、添加或缺失的堿基序列，并且該反義RNA含有與前述正義RNA互補的堿基序列。另外，所述siRNA還可以是其中這些siRNA中的一個或多個堿基經(jīng)修飾并同時還對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應的siRNA。
[0099]靶向NEKlO變異mRNA中由SEQ ID N0:4表示的堿基序列的整個長度或其部分長度的siRNA的具體實例包括:由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，該正義RNA由SEQ ID N0:4 (5’ -UCUGCCUUGUUUGUUCACCACUAUU-3’)表示的堿基序列構成，且該反義 RNA 由SEQ ID NO:5 (5’-AAUAGUGGUG AACAAACAAGGCAGA-3’)表示的堿基序列構成；和由正義 RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，該正義RNA含有SEQ ID N0:4表示的堿基序列中的15~24個堿基的連續(xù)堿基序列，并且該反義RNA含有與前述正義RNA互補的堿基序列；并且所述siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應。另外，所述siRNA也可以是由正義RNA和反義RNA的組合構成的并且對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應的siRNA，該正義RNA含有SEQ ID NO:4表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列中的一個或多個堿基被替換、添加或缺失的堿基序列，并且該反義RNA含有與前述正義RNA互補的堿基序列。另外，所述siRNA還可以是其中這些siRNA中的一個或多個堿基經(jīng)修飾并同時還對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應的siRNA。
[0100][RNAi核酸分子的前體]
[0101]在本發(fā)明的用于抑制細胞生長的方法中，可以直接使用RNAi核酸分子(如siRNA)轉染細胞，或者可以使用所述RNAi核酸分子的前體來轉染細胞，并且在細胞中可以通過反應(如降解)由所述前體來產(chǎn)生所述RNAi核酸分子。只要是最終在細胞中產(chǎn)生RNAi核酸分子(如siRNA)的前體，對所述RNAi核酸分子的前體就沒有特別的限制。siRNA前體的實例包括相對長鏈的dsRNA以及單鏈RNA，其中構成siRNA的正義RNA和反義RNA通過間隔子(間隔物，spacer)偶聯(lián)(couple)。雖然對間隔子的長度沒有特別的限制，但是例如其可以為3~23個堿基的長度。此外，偶聯(lián)所述正義RNA和反義RNA的間隔子優(yōu)選形成環(huán)，并且該環(huán)之前和之后的RNA序列優(yōu)選退火形成雙鏈(shRNA)。雖然對shRNA中的環(huán)和莖的長度沒有特別的限制，但是所述莖的長度例如可以是5~29個堿基。另外，可以在5’ -端和/或3’ -端上存在或不存在由若干堿基構成的突出端。RNAi核酸分子(如siRNA)是由這些前體通過細胞中Dicer酶等的消化來產(chǎn)生的。
[0102]在本發(fā)明的抑制細胞生長的方法中使用的前體的實例是靶向NEKlO變異基因的mRNA中的由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4表示的堿基序列的具有RNA干擾效應的shRNA。在本發(fā)明中使用的所述前體優(yōu)選如下shRNA，該shRNA能夠在細胞中產(chǎn)生靶向NEKlO變異mRNA中的由SEQ ID NO:2表示的堿基序列的整個長度或部分長度的siRNA或者靶向NEKlO變異mRNA中的由SEQ ID N0:4表示的堿基序列的整個長度或部分長度的siRNA。
[0103]作為用于產(chǎn)生靶向由SEQ ID` N0:2表示的堿基序列的整個序列或部分序列的siRNA的前體的核酸分子的實例包括:shRNA，其含有SEQ ID N0:2表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列、或該堿基序列中的一個或多個堿基經(jīng)修飾、替換、添加或缺失的堿基序列；和SEQ ID N0:3表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列、或該堿基序列中的一個或多個堿基經(jīng)修飾、替換、添加或缺失的堿基序列；并且在細胞中從該shRNA能夠產(chǎn)生對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應的siRNA。作為用于產(chǎn)生靶向由SEQID N0:4表示的堿基序列的整個序列或部分序列的siRNA的前體的核酸分子的實例包括:shRNA，其含有SEQ ID N0:4表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列、或該堿基序列中的一個或多個堿基經(jīng)修飾、替換、添加或缺失的堿基序列；和SEQ ID N0:5表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列、或該堿基序列中的一個或多個堿基經(jīng)修飾、替換、添加或缺失的堿基序列，并且在細胞中從該shRNA能夠產(chǎn)生對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應的siRNA。
[0104]RNAi核酸分子(如siRNA)或為其前體的核酸分子可以適合地通過例如以下而制備:體外化學合成系統(tǒng)、使用噬菌體RNA聚合酶的體內轉錄方法、或其中通過RNase III或Dicer酶來裂解已經(jīng)使用克隆cDNA作為模板通過轉錄而綴合(結合,conjugate)的長dsRNA的方法。另外，在使用含有經(jīng)修飾的堿基的RANi核酸分子的情況下，可以對合成的核酸分子進行修飾，或者可以使用經(jīng)修飾的堿基來合成RNAi核酸分子。
[0105][表達載體]
[0106]在本發(fā)明的用于抑制細胞生長的方法中，RNAi核酸分子等可以通過使用能夠在細胞中表達RNAi核酸分子或其前體的表達載體來轉染細胞并且由該表達載體來生產(chǎn)。能夠表達siRNA的載體的實例包括:表達載體，其中分別偶聯(lián)獨立的啟動子以便獨立地表達siRNA的正義RNA和反義RNA ;和經(jīng)設計以便通過選擇性剪接等獨立地由單個啟動子轉錄正義RNA和反義RNA的表達載體。能夠表達shRNA的載體的實例包括以下表達載體，其中構成shRNA的單鏈RNA偶聯(lián)在啟動子的下游。
[0107]這些表達載體可以由本領域普通技術人員使用普通的基因工程技術來容易地制造(T.R.Brummelkamp, et al., Science, 2002, Vol.296, pp.550-553 ;Ν.S.Lee, et al., Nat.Biotech., 2001, Vol.19, pp.500-505 ；M.Miyagishi 和K.Taira,Nat.Biotech.，2002，Vol.19，pp.497-500 ；P.J.Paddisonjet al.，Proc.Nat 1.Acad.Sc 1.USA，2002，V ol.99，pp.1443-1448 ； C.P.Paul, et al.，Nat.Biotech.，2002，Vol.19，p.505-508 ；G.Sui，et al.，Proc.Nat 1.Acad.Sc 1.USA, 2002，Vol.99，pp.55 15-5520 ；G.M.Barton 和 R.MedzhitovjProc.Nat 1.Acad.Sc1.USA, 2002，Vol.99，pp.14943-14945 ；P.J.Paddi son, et al.，GenesDev.，2002，Vol.16，pp.948-958)。更具體地說，編碼靶RNA序列的DNA可以通過適當?shù)夭迦敫鞣N已知的表達載體來構建?？梢詫NA聚合酶III啟動子等用作啟動子。更具體地說，可以使用啟動子如U6啟動子或Hl啟動子?？梢允褂玫囊阎d體的實例包括病毒載體(如反轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體或負鏈RNA病毒載體(minus-strand RNAviral vectors))和非病毒載體(如質粒)。
[0108][細胞轉染]
[0109]對用于使用RNAi核酸分子(如siRNA)、其前體或其表達載體轉染細胞的方法沒有特別的限制，并且可以使用當用核酸分子轉染細胞時的任何已知的技術。例如，可以通過注射來使用RNAi核酸分子等來轉染細胞，或者如果必要可以使用已知的基因轉染試劑通過胞吞作用等而并入到細胞中。另外，可以使用一種類型的RNAi核酸分子等轉染細胞或者兩種以上類型的組合來轉染細胞。
[0110]在本發(fā)明的用于抑制細胞生長的方法中，被靶向而抑制生長的那些細胞是其中表達了 NEK10變異基因的細胞，或者換句話說，能夠表達NEK10變異基因的mRNA形式的轉錄產(chǎn)物或其蛋白質形式的翻譯產(chǎn)物的細胞(稱為NEK10變異體表達細胞)。對所述NEK10變異體表達細胞沒有特別的限制，并且它們可以是正常細胞或癌細胞。另外，對它們來源的器官沒有特別的限制。例如，在為癌細胞的情況下，對癌癥的類型沒有特別的限制。此外，所述細胞可以是人類來源的或可以是來自人類以外的動物。被靶向以抑制生長的細胞可以是培養(yǎng)的細胞、從活的個體中采集的細胞或存在于活的個體中的細胞。
[0111]<用于抑制NEK10變異基因的表達的組合物和抗癌劑>
[0112]當細胞被對NEK10變異mRNA具有RNA干擾效應的核酸分子如siRNA、該siRNA的前體(且特別是shRNA)、前述siRNA的表達載體或前述前體的表達載體轉染時，由于在所述細胞中產(chǎn)生RNA干擾，NEK10變異基因的表達降低，所述細胞的生長被抑制。換句話說，這些核酸分子是以細胞生長抑制劑的活性成分的形式獲得的，因此它們可用于作為針對由細胞的過度增殖(如腫瘤細胞)所致的疾病的藥物的物質。因此，這些核酸分子可以直接地使用，或者在與藥理學上可接受的配合劑(助劑，compounding agent)適當?shù)鼗旌现笥米鹘M合物(本發(fā)明的組合物)或抗癌劑(本發(fā)明的抗癌劑)以抑制NEKlO變異基因的表達。另外，本發(fā)明的所述組合物和抗癌劑可以僅含有一種類型的核酸分子(如siRNA)或者可以含有多種類型的組合。
[0113]認為本發(fā)明的抗癌劑在治療表達NEKlO變異基因的癌癥中是有用的，所述抗癌劑包含對NEKlO變異mRNA具有RNA干擾效應的核酸分子作為其活性成分。不僅在乳腺癌中表達NEKlO變異基因，而且至少在肝癌、腎癌、前列腺癌和子宮癌中也表達NEKlO變異基因。因此，預計本發(fā)明的抗癌劑通過影響癌細胞的細胞生長而會在多種類型的癌細胞中表現(xiàn)出高水平的抗腫瘤效果。
[0114]本發(fā)明的組合物和抗癌劑表現(xiàn)的抗癌效果，如癌細胞生長的抑制效果、癌細胞的細胞死亡誘導效果、或相對于抗癌劑等的敏感性增強效果。另外，本發(fā)明的組合物和抗癌劑的這些效果可以瞬時地或永久地表現(xiàn)出來。此外，所述效果可以在用本發(fā)明的組合物或抗癌劑轉染后經(jīng)過固定的時間量之后而最終被顯現(xiàn)出來。
[0115]可以加入到本發(fā)明的組合物和抗癌劑中的配合劑的實例包括藥理學上可接受的添加劑，例如載體、賦形劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、流化劑(fluidizers)、包衣齊Li (coatingagents)、助懸劑(suspending agents)、乳化劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、矯味劑、調味劑、稀釋劑或溶解助劑。另外，本發(fā)明的所述組合物和抗癌劑可以安全地以粉末、顆粒劑、片劑、囊片、膠囊劑、注射劑、栓劑或軟膏劑的劑型口服給藥或腸胃外給藥(包括全身用藥和局部用藥)。雖然本發(fā)明的組合物和抗癌劑中的活性成分(RNAi核酸分子或其前體形式的核酸分子)的含量根據(jù)制劑而變化，但通常優(yōu)選為0.1重量％~100重量％ (以重量計0.1%~以重量計100%)。雖然劑量根據(jù)給藥途徑、患者年齡或進行預防或治療的實際癥狀等因素而變化，但是作為成人在口服給藥的情況下的活性成分的量，例如0.01mg~2000mg/天,且優(yōu)選
0.1mg~1000mg/天，并且劑量可每天一次給藥或者在若干次給藥之間進行分配。
[0116]〈用于篩選抗癌劑的方法〉
[0117]如前面所描述的，由于通過降低NEKlO變異基因的表達而抑制了對癌細胞中NEKlO變異蛋白的功能，所以抑制了癌細胞的生長并且表現(xiàn)出抗腫瘤效果。因此，對NEKlO變異基因的表達具有抑制效應的物質或對NEKlO變異蛋白的活性具有抑制效應的物質有被作為癌癥治療藥物的有效成分而使用的高可能性。因此，可以通過使用對NEKlO變異基因的表達的抑制效果或對NEKlO變異蛋白的活性的抑制效果作為指標來篩選新的抗癌劑。
[0118]抗癌劑的候選物質的實例包括核酸、肽、蛋白質、有機化合物(包括低分子量化合物和高分子量化合物)和無機化合物。本發(fā)明的篩選方法可以在含有這些候選物質(稱為測試物質)的樣品上進行。含有測試物質的樣品包括細胞提取物、基因文庫的表達產(chǎn)物、微生物的培養(yǎng)物上清液，真菌成分等。
[0119]更具體地說，在通過使用對NEKlO變異基因的表達的抑制效果作為指標來在測試物質中進行搜尋的情況下，在存在或不存在測試物質的條件下培養(yǎng)NEKlO變異基因表達細胞，隨后將在該兩種條件下NEKlO變異mRNA或NEKlO變異蛋白的表達水平進行比較。
[0120]在篩選中使用的細胞只要求是NEKlO變異體表達細胞。雖然在篩選在人類中有效的抗癌劑的情況下優(yōu)選使用源于人類的NEKlO變異體表達細胞，但是源于人類之外的動物的NEKlO變異體表達細胞也可以使用，只要所述細胞來源的物種中存在顯示與人類NEKlO變異mRNA具有同源性的堿基序列。例如，由于在小鼠轉錄產(chǎn)物中存在顯示與人類NEKlO變異mRNA具有同源性的堿基序列(NCBI登錄號:NM_001195119.1)，因此也可以使用源于小鼠的NEKlO變異體表達細胞。另外，在篩選中使用的細胞的范圍包括作為細胞集合的組織。另外，按照既定的方法在能夠產(chǎn)生NEKlO變異蛋白的狀態(tài)下通過使用具有人類NEKlO變異基因的cDNA的表達載體轉染來制備的轉化細胞也可以用作NEKlO變異體表達細胞。
[0121]在前述的篩選方法中，例如，可以通過在將測試物質添加到NEKlO變異體表達細胞的培養(yǎng)液中的狀態(tài)下來培養(yǎng)NEKlO變異體表達細胞，從而使所述測試物質與NEKlO變異體表達細胞接觸。此外，雖然對其沒有特別的限制，但是優(yōu)選選擇能夠促使細胞表達NEKlO變異mRNA或蛋白質但不破壞所述細胞的培養(yǎng)條件(例如溫度、pH和培養(yǎng)基組成)來作為測試物質接觸NEKlO變異體表達細胞的條件。
[0122]例如，可以在前述的條件下使測試物質與NEKlO變異體表達細胞接觸，并且尋找導致NEKlO變異mRNA或蛋白質的表達水平降低的那些物質從而篩選候選物質。更具體地說，在測試物質的存在下培養(yǎng)NEKlO變異體表達細胞的情況下，當與在相同的條件下、在不存在所述測試物質下的NEKlO變異mRNA或蛋白質的表達水平相比，其NEKlO變異mRNA或蛋白質的表達水平更低時，則選出該測試物質。
[0123]可以通過使用了 Northern印跡法的測量方法或者使用了具有與NEKlO變異mRNA的堿基序列互補的序列的寡核苷酸探針的DNA陣列的測量方法、或者通過使用了 NEKlO變異mRNA中存在的部分堿基序列作為引物的RT-PCR或實時PCR來測試NEKlO變異mRNA或蛋白質的表達水平。
[0124]例如，可以通過使用了 NEKlO變異蛋白的抗體的已知方法來測量NEKlO變異蛋白的表達水平。使用抗體的測量方法的實例包括蛋白質印跡、免疫沉淀和ELISA。
[0125]基于其結構，預測NEKlO變異體具有激酶活性。因此，可以通過使用對NEKlO變異蛋白的激酶活性的抑制效果作為指標來篩選抗癌劑。更具體地說，使用純化的NEKlO變異蛋白或表達NEKlO變異蛋白的細胞的提取物在存在和不存在測試物質的條件下來比較NEKlO變異蛋白的激酶活性。
[0126]在激酶活性的測量中，可以將通過基因重組技術生產(chǎn)的重組蛋白質用作NEKlO變異蛋白。重組蛋白質可以按照普通方法使用NEKlO變異基因的cDNA和已知的表達系統(tǒng)來生產(chǎn)。表達系統(tǒng)的實例包括使用了大腸標桿菌、酵母、作為宿主細胞的昆蟲細胞或哺乳動物細胞的表達系統(tǒng)以及無細胞表達系統(tǒng)。例如，強制表達NEKlO變異蛋白后的宿主細胞的提取物可以在激酶活性的測量中直接使用，或者可以使用純化自該細胞提取物的重組蛋白質。另外，還可以使用固有表達NEKlO變異蛋白的細胞的提取物或純化自該提取物的NEKlO變異蛋白來測量激酶活性。
[0127]通常用作激酶底物的各種類型的蛋白質可以用于在激酶活性的測量中使用的底物。其具體實例包括髓磷脂堿性蛋白(myelin basic protein, MBP)和組蛋白。用作底物的蛋白質可以是重組蛋白質，可以是通過肽合成等來人工合成的，或者可以是存在于細胞的固有蛋白質。在使用重組蛋白質或固有存在于細胞中的蛋白質的情況下，細胞提取物或從提取物中純化的蛋白質可以被用來測量激酶活性。[0128]在前述的篩選方法中，在用于測量激酶活性的環(huán)境中使測試物質與NEKlO變異體表達細胞接觸。測量激酶活性期間的條件(如溫度、PH或鹽濃度)由將蛋白質作為底物通過NEKlO變異蛋白進行磷酸化的那些條件構成，并且對它們沒有特別的限制。
[0129]測試物質的選擇可以通過將在所述測試物質的存在下在前述條件下由NEKlO變異蛋白磷酸化的底物蛋白質的量與不存在所述測試物質下由NEKlO變異蛋白磷酸化的底物的量進行比較來進行。更具體地說，當存在測試物質下的底物蛋白質的磷酸化的量少于在相同條件下在不存在所述測試物質下的底物蛋白質的磷酸化的量時，選擇該測試物質。
[0130]根據(jù)本發(fā)明的用于篩選抗癌劑的方法選定的物質通過抑制細胞中NEKlO變異基因的表達，從而具有減少NEKlO變異蛋白的產(chǎn)生的效應或者具有降低NEKlO變異蛋白的激酶活性的效應，因此認為其在癌癥的治療中是有用的。另外，通過生產(chǎn)根據(jù)這種篩選方法選定的測試物質的各種衍生物并且對其進行進一步的篩選，也可以獲得具有優(yōu)異的療效和安全性的衍生物。
[0131]實施例
[0132]雖然以下通過實施例對本發(fā)明進行了更加詳細的說明，但是這些實施例僅用于舉例說明，并且本發(fā)明并不限于此。另外，除非另有具體說明，所述實施例中提及的市售試劑都是按照制造商的說明書來使用的。
[0133][參考例I]
[0134]進行本參考例以確認NEKlO變異mRNA在各種癌細胞系中的表達。即，使用SYBR?Green通過實時PCR測量NE KlO變異mRNA在表1中列出的各種癌細胞系中的相對表達水平。
[0135]使用RNAeasy試劑盒(Qiagen)從各個癌細胞系中純化出總RNA。通過根據(jù)說明書使用逆轉錄酶Superscript III (Invitrogen)使用400ng經(jīng)純化的RNA來制備cDNA。即，將RNA在65°C下進行5分鐘的變性處理，然后在4°C下快速冷卻，隨后使其在55°C下反應30分鐘，然后在75°C下反應15分鐘以合成cDNA。
[0136]使用IyL所得到的cDNA作為模板，使用用于擴增由NEKlO變異mRNA合成的cDNA的引物、用于擴增由GAPDH合成的cDNA的引物和根據(jù)說明書使用Brilliant SYBR?Green Master Mix (Stratagene)進行實時PCR。進行GAPDH的擴增作為反應體系的對照。即，在95°C下進行10分鐘的熱變性之后，進行40個PCR循環(huán)，其中一個循環(huán)由在95 °C下30秒、在55 °C下60秒和在72 °C下60秒構成。使用MX3000 (Stratagene)系統(tǒng)進行實時PCR。用于擴增由NEKlO變異mRNA合成的cDNA的引物包括由SEQ IDNO: 6 (5，-GCACACAAAGGTATTTTATGG-3’ )的堿基序列構成的正向引物和由SEQ ID NO: 7(5' -CTACTCAAACT TGCCTTCTCA-3’ )的堿基序列構成的反向引物。另外,用于擴增由GAPDHmRNA 合成的 cDNA 的引物包括由 SEQ ID NO:8 (5’ -TCTGCTCCTCCTGTTCGACAGT-3’)的堿基序列構成的正向引物和由SEQ ID NO:9 (5’-ACCAAATCCGTTGACTCCGAC-3’)的堿基序列構成的反向引物。使用MX Pro軟件(Stratagene)來確定Ct值。Ct值是指通過PCR反應的革巴基因擴增按指數(shù)規(guī)律地發(fā)生時的循環(huán)閾值數(shù)(循環(huán)閾值)。
[0137]使用以下所示的等式(I)，由所得到的Ct值確定各種癌細胞系的NEKlO變異mRNA的Λ Ct值(在經(jīng)過與校準器(calibrator)相比的情況下的相對Ct值)。
[0138]等式(I):[0139]Δ Ct (NEK IO 基因變異體)值=NEKlO 變異 mRNA 的 Ct 值-GAPDH mRNA 的 Ct 值
[0140]通過使用從等式(I)中獲得的各癌細胞系中NEKlO變異mRNA的Λ Ct值，以NEKlO變異mRNA在HeLaS3細胞中的表達水平的值作為100為基礎，根據(jù)等式(2)確定各癌細胞系中NEKlO變異mRNA的相對表達水平。
[0141]等式(2):
[0142]各癌細胞系中NEKlO變異mRNA的相對表達水平=(各癌細胞系中NEKlO變異mRNA的Λ Ct值/HeLaS3細胞中NEKlO變異mRNA的Λ Ct值)X 100
[0143]使用前述的等式(2)，以NEKlO變異mRNA在HeLaS3細胞中的表達水平的值為100作為基礎，得到的各癌細胞系中NEKlO變異mRNA的相對表達水平如表1所示。觀察了乳腺癌、肝癌、腎癌、前列腺癌和子宮癌的細胞中NEKlO變異mRNA的表達。因此，預計NEKlO變異體不僅在乳腺癌細胞中發(fā)揮了重要作用，同時在其它癌細胞中也發(fā)揮了重要作用。
[0144][表 I]
[0145]
【權利要求】
1.一種用于抑制細胞生長的方法，包括: 在細胞中 用于降低NEKlO變異基因表達的表達降低步驟，和/或 用于降低NEKlO變異蛋白活性的活性降低步驟。
2.根據(jù)權利要求1所述的用于抑制細胞生長的方法，其中，所述表達降低步驟是用于使用選自由以下構成的組中的至少一種類型來轉染細胞的步驟:通過RNA干擾抑制NEKlO變異基因表達的核酸分子、所述核酸分子的前體、以及能夠表達所述核酸分子或所述前體的表達載體。
3.根據(jù)權利要求2所述的用于抑制細胞生長的方法，其中，所述核酸分子是靶向NEKlO變異基因的mRNA中的堿基序列的具有RNA干擾效應的siRNA，所述堿基序列由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4表示，以及 所述前體是靶向NEKlO變異基因的mRNA中的堿基序列的具有RNA干擾效應的shRNA，所述堿基序列由SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:4表示。
4.根據(jù)權利要求2所述的用于抑制細胞生長的方法，其中，所述核酸分子選自由以下所構成的組: (a)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，所述正義RNA由SEQID NO: 2表示的堿基序列構成，而所述反義RNA由SEQ ID NO:3表示的堿基序列構成， (b)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，所述正義RNA由SEQID NO: 4表示的堿基序列構成，而所述反`義RNA由SEQ ID NO:5表示的堿基序列構成， (c)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，所述正義RNA含有SEQID NO: 2表示的堿基序列中的15~24個堿基的連續(xù)堿基序列，而所述反義RNA含有與所述正義RNA互補的堿基序列；并且所述siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應， (d)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，所述正義RNA含有SEQID NO: 4表示的堿基序列中的15~24個堿基的連續(xù)堿基序列，而所述反義RNA含有與所述正義RNA互補的堿基序列；并且所述siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應， (e)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，所述正義RNA含有這樣的堿基序列，其中，SEQ ID NO:2表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列中的一個或多個堿基被替換、添加或缺失，而所述反義RNA含有與所述正義RNA互補的堿基序列；并且所述siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應， (f)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，所述正義RNA含有這樣的堿基序列，其中，SEQ ID N0:4表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列中的一個或多個堿基被替換、添加或缺失，而所述反義RNA含有與所述正義RNA互補的堿基序列；并且所述siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應，以及 (g)其中(a)~(f)任一項中所描述的siRNA中的一個或多個堿基被修飾的siRNA，并且所述siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應。
5.根據(jù)權利要求2所述的用于抑制細胞生長的方法，其中，所述前體在細胞中產(chǎn)生以下任一種: (a)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，所述正義RNA由SEQ ID NO: 2表示的堿基序列構成，而所述反義RNA由SEQ ID NO:3表示的堿基序列構成，(b)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，所述正義RNA由SEQID NO: 4表示的堿基序列構成，而所述反義RNA由SEQ ID NO:5表示的堿基序列構成， (c)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，所述正義RNA含有SEQID NO: 2表示的堿基序列中的15~24個堿基的連續(xù)堿基序列，而所述反義RNA含有與所述正義RNA互補的堿基序列；并且所述siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應， (d)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，所述正義RNA含有SEQID NO: 4表示的堿基序列中的15~24個堿基的連續(xù)堿基序列，而所述反義RNA含有與所述正義RNA互補的堿基序列；并且所述siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應， (e)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，所述正義RNA含有這樣的堿基序列，其中，SEQ ID NO:2表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列中的一個或多個堿基被替換、添加或缺失，而所述反義RNA含有與所述正義RNA互補的堿基序列；并且所述siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應， (f)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，所述正義RNA含有這樣的堿基序列，其中，SEQ ID N0:4表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列中的一個或多個堿基被替換、添加或缺失，而所述反義RNA含有與所述正義RNA互補的堿基序列；并且所述siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應，以及 (g)其中(a)~(f)任一項中所描述的siRNA中的一個或多個堿基被修飾的siRNA，并且所述siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應。
6.根據(jù)權利要求2所述的用于抑制細胞生長的方法，其中，所述前體是: (P) shRNA，含有:SEQ ID NO:2表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列，或其中在所述堿基序列中的一個或多個堿基被修飾、替換、添加或缺失的堿基序列；以及SEQ ID NO:3表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列，或其中在所述堿基序列中的一個或多個堿基被修飾、替換、添加或缺失的堿基序列， 或 (q) shRNA，含有:SEQ ID N0:4表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列，或其中在所述堿基序列中的一個或多個堿基被修飾、替換、添加或缺失的堿基序列；以及SEQ ID NO:5表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列，或其中在所述堿基序列中的一個或多個堿基被修飾、替換、添加或缺失的堿基序列； 并且， 對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應的siRNA，是在細胞中由(p)的shRNA和(q)的shRNA產(chǎn)生的。
7.根據(jù)權利要求1所述的用于抑制細胞生長的方法，其中，所述細胞是癌細胞。
8.—種核酸分子，其為: (a)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，所述正義RNA由SEQID NO: 2表示的堿基序列構成，而所述反義RNA由SEQ ID NO:3表示的堿基序列構成， (b)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，所述正義RNA由SEQID NO:4表示的堿基序列構成，而所述反義RNA由SEQ ID NO:5表示的堿基序列構成， (c)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，所述正義RNA含有SEQID NO: 2表示的堿基序列中的15~24個堿基的連續(xù)堿基序列，而所述反義RNA含有與所述正義RNA互補的堿基序列；并且所述siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應， (d)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，所述正義RNA含有SEQID NO: 4表示的堿基序列中的15~24個堿基的連續(xù)堿基序列，而所述反義RNA含有與所述正義RNA互補的堿基序列；并且所述siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應， (e)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，所述正義RNA含有這樣的堿基序列，其中，SEQ ID NO:2表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列中的一個或多個堿基被替換、添加或缺失，而所述反義RNA含有與所述正義RNA互補的堿基序列；并且所述siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應， (f)由正義RNA和反義RNA的組合構成的siRNA，所述正義RNA含有這樣的堿基序列，其中，SEQ ID N0:4表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列中的一個或多個堿基被替換、添加或缺失，而所述反義RNA含有與所述正義RNA互補的堿基序列；并且所述siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應，以及 (g)其中(a)~(f)任一項中所描述的siRNA中的一個或多個堿基被修飾的siRNA，并且所述siRNA對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應。
9.一種核酸分子，其為: (P) shRNA，含有:SEQ ID NO:2表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列，或其中在所述堿基序列中的一個或多個堿基被修飾、替換、添加或缺失的堿基序列；以及SEQ ID NO:3表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列，或其中在所述堿基序列中的一個或多個堿基被修飾、替換、添加或缺失的堿基序列， 或 (q) shRNA，含有:SEQ ID N0:4`表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列，或其中在所述堿基序列中的一個或多個堿基被修飾、替換、添加或缺失的堿基序列；以及SEQ ID NO:5表示的堿基序列中的15或更多個堿基的連續(xù)堿基序列，或其中在所述堿基序列中的一個或多個堿基被修飾、替換、添加或缺失的堿基序列； 并且， 其為前體，用于在細胞中產(chǎn)生對NEKlO變異基因具有RNA干擾效應的siRNA。
10.一種表達載體，含有根據(jù)權利要求8或9所述的核酸,所述表達載體能夠表達所述核酸。
11.一種用于抑制NEKio變異基因的表達的組合物，包含選自由以下所構成的組中的一種或多種類型: 根據(jù)權利要求8所述的核酸分子， 根據(jù)權利要求9所述的核酸分子，以及 根據(jù)權利要求10所述的表達載體。
12.一種抗癌劑，包含選自由以下所構成的組中的一種或多種類型作為其活性成分: 根據(jù)權利要求8所述的核酸分子， 根據(jù)權利要求9所述的核酸分子，以及 根據(jù)權利要求10所述的表達載體。
13.一種用于篩選抗癌劑的方法，其利用對NEKlO變異基因的表達的抑制效應或對NEKlO變異蛋白的活性的抑制效應作為指標。
14.根據(jù)權利要求13所述的用于篩選抗癌劑的方法，包括: 針對于對NEKlO變異基因的表達的抑制效應或對NEKlO變異蛋白的活性的抑制效應，分別在存在和不存在候選物質的情況下培養(yǎng)NEKlO變異體表達細胞的步驟，和 測量NEKlO變異mRNA在細胞中的表達水平或NEKlO變異蛋白的活性量，以及比較在存在和不存在所述候選物質的 情況下的所述表達水平或所述活性量的步驟。
【文檔編號】C12N15/113GK103781906SQ201280044023
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年8月29日 優(yōu)先權日:2011年9月14日
【發(fā)明者】佐藤學道 申請人:日本化藥株式會社