基于基因組測(cè)序的體細(xì)胞突變位點(diǎn)挖掘方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及柑橘基因組學(xué)及分子育種領(lǐng)域，具體地指一種基于基因組測(cè)序的體細(xì) 胞突變位點(diǎn)挖掘方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 體細(xì)胞突變（somatic mutation)是指植物在體細(xì)胞水平（如芽的分生組織）發(fā) 生的突變。芽變是體細(xì)胞突變的一種，一般表現(xiàn)在枝、葉、花、果及物候期、成熟期等特征和 特性上。人們通過(guò)芽變選種選育了很多優(yōu)良的品種，柑橘主要栽培品種70%以上來(lái)自于體 細(xì)胞變異，如臍橙、溫州蜜柑、葡萄柚、克里曼丁橘的一系列品系。選擇突變芽及其成長(zhǎng)的 枝，經(jīng)過(guò)無(wú)性繁殖可以創(chuàng)造出新品種稱芽變選種。芽變選種作為柑橘育種的一種方式，與其 它育種方式（實(shí)生選種、雜交育種、輻射誘變育種、原生質(zhì)體融合育種、轉(zhuǎn)基因育種等）相 比，有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：其變異性狀在田間容易被發(fā)現(xiàn)；可通過(guò)嫁接繁殖被保存下來(lái)；沒(méi)有童 期的干擾；可較快地進(jìn)行鑒定和推廣應(yīng)用。由于芽變的經(jīng)常發(fā)生以及變異的多樣性，使得 芽變成為無(wú)性繁殖植物變異選擇的豐富源泉。隨著分子生物學(xué)研宄手段的迅速發(fā)展，人們 在對(duì)芽變品種進(jìn)行利用的同時(shí)開(kāi)始研宄芽變性狀形成的分子機(jī)理，以期深入認(rèn)識(shí)芽變的規(guī) 律，利用基因工程手段定向改良柑橘品種。
[0003] 目前對(duì)體細(xì)胞突變機(jī)理的研宄特別是突變基因的挖掘和鑒定還缺乏有效的方法， 特別是利用遺傳學(xué)手段鑒定突變位點(diǎn)，所需要的時(shí)間長(zhǎng)（果樹(shù)一般需要5-10年才能獲得雜 交后代的果實(shí)），另果樹(shù)樹(shù)體大，種植大規(guī)模群體的占地面積比較大。以500棵單株的柑橘 群體為例，需要10畝地才能定值。因此，無(wú)論是正向遺傳學(xué)（遺傳群體定位策略）和反向 遺傳學(xué)（人工突變體庫(kù)）方法鑒定突變位點(diǎn)在果樹(shù)上都比較困難，在人力、物力和時(shí)間上都 很難實(shí)現(xiàn)，獲得成功的例子僅有少數(shù)幾例。
[0004] 通過(guò)全基因組序列信息挖掘?yàn)殍b定體細(xì)胞突變位點(diǎn)提供了一條快速、有效和低成 本的途徑。特別是二代測(cè)序的成本進(jìn)一步下降（當(dāng)前市場(chǎng)價(jià)降低到250元/Gbase)，通過(guò)全 基因組測(cè)序的策略挖掘芽變位點(diǎn)的成本可以為單個(gè)課題組承擔(dān)。但目前基于基因組測(cè)序挖 掘體細(xì)胞突變位點(diǎn)還缺乏適合的方法（果樹(shù)基因組具有雜合態(tài)等特點(diǎn)），需要對(duì)序列信息 分析流程和方法進(jìn)行優(yōu)化和改良。全基因組重測(cè)序是對(duì)已知基因組序列的物種進(jìn)行不同個(gè) 體的基因組測(cè)序，并在此基礎(chǔ)上對(duì)個(gè)體或群體進(jìn)行差異性分析。全基因組重測(cè)序的個(gè)體，通 過(guò)序列比對(duì)，可以找到大量的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（Single Nucleotide Polymorphisms， SNP)。提取全基因組中所有的多態(tài)性位點(diǎn)，結(jié)合質(zhì)量值、深度、重復(fù)性等因素做進(jìn)一步的過(guò) 濾篩選，得到可信度高的SNP數(shù)據(jù)集，有望在全基因組水平上掃描并檢測(cè)與重要性狀相關(guān) 的基因序列差異，實(shí)現(xiàn)突變位點(diǎn)及重要性狀候選基因的篩選。
[0005] 單核苷酸多態(tài)性（SNP)，主要是指近緣種群或同種個(gè)體在基因組水平上由于單個(gè) 核苷酸變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個(gè)堿基的變異，這 種變異常由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換（transition)或者顛換（transversion)所引起，組成DNA的 堿基雖然只有4種，但SNP -般只有兩種堿基組成，所以它是一種二態(tài)的標(biāo)記即二等位基因 (biallelic)。由于SNP的二態(tài)性，非此即彼，在基因組篩選中SNPs往往只需+/-的分析， 而不用分析片段的長(zhǎng)度。SNP被認(rèn)為是繼RFLP和SSR之后最有前途的第三代分子標(biāo)記，在 植物領(lǐng)域的遺傳圖譜構(gòu)建、性狀相關(guān)分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)、以及生物學(xué)基礎(chǔ)研宄正在快速應(yīng)用。
[0006] PCR擴(kuò)增目的序列及對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序是鑒別SNP的最簡(jiǎn)捷的方法。根據(jù)目的序 列設(shè)計(jì)特異性引物，以不同個(gè)體的基因組DNA為模板，用同一 PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)所 獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序，仔細(xì)核對(duì)各個(gè)體的PCR產(chǎn)物序列就可查明該目的序列在所測(cè)各 個(gè)體基因組之間是否存在SNP。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題就是提供一種基于基因組測(cè)序的體細(xì)胞突變位點(diǎn)挖 掘方法。本發(fā)明可以揭示柑橘芽變品種的突變位點(diǎn)，為解析柑橘體細(xì)胞突變機(jī)制提供強(qiáng)有 力的基因組工具。
[0008] 為解決上述目的，本發(fā)明提供的一種基于基因組測(cè)序的體細(xì)胞突變位點(diǎn)挖掘方 法，包括以下步驟：
[0009] 1)首先對(duì)野生型柚和突變型柚的果皮、果肉各個(gè)組織進(jìn)行深度30X的DNA重測(cè) 序，并對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，去除其中低質(zhì)量的部分，得到各組材料高質(zhì)量的測(cè)序 reads ；
[0010] 2)然后以已發(fā)布的甜橙基因組為參考基因組，使用軟件BWA將各組reads比對(duì)到 基因組上；再使用samtools/GATK進(jìn)行SNP calling和genotyping，得到各組材料的多態(tài) 性位點(diǎn)；
[0011] 3)根據(jù)檢測(cè)到的所有的SNP的信息，使用熵權(quán)法對(duì)SNP的QUAL、DP和MQ屬性賦 權(quán)值，從而計(jì)算出各組材料各個(gè)SNP位點(diǎn)的Q值；并綜合衡量該處SNP的可靠性；將野生型 柚和突變型柚中的SNP的Q值進(jìn)行對(duì)應(yīng)比較，
[0012] 4)采用wilcoxon秩檢驗(yàn)，并用BH法對(duì)p值進(jìn)行校正，找到野生型柚和突變型柚 中Q值顯著不同即可靠的SNP位點(diǎn)；對(duì)上述找到的SNP位點(diǎn)，對(duì)野生型柚和突變型柚設(shè)計(jì) case-control型的關(guān)聯(lián)分析，得到突變相關(guān)的候選位點(diǎn)；對(duì)找到的候選SNP位點(diǎn)進(jìn)行注釋， 并推測(cè)性狀相關(guān)變異發(fā)生的染色體區(qū)域；
[0013] 5)最后利用Sanger測(cè)序方法對(duì)候選位點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
[0014] 進(jìn)一步地，所述方法還用于果樹(shù)芽變位點(diǎn)的挖掘和鑒定。
[0015] 再進(jìn)一步地，所述方法還用于木本植物體細(xì)胞突變位點(diǎn)的挖掘和鑒定。
[0016] 再進(jìn)一步地，包括以下步驟：
[0017] 1)制備琯溪蜜柚紅肉突變體的基因組DNA
[0018] 在本實(shí)施例中，采用改良的CTAB法提取琯溪蜜柚野生型及其紅肉突變體的四個(gè) 組織的基因組DNA，其四個(gè)組織分別為外果皮、中果皮、囊衣和汁胞；
[0019] 2)基因組測(cè)序
[0020] a. DNA測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建：基因組DNA的片段化、末端補(bǔ)平、磁珠純化；加 A即添加 dAMP到雙鏈DNA文庫(kù)片段的3'端、加接頭即連接帶有3' -dTMP端的雙鏈DNA接頭到文庫(kù) 片段；磁珠純化，切膠回收500bp左右大小的DNA片段；文庫(kù)擴(kuò)增；磁珠純化；
[0021] b. DNA文庫(kù)的測(cè)序
[0022] 對(duì)建好的DNA文庫(kù)用Qubit 2. 0測(cè)定質(zhì)量濃度，用Agilent 2100生物分析儀檢測(cè) 插入片段大小，用QPCR測(cè)定摩爾濃度，當(dāng)質(zhì)量濃度多2nM、插入片段集中且符合目的大小即 可判定文庫(kù)合格。根據(jù)所需30X的數(shù)據(jù)量對(duì)各個(gè)文庫(kù)取樣，用hiseq2000-PE125的測(cè)序策 略上機(jī)測(cè)序；
[0023] 3、SNP 分析
[0024] 對(duì)測(cè)序得到的野生型柚和突變型柚的各個(gè)組織數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，并用 Trimmomatic-O. 30去除其中低質(zhì)量的部分，得到各組材料高質(zhì)量的測(cè)序reads ;以甜橙基 因組為參考基因組，使用軟件BWA將各組reads比對(duì)到基因組上；使用samtools/GATK進(jìn)行 SNP calling和genotyping的流程，得到各組材料全基因組范圍內(nèi)的SNP多態(tài)性位點(diǎn)。
[0025] 4、突變位點(diǎn)挖掘
[0026] 根據(jù)檢測(cè)到的所有的SNP的信息，使用熵權(quán)法對(duì)SNP的QUAL、DP和MQ屬性賦權(quán) 值，從而計(jì)算出各組材料各個(gè)SNP位點(diǎn)的Q值，用以綜合衡量該處SNP的可靠性；將野生型 柚和突變型柚中的SNP的Q值進(jìn)行對(duì)應(yīng)比較，采用wilcoxon秩檢驗(yàn)，并用BH法對(duì)p值進(jìn)行 校正，找到野生型柚和突變型柚中Q值顯著不同，即可靠的SNP位點(diǎn)；對(duì)上述找到的SNP位 點(diǎn)，用beagle軟件對(duì)野生型柚和突變型柚設(shè)計(jì)case-control型的關(guān)聯(lián)分析，得到突變相關(guān) 的5個(gè)候選位點(diǎn)，并進(jìn)行驗(yàn)證；
[0027] 5、相關(guān)突變位點(diǎn)的驗(yàn)證
[0028] 根據(jù)5個(gè)候選SNP位點(diǎn)所在的序列設(shè)計(jì)特異性引物，以不同的基因組DNA為模板， 用PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序，比較各個(gè)體的PCR產(chǎn)物序列，驗(yàn) 證該目的序列，最終確定統(tǒng)計(jì)水平最顯著的候選位點(diǎn)即5號(hào)染色體上的SNP位點(diǎn)為突變位 點(diǎn)。
[0029] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0030] 1)芽變（體細(xì)胞變異）育種是果樹(shù)獨(dú)具特色的育種途徑，70%的柑橘品種來(lái)自于 芽變。本方法將為挖掘柑橘芽變位點(diǎn)、解析芽變機(jī)理以及未來(lái)進(jìn)一步利用芽變機(jī)理育種提 供重要工具和方法；
[0031] 2)本發(fā)明基于基因組測(cè)序開(kāi)發(fā)了適合于柑橘的信息分析方法，該方法最大的優(yōu)勢(shì) 在于縮短了檢測(cè)突變位點(diǎn)的時(shí)間，在3個(gè)月時(shí)間內(nèi)挖掘到體細(xì)胞突變位點(diǎn)（而傳統(tǒng)的遺傳 學(xué)方法在柑橘鑒定果實(shí)性狀突變位點(diǎn)需要5-10年），體現(xiàn)了基因組前沿技術(shù)和柑橘傳統(tǒng)育 種研宄的結(jié)合與創(chuàng)新探索。
[0032] 3)本發(fā)明的方法所需要的成本低，完成一個(gè)突變體突變位點(diǎn)挖掘的成本在3萬(wàn)元 左右。相比于傳統(tǒng)的遺傳學(xué)辦法，如種植大規(guī)模群體、遺傳圖譜構(gòu)建以及性狀定位在土地管 理、材料維護(hù)、分子試劑等高昂的成本，本方法價(jià)格低廉。本方法對(duì)于其它果樹(shù)芽變機(jī)理研 宄具有借鑒價(jià)值，有望推廣應(yīng)用到其它果樹(shù)品種。
【附圖說(shuō)明】
[0033] 圖1為本發(fā)明的技術(shù)流程圖。
[0034] 圖2為利用本發(fā)明找到的與柑橘果肉體細(xì)胞變異有關(guān)的SNP位點(diǎn)驗(yàn)證結(jié)果。利用 Sanger測(cè)序方法對(duì)此發(fā)明找到的候選位點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，找到與琯溪蜜柚紅肉突變性狀相 關(guān)的5個(gè)SNP候選位點(diǎn)，運(yùn)用PCR得到驗(yàn)證的是5號(hào)染色體上的一個(gè)SNP位點(diǎn)。在該位點(diǎn)， 野生型白肉琯溪蜜柚的基因型為純合的T/T，而突變體紅肉琯溪蜜柚的基因型為雜合的T/