暗褐網(wǎng)柄牛肝菌ssr分子標記的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及暗褐網(wǎng)柄牛肝菌SSR分子標記，具體涉及暗褐網(wǎng)柄牛肝菌的簡單重復序列(SSRs，Simple sequence repeats)分子標記，屬DNA分子標記技術領域。
【背景技術】
[0002]簡單重復序列(SSRs，Simple Sequence Repeats)，又叫做微衛(wèi)星位點(Microsatellites)，是由I ~ 6 bp的重復單元串聯(lián)重復而成的序列(Sharma et al.2007)。它們在原核、真核基因組中廣泛分布，在基因編碼區(qū)及非編碼區(qū)都能找到(Li etal.2004)。作為分子標記，SSR有許多優(yōu)點:在整個基因組中分布廣泛、均勻且數(shù)量充足，因而多態(tài)性很高；SSR標記呈孟德爾共顯性遺傳，可以區(qū)分純合、雜合基因型；PCR擴增僅需要少量DNA，且對DNA的質量要求不高。近年來還發(fā)現(xiàn)SSR在基因組中可能發(fā)揮著一些功能，例如影響基因調控、基因組系統(tǒng)組成等。因此從基因組水平上了解SSR的分布是非常重要的。傳統(tǒng)獲得SSR標記的方法需通過建立、篩選基因組文庫、克隆測序、引物設計等一系列實驗，耗費許多人力、物力。而現(xiàn)在，隨著基因組測序越來越便捷，由基因組數(shù)據(jù)中直接開發(fā)SSR標記的方法也被運用得越來越多。
[0003]暗褐網(wǎng)柄牛肝菌(/%76^ο/7?5.Poriefl11SW1S)是云南南部及泰國北部最受歡迎的野生食用菌之一。在脫離宿主樹，接種于人工培養(yǎng)基的情況下，暗褐網(wǎng)柄牛肝菌在菇房中經(jīng)過約3個月時間培養(yǎng)，能夠完成整個生活史，形成子實體，是目前牛肝菌目中唯一一個擔孢子、菌絲體在實驗室條件下能夠萌發(fā)、生長、交配，并實現(xiàn)溫室栽培出菇的物種。作為剛剛開始被人工栽培的物種，暗褐網(wǎng)柄牛肝菌生物學、生態(tài)學的研宄基本上還停留在現(xiàn)象觀察的程度上，能用的特異性分子標記缺乏，對它的遺傳多樣性、群體遺傳學方面的特性更是幾乎一無所知。利用上述方法，開發(fā)SSR分子標記，能對其遺傳多樣性，群體遺傳學及種質鑒定進行研宄，對將來新品種的開發(fā)，種質資源的評價，栽培技術的創(chuàng)新突破都具有十分重要的意義。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的在于，根據(jù)目前暗褐網(wǎng)柄牛肝菌研宄的需要，開發(fā)具有多態(tài)性的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌SSR分子標記，建立技術體系，彌補其特異性分子標記的空白，為其遺傳多樣性，群體遺傳學及種質鑒定研宄提供有力的研宄工具。
[0005]本發(fā)明的技術方案為:在已經(jīng)獲得暗褐網(wǎng)柄牛肝菌基因組數(shù)據(jù)的基礎之上，利用常規(guī)生物信息學方法，在基因組水平上檢測其SSR的分布，進行引物設計，利用來自西雙版納地區(qū)的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌樣品，選取部分引物進行初篩、復篩后，得到15個具有多態(tài)性的 SSR 分子標記，其編號為:ΡΡ50097、ΡΡ64100、ΡΡ32087、ΡΡ85099、ΡΡ80085、ΡΡ56123、ΡΡ76127、ΡΡ57130、ΡΡ39117、ΡΡ60130、ΡΡ93120、ΡΡ23157、ΡΡ45160、ΡΡ30156、ΡΡ48147。
[0006]上述SSR分子標記的核苷酸序列分別為:
ΡΡ50097 (143 bp),由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列組成:ACCAAGTTTTTCCCCACTCCCTTCTCAAAGCCCCCTTCACCCACTTACTTACGAGGGCCGGCGGGAGCAATTCAAGATGGTAGGGTGATATTTCACCAGATCGCGTGAGCTCATACGACCCTGTGTACTGCCATTCGTTGGCC ；PP64100 (312 bp),由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列組成:
ATGTGATGATGAAGTCAAGCAGCAGTCGATGAGGTGGGAGATTGTCATGTTGTGAGTGCACATGTGTGTGACAAGCAGCAGTCGAGGGGGTGAGGGATTGCCATGCATCATTGATGGAATTGAGTGCGTGTGTCATGAGTGCGTGTGCCGGTGTGTGTGTGTGACAAGCAGCAGTAAAGGGGGTGGGGGATTGCCATGTTGGTGATGCCATCGAACAGGTGGGTCGTGAGCGTGCATGCATGCGTGCCGTGAACATCGAGGGGGTGGGGGATTACCATGCATCGTCGATGAAATCGAGTAGGTAGGTCGTGA ；
PP32087 (143 bp)，由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列組成:
TAGTATTGTGGTGGTCATGGTGATCATTGTTGTCAATGTAGAGTCATGGTGGTCATGTTGACATGGTCATCATTGATGTTGCAGTCATGGTCATTGTGGGTGTGCATCATCCCAATATTGTGGTGCACAGGTATTGTCATCAA ；PP85099 (143 bp)，由SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列組成:
TCGTGTTGCCATGTGAGGGTGTGTTTCATCCAGTTTTCGTCGTCACGCTTGTTGGTGGAGTATGTTAGATGGAAGAAAAGGATGAAGCGGATGTGAAAGACAGACCTCGGGATAGTCTTCGCGTGCGTGGGCACCACGAGATT ；PP80085 (143 bp)，由SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列組成:
CACCACCACCACCACCACGACGTGAATGACGACGACGACCATCACCATCACCATCATCACCACGACGCGAACGAGAACGACGGCGACGACGACTACCACCACGACCACCACGCAAACGACGACAACGACTACTACGACTACCA ；PP56123 (349 bp),由SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列組成:
TGATCAACGTCCCTCTCGGTGGTAATGTACGACGACCTCCATACGTATCCGAGTCGCGTAAGTCTTCACCCCATGCAGTACGTATGCACAAGTAAGCGACGACTTCTTGCGAGACGTCGGAGCCGTTCTGGATCAGCCTTTCCGAGGACTTGATGATGATGATGATCGTTGCGTTGCGTTGGGGTTTCAAGTTATCAGATTATGTATGTAAGCGTGCGTAGATAGAATGTGGCGCATCCGCACCGCCATCGGATTGGAGAGTTGTTTCCTTTTTCTTCCACTTGTTCCCGTCCCCGCTCCCCCTATGTCATGCAG ；
PP76127 (143 bp)，由SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列組成:
ACTGCAGCGCTTGAGAAACCGTTGAATAAACCCCGGTTATAGGCGCAGACCGAAGAGACATGTTTGAACGTGCTAGATCGAGAGCCTGGCCGTGCCTCGCGGCATCTGTCGACATCTGACTCGCATCCAACTGAACGTCCGCA ；PP57130 (143 bp),由SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列組成:
CATTGATGGCAGTGACCCCTGGACTTGAGGGCAGCGACATGACAACAACAGCAATGATAGCAATGACAGCATATGGCCACCTTGTATCACCATCATCACCATGACCATCACACGATAATGACAATGACCTTGGCCATCACCAC ；PP39117 (318 bp)，由SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列組成:
AGGCGCGTTGGATCGAACGTCGTGAACGTCGTCGTCGTCGCCGTCGAGGTGAGCCGTGCACTGTGCTGTCTATGCATGTCTGCTCTACTCTAGTGTCCGTTGTTTGATTATTCCGCATCTCTGCGATGGCGATGGCGATCACGCGTTATTATCATCATCATCATCATCCGTCCGTCCGTAAACTACAAGTGGACTTTGGACTTTGGATTGCTGATATCCATCCATCATCATGTTATTTATCTAGATAAACGAGTCTTTACGCGCTTGTTGGATACGCCGGTTTTAGAGGTCTCCGAGTCGGAGGGGGAGGCGGAGGAG ；
PP60130 (312 bp)，由SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列組成:
AAACTAGCACTTACGCCGAACACCTTCCGGTCCTCGAGGATGTCACAGAGCGCGAGCAGGAATGTTTGGAT
GGGTTTGAGAGCCCTTCTTGCTCAGATTTTGGAGAACGCAACGCGAAGCCGTCTCTCTCCGTGTCTGCATCAATGG
CGGTCTCTCTCTCTCCATCCGTTGCTTCATCCATCACAGCGGCGGGACTCGAGATAATGAGGATGGATGCCGACGCCCAGGAACGCGCGCGGGAAAAGGAGAGAGAACGCGAAAGGGCTCGCGAGAGAGAACGTGAAACAAGGAAGGAGGGACAACACCAGCGCA ；
PP93120 (312 bp),由SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列組成:
GGACGTTTCTTAAAAGTCATGATAATGTTTAGCCTTCTGAGTTCTCATATCCAGATTGACATGTTATGTTCCAGTTGAAAACGAAGACATTGGGAGAAGGGGACCAATGATGGAAATCAAATAAATAACGCCGACATGGACATTTACCCCGCAGCAGCAGCAGCCCCGCTTGTGGCCAGCTTCTCACTGTAGCCCTGCGAAACAATCTCATTGACCTTATTTAGTGTCTCGAAACTCTCAGATGACGCTAATCGCCAACGTGGTCGGAGAAAACGACCCAAGTGACCAGATTCCATGTGCAGCTTCTGAAGT ；
PP23157 (143 bp)，由SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列組成:
ACAGTGACGACAGCCATGGCCACCACTGTACCATCATGACCATGGCATCACGACAACGACTACGACAACAACAGCGACGACCATGATGACCACTACCACAACCACGACGATGCGAATGACGATGACAACGACAACTACCACTG ；PP45160 (312 bp)，由SEQ ID NO: 13所示的核苷酸序列組成:
ACGCAACCATCTCCGTTCACTCCCGGCACCCACTTATCGCTCTTCCAGCCCCGTCTACGAGTACCCACTCAATGGCCAGTGGATCATGATGGACATCGACGACGGTTACATCCTCTGGACTGGCATCTGGAAAGGTATCCCTTGTCCTTCTCGTCGTCGTCGTTCTCCAGCTGATGACCTCTCCAGCCCTTGGCAATTCAAAAGGTATGCTCCGCCTCTGACTGCGGCGCGCGCCATGTCAACGCCACTCCTTACAGCTGATATCGTCAAGATGATCGATTCGCAGCCCGACTTGGCACCTGTTATCCGTCG ；
PP30156 (312 bp)，由SEQ ID NO: 14所示的核苷酸序列組成:
AGTTTTCTGACTGGCATGCATTCAGATTCTCCCTTAGAGAACCGTCCATAATATTGATGGTATGCGCTAGGCACCATCTCTTCTATAGTCTTTTCAAGCTTAGGAGGCGCCTCGATATTAGCACATATTGCATAGGCATGGTAGGCAGCCTCTTCTTCTTCTTTTTCCAAAACACGTAGGAATACACTCCTTTCCTTTAATAGATGGCAGCTTCTAGGGCACCTCGTCATCTTGACTTCGCCTTTAGACCAATCTATTTCGGGATTGTGCTTCTTTAGCCATGTGTAACCAAGGATGATCTGGTTACGTCCT ；
PP48147 (143 bp)，由SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列組成:
GCTGTCCGAGATAAGATAAGATAAAGGGACTTAGACGTTTCTAAGTCAAAGGTCGTCAAATAATAGTGGAAAAATAGGGAAAAAAGTCATATCGTAACACATAGTACTAACACTATACCAACATATACTAGTCAGAGTCAGCA ；
上述SSR分子標記的引物序列分別為:
PP50097-F:ATACGACCCTGTGTACTGCCATTC ；
PP50097-R:AGTGCGATG