專利名稱：暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌種的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌種的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
暗褐網(wǎng)柄牛肝菌(Phleb叩usportentosus)是一種味道鮮美，營養(yǎng)價值豐富，深受產(chǎn)地 消費(fèi)者喜愛的美味食用菌，目前仍不能人工栽培，市場上銷售的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實(shí)體均 采自野生自然生長。
多數(shù)牛肝菌為菌根食用菌，目前菌根食用菌栽培研究多為半人工模擬栽培及菌塘人工 促繁。半人工模擬栽培需要將人工分離的純培養(yǎng)菌種或天然菌種接種在相應(yīng)樹苗的根部進(jìn) 行"菌根化"，再栽培"菌根化"的苗木培養(yǎng)子實(shí)體生長。分布于土壤中的暗褐網(wǎng)柄牛肝 菌的菌絲體、菌索、子實(shí)體、孢子等天然菌種，因受季節(jié)條件的限制，不可能常年找到， 不方便于應(yīng)用，且易帶其他雜菌，接種效果不穩(wěn)定。人工純培養(yǎng)的菌種，不受環(huán)境、季節(jié) 與氣候條件的影響、限制，工藝易于放大，重復(fù)性、安全性好，短時間內(nèi)可獲得大量的純 菌種，是規(guī)模擴(kuò)大生產(chǎn)的基本方法。純培養(yǎng)固體菌種，便于運(yùn)輸，貯存，用于半人工模擬 栽培的接種效果較液體菌種及天然菌種穩(wěn)定，是接種用的首選菌種。
產(chǎn)自于云南的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌味道鮮美，營養(yǎng)價值豐富，有較好的食用及藥用價值， 是一種較好的保建食品。由于受氣候季節(jié)條件的限制產(chǎn)量有限，需通過半人工模擬栽培增 加產(chǎn)量滿足人們需求。因此，迫切需要提供一種有效的從母種、液體菌種至固體菌種的菌 種培養(yǎng)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌種培養(yǎng)從母種、液體菌種至固體菌種的快速培 養(yǎng)方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案為暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌種的培養(yǎng)方法按以下步驟進(jìn)行 a、用母種培養(yǎng)基培養(yǎng)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實(shí)體組織塊制備母種，母種培養(yǎng)基的制備由下 述原料及方法配制而成
馬鈴薯 150.0 200.0g 葡萄糖 15.0 20.0g酵母膏 L0 2力g MgS04 1.0 2.0g
KH2P04 1.0 2.0g 瓊脂 15.0 20.0g 水 1000ml
配制方法
al)將新鮮馬鈴薯洗凈、去皮、稱量、切成薄片放入大燒杯中，加入定量的水，煮沸 20分鐘過濾取濾液，加入葡萄糖、瓊脂、酵母膏、MgS04、 KH2P04，煮沸至瓊脂完全溶 化，pH值4.0 6.0，得母種培養(yǎng)基；將培養(yǎng)基分裝于三角瓶中，12(TC滅菌30分鐘，待 冷卻后倒入培養(yǎng)皿中即可使用；
a2)用解剖刀分離暗褐網(wǎng)柄牛肝菌野生子實(shí)體組織塊，置于有母種培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中 培養(yǎng)菌絲體生長并擴(kuò)繁；
a3)采集野生的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實(shí)體，用清水沖洗凈、涼干，用75%酒精溶液消毒 子實(shí)體表面，將子實(shí)體一掰為二，用解剖刀取菌柄與菌蓋交界的中間部位2-3mm的菌肉組 織塊放于倒有母種培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，置于28'C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30天，菌絲體長滿培養(yǎng) 皿，得母種；
b、用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)液體菌種，液體培養(yǎng)基的原料組成如下
馬鈴薯 150.0 200.0g
蔗糖 15.0 20.0g
酵母膏 1.0 2.0 g
MsS04 1.0 2.0g
KH2P04 1.0 2.0g
水 1000ml
配制方法
bl)將新鮮馬鈴薯洗凈、去皮、稱量，切成薄片放入大燒杯中，加入定量的水，煮沸
20分鐘過濾取濾液，在濾液中加入蔗糖、酵母膏、MgS04、 KH2P04，混勻，pH值4.0 6.0， 得液體培養(yǎng)基；將配制好的液體培養(yǎng)基分裝于三角瓶中，每瓶300ml， 12(TC滅菌30分鐘， 待冷卻后備用；
b2)將在上述步驟a3)中獲得的母種轉(zhuǎn)管活化后，將菌絲體連同培養(yǎng)基切成2mm 4
5mm的碎菌塊接種于歩驟bl中瓶裝的培養(yǎng)基中，在28'C， 125r/min回旋式搖床中振蕩培養(yǎng)， 培養(yǎng)8天得到液體菌種；
C、用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)固體菌種，固體培養(yǎng)基的原料組成如下
鋸木屑 10. 0 kg
谷粒 4. 0 6.0 kg
MgS0j 10. C) 20.0g
KH2P(^ 10.0 20.0g 配制方法-
cl)將谷粒稱量放入桶中，加水浸泡10 12小時，濾除多余水份備用，將MgSCU 、 KH2P04溶解于適量的水中噴灑入鋸木屑料堆中，再加入浸泡濾水后的谷粒，拌料混合均 勻，最后調(diào)培養(yǎng)料含水量至60.0%, pH4.0 6.0，得固體培養(yǎng)基；將配制好的固體培養(yǎng)基 分裝于廣瓶中或菌種袋中，每瓶或每袋700ml， 12(TC滅菌60分鐘，待冷卻后備用；
c2)將在上述步驟b2)中獲得的液體菌種接種于步驟cl)中瓶裝或袋裝的培養(yǎng)基中， 置于28'C培養(yǎng)室中培養(yǎng)40 50天，菌絲體長滿培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)袋，得固體菌種。
本發(fā)明的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌從母種、液體菌種至固體菌種的培養(yǎng)方法，為牛肝菌類菌種 培養(yǎng)方法的首創(chuàng)，其優(yōu)點(diǎn)是①培養(yǎng)基營養(yǎng)成份簡單，培養(yǎng)基配方中只用了簡單的碳氮源 (馬鈴薯、葡萄糖、蔗糖、谷粒、酵母膏)， 一般的無機(jī)鹽(MgS04、 KH2P04 )及橡膠 木或其他雜木的鋸木屑即可進(jìn)行從母種至固體菌種的培養(yǎng)；②培養(yǎng)方法簡便，用培養(yǎng)皿、 三角瓶、搖床、菌種瓶(袋)和一般培養(yǎng)室(可加溫)即可進(jìn)行從母種至固體菌種的培養(yǎng)； ③菌絲、菌球生長速度快，28X:溫度條件下，培養(yǎng)30天母種即可長滿10cm的培養(yǎng)皿。培 養(yǎng)8天液體種的菌絲球均勻分布懸浮于三角瓶的液體培養(yǎng)基中，且生長均勻，大小一致， 色澤金黃。培養(yǎng)50天固體菌種的菌絲體長滿700 ml瓶裝或袋裝的固體培養(yǎng)基質(zhì)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
a、用母種培養(yǎng)基培養(yǎng)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實(shí)體組織塊制備母種，母種培養(yǎng)基的制備由下
述原料及方法配制而成
原料馬鈴薯200.0g，葡萄糖20.0g，酵母膏2.0g， MgSO41.0g， KH2P04 l.Og，瓊脂 15.0g，水1000ml
制備方法
6al)將新鮮馬鈴薯洗凈，去皮，稱量，然后切成薄片，放入大燒杯中，加入定量的水, 煮沸20分鐘過濾取濾液，加入葡萄糖、瓊脂、酵母膏、MgS04、 KH2P04，煮沸至瓊脂完 全溶化，pH值約6.0，得母種培養(yǎng)基；將培養(yǎng)基分裝于三角瓶中，12(TC滅菌30分鐘，
待冷卻后在超凈工作臺中倒入培養(yǎng)皿中即可使用；
a2)在超凈工作臺中無菌操作，用解剖刀分離暗褐網(wǎng)柄牛肝菌野生子實(shí)體組織塊，置 于有母種培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)菌絲體生長并擴(kuò)繁；
a3)采集野生的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實(shí)體，去掉子實(shí)體表面的泥沙，先用清水沖洗凈、 涼干，用75%酒精溶液消毒子實(shí)體表面，在超凈工作臺中，將子實(shí)體一掰為二，用解剖刀 取菌柄與菌蓋交界的中間部位2-3ram的菌肉組織塊放于倒有母種培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，置于 28'C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30天，菌絲體長滿培養(yǎng)皿，得母種。
b、用液體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)液體菌種，液體培養(yǎng)基的原料組成如下馬鈴薯200.0g， 蔗糖20.0g，酵母膏2.0 g， MgSO41.0g， KH2PO41.0g，瓊脂15.0g，水1000ml
制備方法
bl)將新鮮馬鈴薯洗凈，去皮，稱量，然后切成薄片，放入大燒杯中，加入定量的水，
煮沸20分鐘過濾取濾液，在濾液加入蔗糖、酵母膏、MgS04、 KH2P04，混勻，pH值約 6.0，得液體培養(yǎng)基；將配制好的液體培養(yǎng)基分裝于三角瓶中，每瓶300ml， 120。C滅菌30 分鐘，待冷卻后備用；
b2)將在上述歩驟a3中獲得的母種轉(zhuǎn)管活化后，將菌絲體連同培養(yǎng)基切成2iM 4咖 的碎菌塊接種于步驟bl中瓶裝的培養(yǎng)基中，在28i:， 125r/min回旋式搖床中振蕩培養(yǎng)， 培養(yǎng)8天得到液體菌種。
C、用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)固體菌種，固體培養(yǎng)基的原料組成如下
橡膠木鋸木屑10. 0 kg，谷粒6. 0 kg， MgSO420.0 g， KH2P04 20.0g。
cl )將谷粒稱量，放入桶中，加水浸泡10 12小時后濾除多余水份，將MgS04 、KH2P04 溶解于適量的水中噴灑入鋸木屑料堆中，再加入浸泡濾水后的谷粒，拌料混合均勻，調(diào)含 水量60.0%、 pH值約6.0，得固體培養(yǎng)基；將配制好的固體培養(yǎng)基分裝于750ml廣瓶中或 17cmX30cm的菌種袋中，每瓶或每袋700ml， 120。C滅菌60分鐘，待冷卻后備用；
c2)將在上述歩驟b2中獲得的液體菌種接種于歩驟cl中瓶裝或袋裝的培養(yǎng)基中，置 于28。C培養(yǎng)室中培養(yǎng)40 50天，菌絲體長滿培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)袋，得固體菌種。
實(shí)施例2:a、 用菌種培養(yǎng)基培養(yǎng)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實(shí)體組織塊制備母種，母種培養(yǎng)基的制備由下 述原料及方法配制而成
原料馬鈴薯150.0g，葡萄糖15 .Og，酵母膏1 .Og， MgS04 2.0 g， KH2P04 2.0g，瓊 脂20.0g，水1000ml, pH值約5.0;
以下步驟與實(shí)施例l相同。
b、 用液體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)液體菌種，液體培養(yǎng)基的原料組成如下馬鈴薯150.0g， 蔗糖15.0 g，酵母膏1.0g， MgS04 2.0 g, KH2P04 2 . 0g，水1000ml， pH值約5.0;
以下歩驟與實(shí)施例l相同。
C、用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)固體菌種，固體培養(yǎng)基的原料組成如下雜木鋸木屑10.0kg， 谷粒4. Okg， MgSO415.0g， KH2PO415.0g， pH值約5.0; 以下歩驟與實(shí)施例1相同。
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權(quán)利要求
1.暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌種培養(yǎng)方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行a、用母種培養(yǎng)基培養(yǎng)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實(shí)體組織塊制備母種，母種培養(yǎng)基的制備由下述原料及方法配制而成馬鈴薯150.0～200.0g葡萄糖15.0～20.0g酵母膏1.0～2.0gMgSO4 1.0～2.0gKH2PO41.0～2.0g瓊脂 15.0～20.0g水1000ml配制方法a1)將新鮮馬鈴薯洗凈、去皮、稱量、切成薄片放入大燒杯中，加入定量的水，煮沸20分鐘過濾取濾液，加入葡萄糖、瓊脂、酵母膏、MgSO4、KH2PO4，煮沸至瓊脂完全溶化，pH值4.0～6.0，得母種培養(yǎng)基；將培養(yǎng)基分裝于三角瓶中，120℃滅菌30分鐘，待冷卻后倒入培養(yǎng)皿中即可使用；a2)用解剖刀分離暗褐網(wǎng)柄牛肝菌野生子實(shí)體組織塊，置于有母種培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)菌絲體生長并擴(kuò)繁；a3)采集野生的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實(shí)體，用清水沖洗凈、涼干，用75％酒精溶液消毒子實(shí)體表面，將子實(shí)體一掰為二，用解剖刀取菌柄與菌蓋交界的中間部位2-3mm的菌肉組織塊放于倒有母種培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，置于28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30天，菌絲體長滿培養(yǎng)皿，得母種；b、用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)液體菌種，液體培養(yǎng)基的原料組成如下馬鈴薯150.0～200.0g蔗糖 15.0～20.0g酵母膏1.0～2.0gMgSO4 1.0～2.0gKH2PO41.0～2.0g水1000ml配制方法b1)將新鮮馬鈴薯洗凈、去皮、稱量，切成薄片放入大燒杯中，加入定量的水，煮沸20分鐘過濾取濾液，在濾液中加入蔗糖、酵母膏、MgSO4、KH2PO4，混勻，pH值4.0～6.0，得液體培養(yǎng)基；將配制好的液體培養(yǎng)基分裝于三角瓶中，每瓶300ml，120℃滅菌30分鐘，待冷卻后備用；b2)將在上述步驟a3)中獲得的母種轉(zhuǎn)管活化后，將菌絲體連同培養(yǎng)基切成2mm～4mm的碎菌塊接種于步驟b1中瓶裝的培養(yǎng)基中，在28℃，125r/min回旋式搖床中振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)8天得到液體菌種；c、用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)固體菌種，固體培養(yǎng)基的原料組成如下鋸木屑10.0kg谷粒 4.0～6.0kgMgSO4 10.0～20.0gKH2PO410.0～20.0g配制方法c1)將谷粒稱量放入桶中，加水浸泡10～12小時，濾除多余水份備用，將MgSO4、KH2PO4溶解于適量的水中噴灑入鋸木屑料堆中，再加入浸泡濾水后的谷粒，拌料混合均勻，最后調(diào)培養(yǎng)料含水量至60.0％，pH 4.0～6.0，得固體培養(yǎng)基；將配制好的固體培養(yǎng)基分裝于廣瓶中或菌種袋中，每瓶或每袋700ml，120℃滅菌60分鐘，待冷卻后備用；c2)將在上述步驟b2)中獲得的液體菌種接種于步驟c1)中瓶裝或袋裝的培養(yǎng)基中，置于28℃培養(yǎng)室中培養(yǎng)40～50天，菌絲體長滿培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)袋，得固體菌種。
全文摘要
本發(fā)明是暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌種培養(yǎng)從母種、液體菌種至固體菌種的培養(yǎng)方法。其特征是使用馬鈴薯、蔗糖、葡萄糖、瓊脂、酵母膏、MgSO₄、KH₂PO₄、橡膠木鋸木屑或其他雜木屑、谷粒、水等原料按照一定比例配制母種、液體菌種及固體菌種培養(yǎng)基，按照從母種、液體菌種至固體菌種的培養(yǎng)方法，先培養(yǎng)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌母種及液體菌種，然后將液體菌種接種于固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)成固體菌種。本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基特別適合暗褐網(wǎng)柄牛肝菌母種、液體菌種及固體菌種的培養(yǎng)。利用該培養(yǎng)方法，可快速進(jìn)行暗褐網(wǎng)柄牛肝菌從母種、液體菌種至固體菌種的培養(yǎng)。
文檔編號A01G1/04GK101491195SQ20091009415
公開日2009年7月29日 申請日期2009年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月5日
發(fā)明者何明霞, 靜 劉, 張春霞, 旸 曹, 王文兵, 紀(jì)開萍 申請人:云南省熱帶作物科學(xué)研究所