專利名稱：：抗Fas配體抗體和利用抗Fas配體抗體的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種抗Fas配體抗體和一種利用抗Fas配體抗體的測定方法。更具體而言，本發(fā)明涉及一種應(yīng)用抗Fas配體抗體測定人體液中的Fas配體的方法以及適合用于這種測定的抗體。本發(fā)明也涉及一種對Fas配體誘導(dǎo)的凋亡有高度抑制作用的抗Fas配體抗體。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生這種抗體的雜交瘤或細胞系。
背景技術(shù)：
：人Fas配體是一種多肽，Nagata等人報道它是一種能誘導(dǎo)表達Fas抗原的細胞發(fā)生凋亡的生物分子(Takahashi.T.等，《國際免疫學(xué)》(InternationalImmunology)，卷6，1567-1574，1994)。人Fas配體是一種屬于TNF家族的II型膜蛋白，分子量約40KD。據(jù)估計人體內(nèi)Fas配體就象TNF的情形一樣，是以三聚體的形式存在(Tanaka，M.等，《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》，(EMBOJournal)卷14，1129-1135，1995)。人Fas配體的胞外區(qū)與大鼠Fas配體的胞外區(qū)(Suda，T.等《細胞》(Cell)，卷75，1169-1178，1993)和小鼠Fas配體的胞外區(qū)(Takakashi，T.等《細胞》(Cell)卷76，969-976，1994)高度同源。人的Fas配體不僅識別人的Fas抗原，而且還識別小鼠的Fas抗原并誘導(dǎo)凋亡。反過來，大鼠的Fas配體和小鼠的Fas配體識別人的Fas抗原并誘導(dǎo)凋亡。凋亡因與機體自身穩(wěn)定密切相關(guān)而引起了人們的注意。上文提及的不同物種間Fas配體具有同源性提示了由Fas配體和Fas抗原介導(dǎo)的凋亡在機體自身穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。最近，F(xiàn)as配體和Fas抗原異常與一種自身免疫病之間存在的有趣的關(guān)系已被報道。這篇報道指出MRL-lpr/lpr(一種自身免疫病的模型小鼠)的Fas抗原基因有突變，而表達這種突變Fas抗原基因的細胞不能誘導(dǎo)凋亡(Watanabe-Fukunnaga.R等.《自然》(Nature)卷356，314-317，1993；Adachi，M.等《國家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，卷90，1993)。同時，也有報道指出C3H-gld/gld(另一種自身免疫病模型小鼠)的Fas配體基因有突變，并且gld小鼠的Fas配體沒有誘導(dǎo)凋亡的活性。gld小鼠的Fas配體基因的突變是一種點突變，這種點突變的結(jié)果是Fas配體胞外區(qū)C末端的第7個氨基酸被另一個氨基酸所代替(Tomohiro，Takahashi，等，《細胞》(Cell)，卷76，969-976，1994)。上述的gld小鼠的Fas配體不能與Fas抗原相結(jié)合(FredRamsdell等，《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur.J.Immunol.)，卷24，928-933，1994)。上述發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了這個假說一些自身免疫病是由Fas抗原或Fas配體的異常誘導(dǎo)的，也就是說是由留在體內(nèi)的自身反應(yīng)性T細胞誘導(dǎo)的，這些細胞如果正常的話應(yīng)以發(fā)生凋亡的方式從體內(nèi)清除的。最近，人們認為風(fēng)濕病中滑膜的異常增生也是由細胞不能正常地凋亡而引起的。Kobayashi，M.等進一步推斷AIDS病毒感染后T細胞數(shù)目的減少是由Fas配體介導(dǎo)的，因為T細胞膜上Fas抗原的表達是由AIDS病毒感染誘導(dǎo)的(Nikkei，《科學(xué)》(Science)，卷6，34-41，1993)。因為Fas配體-Fas抗原介導(dǎo)的凋亡與疾病之間的關(guān)系逐漸被搞清楚，所以人們越來越期望能用Fas配體或Fas抗原治療與凋亡異常相關(guān)的疾病，如上面提到的自身免疫病、風(fēng)濕病以及AIDS。Nagata等還報道他們成功地獲得一種抗Fas配體的抗體，并且這種抗體能夠抑制凋亡(MasatoTanaka等，《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》(EMBOJournal)，卷14，1129-1135，1995；國際專利申請公開號WO95/13293)。
發(fā)明內(nèi)容如上所述，Nagata等已經(jīng)作了一系列深入研究工作以分離Fas配體和制備抗這種Fas配體的抗體。然而，到目前為止尚無關(guān)于準確測定人體液中Fas配體的報道，并且可溶性Fas配體在人體液中是否存在也不能確定。通常認為有生理活性的細胞因子象Fas配體是局部少量產(chǎn)生以在局部介導(dǎo)反應(yīng)。這樣的細胞因子通常半衰期短，并且介導(dǎo)完一個反應(yīng)后，被迅速地從組織或血液中清除。因此，象Fas配體這樣的細胞因子在外周血中不易測出。最初報道Fas配體是一種跨膜蛋白(膜結(jié)合蛋白)，并且在一項體外實驗中于某些特殊的條件下Fas配體可從細胞上釋放下來。(MasatoTanaka等，《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》(EMBOJournal)，卷14，1129-1135，1995)。這樣的現(xiàn)象在體內(nèi)生理條件下能否發(fā)生還不知道，人體液中是否有Fas配體存在也不知道。即使Fas配體在人體液中存在，估計它的濃度也非常低，并且在這樣低的濃度下測定Fas配體會非常困難。此外，體液中可能存在著各種各樣干擾免疫測定的物質(zhì)；因此，這就要求建立一個高敏感性和高特異性的Fas配體測定系統(tǒng)和一種適合用于這種測定的抗體。鑒于Fas配體與各種已指明疾病之間的關(guān)系，相信用測量體液中Fas配體的濃度作為一種診斷這樣的疾病的方法會有臨床價值。然而，到目前為止尚無關(guān)于人體液中Fas配體濃度波動的報道。鑒于有的疾病使用一種象Fas配體這樣的誘導(dǎo)凋亡的物質(zhì)可能有效，將來會對患有這樣疾病的病人給予Fas配體或影響Fas配體活性或表達的物質(zhì)，所以能夠測出人體液中Fas配體的濃度就非常必要，這樣就可以監(jiān)測血中濃度和判斷治療效果。因此人們期待著有一種高敏感性、高特異性的Fas配體測定方法。至于中和性抗體，人們期待會有一種有更高中和活性、作用機制更清楚的中和抗體；并且由于要用于治療，出于有效性和安全性的原因，人們期待會有一種能在低劑量下抑制凋亡的抗體。不幸的是，對人的治療使用非人源的單克隆抗體如小鼠的單克隆抗體有一些缺陷，尤其是在重復(fù)性治療方案中，這將在下面解釋。舉個例子，小鼠的單克隆抗體循環(huán)半衰期相對短些，而且當用于人時缺少其它的一些重要的免疫球蛋白功能特性。也許更重要的是，非人源性單克隆抗體包含相當程度的當給病人注射時具有免疫原性的氨基酸序列。大量的研究表明，在注射了外源性抗體之后，病人針對這種抗體而產(chǎn)生的免疫反應(yīng)相當強，在最初的治療以后基本可以抵消抗體的治療作用。而且，因為用于治療各種疾病的不同種小鼠和其它有抗原性(對人而言)的單克隆抗體數(shù)量不斷增加，以任何不同的非人源性單克隆抗體治療一次或數(shù)次后，接下來的即使是無關(guān)聯(lián)的治療也會由于交叉反應(yīng)而無效甚或有害。雖然所謂的“嵌合抗體”(如小鼠可變區(qū)與人的恒定區(qū)連接)的制備取得了一定程度的成功，但仍然存在明顯的免疫原性的問題。一般來說，使用典型的人單克隆抗體制備技術(shù)制備與Fas配體相互作用的人免疫球蛋白，就象制備與許多抗原相互作用的人免疫球蛋白一樣是極其困難的。同樣地，使用重組DNA技術(shù)制備所謂的“人源化”或“重構(gòu)”抗體其效果難以保證，這部分歸因于不能預(yù)測產(chǎn)生的免疫球蛋白的親和力(例如，請參見Jones等，《自然》(Nature)，321，522-525(1986)；Shearman等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)147卷，4366-4373(1991)；Keetleborough蛋白質(zhì)工程4，773-783(1991)；Gorman等.《國家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，88卷，4181-4185(1991)；Tempest等，《生物技術(shù)學(xué)》(Biotechnology)，9卷，266-271(1991)；Riechmann等，《自然》(Nature)，332卷，323(1988)和EPO出版號0239400，在此引入以供參考)。此外，期待得到能與來源于Fas配體的特定多肽相互作用的抗體，即已知其與Fas配體結(jié)合部位的抗體，以對Fas配體進一步研究并對其功能進一步分析。本發(fā)明的一個目的是提供一種抗Fas配體抗體和一種應(yīng)用這種抗體的測定方法；更具體地講，是一種應(yīng)用抗Fas配體測定人體液中Fas配體的方法以及適宜應(yīng)用于這種測定方法的抗體。本發(fā)明的另一個目的是提供一種抗Fas配體抗體，它對Fas配體誘導(dǎo)的凋亡表現(xiàn)出高度抑制，如抑制50％或更高；并且該抗體是一種人源化的抗體。本發(fā)明的再一個目的是提供產(chǎn)生這樣的抗體的雜交瘤或細胞系。還有，本發(fā)明也提供包括至少一種前述的本發(fā)明的抗Fas配體抗體作為不可缺少的成分或有效成分的新型組合物或藥劑，同時也提供用來治療伴隨著、起因于或涉及Fas/Fas配體系統(tǒng)異常或通過Fas抗原導(dǎo)致的凋亡異常的全身性或局部病理狀況或疾病的方法，該方法包括給病人注射有效治療劑量的一種抗Fas配體抗體以抑制表達Fas抗原的細胞發(fā)生凋亡。附圖簡述圖1.一幅圖解式圖，說明推測的人Fas配體胞外區(qū)的表位區(qū)以及推測的表位區(qū)中的氨基酸序列或多肽。圖2.一張照片，代替附圖，顯示用抗M52多肽的單克隆抗體對Fas配體進行Western印跡得到的結(jié)果。圖3.一幅圖，說明抗M52多肽的單克隆抗體對凋亡誘導(dǎo)活性的影響。圖4.一幅圖，說明抗Fas配體抗血清(批號8-2)中的抗體滴度。圖5.一幅圖，說明F919-9-18單克隆抗體的凋亡抑制活性。圖6.一幅圖，說明來源于酵母的Fas配體的胞外區(qū)經(jīng)凝膠過濾層析所得的結(jié)果。圖7.一幅圖，是應(yīng)用多克隆抗體的夾心EIA系統(tǒng)的標準曲線。圖8.一幅圖，說明正常人血清在夾心EIA系統(tǒng)中的作用。圖9.一幅圖，顯示患各種疾病的病人血清中Fas配體的濃度。圖10.一幅圖，說明小鼠F919抗體輕鏈可變區(qū)cDNA序列和翻譯后的氨基酸序列。其互補決定區(qū)(CDRs)下劃單線，成熟鏈的第一個氨基酸下劃雙線。圖11.一幅圖，說明小鼠F919抗體重鏈可變區(qū)cDNA序列和翻譯后的氨基酸序列。其互補決定區(qū)(CDRs)下劃單線，成熟鏈的第一個氨基酸下劃雙線。圖12.一幅圖，說明人源化F919抗體變體2輕鏈可變區(qū)DNA序列和翻譯后的氨基酸序列。在其互補決定區(qū)(CDRs)下劃單線，成熟鏈的第一個氨基酸下劃雙線。圖13.一幅圖，說明人源化F919抗體變體2重鏈可變區(qū)DNA序列和翻譯后的氨基酸序列。在其互補決定區(qū)(CDRs)下劃單線，在成熟鏈的第一個氨基酸下劃雙線。圖14.一幅圖，說明小鼠的與人源化的F919抗體變體1的競爭性結(jié)合。在有放射性標記的示蹤物小鼠F919抗體存在時，以濃度逐漸升高的預(yù)冷的競爭性抗體與表達Fas配體的1A12轉(zhuǎn)染細胞共同孵育，并測定放射活性的結(jié)合/游離的比率。所示的結(jié)果是兩個樣品的平均值。圖15.一幅圖，說明小鼠的和人源化的F919抗體變體2的競爭性結(jié)合。在有放射性標記的示蹤物小鼠F919抗體存在時，以濃度逐漸升高的預(yù)冷的競爭性抗體與表達Fas配體的1A12轉(zhuǎn)染細胞共同孵育，并測定放射活性的結(jié)合/游離的比率。所示的結(jié)果是兩個樣品的平均值。圖16.一幅圖，說明小鼠F919抗體和人源化的F919抗體(變體1)的凋亡抑制活性。所示結(jié)果是三個樣品的平均值。圖17.一幅圖，說明小鼠F919抗體和人源化的F919抗體(變體2)的凋亡抑制活性。所示結(jié)果是三個樣品的平均值。圖18.一幅圖，是用兩種單克隆抗體作夾心EIA所得的標準曲線。圖19.一幅圖，表示一個HIV病毒感染者的一組血清中Fas配體濃度的變化。圖20.一幅圖，表示一個甲肝病毒感染者的一組血清中Fas配體濃度的變化。圖21.一幅圖，表示一個乙肝病毒感染者的一組血清中Fas配體濃度的變化。圖22.一幅圖，表示一個丙肝病毒感染者的一組血清中Fas配體濃度的變化。實施發(fā)明的最佳方式自此之后將對本發(fā)明詳細敘述。下文所述的抗體由本發(fā)明提供。一種抗Fas配體的中和抗體(自此之后有時會稱之為中和抗體)，它是(1)一種抗Fas配體的抗體，對Fas抗原表達細胞由Fas配體誘導(dǎo)的凋亡有高度抑制活性，在30μg/ml時凋亡抑制率可達50％或更高，優(yōu)選10μg/ml，更優(yōu)選3μg/ml，再更優(yōu)選1μg/ml，最優(yōu)選0.3μg/ml。(2)一種至少識別一種有生物活性的Fas配體的抗Fas配體抗體。(3)一種不識別任何無生物活性Fas配體的抗Fas配體抗體。(4)一種具有(2)和(3)特點的抗Fas配體抗體。(5)根據(jù)(2)或(4)的抗Fas配體抗體，其中有生物活性的Fas配體如實例中所描述的那樣，至少是Fas配體的胞外區(qū)、游離Fas配體、Fas配體胞外區(qū)的缺失突變體多肽nd5、nd12、nd20、nd32和nd42和人Fas配體胞外區(qū)的置換突變體L179F之一。(6)根據(jù)(3)、(4)或(5)的抗Fas配體抗體，其中無生物活性的Fas配體至少是Fas配體胞外區(qū)的缺失突變體多肽nd49、Fas配體胞外區(qū)的缺失突變體多肽cd179和以硫酸銨鹽析因聚集反應(yīng)而變性的Fas配體之一。(7)一種具有(1)和(2)特點的抗Fas配體抗體。(8)一種抗Fas配體抗體，與人Fas配體結(jié)合的親和常數(shù)至少是107M-1，優(yōu)選108M-1，更優(yōu)選109M-1，特別優(yōu)選1010M-1或更高。(9)根據(jù)(1)～(7)任何一條的抗Fas配體抗體，與人Fas配體結(jié)合的親和常數(shù)至少是107M-1，優(yōu)選108M-1，更優(yōu)選109M-1，特別優(yōu)選1010M-1或更高。(10)一種抗Fas配體抗體，至少包括圖10或圖11所示的互補決定區(qū)(CDRs)之一，優(yōu)選全部包括。(11)根據(jù)(1)～(9)任何一條的抗Fas配體抗體，至少包括圖10或圖11所示的互補決定區(qū)(CDRs)之一，優(yōu)選全部包括。(12)一種作為人源化免疫球蛋白(Ig)的抗Fas配體抗體，它包括人受者Ig框架區(qū)(FR)至少之一，優(yōu)選全部包括，并且包括能與人Fas配體特異結(jié)合的非人供者Ig的CDRs至少之一，優(yōu)選全部包括。(13)根據(jù)(1)～(11)任何一條的抗Fas配體抗體，是根據(jù)(12)的人源化免疫球蛋白(Ig)。(14)根據(jù)(12)或(13)的抗Fas配體抗體，其中非人供者的Ig是根據(jù)(1)～(11)任何一條的抗Fas配體抗體。(15)根據(jù)(14)的抗Fas配體抗體，其中非人供者的Ig是小鼠F919-9-18抗體。此處所用的術(shù)語中和抗體是指對Fas抗原表達細胞由Fas配體誘導(dǎo)的凋亡有抑制活性的抗體，用實例1-3中所描述的方法或用一種已知的方法測定凋亡的水平(用放射活性或特異裂解(％)表示)，中和抗體表現(xiàn)出的凋亡水平比對照組如未加抗體組的水平要低。更進一步講，中和抗體是以下面的公式計算對凋亡的抑制可達10％或更高的抗體，優(yōu)選30％或更高，更優(yōu)選50％或更高，最優(yōu)選90％或更高。術(shù)語Fas配體的生物活性是指Fas配體能誘導(dǎo)或抑制Fas抗原表達細胞發(fā)生凋亡的活性，可以通過實例1-3所描述的方法進行測定；或者也可以通過一種已知的方法進行測定。術(shù)語抗Fas配體抗體是指具有識別Fas配體或與Fas配體反應(yīng)活性的抗體，并且包括可以通過本發(fā)明所述的任何方法或通過一種已知的方法確認能與Fas配體抗原(如Fas配體的胞外區(qū))相結(jié)合的抗體。本發(fā)明還提供[2]針對來源于Fas配體的特定肽的抗Fas配體抗體。(1)一種與該肽特異性反應(yīng)的抗Fas配體抗體。(2)根據(jù)(1)的抗Fas配體抗體，其中的肽選自序列鑒定號1-8的肽。(3)根據(jù)(1)的抗Fas配體抗體，其中的肽是序列鑒定號1或6的肽。(4)根據(jù)(1)的抗Fas配體抗體，其中的肽是序列鑒定號1的肽。(5)根據(jù)(4)的抗Fas配體抗體，其中肽的區(qū)域與序列鑒定號1氨基酸序列所描述的氨基酸序號1-9或10-20相對應(yīng)。本發(fā)明中的抗體[1]是識別對Fas配體生物活性表達至關(guān)重要的表位的抗體。這樣的表位被確信是在有生物活性的Fas配體上所表達的，而不是在無生物活性的Fas配體上所表達的。舉例說明一下，前者有Fas配體的胞外區(qū)，游離Fas配體，F(xiàn)as配體胞外區(qū)的缺失突變體多肽nd5、nd12、nd20、nd32和nd42和人Fas配體胞外區(qū)的置換突變體L179F；后者有Fas配體胞外區(qū)的缺失突變體多肽nd49，人Fas配體胞外區(qū)的缺失突變體多肽cd179和實例4-1中所描述的硫酸銨鹽析所形成的Fas配體胞外區(qū)的聚集體。本發(fā)明還提供如下抗Fas配體抗體，它們在以下[實例]所述的實驗中在標準的結(jié)合條件下(即生理鹽水或血清)與Fas配體的親和常數(shù)至少為約107M-1，優(yōu)選108M-1，更優(yōu)選109M-1，最優(yōu)選1010M-1或更強。本發(fā)明也提供如下抗Fas配體抗體，它包括圖10或圖11所示的互補決定區(qū)(CDRs)中的至少一種，優(yōu)選3種，更優(yōu)選全部。本發(fā)明[1]的抗體的優(yōu)選實施方案包括雜交瘤F919-9-18產(chǎn)生的單克隆抗體；識別的表位與這樣的單克隆抗體所識別的表位相同的抗體；和與這樣的單克隆抗體競爭性結(jié)合相應(yīng)抗原的抗體。本發(fā)明[1]的抗體能夠高度抑制凋亡。本發(fā)明[1]的抗體也可應(yīng)用于一種測定方法，其中Fas配體，尤其是人體液中有生物活性的Fas配體可以高度敏感地被測定，因為這些抗體識別Fas配體。尤其是有生物活性的Fas配體。本發(fā)明[2]的抗體的優(yōu)選實施方案包括由F918-7-3、F918-9-4、F918-20-2等雜交瘤產(chǎn)生的抗體，識別的表位與這樣的抗體所識別的表位相同的抗體；以及與這樣的抗體競爭性結(jié)合相應(yīng)抗原的抗體。前面所提的[2](5)的抗體中，其中特異地與由序列鑒定號1的肽中氨基酸1-9組成的肽反應(yīng)的抗體包括F918-7-3；與由序列鑒定號1的肽中氨基酸10-20組成的肽反應(yīng)的抗體包括F918-9-4和F918-20-2。本發(fā)明[2]中的抗體和Fas配體特異性結(jié)合，也和參與反應(yīng)的Fas配體的區(qū)域已經(jīng)搞清的特殊物種的Fas配體特異性結(jié)合。因此，這樣的抗體可用于對人體液中的Fas配體進行高敏感性測定。這樣的抗體也可用于選擇性地測定一種或多種特殊的Fas配體。本發(fā)明的抗Fas配體抗體可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體，只要它結(jié)合Fas配體或來源于Fas配體的多肽。不過，鑒于單克隆抗體特性明確，它更為優(yōu)選?？贵w，即免疫球蛋白，包括重鏈和輕鏈，根據(jù)重鏈的類型分成五類(IgG、IgA、IgM、IgD和IgE)。五類中IgG和IgA根據(jù)重鏈的類型又可分成亞類。本發(fā)明的抗Fas配體抗體可屬于其中的任何一類和任何一亞類。免疫球蛋白可以分成兩個片段，例如，用胃蛋白酶消化后分成F(ab′)2和Fc′，用木瓜蛋白酶消化后分成Fab和Fc。本發(fā)明中的抗體既可以是完整的抗體，也可以是組成抗體一部分的片段，只要這個片段能夠與抗原相結(jié)合。本發(fā)明中的抗體也可以是嵌合抗體或人的抗體。本發(fā)明中的抗體也包括用已知方法連接了各種標記物的標記抗體以及與另一種物質(zhì)如多肽、免疫毒素融合在一起的融合抗體?？贵w的基本結(jié)構(gòu)單位包含一個四聚體。每一個四聚體由兩對相同的多肽鏈組成，每一對里有一條“輕”鏈(約25KD)和一條“重”鏈(約50-70KD)。每一條鏈的NH2-未端以約100-110或更多個氨基酸的可變區(qū)開始，主要負責(zé)抗原的識別。每一條鏈的COOH部分是一個恒定區(qū)，主要負責(zé)效應(yīng)功能。輕鏈要么是Kappa型，要么是lambda型。重鏈又可分為gamma，mu，alpha，delta和epsilon，分別決定了抗體的同種型，即IgG、IgM，IgA、IgD和IgE。在輕鏈和重鏈內(nèi)，可變區(qū)和恒定區(qū)被一個約有12或更多個氨基酸的“J”區(qū)連在一起，重鏈還包括一個約有10多個氨基酸的D區(qū)(請參見《基礎(chǔ)免疫學(xué)》(Fundamentallmmunology)，Paul，W.編輯，第七章，131-166頁，RavenPress.N.Y.(1984)，在此引入以供參考)。每一對輕鏈/重鏈的可變區(qū)形成了抗體的結(jié)合部位。這些鏈均表現(xiàn)出相同的基本結(jié)構(gòu)，即相對保守的框架區(qū)被三個高變區(qū)，也稱為互補決定區(qū)域或CDRs連接起來(請參見“免疫相關(guān)蛋白的序列”KabatE.等，U.S.DepartmentofHealthandHumanSeruices，(1987)；和ChothiaandLesk，《分子生物學(xué)雜志)》(J，MolBiol)196.901-917，(1987)在此引入以供參考)。每一對的兩條鏈的CDRs通過框架區(qū)而密切合作以便能與特異的表位相結(jié)合。象此處所用的那樣，術(shù)語“免疫球蛋白”是指一種蛋白，它包含一條或多條基本由免疫球蛋白基因編碼的多肽。已經(jīng)確認的免疫球蛋白的基因包括Kappa，Lanbda，alpha，gamma，delta，epsilon和mu的恒定區(qū)基因以及大量的免疫球蛋白的可變區(qū)基因。免疫球蛋白可以以除抗體以外的許多形式存在；包括，如Fv，F(xiàn)ab和F(ab′)2，以及雙功能雜合抗體(例Lanzavecchia等，《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur.J.Immunol)，17，105(1987))和單鏈(如Huston等，《國家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.)，85，5879-5883(1988)和Bird等，《科學(xué)》(Science)242，423-426，(1988)，在此引入以供參考)。(請參見，Hood等，《免疫學(xué)》(Immunology)，Benjamin，N.Y.，2nded.，(1984)，HarlowandLane，《抗體實驗室手冊》(AntibodiesAlaboratoryManual)，ColdSpringHarborLaboratory(1988)和HunkapillerandHood，《自然》(Nature)，323，15-16(1986)，在此引入以供參考)。眾所周知，天然形式的“成熟免疫球蛋白”在長度方面有一定程度的變化，這是因為序列中有一個或多個氨基酸發(fā)生缺失、置換、插入或加入。因此，可變區(qū)和恒定區(qū)兩者均易發(fā)生大量的自然的修飾，而它們又基本一致并能保持各自的活性。根據(jù)已經(jīng)熟知的方法，人恒定區(qū)DNA序列和重排的可變區(qū)DNA序列可以從許多人的細胞，優(yōu)選永生化B細胞中分離出來。同樣的方法可以用來從非人源細胞中分離非人免疫球蛋白序列。用于分離DNA序列的適宜的來源細胞和用于表達和分泌免疫球蛋白的宿主細胞有許多來源途徑，如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(“細胞系和雜交瘤目錄”，第五版(1985)，Rockville，Maryland，U.S.A.，在此引入以供參考)。除了這些“天然存在”形式的免疫球蛋白鏈之外，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種重組DNA技術(shù)很容易設(shè)計和制備“基本一致”的經(jīng)修飾的重鏈和輕鏈。例如，這些鏈可以通過數(shù)個氨基酸的置換、末端或中間插入和缺失等等而在一級結(jié)構(gòu)水平上與天然存在的序列不同。另外，可以制備只包括一部分一級結(jié)構(gòu)的多肽片段，這些片段有一種或多種免疫球蛋白活性(如結(jié)合活性)。尤其是人們已經(jīng)注意到，象許多基因一樣，免疫球蛋白相關(guān)基因有不同的功能區(qū)，每個區(qū)有一種或多種不同的生物活性。通常來說，利用許多已經(jīng)熟知的技術(shù)，如定點誘變技術(shù)，很容易對編碼想得到的表位結(jié)合成份的基因進行修飾(參見，GillmanandSmith，《基因》(Gene)，881-97(1979)和Roberts.S.等，《自然》(Nature)，328731-734(1987)，兩者在此引入以供參考)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，表位結(jié)合成份是由“嵌合的”或“人源化的”免疫球蛋白基因編碼(參見，CoandQueen(1991)，《自然》(Nature)，351501)。嵌合抗體，其輕鏈和重鏈的基因是由分屬不同物種的免疫球蛋白基因片斷構(gòu)建而成，構(gòu)建的方法通常是基因工程方法。例如，來自小鼠的單克隆抗體的基因可變區(qū)片段(V)可以連接于人的恒定區(qū)片段(C)，如γ1和γ4。因此，典型的治療性嵌合抗體是一種雜合蛋白，這種蛋白是由來自小鼠抗體的V或抗原結(jié)合功能區(qū)和來自人抗體的C或效應(yīng)功能區(qū)組成，盡管來自其他哺乳動物的也可以被采用。象此處所用的那樣，術(shù)語“框架區(qū)”是指免疫球蛋白重鏈/輕鏈可變區(qū)的一些部分，它們在一個物種的不同免疫球蛋白中相對保守(如，CDRs之外的部分)，如Kabat等的定義，見所引的文獻。象此處所用的那樣，術(shù)語“人框架區(qū)”是指與天然存在的人抗體框架區(qū)基本一致(達約85％或更高)的一種框架區(qū)或抗體中一些共同序列等。象此處所用的那樣，術(shù)語“人源化的免疫球蛋白”是指一種免疫球蛋白，它包括一個人的免疫球蛋白框架、至少一個非人抗體的CDRs，并且其中的任何恒定區(qū)與人免疫球蛋白的恒定區(qū)基本一致，即，至少約85-90％，優(yōu)選至少95％一致。因此，可能除了CDRs，人源化的免疫球蛋白的所有部分均與一種或多種天然的人免疫球蛋白序列的相應(yīng)部分基本一致。例如，人源化免疫球蛋白不包括由小鼠可變區(qū)/人恒定區(qū)組成的嵌合抗體。作為本發(fā)明的更優(yōu)選方式，本發(fā)明還提供能特異性地與Fas配體結(jié)合、屬于人源化免疫球蛋白的抗Fas配體抗體。更具體地講，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明任何一種抗體的抗Fas配體抗體，其為人源化免疫球蛋白，包括來源于多個，優(yōu)選一個人受者的免疫球蛋白的至少一個框架區(qū)，優(yōu)選一條鏈的所有框架(4個)，更優(yōu)選所有框架區(qū)(每條鏈上有4個)，和多于1個，優(yōu)選所有的(每條鏈上有3個)來源于非人供者，優(yōu)選嚙齒類，更優(yōu)選小鼠的能與Fas配體特異性結(jié)合的免疫球蛋白的互補決定區(qū)。這些免疫球蛋白可有兩對輕鏈/重鏈復(fù)合體，其中至少一條鏈，尤其是重鏈包括一個或多個，優(yōu)選所有的(3個)與人的框架功能性相連的供者(小鼠)免疫球蛋白的CDRs，例如，供者(小鼠)的CDRs，無論有或沒有額外的自然相連的供者(小鼠)的氨基酸殘基，均可被導(dǎo)入人的框架區(qū)以制備人源化的免疫球蛋白，它能與Fas配體結(jié)合，親和力水平強于約107M-1。這些人源化的免疫球蛋白也能阻斷提供CDRs的小鼠單克隆抗體與Fas配體的結(jié)合。在優(yōu)選實施方案里，一個或多個CDRs將來源于本發(fā)明中的抗體，優(yōu)選根據(jù)發(fā)明[1]中任何一種的非人供者抗體，尤其是F919-9-18抗體，并且人源化的免疫球蛋白將屬于IgG1或IgG4同種型。更確切地講，本發(fā)明的人源化免疫球蛋白包括至少一個，優(yōu)選全部的(每條鏈上有3個)CDRs，其每一個均包含或由序列鑒定號11，13，15，19，21或23的氨基酸序列組成。優(yōu)選人源化免疫球蛋白的每一個CDR和框架區(qū)的位置與它們所來源的供者免疫球蛋白的對應(yīng)部分相當。通常情況下，本發(fā)明的人源化抗體將包括重鏈可變區(qū)序列，其中人源化免疫球蛋白重鏈可變區(qū)框架的序列與供者免疫球蛋白重鏈可變區(qū)框架的序列65％或65％以上但95％或95％以下一致(即序列同源性百分比)，優(yōu)選70％或70％以上但90％或90％以下一致。通常情況下，人們選擇來自于同一個人抗體的重鏈和輕鏈以減小不相匹配的可能性，但來自于兩個不同人抗體的重鏈和輕鏈也可使用。至于人框架區(qū)，要把提供CDR的非人免疫球蛋白的框架區(qū)或可變區(qū)的氨基酸序列與人免疫蛋白的序列庫中的相應(yīng)序列進行比較，并選擇有高度同源性的序列。優(yōu)選框架氨基酸序列同源性達60％或60％以上，更優(yōu)選65％或65％以上。受者免疫球蛋白重鏈可變區(qū)序列優(yōu)選在與供者免疫球蛋白重鏈可變區(qū)序列最為同源的人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)代表性序列庫的5段序列中，更優(yōu)選3段序列中。人源化免疫球蛋白的設(shè)計可按下面所述進行。(1)當一個氨基酸屬于下述類型時，要用的人免疫球蛋白(受者免疫球蛋白)框架氨基酸可以被提供CDR的非人免疫球蛋白(供者免疫球蛋白)的框架氨基酸所代替(a)受者免疫球蛋白人框架區(qū)的氨基酸在那個位置對人免疫球蛋白來說不同尋常，而供者免疫球蛋白相應(yīng)的氨基酸在那個位置對人免疫球蛋白來說有代表性；(b)氨基酸所在的位置緊鄰一個CDR；或者(c)氨基酸至少有一個原子與免疫球蛋白三級結(jié)構(gòu)模型中的CDR距離為約5以內(nèi)，優(yōu)選4以內(nèi)，更優(yōu)選3以內(nèi)(參見Co等，《國家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，88，2869(1991))。(2)當受者免疫球蛋白人框架區(qū)的每一個氨基酸和供者免疫球蛋白的相應(yīng)氨基酸在那個位置對人免疫球蛋白來說都不同尋常時，這樣的氨基酸就可以被在那個位置對人框架區(qū)有代表性的氨基酸置換。關(guān)于獲得人源化免疫球蛋白的詳細敘述(參見，Queen等，《(國家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl，Acad，Sci.U.S.A.)86，10029(1989)，國際專利申請公開號WO90/07861和WO92/11018，Co等，《國家科學(xué)院院刊》(Proc，Natl，Acad.SciU.S.A.)，88，2869(1991)，Co和Queen，《自然》(Nature)，卷351，501(1991)和Co等《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol，)148，1149(1992)，在此引入以供參考)。通常符合上述標準的所有或絕大部分氨基酸均被置換是可取的。然而，有時并不清楚是不是每一個氨基酸都符合上述標準，這樣就制備了各種各樣的置換免疫球蛋白，它們有的有特異性置換，有的沒有。本發(fā)明的人源化抗體通常用相應(yīng)的供者(小鼠)框架殘基在至少第1，3，5，更常見在第7位上置換人輕鏈框架殘基。而且，當人的框架是來自Eu抗體，特別當CDR供者是小鼠F919-9-18的時候，氨基酸的置換包括在表4和5中所列的位置的置換。人源化抗體通常也包括用相應(yīng)的供者(小鼠)重鏈框架殘基在至少第1，3，5，7，9，11，13，更常見在第16位上進行置換。而且，當人的框架是來自Eu抗體，特別是當CDR供者是小鼠F919-9-18的時候，氨基酸的置換包括表4和表5中所列的位置上的置換。通常這些位置可以用含有典型氨基酸或類似氨基酸的人免疫球蛋白相應(yīng)位置的氨基酸置換。再者，框架區(qū)某些位置上的氨基酸可以直接與抗原相互作用，比如通過非共價鍵相互作用。這些位置上的氨基酸可以被置換。尤其是人們相信重鏈26-30位的氨基酸被包括在一個高變環(huán)里(Chothia和Lesk，《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.)，196，901-917(1987))，那么這些位點的氨基酸也可象CDRs一樣被植入。人源化抗體在用于人的治療方面較小鼠并且某些情況下較嵌合抗體至少有三個潛在的優(yōu)越性。1)因為效應(yīng)部分是來源于人的，它與人免疫系統(tǒng)的其他部分的相互作用可能會更好(如通過補體依賴的細胞毒(CDC)或抗體依賴的細胞毒(ADCC)更有效地破壞靶細胞)。2)人免疫系統(tǒng)將不會認為人源化抗體的框架區(qū)或C區(qū)為外源物質(zhì)，因此，針對被注射的這樣的抗體的抗體反應(yīng)將會比針對完全是外源性的小鼠抗體或部分是外源性的嵌合抗體的抗體反應(yīng)更小。3)有人報道注射的小鼠抗體在人體循環(huán)的半衰期要比正?？贵w的半衰期短得多(Shaw，D.等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol)，138，4534-4538(1987))。注射的人源化抗體的半衰期很可能更接近于天然存在的人抗體的半衰期，這就允許給予的劑量可以更少，頻率更低。本發(fā)明的抗Fas配體抗體既包括對Fas抗原和Fas配體的結(jié)合有影響的抗體，也包括對Fas抗原和Fas配體的結(jié)合無影響的抗體。有些抗體，比如本發(fā)明[1]中的抗Fas配體的抗體，能與Fas配體結(jié)合但不誘導(dǎo)凋亡；這樣的抗體可以作為在體內(nèi)與Fas配體競爭的物質(zhì)以人工抑制凋亡。本發(fā)明中的抗Fas配體抗體可以用于對Fas配體的測定，并且作為進行這樣的測定所用試劑或試劑盒的一個組分。本發(fā)明還提供一種測定方法、用于這種測定的一種試劑和一種試劑盒，如下所述。用抗Fas配體抗體測定人體液中Fas配體的方法、試劑和試劑盒。(1)測定Fas配體的方法、試劑和試劑盒，其中至少使用或包括一種在[1]或[2]中所描述的抗體。(2)根據(jù)(1)的用于測定的方法、試劑和試劑盒，這種測定是用競爭法進行。(3)根據(jù)(1)的用于測定的方法、試劑和試劑盒，這種測定是用夾心法進行。(4)根據(jù)(1)～(3)任一項的用于測定方法、試劑和試劑盒，其中組合使用或包括兩種或兩種以上相同類型或不同類型的中和抗體。(5)根據(jù)(1)～(3)任一項的用于測定的方法、試劑和試劑盒，其中組合使用或包括兩種或兩種以上相同或不同類型的根據(jù)[2]的抗體。(6)根據(jù)(1)～(3)任一項的用于測定的方法、試劑和試劑盒，其中組合使用或包括根據(jù)[2]的抗體和中和抗體。(7)根據(jù)(6)的用于測定的方法、試劑或試劑盒，其中該中和抗體是F919-9-18，它由登記號為BP-5535的雜交瘤所產(chǎn)生。(8)根據(jù)(6)或(7)的用于測定的方法、試劑和試劑盒，其中根據(jù)[2]的抗體能特異的與序列鑒定號1的肽反應(yīng)。(9)根據(jù)(8)的用于測定的方法、試劑和試劑盒，其中根據(jù)[2]的抗體能特異地與序列鑒定號1中氨基酸序號11-20的肽反應(yīng)。(10)根據(jù)(8)或(9)的方法、試劑和試劑盒，其中根據(jù)[2]的抗體是F918-9-4或F918-20-2。一種抗Fas配體抗體可以和另外兩種或更多種抗Fas配體抗體組合應(yīng)用于根據(jù)(1)～(10)的用于測定的方法、試劑和試劑盒。中和抗體，特別是本發(fā)明中的中和抗體據(jù)信能夠識別Fas配體上的結(jié)構(gòu)或表位，這種結(jié)構(gòu)或表位對Fas配體的生物活性而言是必要的；因此，本發(fā)明中應(yīng)用中和抗體的測定方法能夠高度敏感地測定標本中特別是人體液中的Fas配體，尤其是有生物活性的Fas配體。這種測定方法可以用來代替生物測定，后者是檢測標本中的Fas配體生物活性。如前述，F(xiàn)as配體在生理條件下是以三聚體的形式存在和行使功能，因此就可以用組合的同一種抗體通過夾心法進行測定，這將在實例中進行描述。由于本發(fā)明[2]中的抗體能特異性地與Fas配體反應(yīng)，且參與這種反應(yīng)的肽的區(qū)域已經(jīng)搞清，因此應(yīng)用本發(fā)明[2]中的抗體的測定方法能高度敏感地測定標本中尤其是人體液中的Fas配體。對一種或多種特定Fas配體的選擇性測定也是可行的。將中和抗體，尤其是本發(fā)明中的中和抗體與本發(fā)明[2]中的抗體組合起來，可以對一種或多種特定的有生物活性的Fas配體進行選擇性測定。更進一步，應(yīng)用本發(fā)明的不同測定方法同時測定同一標本可以獲得Fas配體的總量，特定Fas配體的量和特定Fas配體的量所占比例。這種測定不僅可以知道在一種特定疾病或病理狀況下Fas配體的量的變化，也可以知道質(zhì)的變化。本發(fā)明所測標本并不限于人體液。不過，本發(fā)明的測定方法適于測定體液特別是人體液中的Fas配體，優(yōu)選的人體液標本選自血液、漿液、血清、尿液、腦脊液、淋巴、唾液、腹水和胸膜腔滲出液之一。如實例所示，F(xiàn)as配體作為本發(fā)明抗體所識別的抗原和本發(fā)明的測定方法所檢測的物質(zhì)，并不限于任何特定的Fas配體，而是只要它來源于Fas配體，尤其是人的Fas配體即可。它可以與Fas抗原結(jié)合，也可以不結(jié)合，可以誘導(dǎo)凋亡，也可以不誘導(dǎo)；可以是一種在機體本身就可以找到的內(nèi)源性Fas配體；也可以是一種外源性Fas配體可以來源于自然存在的生物體，也可以通過遺傳工程的方法制備或化學(xué)合成；可以被一條糖鏈所修飾，也可以不被修飾。代表性的Fas配體包括表達Fas配體的細胞，F(xiàn)as配體，F(xiàn)as配體的胞外區(qū)，游離Fas配體或來源于Fas配體的一個肽片段，F(xiàn)as配體的缺失突變體或置換突變體，其中有一個或多個氨基酸缺失或置換，以及包括部分Fas配體在內(nèi)的融合蛋白。該測定方法可以用來測定正常供者或那些患各種疾病的供者體液中的Fas配體。應(yīng)當指出的是正是本發(fā)明第一次使測定體液中Fas配體的濃度成為可能。例如，肝炎、HIV感染或自身免疫病患者的Fas配體濃度比正常供者的要高，這樣的發(fā)現(xiàn)可用于診斷這些疾病。而且，不影響由Fas配體誘導(dǎo)的凋亡的抗Fas配體抗體可用于體內(nèi)診斷。本發(fā)明還提供一種用于如下所述測定的方法，一種試劑和一種試劑盒。使用抗Fas配體抗體測定人體液中Fas配體的方法、試劑和試劑盒。(1)測定人體液中Fas配體的方法、試劑和試劑盒，用于預(yù)測或檢測Fas配體的升高/降低和/或Fas抗原/Fas配體系統(tǒng)的異常；用于預(yù)測、檢測和診斷有這種異常的疾病和與這樣的疾病相關(guān)的病理狀況。(2)用于檢測與Fas/Fas配體異常有關(guān)的疾病中Fas/Fas配體系統(tǒng)異常而引起的全身性或局部病理狀況。(3)根據(jù)(1)或(2)的方法、試劑和試劑盒，根據(jù)[3]的方法進行。(4)根據(jù)(1)～(3)的方法、試劑和試劑盒，其中該疾病是一種自身免疫病、肝炎或HIV感染。本發(fā)明還再提供一種雜交瘤或細胞系，如下所述。產(chǎn)生抗Fas配體抗體的雜交瘤或細胞系。(1)產(chǎn)生根據(jù)[1]或[2]的抗體的雜交瘤或細胞系。(2)具有登記號FERMBP-5533、FERMBP-5534或FERMBP-5535的雜交瘤(在本說明書中，它們分別稱為F918-7-3、F918-9-4、F919-9-18。這些雜交瘤于1995年6月22日保存于日本通產(chǎn)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，1-3，Higashi1ChomeTsukuba-shiIbaruki-Ken，并且于1996年3月9日根據(jù)《布達佩斯條約》移交了它們的管理權(quán)。)。本發(fā)明進一步還提供新型組合物或藥劑，它們含有本發(fā)明前面提及的抗Fas配體抗體中的至少一種作為活性或有效成分；本發(fā)明也提供治療全身性或局部病理狀況或疾病的方法、這些病理狀況或疾病伴隨、起因于、涉及或包括Fas/Fas配體系統(tǒng)的異?；蛴蒄as抗原誘導(dǎo)的凋亡的異常。這些方法包括一個步驟，在該步施用本發(fā)明中的抗Fas配體抗體的至少一種，尤其是抑制表達Fas的細胞的Fas配體誘導(dǎo)的凋亡的抗Fas配體抗體。獲得根據(jù)本發(fā)明的抗Fas配體抗體的方法將在下文中進一步描述。如實例所示，用以制備本發(fā)明的抗Fas配體抗體的抗原不限于任何特殊的抗原，只要它包含來源于Fas配體的肽，優(yōu)選人Fas配體。用以制備本發(fā)明的抗Fas配體抗體的抗原可以與Fas抗原結(jié)合，也可以不結(jié)合；可以誘導(dǎo)凋亡，也可以不誘導(dǎo)凋亡；可以來源于自然存在的生物體，也可以通過遺傳工程的方法或化學(xué)合成制備；可以被一條糖鏈所修飾，也可以不被修飾。代表性的抗原包括表達Fas配體的細胞，全長Fas配體，F(xiàn)as配體的胞外區(qū)，游離Fas配體，來源于Fas配體的一個肽片段，F(xiàn)as配體的缺失突變體或置換突變體，其中一個或多個氨基酸缺失或置換以及包括部分Fas配體的融合蛋白。本發(fā)明的抗Fas配體抗體，可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體，可以參考已知的方法制備(見《免疫學(xué)實驗操作指南》(日文)，由日本免疫學(xué)會編輯、出版和發(fā)行。)?？笷as配體抗體的制備簡述如下。為制備抗Fas配體抗體，動物首先要用免疫抗原(Fas配體或為Fas配體一部分的肽)接種，并且可同時接種適當?shù)淖魟?，如完全弗氏佐?FCA)或不完全弗氏佐劑(FIA)；如果需要，動物要在2-4周的間隔后再次免疫。再次免疫之后，收集血液以獲得抗血清。用作抗原的Fas配體并不由于它的制備過程而有所限制，只要所用的Fas配體有足夠的純度可用以制備抗體即可。當用作免疫抗原的多肽是一個含約10-20個氨基酸的低分子量多肽時，這條多肽可以在用作抗原前與一個載體如鑰孔血藍蛋白(KLH)相連接。用Fas配體免疫的動物并不限于任何特定的物種，優(yōu)選的是本領(lǐng)域技術(shù)人員在免疫學(xué)實驗中通常使用的動物，如大鼠、小鼠、兔子、倉鼠、綿羊、馬、母雞、山羊、豬和奶牛。優(yōu)選能產(chǎn)生目的抗體的動物種類。通過純化所得抗血清可以制備多克隆抗體。純化可以通過把鹽析、離子交換層析、親和層析和其他已知的合適方法組合起來進行。單克隆抗體的制備如下文所述。從被免疫動物中收集抗體產(chǎn)生細胞如脾細胞或淋巴細胞，收集到的細胞通過利用聚乙二醇、仙臺病毒、電脈沖等等的方法與一種骨髓瘤細胞系相融合以制備雜交瘤。然后選出產(chǎn)生Fas配體結(jié)合抗體的克隆并進行培養(yǎng)。通過純化所選克隆的上清可以獲得單克隆抗體。純化可以通過把鹽析、離子交換層析、親和層析和其他合適的方法組合起來進行?？笷as配體的抗體還可以通過遺傳工程的方法獲得。例如，mRNA可以從以Fas配體或它的肽片斷免疫的動物的脾細胞或淋巴細胞中提取，或從產(chǎn)生針對Fas配體的單克隆抗體的雜交瘤中提?。焕眠@些提取的mRNA可以構(gòu)建一個cDNA文庫。篩選產(chǎn)生與抗原反應(yīng)的抗體的克隆，將獲得的克隆進行培養(yǎng)。從培養(yǎng)混和物中就可以得到目的抗體，把已知的純化方法組合起來進行純化。本發(fā)明的免疫球蛋白，包括結(jié)合片段或由此來源的其他衍生物，用很多重組DNA技術(shù)可以方便地制備，最終表達于轉(zhuǎn)染的細胞，優(yōu)選永生化的真核細胞，如骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞。包含編碼人源化免疫球蛋白框架區(qū)的第一序列和編碼所需的免疫球蛋白互補決定區(qū)的第二序列庫可以通過合成制備或通過適宜的cDNA和基因組DNA片段重組進行制備。一方面，本發(fā)明針對編碼重鏈和/或輕鏈CDRs的重組DNA片段，這些重鏈和/或輕鏈的CDRs是來自能與所期望的Fas配體表位相結(jié)合的免疫球蛋白，優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明[1]的抗體，如單克隆抗體F919-9-18。編碼這些區(qū)的DNA區(qū)段一般會被連接到編碼合適的人框架區(qū)的DNA區(qū)段上。有代表性的DNA序列，它們編碼包含單克隆抗體F919-9-18的重鏈和輕鏈CDRs的多肽鏈，被包括在圖12和13中。由于密碼子簡并和非關(guān)鍵性的氨基酸置換，其他的DNA序列可以方便地置換那些序列，如下所述。關(guān)于人源化免疫球蛋白設(shè)計和制備的詳細描述請參見國際專利申請公開號WO/07861。DNA區(qū)段一般還會包括一個可操縱地與人源化免疫球蛋白編碼序列相連的表達控制DNA序列，它包括自然相連的或異源性的啟動子區(qū)。這些表達控制序列優(yōu)選能夠轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真核宿主細胞的載體的真核啟動子系統(tǒng)，但是針對原核宿主細胞的控制序列也可以使用。一旦載體導(dǎo)入到適宜的宿主中，宿主就可以置于適宜高水平表達核苷酸序列的條件下，根據(jù)需要，接下來就可以收集和純化輕鏈、重鏈、輕/重鏈二聚體或完整的抗體、結(jié)合片段或其他免疫球蛋白的形式。本發(fā)明的能最終表達所需人源化抗體的核苷酸序列可以通過許多不同的多核苷酸(基團組DNA或cDNA、RNA、合成的寡核苷酸等)和許多組成成分(如V，J，D和C區(qū))，并利用許多不同的技術(shù)而制備。將適宜的基因組序列和合成序列連接起來是目前最常用的制備方法，但cDNA序列也可以使用(請參見歐洲專利出版號0239400和Reichmann，L.等，《自然》(Nature)，332，323-327(1988)，在此引入以供參考)。根據(jù)已經(jīng)熟知的方法，可以從許多人細胞中，但優(yōu)選永生化B細胞中分離人恒定區(qū)DNA序列(請參見，Kabat，在所引文獻中，和WP87/02671)。制備本發(fā)明的免疫球蛋白的CDRs將同樣來源于能與Fas配體結(jié)合的單克隆抗體，也將同樣以熟知的方法在任何合適的哺乳動物，包括小鼠、大鼠、兔子或能產(chǎn)生抗體的脊椎動物中制備。合適的提供DNA序列的細胞和用于免疫球蛋白表達和分泌的宿主細胞有許多來源，如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(細胞系和雜交瘤目錄，第五版(1985)Rockville，Maryland，U.S.A.)。在優(yōu)選的實施方案中，這些CDRs有與F919-9-18的CDRs的序列分別相應(yīng)的序列，還可能包括與編碼相應(yīng)的F919-9-18的CDR氨基酸序列等同的核苷酸序列。除了此處詳細描述的人源化免疫球蛋白之外，利用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的各種重組DNA技術(shù)，易于設(shè)計和制備其它“基本同源”的修飾抗體。比如，許多不同的人框架區(qū)可以單獨或組合用作本發(fā)明的人源化免疫球蛋白的基礎(chǔ)。并且，框架區(qū)在一級結(jié)構(gòu)水平上可以通過幾個氨基酸的置換、末端和中間插入和缺失等而與天然序列有所不同。一個框架區(qū)的許多氨基酸幾乎不能或完全不能直接影響抗體的特異性或親和力。因此，目前認為，可允許許多單個的同源置換而不會改變所獲得的人源化免疫球蛋白的特異性和親和力。但是總體而言，這樣的置換是不可取的。通過許多眾所周知的技術(shù)可易于進行基因的修飾改變，比如定點誘變(參見，Gillman和Smith，《基因》8卷81-97頁，(1979)，以及RobertsS等，《自然》(Nature)328卷731-734頁(1987))。另一種選擇方法，可以制備只包括抗體一級結(jié)構(gòu)一部分的多肽片斷，這些片段包含一種或多種免疫球蛋白活性(如，結(jié)合活性)。這些多肽片斷可以通過以下方法制備，通過本領(lǐng)域中眾所周知的方法，蛋白水解裂解完整的抗體，或利用定點誘變將終止密碼子插入到pvk和pvgldhfr載體中的所需位置上，比如插入到CH1之后以制備Fab片斷或插入到鉸鏈區(qū)后以制備F(ab′)2片斷。利用DNA接頭連接VL和VH可以制備單鏈抗體(見Huston等，在所引用的文獻中和Bird等，在所引用的文獻中)。作為一個實例，根據(jù)以下方法在大腸桿菌中可制備Fv或Fab片斷，Buchner和Rudolph(1991)《生物/技術(shù)學(xué)》(Bio/Technology)9卷157-162頁和Skerra等(1991)《生物/技術(shù)學(xué)》(Bio/Technology)9卷273-277頁，在此引入作為參考)。Fv和Fab也可通過在真核細胞，優(yōu)選哺乳動物細胞中表達來制備。再者，因為免疫球蛋白相關(guān)基因象其它許多基因一樣，包含不同的功能區(qū)，每一區(qū)具有一種或多種不同的生物活性，所以這些基因可以與其它基因的功能區(qū)融合以制備具有新特性的融合蛋白(如，免疫毒素)(其它基因比如，酶，見普通轉(zhuǎn)讓的1987.12.15提交的U.S.S.N.132，387，在此引入作為參考)。本發(fā)明的抗-Fas配體抗體可用于檢測體液和組織中的Fas配體。再者，本發(fā)明的抗-Fas配體抗體也可用于制備適合在Fas配體的純化中使用的一種抗體柱，以及用于檢測在純化過程中所得到的級分中的本發(fā)明的Fas配體。在細菌宿主中表達編碼人源化免疫球蛋白的序列有助于應(yīng)用在編碼更高親和力的人源化免疫球蛋白序列的篩選中，該更高親和力人源化免疫球蛋白通過以下方法制備，在CDR區(qū)誘導(dǎo)一種突變并且制備噬菌體展示庫，該庫將用于篩選對Fas配體有高親和力和/或高特異性結(jié)合活性的具有突變CDR的人源化免疫球蛋白。這種高親和力的潛在優(yōu)勢可用于制備這樣一種具有突變CDR的人源化免疫球蛋白，即它對Fas配體的親和力得到提高和/或?qū)Τ鼺as配體之外的眾多分子的交叉反應(yīng)性得到降低。在該
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內(nèi)已經(jīng)可以獲得各種用于制備包括編碼免疫球蛋白可變區(qū)序列的噬菌體展示庫的方法。參見如，Sesalini，《歐洲生物化學(xué)學(xué)會聯(lián)合會通訊》(FEBSLett.)307卷66-70(1992)；Swimmer等，《國家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89卷3756-60頁(1992)；Gramm等，《國家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89卷3576-80頁(1992)；Crasson等，《自然》(Nature)352卷624-8頁(1991)；Scot和Smith，《科學(xué)》(Science)249卷386-90頁(1990)；Gallard等，《生物/技術(shù)學(xué)》(Bio/Techniques)9卷1373-1377(1991)，在此引入作為參考。所獲得的編碼具有更高強度親和力的CDR-突變的人源化免疫球蛋白的序列隨后在適合有效表達的宿主中進行表達。正如前面所述，一段DNA序列只有操縱性地與表達調(diào)控序列連接才能表達于宿主中，即，將它定位于能夠使表達調(diào)控序列發(fā)揮功能的一個位點上才能夠得以表達。這種表達載體在宿主中作為一種附加體或宿主染色體DNA的重要部分一般可以復(fù)制。一種表達載體通常包括一種篩選標志，如四環(huán)素抗性(tetR)、G418抗性(neoR)、霉酚酸(micophenolacid)抗性(gpt)或HSV-tk等標志，這種標志能使對已經(jīng)用所需DNA序列轉(zhuǎn)化的細胞的檢測得以進行。見，如，USP4,704,362，在此引入作為參考。大腸桿菌是一種尤其有利于克隆本發(fā)明DNA序列的原核生物宿主。其它適合的微生物宿主包括芽胞桿菌，如枯草芽胞桿菌，以及諸如沙門氏菌屬、沙雷氏菌屬和各種假單胞菌屬的菌株等腸道細菌。表達載體可在這種原核生物宿主中擴增，并且代表性的這種載體包括適合宿主細胞的表達調(diào)控序列(如復(fù)制起點)。載體還包括任何一種眾所周知的啟動子，如乳糖啟動子系統(tǒng)、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)、β-內(nèi)酰胺酶啟動子系統(tǒng)，和來源于λ噬菌體的啟動子系統(tǒng)。代表性的啟動子(如果有的話，與操縱基因序列一起)調(diào)控基因表達，并且啟動子包括轉(zhuǎn)錄和翻譯得以起始和完成的核糖體結(jié)合位點的序列。其它的諸如酵母等微生物也可以用于表達。酵母屬的種類是優(yōu)選的宿主，它具有包含以下表達調(diào)控序列的載體，如包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶在內(nèi)的各種酶的啟動子，復(fù)制起點，終止序列，和由此而來的所需類似序列。一種植物或一種植物細胞培養(yǎng)物也可用于表達本發(fā)明的人源化免疫球蛋白。見，Laric和Fry，《人抗體雜交瘤》(Hum.AntibodiesHybridomas)2卷4期172-89頁(1991)；Benvenuto等，《植物分子生物學(xué)》(PlantMol.Biol.)17卷4期865-74(1991)；Durin等，《植物分子生物學(xué)》(PlantMol.Biol.)15卷2期281-93(1990)；Hyatt等，《自然》(Nature)342卷76-8頁(1989)，在此引入作為參考。優(yōu)選的植物宿主包括擬南芥屬、煙草、黃花煙草，和馬鈴薯。質(zhì)粒pMOG18是適合表達編碼本發(fā)明的人源化抗Fas配體抗體的多核苷酸序列的表達盒，其中已插入的編碼人源化免疫球蛋白鏈的多核苷酸序列和重疊的增強子操縱性地連接于CaMV35S啟動子。pMOG18按照Simons等所述的方法進行使用，《生物/技術(shù)學(xué)》(Bio/Technology)8卷217-221(1990)，在此引入作為參考。另一種方法，按照Hyatt等在所引用的文獻中所述，人源化免疫球蛋白可表達于一種植物中，其中，上述引用的Hyatt等人的文獻中所用的免疫球蛋白序列可用編碼本發(fā)明的人源化抗Fas配體抗體的多核苷酸序列進行替換。這是另一種優(yōu)選實施方案?；诟┺r(nóng)桿菌T-DNA的載體也可用于表達人源化的免疫球蛋白序列，并且這種載體可優(yōu)選包含編碼壯觀霉素抗性的標志基因或其它的篩選標志。昆蟲細胞培養(yǎng)也可用于制備本發(fā)明的人源化免疫球蛋白，并且代表性的情況是，可以采用基于桿狀病毒的表達系統(tǒng)。根據(jù)Ptritz等所述的方法，《生物/技術(shù)學(xué)》(Bio/Technology)8卷651-654頁(1990)，該文在此引入作為參考，人源化免疫球蛋白可通過表達編碼人源化免疫球蛋白的多核苷酸序列來進行制備，條件是插入編碼本發(fā)明人源化抗Fas配體抗體的多核苷酸序列而不是小鼠單克隆抗體6A4的輕鏈和重鏈的cDNA。除了微生物和植物細胞培養(yǎng)外，哺乳動物細胞培養(yǎng)也可用以表達和制備本發(fā)明的多肽。見Winacker，“從基因到克隆”(FromGenetoClone)，VCH出版社，N.Y.，1987，在此引入作為參考。優(yōu)選采用哺乳動物細胞培養(yǎng)作為實際應(yīng)用的表達系統(tǒng)，因為在本
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中已經(jīng)發(fā)展了多種能夠分泌完整免疫球蛋白的適當?shù)乃拗骷毎?，包括CHO細胞系，各種類型的COS細胞系，Hela細胞，骨髓瘤細胞系等，以及轉(zhuǎn)化的B細胞或雜交瘤。優(yōu)選采用骨髓瘤細胞系或轉(zhuǎn)化的B細胞或雜交瘤。這類細胞的表達載體包括表達調(diào)控序列，如，復(fù)制起點、啟動子和增強子(Queen等，《免疫學(xué)綜述》(Immunol.Rev.)89卷49-68頁(1986)，在此引入作為參考)，還包括所需要的加工信息位點，如，核糖體結(jié)合位點、RNA剪接位點、多聚腺苷酸位點，以及轉(zhuǎn)錄終止序列。優(yōu)選表達調(diào)控序列包括來源于免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、和巨細胞病毒，或其它等的啟動子。在表達載體中包含諸如neoR表達盒等的篩選標志。編碼本發(fā)明的人源化免疫球蛋白的轉(zhuǎn)移基因可用于制備一種非人的轉(zhuǎn)基因動物，該動物一般在諸如奶或血清等可回收的體液中表達所需要的人源化免疫球蛋白。這種轉(zhuǎn)移基因通常包含編碼人源化免疫球蛋白的多核苷酸序列，該序列與啟動子可操縱地連接，同時與諸如嚙齒類免疫球蛋白增強子或酪蛋白基因啟動子/增強子等增強子連接(Buhler等，《生物/技術(shù)學(xué)》(Bio/Technology)，8卷140-143頁(1990)；Meade等，《生物/技術(shù)學(xué)》(Bio/Technology)8卷443-446頁(1990)，在此引入作為參考)。如下所述，通過本領(lǐng)域中已知的方法，轉(zhuǎn)移基因可被轉(zhuǎn)入細胞或胚胎以制備同源重組產(chǎn)物。優(yōu)選非人動物包括小鼠、大鼠、綿羊、奶牛、和山羊，其中在奶牛奶中的表達是最優(yōu)選的(見WO91/08216(1991)，在此引入作為參考)。人源化免疫球蛋白的純化也可采用本領(lǐng)域中已知的純化免疫球蛋白的方法進行。根據(jù)特定的宿主細胞類型，利用本領(lǐng)域中熟知的方法，可以將包含靶DNA區(qū)段(如，編碼重鏈和輕鏈的序列，和表達調(diào)控序列)的載體轉(zhuǎn)入到宿主細胞中。例如，氧化鈣轉(zhuǎn)染法通常用于原核細胞，而磷酸鈣處理、lipofectin、biolistics、基于病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)、或電穿孔被用于其它的宿主細胞。在轉(zhuǎn)入到植物細胞或組織的情況下優(yōu)選利用鎢粒介導(dǎo)的轟擊轉(zhuǎn)基因法。關(guān)于一般描述，見Maniatis等《分子克隆實驗室手冊》(MolecularClonignALaboratoryManual)，Cold.SpringHarborPress，1982，在此引入作為參考。一旦表達后，完整抗體形式的本發(fā)明的多肽、它的二聚體、和單個輕鏈或重鏈，或其它的形式均可被純化，純化可采用本領(lǐng)域中的任何標準方法，如硫酸銨沉淀、親和層析、柱層析和凝膠電泳，一般描述見于ScopesR，《蛋白質(zhì)的純化》(PurificationofProteins)，Springer-Verlag，N.Y.1982，在此引入作為參考。在制藥上應(yīng)用，優(yōu)選均一性為90-95％的基本純凈的免疫球蛋白，最優(yōu)選均一性為98-99％或甚至更高的免疫球蛋白。部分純化或純化至所需均一性后，多肽可用于治療性應(yīng)用(包括體外應(yīng)用)，并可用于實踐和發(fā)展諸如免疫熒光等試驗。關(guān)于一般描述，見《免疫學(xué)方法》(ImmunologicalMethods)，卷I和II，Rufcovitz和Pernis編輯，AcademicPress，N.Y.，1979和1981)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一套計算機程序，利用該程序，抗體的三維構(gòu)象可展示在顯示器上。比如，適宜的系統(tǒng)是SiliconGraphicsIRIS4D工作站，在UNIX操作系統(tǒng)以及分子模型包裝QUANTA(Polygen公司，美國)的操作程序下運行。計算機系統(tǒng)有利于制備人源化抗體的突變體。在沒有作任何其它突變的情況下，本發(fā)明的抗體通常就具有足夠的結(jié)合親和力。然而在特定氨基酸殘基進一步發(fā)生改變的過程中可鑒定出具有更高結(jié)合親和力的抗體。三維構(gòu)象也有助于鑒定出各種作用較小的氨基酸殘基，并且這些氨基酸殘基可以進行不會改變抗體的結(jié)合親和力到可檢測水平的保守替換。總體而言，保守替換可能顯著影響免疫球蛋白的特性。然而，許多單一的保守替換不可能有損于免疫球蛋白的特性。據(jù)本發(fā)明更進一步的一方面，本發(fā)明提供了抗Fas配體的人抗體。這種抗體用以下技術(shù)方法進行制備，這些技術(shù)包括體外免疫、三體瘤(trioma)法(Ostberg等，《雜交瘤》(Hgbridoma)2卷361-367頁，(1983)；OstbergUSP4,634,664；和Engleman等，USP4,634,666)，和人抗體基因制備的非人轉(zhuǎn)基因動物(Lomberg等WO93/12227(1993)；KuchellapatyWO91/10741(1991))。將這些技術(shù)和常用的Kehler-Milstein法結(jié)合起來可制備人源單克隆抗體。根據(jù)在Hughs等，《科學(xué)》(Science)246卷1275-1281(1989)中一般描述的普通方法，對來自人B細胞的DNA庫進行篩選以篩選出與Fas配體或其片斷相結(jié)合的抗體。然后克隆并擴增編碼這樣篩選出的具有結(jié)合活性的抗體或其片斷的序列。結(jié)合噬菌體展示技術(shù)可以改變Hughs所述方法的效率。見，如，Dowar(WO91/11271)和Mackaferti等(WO92/01047)，在此引入作為參考。在這些方法中，可制備出在外膜上表達各種抗體的噬菌體庫?？贵w通常表達為Fv或Fab片斷。根據(jù)對Fas配體多肽或其片斷親和力的增加來篩選出產(chǎn)生所需特異性抗體的噬菌體。在改良噬菌展示法中，可制備出具有選定的小鼠抗體結(jié)合特異性的一種人抗體。(見Winter，WO92/20791)。本發(fā)明的抗Fas配體抗體包括改變，即，提高或抑制Fas配體對細胞的作用的抗體。為了獲得具有抑制Fas配體誘導(dǎo)的凋亡作用的抗體，利用Fas配體或Fas配體表達細胞，和Fas抗原表達細胞，在體外進行試驗，篩選在制備上述單克隆抗體或多克隆抗體過程中所獲得的血清，或雜交瘤上清。從在這種篩選中所選定的血清或上清中，通過適當組合應(yīng)用已知的方法，純化出目的抗體。利用Fas配體或Fas配體表達細胞和Fas抗原表達細胞的篩選過程的優(yōu)選實施方案見于實例中，并且應(yīng)當指出該篩選過程也述于國際專利申請公開號WO95/13293等。篩選也可通過利用與示于實例中的特定Fas配體的反應(yīng)性或非反應(yīng)性作為指標來進行，即利用與nd32、nd42和L179F中至少之一的反應(yīng)性，或與nd42和cd179中至少之一的非反應(yīng)性作為指標。本發(fā)明的抗體和包含抗體混合物的組合物可用于預(yù)防性和/或治療性處理。本發(fā)明中能夠高度抑制Fas配體誘導(dǎo)的凋亡的中和抗體可用于調(diào)控機體凋亡的目的。例如，中和抗體可作為治療試劑以治療涉及細胞和組織凋亡的疾病，如，風(fēng)濕病中關(guān)節(jié)組織的破壞，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)中自體組織的破壞，糖尿病、流感、AIDS、肝炎等。另一方面，本發(fā)明中增加Fas配體誘導(dǎo)的凋亡的抗體可用于除去機體不需要的細胞以治療，如，早期AIDS，風(fēng)濕病中滑膜細胞的異常增殖，和自身免疫病中自體抗原反應(yīng)性T細胞的增殖。本發(fā)明中的抗體和它的藥用組合物尤其適合于非腸道用藥，即皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)用藥。另外，本發(fā)明的抗體也可采用以下方式給藥胃灌洗或胃灌注，腹腔輸注，眼用油膏、外用油膏、顱內(nèi)輸注(典型的是注入腦室)、心包內(nèi)輸注，或囊內(nèi)輸注，典型的是局部應(yīng)用的情況。非腸道用藥的組合物一般包含一種制藥上可接受的載體，并且優(yōu)選組合物是溶于水性載體或其混合物中的免疫球蛋白溶液。可采用各種水性載體，比如水、緩沖液、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、0.4％生理鹽水、0.3％甘氨酸溶液、或人白蛋白溶液。這些溶液應(yīng)當是無菌的、并且通常無細微的顆粒物質(zhì)。這種藥用組合物可利用本領(lǐng)域中熟知的慣用滅菌方法進行滅菌。為了達到一種生理狀態(tài)，組合物可包含一種制藥上可接受的添加劑，比如pH調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、毒性調(diào)節(jié)劑以及其它等，如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣和乳酸鈣。制劑中抗體的濃度可在一大范圍內(nèi)變動，即，從按重量算小于大約0.005％(通常按重量算至少大約1％)到按重量算高至15％或20％的范圍內(nèi)?；旧细鶕?jù)所選定的用藥方式來選擇濃度，后者又取決于溶液體積、粘性等。對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在實踐中用以制備非腸道用藥組合物的方法是已知的或顯然的，并且這種方法準確描述于，如，《雷明頓制藥科學(xué)》(Remington′sPharmaceuticalScience)，(15版，MacPublishingCompany，Easton，Pennsylvania，1980)，在此引入作為參考。根據(jù)計劃的特定應(yīng)用，可適當選擇適合灌洗和其它用藥途徑的組合物。一些藥用組合物可能包含抗Fas配體抗體和其它常用于治療疾病的治療試劑。上述的所有藥用組合物都適合用于團塊(boluses)用藥和持續(xù)應(yīng)用。依據(jù)受治者的疾病、病理狀況、病人的狀況等可確定組合物預(yù)防和治療有效的量。本發(fā)明的抗體可以冰凍或凍干保存，并在使用前重懸于適當載體中。這種凍干/重懸的方法對常規(guī)免疫球蛋白已知是有效的，并且可采用已知的凍干/重懸法。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員知道這種凍干/重懸過程可能在各種不同程度上導(dǎo)致抗體活性的丟失(如，常規(guī)免疫球蛋白和IgM抗體比常規(guī)IgG抗體可能有更大的活性損失)，并且可能必需調(diào)整所用的量以彌補這種活性的損失。本發(fā)明的優(yōu)選藥用組合物包括在免疫毒素中使用根據(jù)本發(fā)明的主要方面的免疫球蛋白，它作為運載系統(tǒng)以將特定的試劑運載至Fas配體表達的細胞，尤其以達到殺死該種細胞的目的。免疫毒素以含有兩種成分為特征，并且尤其有助于在體外或體內(nèi)殺死所選定的細胞。一種組成成分是細胞毒性試劑，它一旦被細胞吸附或吸收將對細胞是致死性的。第二種成分是稱為“運載體”的部分，它提供一種方式將毒性試劑運載至一種特定類型的細胞，如，表達Fas配體表位的細胞。通常，利用任一種各種已知的化學(xué)方法將兩種成分化學(xué)交聯(lián)在一起。當細胞毒性劑是一種蛋白質(zhì)而第二種成分是完整免疫球蛋白時，結(jié)合劑為一種異雙功能(heterodifuntional)交聯(lián)劑，如SPDP、碳二亞胺、戊二醛等。在本領(lǐng)域中各種免疫毒素的制備是眾所周知的，并且描述于，如，Torpe等，“單克隆抗體-毒素結(jié)合物以作為神奇生物導(dǎo)彈”(MonoclonalAntibody-ToxinConjugatesAmingatMagicBullet)，于《臨床醫(yī)學(xué)中的單克隆抗體》(MonoclonalAntibodiesinClinicalMedicine)，AcademicPress，168-190頁(1982)，在此引入作為參考。另外一種方法，可利用遺傳學(xué)方法將兩種成分交聯(lián)。見Chawderly等，《自然》(Natnre)339卷394頁(1989)，在此引入作為參考。各種細胞毒試劑均適合用于免疫毒素。細胞毒試劑可包括一種放射性核素，如131碘和其它碘的同位素、90釔、188錸、212鉍和其它的α發(fā)射體；各種化療劑，如長春新堿、氨甲喋呤、阿霉素和順氯氨鉑；細胞毒性蛋白，如核糖體抑制蛋白樣商陸抗病毒蛋白，假單胞菌外毒素A，溶解素，白喉毒素，溶解素A鏈，等等；和其它在細胞表面有活性的試劑，如磷脂酶(如磷脂酶C)。關(guān)于一般描述，見USSN07/290,968和07/310,252，它們轉(zhuǎn)讓給同一受讓人；《嵌合毒素》(Chimeratoxin)，Orsness和Phil，Pharmac.There.，25卷355-381頁(1982)，以及《癌癥檢測和治療的單克隆抗體》(MonoclonalAntibodiesforCancerDetectionandTherapy)，Baldwin和Bayers編輯，AcademicPress，(1985)，159-179頁和224-226頁，在此引入作為參考。免疫毒素中被運載的成分包括本發(fā)明的免疫球蛋白。優(yōu)選應(yīng)用完整的免疫球蛋白或它的可結(jié)合片斷，如Fas或Fv。免疫毒素中的抗體一般是人IgM或IgG同種型。然而，按照需要，其它哺乳動物的恒定區(qū)也可被采用。Fas配體本身用于治療和研究需要大量制備高純度的Fas配體蛋白。本發(fā)明的抗Fas配體抗體有助于純化Fas配體。本發(fā)明的中和抗體選擇性與有生物活性的Fas配體結(jié)合，因此，本發(fā)明的抗體尤其有利于高效特異地純化可作為一種重要治療試劑的活性Fas配體。本發(fā)明的試驗方法包括使用如上所述已獲得的抗體的步驟，并且該步優(yōu)選是通過待檢樣品中分析物Fas配體與如上所述已獲得的抗體之間的抗原-抗體反應(yīng)來捕獲待檢樣品中分析物的步驟。在本發(fā)明的試驗方法中檢測分析物所采用的原理不限于任一特定的原理。然而，作為實例的原理包括凝集法、夾心法、固相直接法固相結(jié)合法和競爭法。在這些方法中，優(yōu)選夾心法和競爭法，最優(yōu)選是夾心法。在凝集法中，使抗體與諸如乳膠顆粒和紅細胞(如，綿羊紅細胞)等微粒表面結(jié)合，這樣當Fas配體存在時，會發(fā)生微粒的凝集，然后用凝集程度作為指標來測定Fas配體。應(yīng)當指出，在凝集法中，除了乳膠和紅細胞外，也可應(yīng)用本領(lǐng)域中常用的微粒，如明膠顆粒、微珠、和碳粒。在夾心法、固相直接法、固相結(jié)合法、和競爭法中，可采用諸如酶免試驗(EIA)、放免試驗(RIA)、化學(xué)發(fā)光免疫試驗、熒光免疫試驗、時間分辨熒光免疫試驗(TR-FIA)和免疫層析試驗(ICA)等原理，用標記的抗原和/或抗體進行試驗。下面將描述采用EIA原理，它是本發(fā)明中優(yōu)選試驗原理之一，所進行的夾心法，固相直接法和競爭法。在通過EIA進行的固相夾心法中，首先制備識別Fas配體的抗體或用諸如過氧化物酶、堿性磷酸酶、或β-半乳糖苷酶標記的第二抗體。特別是，用過氧化物酶標記的抗體是優(yōu)選實施方案。下一步，識別Fas配體的抗體吸附于所用的固相支持物上。加入樣品或標準品后，加入如上所述的酶標抗體以開始抗原抗體反應(yīng)。洗滌掉過量酶標抗體后，加入適合所用的酶的發(fā)色物質(zhì)，如，鄰苯二胺和H2O2，對硝基苯磷酸，2-硝苯基-β-D-半乳糖苷，以起始與酶的反應(yīng)。底物形成的顏色依賴于酶的數(shù)量，因而依賴于樣品中Fas配體的量。因此，通過測定形成顏色的終產(chǎn)物量可以對Fas配體進行定量。在固相直接法中，樣品直接吸附于固相支持物，固相支持物上不能吸附Fas配體的表面用諸如BSA(牛血清白蛋白)等不影響測定的一種蛋白質(zhì)進行封閉。然而加入識別Fas配體的酶標抗體以開始反應(yīng)。隨后進行類似于固相夾心法的操作步驟以確定樣品中存在/缺乏Fas配體，或定量測定樣品中的Fas配體。在固相競爭法中，可被所使用的抗體識別的特定量的Fas配體直接吸附于固相，然后進行封閉。然后再加入識別Fas配體的酶標抗體和待檢樣品，使反應(yīng)進行一定時間。不能與固相結(jié)合的物質(zhì)被洗滌掉，然后加入發(fā)色物質(zhì)以開始與酶的反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，測定樣品抑制酶標抗體與固相上Fas配體結(jié)合的程度以對樣品中的Fas配體定量。以相同的方法，抗體吸附到固相上之后，酶標Fas配體和樣品可同時加入，以測定由于樣品的加入而抑制酶標Fas配體與固相-固定抗體結(jié)合的程度，從而測定樣品中Fas配體的量。除了上述的試驗方法之外，F(xiàn)as配體可通過以下方法測定在液相中進行抗原-抗體反應(yīng)，然后通過凝集沉淀將與酶標抗體結(jié)合的Fas配體和不能與標記抗體結(jié)合的Fas配體分開，利用抗體或其它物理化學(xué)方法對Fas配體進行定量。Fas配體也可這樣測定先獲得并標記能識別Fas配體-識別抗體的第二抗體，而不是標記Fas配體-識別抗體，然后使它進行抗原抗體反應(yīng)，從而可測定Fas配體。在夾心法、固相直接法和競爭法中的任何一種方法中，標記酶和發(fā)色物質(zhì)的組合可替換為標記酶和一種生物發(fā)光或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的組合，或替換為標記酶和發(fā)熒光的物質(zhì)。在這種情況下可采用的代表性酶-發(fā)光物質(zhì)的組合包括堿性磷酸酶-AMPPD，辣根過氧化物酶-魯米諾，和蟲熒光素酶-熒光素，代表性酶-發(fā)熒光物質(zhì)的組合包括堿性磷酸酶-磷酸傘形花內(nèi)酯，和辣根過氧化物酶-羥丙基丙酸對羥基苯酯。在上述的三種試驗方法中，可以采用抗體或抗原直接或間接用放射性同位素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、或熒光物質(zhì)標記而不是酶標記，通過測定放射活性、發(fā)光和熒光的強度來檢測樣品中的Fas配體。在這種情況下常用的代表性放射性同位素包括125I和131I。典型的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)包括acridiniumester。當測定熒光強度時，可以采用更高敏感性的方法。其中一種螯合劑直接或間接與抗體或抗原結(jié)合，以激發(fā)光束照射以測定以時間-分辨方式與螯合劑結(jié)合的稀土金屬發(fā)出的熒光強度，由此來檢測樣品中的Fas配體(時間-分辨熒光免疫試驗，TR-FIA)。典型的稀土金屬包括銪。如上所述，本發(fā)明中試驗方法的目的是測定樣品中的Fas配體。待檢樣品可為一種體液或組織，細胞，或細菌和它們的提取物或上清，并且優(yōu)選是一種體液。更優(yōu)選，待檢樣品可選自血液、漿液、血清、尿液、腦脊液、淋巴、唾液、腹水和胸膜滲出液。本發(fā)明的測定方法可用于測定正常獻血者或患各種疾病的病人的體液中的Fas配體。本發(fā)明首次使得能夠測定體液中Fas配體的濃度，并證實了在一些特定疾病中Fas配體的濃度變化。應(yīng)當指出本發(fā)明中用于上述試驗的試劑和試劑盒與試驗方法中所述的試劑和試劑盒有相同意義。實例下面，借助于實例更詳細地舉例說明本發(fā)明，這些實例僅僅用于舉例說明，決不限制本發(fā)明的范圍。在以下描述中所用的簡稱是依據(jù)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
中常用簡稱的那些。進行如下所述的實例中所用的操作參考Sambrook等編輯，“分子克隆，實驗室手冊，第2版”(MolecularCloning，alaboratoryManual，2nded，)，ColdSpringHarborLaboratory，1989，Imamoto，F(xiàn)等編輯，“重組基因?qū)爰毎⒈磉_”(日文)(IntroductionofRecombinantGentintoCellandtheExpression)，Tanpakushitsu-Kakusan-Kouso(蛋白質(zhì)，核酸和酶)，?？?8(14)，1983；和Okada，Y.(審校)，“細胞工程技術(shù)(一系列文章的摘要)(日文)(CellEngineeringTechnology)，Jikken-Igaku(實驗醫(yī)學(xué))，專刊7(13)，1989；等等。1.制備抗Fas配體多肽抗體1-1抗原多肽的篩選如圖1所示，分析序列表中序列鑒定號9的Fas配體胞外區(qū)中預(yù)測的表位。用BIOSYMINC.的同源模塊中所包含的FASTA程序檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，該庫是實驗測定的生物大分子的三維結(jié)構(gòu)有關(guān)檔案的數(shù)據(jù)庫，以尋找與Fas配體的胞外區(qū)氨基酸序列具有高度同源性的蛋白質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-α(PDB-IDITNF和2TUN)在它們的全部結(jié)構(gòu)上是高度同源的。然后這種TNF-α作為參考蛋白質(zhì)，利用其三維結(jié)構(gòu)進行Fas配體胞外區(qū)的模型化。在制作模型結(jié)構(gòu)時，進行以下操作抽取作為基本結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)保守區(qū)(SCR)，將TNF-α單體結(jié)構(gòu)在α碳位重疊，然后篩出結(jié)構(gòu)距離在1之內(nèi)的區(qū)域，同時在x-射線晶體衍射中溫度因素高達20。至于與結(jié)構(gòu)保守區(qū)相連的可變區(qū)(VR)，檢索PDB以尋找插入或缺失發(fā)生時的一種適當結(jié)構(gòu)。BIOSYMSINC.的同源模塊被用于構(gòu)建分子結(jié)構(gòu)。進行構(gòu)象的球形最小檢索(Globalminimumsearch)以尋找在構(gòu)建的初級結(jié)構(gòu)中置換的側(cè)鏈，并且利用計算軟件，DiscoverofBIOSYMSINC.將結(jié)構(gòu)最佳化以獲得Fas配體胞外區(qū)的模型結(jié)構(gòu)。用這樣獲得的模型結(jié)構(gòu)，將在分子表面暴露的結(jié)構(gòu)區(qū)，即當TNF-α的單體結(jié)構(gòu)重疊時表現(xiàn)出大裂縫的區(qū)域，以及具有高TNF-α溫度因素的區(qū)域選為包含易為抗原識別的表位的區(qū)域。根據(jù)模型結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu)信息，選擇具有序列表中序列鑒定號1-8所示氨基酸序列的8肽序列以利于合成這些區(qū)域的肽時保持抗原的結(jié)構(gòu)。所選定的8個肽的氨基酸序列示于圖1。合成肽在碳端引入含巰基的半胱氨酸以利于與載體結(jié)合。序列表中序列鑒定號1-8代表沒有這種半胱氨酸的序列。1-2制備抗血清根據(jù)示于圖1的肽的氨基酸序列，委托FujiyaBioscienceKenkyushoK.K.合成序列表中序列鑒定號1-8的肽、如圖1所示，將對應(yīng)于鑒定號1-8的氨基酸序列的肽稱為M52-M59，并且該名稱用于下述內(nèi)容中。委托Men-ekiSeibutsuKenkyushoK.K.通過馬來酰亞胺法結(jié)合載體鑰孔血藍蛋白(KLH)并免疫兔子。1-3抗血清評定通過測定固定化肽和抗血清之間的反應(yīng)性，在Men-ekiSeibutsuKenkyushoK.K證實了針對所給予肽的抗體的滴度不斷增加。然后發(fā)現(xiàn)針對所用的8個肽的抗血清在大約6,000-24,000的稀釋度與相應(yīng)的固定化肽發(fā)生反應(yīng)。接著，進行Westem印跡以證實抗血清與人Fas配體結(jié)合。10μl含有將在4-1中描述的Fas配體胞外區(qū)的培養(yǎng)上清與等體積凝膠上樣緩沖液(SEPRASOL，IntegratedSeparationSystem)混合，并于37℃孵育1小時，2μl溶液加樣至4-20％SDS-PAGE(Tefco)的加樣孔中，并且在25mA室溫進行1小時的電泳。電泳結(jié)束后，在4℃和200mA的條件下將凝膠轉(zhuǎn)印于PDVF膜(Millipore)，持續(xù)90分鐘。室溫將膜浸入未稀釋的封閉試劑(BlockAce，SnowBrandMilkProductsCo.，Ltd)中，不斷搖動封閉該膜。該膜剪成條狀，每條浸入1ml稀釋500倍的抗血清中，抗血清是用含0.05％吐溫20的pH6.40.076M的PBS(此后簡稱為T-PBS)并加入0.5％BSA后進行稀釋的，同時室溫下不斷搖動1小時。反應(yīng)結(jié)束后，用T-PBS洗滌每條膜2次，然后浸入1ml用含10％山羊血清的T-PBS稀釋500倍的HRPO標記的抗-兔Igs抗體(DACO)中，室溫反應(yīng)1小時。用T-PBS洗膜5次后，用ECL系統(tǒng)(Amersham)進行檢測。通過培養(yǎng)板試驗(固相直接法)，證實了抗血清與固定于培養(yǎng)板上的Fas配體胞外區(qū)的反應(yīng)性。首先，50μl已用0.076MPBS，pH6.4(此后稱為PBS)稀釋至0～25ng/孔的將在4-1中描述的部分純化的Fas配體胞外區(qū)加入免疫培養(yǎng)板(Maxisorp，Nunc.)的各孔中，該培養(yǎng)板在45℃孵育30分鐘以將Fas配體胞外區(qū)固定在孔中。用離子交換水洗滌各孔5次后，各孔中加入100μl/孔的0.1％BSA/PBS以封閉培養(yǎng)孔。然后除去封閉試劑，各孔中加入用0.1％BSA/PBS稀釋的抗血清，于37℃反應(yīng)1小時。隨后用含0.005％吐溫20的0.9％NaCl洗滌各孔兩次，再加入50μl/孔用10％山羊血清/PBS稀釋1,000倍的HRPO標記的抗免Igs抗體(DACO)。反應(yīng)于37℃進行1小時。反應(yīng)結(jié)束后，用洗液洗滌各孔5次，用離子交換水洗滌兩次，然后加入50μl含3mg/ml鄰苯二胺和0.027％過氧化氫的0.1MMaIlvaine緩沖液(pH5.0)，反應(yīng)5分鐘。用50μl1N鹽酸終止反應(yīng)，并在490nm處測定吸收值。通過51Cr釋放試驗測定Fas配體對凋亡誘導(dǎo)活性的影響。106WC8細胞于37℃在含20μCi(51Cr)鉻酸鈉(NEN)的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)2小時以用51Cr標記。最終濃度達500倍稀釋的抗血清加入到含1×10451Cr標記細胞的反應(yīng)液中，隨后加入來源于COS-1細胞培養(yǎng)上清的Fas配體的胞外區(qū)(相當于0.9μg/mlFas配體胞外區(qū)的濃度)達10％的終濃度。反應(yīng)液于37℃孵育4小時，然后用51Cr的釋放作為指標測定誘導(dǎo)凋亡的活性。表1說明每一種抗血清對Fas配體的結(jié)合活性，以及抗血清對凋亡誘導(dǎo)活性的影響。在Western印跡中，用M52和M57肽免疫所制備的抗血清表現(xiàn)出與Fas配體胞外區(qū)的陽性結(jié)合(+)，然而其它的抗血清不能與Fas配體的胞外區(qū)結(jié)合(-)。在培養(yǎng)板試驗中，在這些抗肽抗血清中，用M52和M57肽免疫所制備的抗血清表現(xiàn)出與Fas配體的強反應(yīng)性(++)，同時用M53和M54肽免疫所制備的抗血清也表現(xiàn)出了與Fas配體相當程度的反應(yīng)性(+)。未發(fā)現(xiàn)抗血清具有抑制凋亡的活性，然而用M52免疫所制備的抗血清表現(xiàn)出了增強Fas配體凋亡誘導(dǎo)活性的作用。表1兔抗肽血清與Fas配體胞外區(qū)的反應(yīng)性以及?？寡鍖Φ蛲稣T導(dǎo)活性的影響抗血清M52M53M54M55M56M57M59Western印跡+----+-的結(jié)果培養(yǎng)板試驗++++--++-的結(jié)果對凋亡誘導(dǎo)增加------活性的影響1-4抗血清的純化應(yīng)用鹽析和通過離子交換柱對M52和M57肽免疫后所制備的抗血清(5ml)進行純化。首先等體積的0.15MNaCl加入到5ml每種抗血清中，然后逐滴加入與抗血清未稀釋前等量的飽和硫酸銨，同時攪拌。攪拌于室溫下持續(xù)30分鐘，然后使混合物靜置30分鐘。隨后在10,000rpm將混合物離心10分鐘，所得到的沉淀溶解于5mlpH6.30.02M的磷酸鹽緩沖液中并進行透析。離心除去雜質(zhì)后，溶液上樣于已用同一緩沖液平衡的10mlDEAE纖維素(DE52，WHATMAN)填充的層析柱中?；厥瘴幢晃降募壏?，然后將用另外的50ml緩沖液洗柱所回收的級分與未吸附的級分混合。用DiafloWPM10膜(AMICON)濃縮這樣處理所獲得的含IgG的溶液，以獲得M52和M57肽免疫后所制備的每一種抗血清的純化抗體。通過在280nm處的吸收值計算出純化抗體的蛋白質(zhì)濃度。2.抗M52肽單克隆抗體的制備2-1制備抗原和免疫小鼠1.1mgM52肽溶解于110μlpH7.00.1M的磷酸鹽緩沖液。同時1.54mg馬來酰亞胺激活的KLH(Boehringer-Mannheim)溶解于154μl蒸餾水中。將所制備的溶液混合，室溫下反應(yīng)2小時。反應(yīng)液上樣于已用生理鹽水平衡的Nick柱中(PharmaciaBiotech)，以純化并獲得用來免疫的抗原。70μl這樣制備的用來免疫的抗原用生理鹽水稀釋至0.1ml，然后與等量的完全弗氏佐劑(DIFCO)混合。將溶液腹腔注射入5周齡的雌性ddY小鼠。間隔2周后，與不完全弗氏佐劑(DIFCO)混合的等量抗原以相同的途徑給藥。2-2抗血清的評定給藥1周后，眼底采血，并證實抗血清能與Fas配體的胞外區(qū)結(jié)合。首先，50μl將在4-1中描述的部分純化的Fas配體胞外區(qū)用pH6.40.076MPBS(此后稱為PBS)稀釋至每孔0～100ng，加入免疫培養(yǎng)板(MaxisorpNunc)的各孔中，然后免疫培養(yǎng)板于45℃孵育30分鐘以將Fas配體的胞外區(qū)固定到孔中。用離子交換水洗滌各孔5次后，每孔中加入100μl0.1％BSA/PBS以封閉各孔。除去封閉試劑后，各孔加入用0.1％BSA/PBS稀釋的抗血清，于37℃反應(yīng)1小時。然后用含0.005％吐溫20的0.9％NaCl洗滌各孔2次，再加入50μl/孔已用10％兔血清/PBS稀釋1,000倍的HRPO-標記的抗-小鼠Igs抗體(DACO)。于37℃反應(yīng)1小時。反應(yīng)結(jié)束后，用洗液洗滌各孔5次，并用離子交換水洗滌2次后，再加入50μl含有3mg/ml鄰苯二胺和0.027％過氧化氫的0.1MMaIlvaine緩沖液(pH5.0)，并反應(yīng)5分鐘。用50μl1N鹽酸終止反應(yīng)，并在490nm處測定吸收值。結(jié)果表明M52肽免疫后所制備的小鼠抗血清與Fas配體的胞外區(qū)之間具有強反應(yīng)性。2-3制備單克隆抗體用400μl生理鹽水稀釋在2-1中所制備的用來免疫動物的抗原70μg，然后通過尾靜脈將遞增抗體滴度的溶液施用于小鼠。3天后，進行細胞融合，融合方法依據(jù)于TamieAndo和TadashiChiba，“應(yīng)用單克隆抗體的實驗操作指導(dǎo)”(IntroductiontoExperimentalOperationUsingMonoclonalAntibody)，Kodansha-Scientific。6天后，通過在2-2中所述的方法篩選培養(yǎng)上清中的抗體，通過有限稀釋法將表現(xiàn)出陽性反應(yīng)的孔中的細胞進行克隆，方法依據(jù)于TamieAndo和TadashiChiba所述，“應(yīng)用單克隆抗體的實驗操作指導(dǎo)”(lntroductiontoExperimentalOperationUsingMonoclonalAntibody)，Kodansha-Scientific?？寺『螅龠M行篩選從而獲得能產(chǎn)生與Fas配體反應(yīng)的抗-M52肽的單克隆抗體的20個雜交瘤克隆(F918系列)。F918-4-5(IgG1/λ)，F(xiàn)918-2-4(IgG1/λ)、F918-7-3(IgG1/k)、F918-9-4(IgG1/λ)、F918-17-1(IgG1/k)、F918-20-2(IgG1/λ)、和F918-23-1(IgG1/k)，如下所述，包含于F918系列中。所獲得雜交瘤的亞類包括IgM/k3個克隆、IgG1/k6個克隆、IgG1/λ9個克隆、IgG2b/λ1個克隆、和IgG2b/k1個克隆。雜交瘤培養(yǎng)于無血清的培養(yǎng)基(PHFM-II，GibcoBRL)，然后用60％飽和硫酸銨鹽析培養(yǎng)上清。IgG上樣于蛋白質(zhì)A柱(PROSEP-A，BIOPROCESSING)進行純化。通過測定280nm處的吸收值計算這樣獲得的純化抗體的蛋白質(zhì)濃度。2-4抗體的評定根據(jù)1-3中所述的方法進行Western印跡，以證實這樣獲得的兩個批號(F918-7-3和F918-9-4)的純化抗體(抗體濃度3μg/ml)能與Fas配體胞外區(qū)結(jié)合。所用的Fas配體是將在4-1中描述的純化的Fas配體胞外區(qū)(來源于畢赤酵母的Fas配體胞外區(qū)示于圖2)，將在實例5-1中描述來源于COS-1細胞的游離Fas配體，和將在實例3中描述來自COS-1細胞的Fas配體的胞外區(qū)。HRPO-標記的抗小鼠Igs抗體(DACO)被用作第二抗體，TMB試劑(SCYTEK，Laboratories)被用于檢測。如圖2所示，對于F918-9-4，來自酵母的Fas配體胞外區(qū)、來自COS-1的Fas配體胞外區(qū)和游離的Fas配體均在分子量大約30,000處檢測到一條帶，證實了抗體與Fas配體的結(jié)合。對于F918-7-3，來自酵母和COS-1的Fas配體胞外區(qū)檢測到一條帶，而游離Fas配體未檢測到條帶。接著，根據(jù)在1-3中所描述的方法檢測Fas配體對凋亡誘導(dǎo)活性的影響。如圖3所示，F(xiàn)918-9-4不能顯著改變凋亡誘導(dǎo)活性，而F918-7-3表現(xiàn)出增加凋亡誘導(dǎo)。正如上文所述，M52肽免疫后所制備的單克隆抗體至少包括兩種具有不同特異性的抗體。3.制備抗Fas配體抗體3-1制備抗原，并免疫小鼠通過下述方法制備的COS-1細胞表達的Fas配體胞外區(qū)被用作抗原來免疫動物。來自COS-1細胞的Fas配體的胞外區(qū)制備使用一種轉(zhuǎn)化子COS-1/pM1070，此處它是已導(dǎo)入質(zhì)粒pM1070的COS-1細胞，該質(zhì)粒描述于國際專利申請公開號WO95/13293中的實例18。更詳細說明，8.1μgpM1070溶于40μl10mMTris-HCl(pH7.4)/1mM乙二胺四乙酸(此后簡稱為TE緩沖液)中。溶液中加入11.3ml含1ml0.2mg/ml的DEAE-葡聚糖和1mlpH7.4的50mMTris-HCl的D-MEM(NipponSeiyakuK.K.)以制備DNA-DEAE-葡聚糖混合液。該DNA-DEAE-葡聚糖混合液滴加到在150cm2Roux培養(yǎng)瓶中已生長至半?yún)R合狀態(tài)的單層COS-1細胞上，然后在5％CO2存在下于37℃孵育以獲得轉(zhuǎn)化子COS-1/pM1070。4小時后，棄去DNA-DEAE葡聚糖混合液，用含10％胎牛血清(FBS，IrvineScientific)的D-MEM培養(yǎng)基置換，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。然后用無酚紅的D-MEM(無FBS，加入BSA)替換原有的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)96小時以回收培養(yǎng)上清。在1,200rpm將培養(yǎng)上清離心5分鐘以除去沉淀，然后用0.22μm孔徑的濾膜過濾。用DiafiowPM10膜(Amicon)濃縮10倍后，2.5ml濃縮物(相當于22.5μg)通過PD10柱(Pharmacia)進行凝膠過濾，反復(fù)洗脫至無樣品濾出，結(jié)果回收了一個3.5ml的級分。這樣回收的級分通過Centricon-10(Amicon)濃縮至400μl以使用該濃縮物作為初次免疫的抗原。同時，300μl已濃縮至10倍的培養(yǎng)上清進行4-20％的制備性SDS-PAGE(2-D，TEFCO)，并且參照分子量標志(PrestainedSDS-PAGEStandardLow，BIO-RADLaboratories)將分子量30,000附近的凝膠切割下來。仔細切碎凝膠并過夜浸于生理鹽水中，同時振蕩，以提取Fas配體的胞外區(qū)。提取物通過Centricon-10(Amicon)濃縮至200μl以使用該濃縮物作為再次和最后免疫的抗原。這樣制備的200μl用于初次免疫的抗原與等量的完全弗氏佐劑(DIFCO)混合，然后將該溶液腹腔注入5周齡的雌性ddY小鼠。間隔兩周后，100μl用于再次免疫的抗原與不完全弗氏佐劑(DIFCO)混合，以相同的方式給藥。3-2抗血清的評定再次免疫1周后，從眼底采血，根據(jù)在2-2中所述的方法評定抗血清與Fas配體的胞外區(qū)相結(jié)合的能力。如圖4所示，以部分純化的來自COS-1細胞的Fas配體胞外區(qū)免疫的小鼠(8-2)抗血清表現(xiàn)出吸附與稀釋度的比率增加，這表明抗血清能與來自酵母的Fas配體的胞外區(qū)相結(jié)合。根據(jù)在1-3中所述的方法也檢測了抗血清對凋亡誘導(dǎo)活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清具有強的抑制活性。3-3制備單克隆抗體200μl通過在3-1中所述的SDS-PAGE進行制備的Fas配體的胞外區(qū)腹腔注入小鼠(8-2)，該小鼠的血清已被證實與來自酵母的Fas配體的胞外區(qū)有結(jié)合活性。3天后，進行細胞融合，方法依據(jù)于TamieAndo和TadashiChiba，“應(yīng)用單克隆抗體的實驗操作指導(dǎo)”(IntroductiontoExperimentalOperationUsingMonoclonalAntibodies)，Kodansha-Scientihc。6天后，通過兩種方法篩選培養(yǎng)上清中的抗體，即，根據(jù)在2-2中所述的方法測定與Fas配體的結(jié)合，以及用夾心EIA系統(tǒng)進行篩選以獲得這樣一種抗體，該種抗體能用于采用在1-4中所述的抗M52肽抗體進行的夾心試驗。首先50μlDEAE-純化的兔抗M52肽的抗體用PBS稀釋至10μg/ml，加入至免疫培養(yǎng)板(Maxisorp，Nunc)的各孔中，然后在45℃孵育30分鐘以使抗體固定在孔中。用離子交換水洗滌5次后，將0.1％BSA/PBS100μl/孔加入到孔中，然后在室溫下封閉30分鐘。當棄去封閉劑后，25μl濃度為200ng/ml的將在4-1中描述的部分純化的Fas配體胞外區(qū)，和25μl培養(yǎng)上清被加入到各孔中，然后于37℃反應(yīng)1小時。隨后各孔用洗液洗滌2次，再加入50μl用10％兔血清/PBS稀釋至1,000倍的HRPO-標記的抗小鼠Igs抗體(DACO)。反應(yīng)在37℃進行1小時。用洗液洗滌5次，并用離子交換水洗滌2次后，加入50μl含3mg/ml鄰苯二胺和0.027％過氧化氫的0.1MMaIlvaine緩沖液，pH5.0，反應(yīng)10分鐘。用50μl1N鹽酸終止反應(yīng)，并測定490nm處的吸收值。在兩次篩選過程中，獲得了一孔能與在4-1中所述的可溶性Fas配體發(fā)生反應(yīng)的上清。表現(xiàn)出反應(yīng)活性的該孔細胞通過有限稀釋法進行克隆，方法依據(jù)于TamieAndo和TadashiChiba所述，“應(yīng)用單克隆抗體的實驗操作指導(dǎo)”，Kodansha-Scientific。克隆后，重復(fù)上述過程進行篩選以獲得能分泌抗體F919-9-18(IgG2b/k)的雜交瘤，該抗體能與Fas配體的胞外區(qū)發(fā)生反應(yīng)并可用于用抗M52肽的抗體進行的夾心試驗。3-4抗體的評定根據(jù)在1-3中所述的方法評定抗體F919-9-18的凋亡抑制活性。如圖5所示由于一種或眾多種因素，F(xiàn)919-9-18表現(xiàn)出比抗Fas配體抗體F883-1-1更強的抑制活性，抗體F883-1-1描述于國際專利申請公開號WO95-13293中的實例15和16中，并且F919-9-18的抑制活性甚至強于國際專利申請公開號WO95-13293的實例1中所述的hFas-Fc。4.夾心EIA系統(tǒng)4-1制備標準品按如下所述制備用作標準品的Fas配體胞外區(qū)。(1)構(gòu)建質(zhì)粒pM1283，它含有編碼人Fas配體胞外區(qū)179個氨基酸的DNA，氨基酸序列示于序列表中序列鑒定號9。首先，化學(xué)合成有義引物1(TCTCTCGAGAAAAGAGAGCAGCTCTTCCACCTG)和反義引物1(AGGGAATTCCTATAGAGCTTATA)。有義引物1包括編碼畢赤酵母-表達質(zhì)粒pPICQ(Invitrogen)的部分α-因子信號序列的核苷酸序列，編碼人Fas配體胞外區(qū)N端區(qū)域的核苷酸序列，以及XhoI酶切位點(CTCGAG)。反義引物1包括編碼人Fas配體胞外區(qū)C端區(qū)域的核苷酸序列，終止密碼子(TAG)，和EcoRI酶切位點(GAATCC)。準備100μl含每種引物100pmol的溶液；50ng質(zhì)粒PM1070，它包括編碼人Fas配體胞外區(qū)179個氨基酸的DNA，該Fas配體描述于國際專利申請公開號WO95-13293的實例18中；dATP、dCTP、dGTP和dTTP每種20nmol；和2.5單位pfuDNA聚合酶以及10μlpfuDNA聚合酶附帶的pfu緩沖液(Stratagene)。每輪PCR循環(huán)包括94℃(30秒)，55℃(30秒)，和72℃(1分鐘)，用DNA熱循環(huán)儀(PCRSytem9600，PerkinElmer)循環(huán)30次。用EcoRI和XhoI雙酶切所得到的PCR產(chǎn)物，在pPIC9的EcoRI-XhoI位點處插入。所獲得的質(zhì)粒稱為pM1283，20μgpM1283用BglII酶切使之線性化以用于轉(zhuǎn)化畢赤酵母。(2)轉(zhuǎn)化畢赤酵母畢赤酵母GS115株(Invitrogen)接種于YPD平板(1％(w/v)細菌-酵母提取物；2％(w/v)蛋白胨；2％(w/v)D-葡萄糖；2％細菌培養(yǎng)用-瓊脂)，然后于30℃培養(yǎng)2天，取單菌落接種于YPD培養(yǎng)基中(1％(w/v)細菌培養(yǎng)用-酵母提取物；2％(w/v)蛋白胨；2％(w/v)D-葡萄糖)。于30℃以200rpm振蕩過夜培養(yǎng)后，10μl培養(yǎng)物接種于500ml容積myer燒瓶的200mlYPD中。在30℃以200rpm再次振蕩培養(yǎng)，然后收集OD600值為0.2-0.3的酵母培養(yǎng)物。酵母培養(yǎng)物于室溫在1,500xg下離心5分鐘，在20ml無菌蒸餾水中重懸并洗滌這樣分離的酵母，然后在1,500xg下再離心5分鐘。重復(fù)該過程，酵母進一步用20mlSED緩沖液(0.95M山梨醇；23.75mM乙二胺四乙酸(EDTA)，pH8.0；50mMDTT)洗滌1次，然后用20ml1M山梨醇洗滌1次，隨后重懸于20mlSCE緩沖液(1M山梨醇；1mMEDTA；10mM氯化鈉緩沖液，pH5.8)中。7.5μl3mg/ml的酶解酶(Invitrogen)加入到10ml酵母懸液中，該懸液于30℃孵育9分鐘，通過OD600值在5％SDS中的降低作為指標進行判斷，使70％的酵母轉(zhuǎn)變成原生質(zhì)球的形式。在750xg下離心10分鐘后，酵母用10ml1M山梨醇洗滌1次，然后用10mlCaS溶液(1M山梨醇；10mMTris-HCl，pH7.5；10mMCaCl2)洗滌1次，再懸浮于0.6ml的CaS溶液中。10μg線性化的pM1283加到0.1ml的原生質(zhì)球溶液中。室溫孵育10分鐘后，加入1ml聚乙二醇(PEG)/CaT溶液(20％(w/v)PEG3350；10mMTris，pH7.5；10mMCaCl2)，該溶液在室溫下再孵育10分鐘。然后將溶液在750xg下離心10分鐘，離心沉淀中加入150μlSOS溶液(1M山梨醇；0.3×YPD；10mMCaCl2)。室溫孵育該溶液20分鐘后，加入850μl1M的山梨醇。這樣獲得的100μl溶液加入到10ml一直在45℃保存的無組氨酸的RD溶液(0.186g/ml山梨醇；20mg/mlD-葡萄糖；13.4mg/ml酵母氮劑(nitrogenbase)；0.4μg/ml生物素；50μg/mlL-谷氨酸；50μg/mlL-蛋氨酸；50μg/mlL-賴氨酸；50μg/mlL-亮氨酸；50μg/mlL-異亮氨酸，1％瓊脂)。所得的溶液在RDB平板(2％瓊脂；RD溶液)上鋪成一層，于30℃孵育4天。所獲得的轉(zhuǎn)化子分別接種于MM平板(13.4mg/ml酵母氮劑；0.4μg/ml生物素；0.5％甲醇；1.5％瓊脂)和MD平板(13.4mg/ml酵母氮劑；0.4μg/ml生物素；2％D-葡萄糖；1.5％瓊脂)，并于30℃繼續(xù)孵育2天。選出在MD板上增殖而幾乎不在MM板上增殖的轉(zhuǎn)化子，然后這些選出的轉(zhuǎn)化子用于表達。(3)利用酵母制備人Fas配體的胞外區(qū)在(2)中制備的轉(zhuǎn)化子30℃下在50ml試管中于10mlBMGY(1％(w/v)酵母提取物；2％(w/v)蛋白胨；13.4mg/ml酵母氮劑；0.4μg/ml生物素；1％(v/v)甘油；0.1M磷酸鉀緩沖液。pH6.0)中振蕩培養(yǎng)2天。這樣獲得的2ml培養(yǎng)物加入到每個裝有100mlBMGY的500mlmyer燒瓶中，通過振蕩培養(yǎng)獲得2升OD600值在10～20的培養(yǎng)物。在4,000xg下室溫離心10分鐘以收集酵母，然后懸于400mlBMMY(1％(w/v)酵母提取物；2％(w/v)蛋白胨；13.4mg/ml酵母氮劑；0.4μg/ml生物素；0.5％(v/v)甲醇；0.1M磷酸鉀緩沖液，pH6.0)。各取50ml懸液加入到8個500ml的myer燒瓶中，于30℃振蕩培養(yǎng)另外的2天。所得的培養(yǎng)物于13,000xg下離心10分鐘以獲得含有人Fas配體胞外區(qū)的培養(yǎng)上清。接著，已用0.22μm孔徑的濾膜過濾的50ml培養(yǎng)上清用80％飽和硫酸銨鹽析并在4℃靜置1小時。在10,000rpm離心10分鐘來回收沉淀并溶于含0.15MNaCl的0.067M磷酸緩沖液(pH7.2)中，然后該溶液進行透析。透析后，在10,000rpm離心10分鐘并用0.22μm的濾膜過濾以進一步除去雜質(zhì)。2ml該溶液上樣到凝膠過濾柱(Hiprep16/60SephacrylS-300HR，Pharmacia)中，在0.5ml的速度下低速洗脫。回收洗脫物每個級分2ml，通過測定280nm處的吸收值對洗脫級分進行蛋白質(zhì)檢測。根據(jù)在1-3中所述的方法，每個級分取出30μl來檢測誘導(dǎo)凋亡的活性。每個級分也取出50μl以固定在免疫培養(yǎng)板上，根據(jù)在2-1中所述的方法用抗M52肽的抗體檢測Fas配體。圖6是凝膠過濾圖，在兩個系列級分中發(fā)現(xiàn)與抗M52肽的抗體有結(jié)合活性，而只在較低分子量的系列級分中發(fā)現(xiàn)有凋亡誘導(dǎo)活性。通過4-20％SDS-PAGE(TEFCO)對表現(xiàn)出活性的級分進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在分子量大約30,000，即Fas配體胞外區(qū)的分子量處的條帶只在那些表現(xiàn)出凋亡誘導(dǎo)活性的具有較低分子量的級分中檢測到，而分子量超過140,000的條帶在具有較高分子量的級分中檢測到。因此估計具有較高分子量的級分中含有聚集的Fas配體(此后有時候稱為酵母Fas配體聚集體)?；厥站哂械蛲稣T導(dǎo)活性的級分并用Centricon-10(Amicon)進行濃縮。利用BSA作為標準品通過蛋白質(zhì)測定(BioRadLaboratories)確定濃縮物的蛋白質(zhì)濃度。該濃縮物被用作人Fas配體胞外區(qū)的一種部分純化的產(chǎn)物。用80％飽和硫酸銨對來自酵母的培養(yǎng)上請進行鹽析，對含0.15MNaCl的50mMTris-HCl，pH8.0進行透析，并上樣至結(jié)合hFas-Fc的蛋白A-Cellurofine(ChissoK.K.)所填充的親和層析柱(5ml)從而獲得純化的Fas配體的胞外區(qū)。親和層析柱的制備方法包括按照蛋白A-Cellurofine所附帶的說明書，將描述于國際專利申請公開號WO95-13293的實例1中的hFas-Fc與蛋白A-Cellurofine結(jié)合(ChissoK.K.)。洗滌層析柱后，用含2MNaClpH8.0的50mMTris-HCl，洗脫層析柱，并回收280nm峰處的級分。這樣回收的級分對pH6.0的50mMMES緩沖液進行透析，并上樣至Monos(HR5/5，Pharmacia)，用含500mMNaCl的pH6.050mMMES緩沖液進行洗脫以回收280nm峰處的級分?；厥盏募壏钟肅entricon-10(Amicon)濃縮，然后該濃縮物對PBS進行透析。用BSA作為標準品用Lowry法測定蛋白質(zhì)的濃度。獲得了38μg純化的人Fas配體胞外區(qū)(蛋白質(zhì)濃度，300μg/ml)。4-2用多克隆抗體制備夾心ElA系統(tǒng)采用DEAE-純化的兔抗M52肽的抗體和抗Fas配體抗血清(批號8-2)制備夾心ElA系統(tǒng)。首先，50μl/孔DEAE-純化的兔抗-M52肽抗體用PBS稀釋至10μg/ml，加入至免疫培養(yǎng)板(Maxisorp，Nunc)的孔中，免疫培養(yǎng)板于45℃孵育30分鐘使抗體固定在孔中。用離子交換水洗滌孔5次后，各孔中加入100μl的0.1％BSA/PBS，并室溫封閉30分鐘。棄去封閉劑后，各孔中加入25μl用0.1％BSA/PBS稀釋至濃度為0～250ng/ml的純化的Fas配體胞外區(qū)，以及25μl用0.1％BSA/PBS稀釋至500倍的抗Fas配體抗血清(批號8-2)，然后于37℃反應(yīng)1小時。之后，用含0.005％吐溫20的0.9％NaCl洗滌各孔兩次，加入50μl用10％兔血清/PBS稀釋至1,000倍的HRPO-標記的抗小鼠Igs抗體(DACO)。反應(yīng)于37℃進行1小時。用洗液洗滌5次及離子交換水洗滌兩次后，孔中加入50μl含0.027％過氧化氫的3mg/ml鄰苯二胺/0.1MMcIlvaine緩沖液，pH5.0，然后反應(yīng)10分鐘。用50μl1N鹽酸終止反應(yīng)，用分光光度計測定490nm處的吸收值。圖7示出標準曲線。結(jié)果表明所制備的夾心EIA系統(tǒng)能夠高靈敏地定量測定Fas配體。4-3用單克隆抗體制備夾心EIA系統(tǒng)如下所述制備用單克隆抗體的夾心EIA系統(tǒng)。首先，用過氧化物酶標記單克隆抗體，方法依據(jù)于Nakane等所述“免疫熒光和相關(guān)染色技術(shù)”(ImmunofluorescenceandRelatedStainingTechniques)，Knapp，W.，Holubar，K.和Wick，G.編輯，1978。更詳細說明，稱取6mg過氧化物酶(RZ3.11，Toyobo.Co.，Ltd)并溶于1.5ml蒸餾水中，在該溶液中加0.3ml溶于蒸餾水的0.1M偏碘酸鈉。該溶液室溫靜置15分鐘后，加入0.3ml溶于蒸餾水的1.5％1，2-亞乙基二醇，然后溶液在室溫靜置20分鐘。所得到的溶液在4℃對pH4.4，0.00lM乙酸鹽緩沖液過夜透析。127ul所得到的活性過氧化物酶(相應(yīng)于400μg過氧化物酶)中加入7μlpH9.5的1M碳酸鹽緩沖液，然后加入500ng對pH9.5，0.01M碳酸鹽緩沖液透析過的純化單克隆抗體(2～3mg/ml)，其后溶液于25℃孵育2小時進行反應(yīng)。隨后溶液中加入12μl4mg/ml的溶于pH9.50.01M碳酸鹽緩沖液的氫硼化鈉，然后溶液于4℃靜置2小時。接著溶液于4℃對0.076M，pH6.4的PBS過夜透析，將所獲得的過氧化物酶標記抗體加入其量一半的18％蔗糖和0.3％BSA/PBS后保存在-20℃。其后，50μl/孔的F918系列和F919-9-8單克隆抗體分別加至免疫培養(yǎng)板的孔中(Maxisorp，Nunc)，并于45℃將免疫培養(yǎng)板孵育30分鐘使抗體固定在孔中。用離子交換水洗滌各孔5次后，加入0.1％BSA/PBS以封閉各孔，然后培養(yǎng)板于室溫孵育30分鐘。棄去封閉試劑后，各孔中加入25μl用0.1％BSA/PBS稀釋至濃度為0～100ng/ml的純化Fas配體胞外區(qū)，隨后加入25μl用10％兔血清/PBS稀釋至0.5～2μg/ml的HRPO標記抗體(F918系列或F919-9-18)，然后于37℃反應(yīng)1小時。之后，各孔用含0.005％吐溫20的0.9％NaCl洗液洗滌5次，并用去離子水洗滌兩次。接著孔中加入50μl含0.027％過氧化氫的3mg/ml鄰苯二胺/0.1MMcIlvaine緩沖液pH5.0，并進行反應(yīng)10分鐘。用50μl1N鹽酸終止反應(yīng)，并用分光光度計測定490nm處的吸收值。表2說明單克隆抗體的組合和在EIA中用這種抗體組合所獲得的結(jié)果。結(jié)果表明了抗M52肽的單克隆抗體(F918系列)與抗Fas配體抗體(F919)組合的可能性。應(yīng)用以下組合進行的夾心系統(tǒng)也是可能的，即含有兩種抗-M52肽單克隆抗體F918-9-4/F918-7-3的組合以及含有相同抗體F919-9-18/F919-9-18的組合。應(yīng)當注意在表2中，“高”表示高反應(yīng)性；“相當”表示相當程度的反應(yīng)性；“低”表示低反應(yīng)性；“無”表示無反應(yīng)性。在表2中，兔抗-M52和兔抗-M57是分別用M52和M57肽免疫的兔子的抗血清。表4按下面所述的方法，表達人Fas配體胞外區(qū)的缺失突變體，多肽nd5、nd12、nd20、nd32和nd49；人Fas配體胞外區(qū)的置換突變體，多肽L179F；游離Fas配體。應(yīng)當指出多肽nd5、nd12、nd20、nd32、nd42和nd49是從序列表中序列鑒定號9所述的氨基酸序列的N端分別缺失5個氨基酸、12個氨基酸、20個氨基酸、32個氨基酸、42個氨基酸和49個氨基酸的多肽，即，分別具有從第6、第13、第21、第33、第43和第50位氨基酸延伸到第179位氨基酸的氨基酸序列的多肽。多肽cd179是從序列表中序列鑒定號9所述的氨基酸序列的C端缺失了1個氨基酸的多肽；即，具有氨基酸序號1～178的氨基酸序列的多肽。多肽L179F是在序列表中序列鑒定號9所述的氨基酸序列中C端氨基酸殘基亮氨酸已被苯丙氨酸取代的多肽。游離Fas配體是表達在COS-1細胞表面并釋放到培養(yǎng)上清中的Fas配體，并且用于表達的COS-1細胞是已導(dǎo)入含有全長Fas配體的質(zhì)粒的細胞。(1)制備質(zhì)粒pM1081按下述的方法制備編碼人Fas抗原的信號肽和人Fas配體胞外區(qū)的質(zhì)粒pM1081。作為沉默突變的結(jié)果，pM1081含有在編碼人Fas抗原信號肽的序列中引入的SpeI和PshAI識別位點，以及在編碼人Fas配體的序列中引入的PstI識別位點。首先，化學(xué)合成有義引物2(TGCGAATTCACCATGCTGGGCATCTGG)和反義引物2(CTTCTGCAGGTGGAAGAGCTGAGCGACACTAGTCAGAACCAGAGG)。有義引物2包括編碼人Fas抗原信號肽的序列的5端區(qū)域；以及EcoRI位點(GAATTC)。反義引物2包括人Fas配體胞外區(qū)的N端和編碼人Fas抗原信號肽的序列的C端；PstI位點(CTGCAG)；SpeI位點(ACTAGT)；和PshAI位點(GACTAGTGTC)。制備含有所獲得的反義引物2和有義引物2每種100pmol；50ng含有編碼人Fas抗原的DNA的質(zhì)粒pBLF58-1(Itoh，N，等，《細胞》(cell)，66卷，233-243頁，1991)；以及2.5UpfuDNA聚合酶和10μl包含于pfuDNA聚合酶配套試劑(Stratagene)中的pfu緩沖液的溶液100μl。每輪PCR循環(huán)包括94℃(30秒)，55℃(30秒)，和72℃(1分鐘)，用DNA熱循環(huán)儀(PCR系統(tǒng)9600，PerkinElmer)重復(fù)30次循環(huán)。用EcoRI和PstI雙酶切PCR產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進行電泳?；厥沾蠹s70bp的DNA片斷并用QIAEX試劑盒(QIAGEN)純化。將上述大約70bp的片斷插入到質(zhì)粒pM1067的EcoRI-PstI位點，質(zhì)粒pM1067描述于國際專利申請公開號WO95-13293的實例18中。當證實了所得到的質(zhì)粒的核苷酸序列后，發(fā)現(xiàn)在EcoRI位點和SpeI位點之間有16bp的缺失。為了構(gòu)建EcoRI位點和SpeI位點之間的序列，化學(xué)合成有義寡核苷酸1(AATTCACCATGCTGGGCATCTGGACCCTCCTACCTCTGGTTCTGA)和反義寡核苷酸1(CTAGTCAGAACCAGAGGTAGGAGGGTCCAGATGCCCAGCATGGTG)，并制備20μl含有義寡核苷酸1和反義寡核苷酸1每種1nmol的TE溶液。TE溶液加熱至95℃，持續(xù)5分鐘，逐漸冷卻至16℃以使核苷酸退火并產(chǎn)生具有EcoRI酶切位點和另一端有SpeI酶切位點的雙鏈DNA片斷。這樣制備的DNA片斷插入到上述具有16bp缺失的質(zhì)粒的EcoRI位點和SpeI位點之間以獲得pM1081。(2)制備質(zhì)粒pM1291首先，化學(xué)合成有義引物3(CTGACTAGTGTCGCTCAGAAGGAGCTGGCA)和反義引物3(GTCTTCCCATTCCAGAGGCATGG)。有義引物3包括編碼位于人Fas抗原信號肽C端的氨基酸序列的核苷酸和編碼從人Fas配體胞外區(qū)N端第6到第10個氨基酸的氨基酸序列的核苷酸；SpeI位點(ACTAGT)；以及PshAI位點(GACTAGTGTC)。反義引物3是與人Fas配體胞外區(qū)cDNA的第164到第186核苷酸的核苷酸序列互補的序列，并包括BstXI位點(CCAGAGGCATGG)。制備含有這樣制備的有義引物3和反義引物3每種100pmol；50ng描述于國際專利申請公開號WO95-13293的實例12中的pBX-hFL1；dATP、dCTP、dGTP、dTTP每種20nmol；以及2.5UpfuDNA聚合酶和10μlpfu緩沖液(兩種pfu均購自Stratagene)的溶液100ml。重復(fù)上述(1)的過程進行PCR。所得的PCR產(chǎn)物用SpeI和BstXI雙酶切，并插入到(1)中制備的質(zhì)粒pM1081的SpeI-BstXI位點。所得的質(zhì)粒稱為pM1291。(3)制備質(zhì)粒pM1292首先，化學(xué)合成有義引物4(CTGACTAGTGTCGCTCGAGAGTCTACCAGC)。有義引物4包括編碼位于人Fas抗原信號肽C末端的氨基酸序列的核苷酸序列和編碼人Fas配體胞外區(qū)的N端第13到第17氨基酸的氨基酸序列的核苷酸序列；SpeI位點(ACTAGT)；和PshAI位點(GACTAGTGTC)。用有義引物4和(2)中的反義引物3重復(fù)(2)中的過程進行PCR。所得的PCR產(chǎn)物用SpeI和BstXI雙酶切，并插入到(1)中制備的pM1081的SpeI-BstXI位點上。所得的質(zhì)粒稱為pM1292。(4)制備質(zhì)粒pM1293首先，化學(xué)合成有義引物5(CTGACTAGTGTCGCTACAGCATCATCTTTG)。有義引物5包括編碼位于人Fas抗原信號肽C末端的氨基酸序列的核苷酸序列和編碼人Fas配體胞外區(qū)的N末端第21到25氨基酸的氨基酸序列的核苷酸序列；SpeI位點(ACTAGT)；和PshAI位點(GATCTAGTGTC)。用有義引物5和(2)中的反義引物3重復(fù)(2)中的過程進行PCR。所得的PCR產(chǎn)物用SpeI和BstXI雙酶切，并插入到pM1081的SpeI-BstXI位點。所得的質(zhì)粒稱為pM1293。(5)制備質(zhì)粒pM1295首先，化學(xué)合成引物6(CTGACTAGTGTCGCTAGTCCACCCCCTGAA)。引物6包括編碼位于人Fas抗原信號肽C末端的氨基酸序列的核苷酸序列和編碼人Fas配體胞外區(qū)N末端第33到37氨基酸的氨基酸序列的核苷酸序列；SpeI位點(ACTAGT)；和PshAI位點(GACTAGTGTC)。用有義引物6和(2)中的反義引物3重復(fù)(2)中的過程進行PCR。所得的PCR產(chǎn)物用SpeI和BstXI雙酶切，并插入到pM1081的SpeI-BstXI位點。所得的質(zhì)粒稱為pM1295。(6)制備質(zhì)粒pM1296、pM1297、pM1298和pM1300制備于(2)～(5)的質(zhì)粒pM1291、pM1292、pM1293和pM1295分別用EcoRI和KpnI雙酶切，酶切產(chǎn)物進行凝膠電泳。分別回收大約580、570、540和500bp的DNA片斷，并用QIAEX試劑盒(QIAGEN)純化DNA。上述大約580、570、540和500bp的DNA片斷分別插入到通過用dhfr基因重組修飾動物細胞表達載體pEF-BOS而制備的pM1103的EcoRI-KpnI位點上。(PEF-BOS見Mizushima和Nagata，《核酸研究》(NucleicAcidsRes.)，18卷5322頁，1990)。所得的質(zhì)粒分別稱為pM1296、pM1297、pM1298、pM1300.利用PRISMDyeTerminatorCycle測序試劑盒(Perkin-Elmer)和DNA測序儀(型號373A，Perkin-Elmer)確定這樣制備的質(zhì)粒的核苷酸序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pM1296、pM1297、pM1298和pM1300分別含有國際專利申請公開號PCT/JP95/00883的序列表中序列鑒定號1、2、3和4所述的DNA，這些DNA分別是編碼人Fas配體胞外區(qū)N末端第6、第13、第21和第33氨基酸之后的氨基酸序列的核苷酸序列。本發(fā)明的發(fā)明者用已知的方法將質(zhì)粒pM1297和pM1300分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101，所得的轉(zhuǎn)化子大腸桿菌HB101(pM1297)和HB101(pM1300)于1995年4月26日保存于國立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(登記號FERMBP-5083，F(xiàn)ERMBP-5084)。(7)制備包括編碼人Fas配體胞外區(qū)的DNA的質(zhì)粒pM1070-pUC118首先，化學(xué)合成有義引物2(TGCGAATTCACCATGCTGGGCATCTGG)和反義引物4(AACCTGCAGGTGGAAGAGCTGAGCAACAGACGTAAG)。有義引物2包括EcoRI位點(GAATTC)，和編碼人Fas抗原信號肽N末端5個氨基酸的核苷酸序列。反義引物4包括PstI位點(CTGCAG)；編碼人Fas配體胞外區(qū)N末端4個氨基酸的核苷酸序列；和編碼人Fas抗原信號肽C末端5個氨基酸的核苷酸序列。制備含所得的引物每種100pmol；50ng包括編碼人Fas抗原氨基酸的DNA的pBLF58-1(ItohN等，《細胞》(cell)66卷233-243頁，1991)；dATP、dCTP、dGTP、dTTP每種20nmol；以及2.5U的pfuDNA聚合酶和10μlpfu緩沖液(兩種均購自Stratagene)的溶液100μl。每輪PCR循環(huán)包括94℃(30秒)，55℃(30秒)，和72℃(1分鐘)，用DNA熱循環(huán)儀(PCR系統(tǒng)9600，PerlcinElmer)重復(fù)30次循環(huán)。PCR產(chǎn)物用EcoRI和PstI雙酶切，并將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳?；厥沾蠹s70bp的DNA片斷，并用QIAEX試劑盒(QIAGEN)純化。用EcoRI和PstI雙酶切描述于國際專利申請公開號WO95-13293的實例18中的pM1067，上述大約70bp的DNA片斷插入到這樣酶切的質(zhì)粒中以獲得質(zhì)粒pM1070-pUC118。(8)制備包括編碼L179F的DNA的質(zhì)粒pM1090，L179F是C端氨基酸發(fā)生置換的人Fas配體胞外區(qū)的突變體。首先，化學(xué)合成有義引物7(GAGCTACTGCACTACTGGGC)和反義引物5(CTTGGTACCCTATTAGAACTTATATAAGCC)。有義引物7包括編碼人Fas配體胞外區(qū)第129～135氨基酸的20bp的DNA；并且ApaI位點(GGGCCC)位于其下游6pb。反義引物5包括編碼人Fas配體胞外區(qū)C末端第175～178氨基酸的核苷酸序列，并且編碼第179亮氨基酸的核苷酸序列(CTC)替換為編碼苯丙氨酸的核苷酸序列(TTC)。反義引物5也包括終止密碼子(TAA，TAG)和KpnI位點(GGTACC)。用有義引物7和反義引物5重復(fù)(2)中的過程進行PCR。所得的PCR產(chǎn)物用ApaI和KpnI雙酶切，并將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳?；厥沾蠹s130bp的DNA片斷并用QIAEX試劑盒(QIAGEN)純化。用ApaI和KpnI雙酶切含有編碼人Fas配體胞外區(qū)的DNA的質(zhì)粒pM1070、pUC118，將上述大約130bp的DNA片斷插入到質(zhì)粒中。所得的質(zhì)粒用EcoRI和KpnI雙酶切，并將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳?；厥沾蠹s600bp的DNA片斷并用QIAEX試劑盒純化。上述大約600bp的DNA片斷插入到pM1103的EcoRI-KpnI克隆位點，pM1103是通過將DHFR基因插入到動物細胞表達載體pEF-BOS(Mizushima和Nagata，《核酸研究》(NucleicAcidRes.)18卷，5322頁，1990)中而構(gòu)建的。所得的質(zhì)粒稱為pM1090。利用PRISMDyeTerminatorCycle測序試劑盒(Perkin-Elmer)和DNA測序儀(373A型，Perkin-Elmer)確定這樣制備的質(zhì)粒的核苷酸序列。結(jié)果證實質(zhì)粒pM1090包含編碼人Fas配體胞外區(qū)氨基酸序列(序列表中序列鑒定號9)的DNA，其中C末端氨基酸殘基，亮氨酸已替換為苯丙氨酸。(9)轉(zhuǎn)化入COS-1細胞如下所述，描述于國際專利申請公開號WO95-13293的實例18中的pM1090、pM1296、pM1297、pM1298、pM1300、pM1070和描述于國際專利申請公開號WO95-13293的實例12中的pEX-hFL1用來制備轉(zhuǎn)化子COS-1/pM1090、COS-1/pM1296、COS-1/pM1297、COS-1/pM1298、COS-1/pM1300、COS-1/pM1070和COS-1/pEX-hFL1。更詳細說明，每種質(zhì)粒DNA8.1μg溶于40μlTris/EDTA溶液中。2.5μl該溶液中加入0.7ml含0.2g/mlDEAE-葡萄糖和50mMpH7.4Tris-HCl的DMEM(NissuiSeiyaku)以制備DNA-DEAE-葡聚糖混合液。將該混合液加入到已在6孔板中生長至半?yún)R合的單層COS-1細胞上，在5％CO2下培養(yǎng)板于37℃孵育以獲得轉(zhuǎn)化子COS-1/pM1090、COS-1/pM1296、COS-1/pM1297、COS-1/pM1298、COS-1/pM1300、COS-1/pM1070和COS-1/pEX-hFL1。這樣獲得的轉(zhuǎn)化子COS-1/pM1090、COS-1/pM1296、COS-1/pM1297、COS-1/pM1298、COS-1/pM1300、COS-1/pM1070和COS-1/pEX-hFL1均于37℃在含1％FCS的D-MEM中培養(yǎng)72小時，然后收集培養(yǎng)上清。通過實例1～3中所述的方法評定培養(yǎng)上清誘導(dǎo)凋亡的活性。(10)游離Fas配體所用的游離Fas配體是從轉(zhuǎn)化子COS-1/pEX-hFL1的培養(yǎng)上清中回收的，COS-1/pEX-hF1是依據(jù)于上述(9)所述的方法，通過將描述于國際專利申請公開號WO95-13293的實例12中的pEX-hFL1導(dǎo)入COS-1細胞而制備的(此后游離Fas配體有時稱為COS游離)。據(jù)報道一種特異的基質(zhì)金屬蛋白酶樣的酶酶解膜結(jié)合的Fas配體而產(chǎn)生其可溶性(游離)形式(TanakaM等，《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》(EMBOJ.)14卷1129-1135頁(1995)，TanakaM等，《自然醫(yī)學(xué)》(NatureMedicine)2卷317-322頁(1996))。游離Fas配體的N末端氨基酸是Fas配體胞外區(qū)的第28位谷氨酰胺，即，游離Fas配體缺乏膜結(jié)合Fas配體N末端的27個氨基酸。5-2與各種Fas配體的反應(yīng)性用各種Fas配體來評定8種類型EIA系統(tǒng)的抗原特異性。利用Fas配體胞外區(qū)的各種缺失和替換突變體；聚集的Fas配體胞外區(qū)(酵母FasL聚集體)和純化的Fas配體胞外區(qū)(酵母FasL)(見4-1中所述)；描述于3-1中的來自COS-1細胞的Fas配體胞外區(qū)(COSsFasL)；以及游離的Fas配體(COS游離)作為Fas配體以確定與這些Fas配體每一種的反應(yīng)性。如表3所示，用M52肽免疫所獲得的單克隆抗體包括識別M52肽N末端區(qū)的單克隆抗體(F918-7-3)；和識別M52肽C末端區(qū)的單克隆體(F918-9-4)。表3也證實了F919-9-18的結(jié)合區(qū)位于M52肽位點的C末端，因為F919-9-18也與不包括M52肽區(qū)的Fas配體的胞外區(qū)發(fā)生反應(yīng)，并且F919-9-18只與表現(xiàn)出凋亡誘導(dǎo)活性的Fas配體胞外區(qū)發(fā)生反應(yīng)。應(yīng)當指出“高”表示高反應(yīng)性；“低”表示低反應(yīng)性；而“無”表示無反應(yīng)。表3與夾心EIA系統(tǒng)反應(yīng)的各種Fas配體</tables>5-3正常人血清的影響為了根據(jù)在4-2中所述的方法對正常人血清進行測定，檢測人血清對Fas配體測定的影響。描述于實例4-1中的部分純化的Fas配體胞外區(qū)用0.1％BSA/PBS或正常人血清稀釋，并制作標準曲線。如圖8所示，加入0.1％BSA/PBS和加入正常人血清未見差別，但未加入Fas配體時正常人血清的背景值較0.1％BSA/PBS稍低，于是得出結(jié)論正常人血清不影響Fas配體的測定。6.在患各種疾病的病人血清中檢測Fas配體利用患各種疾病的病人血清依據(jù)4-2中所述的方法對血中的Fas配體進行檢測。描述于實例4-1中的純化Fas配體胞外區(qū)用正常人血清稀釋至0、10、50、100和200ng/ml，將這些稀釋物用作標準品。檢測了取自正常獻血者的26例血清，取自乙型肝炎病人的36例血清，取自丙型肝炎病人的13例血清，取自HIV抗體陽性病人的14例血清，和取自患其它疾病的病人的血清。圖9列出了不同血清的檢測結(jié)果。正常獻血者測定出低于測定敏感性的數(shù)值(大約1ng/ml)，而高數(shù)值發(fā)現(xiàn)于乙型肝炎(9/36)，丙型肝炎(4/13)，和HIV抗體陽性的病人(1/14)(括號中所示為當閾值定在1ng/ml時陽性例數(shù)與測定數(shù)之比)。陽性病例也見于瘧疾患者(2/10)，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者，以及抗DNA抗體陽性的自身免疫病患者(1/1)，這表明Fas配體與這些疾病的病因?qū)W或病理學(xué)相關(guān)。7.小鼠F919-9-18抗體可變區(qū)cDNAs的克隆和測序用錨定PCR克隆小鼠F919-9-18抗體(此后簡稱為F919)的重鏈和輕鏈可變區(qū)cDNAs(見，Co等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)148卷1149頁(1992)，普通轉(zhuǎn)讓的U.S.S.N.07/634,278)所用的5引物與加入到cDNA中的多聚-dG退火，3引物與恒定區(qū)退火。然后將PCR擴增的基因片斷插入到pUC18中。從幾個獨立的克隆中確定輕鏈和重鏈可變區(qū)cDNA的核苷酸序列。對重鏈鑒定出了一段單一序列，是典型的小鼠重鏈可變區(qū)。對輕鏈鑒定出了均與小鼠輕鏈可變區(qū)序列同源的兩段單一序列。然而，一段序列由于缺失了1個核苷酸使得V-J結(jié)合區(qū)發(fā)生了移碼，所以沒有功能，因而稱為無效等位基因。另一序列是典型的小鼠kappa鏈可變區(qū)。對每一段序列的幾個克隆分別測序并發(fā)現(xiàn)它們相同。重鏈和功能性輕鏈的可變區(qū)cDNA序列以及來源于這些序列的氨基酸序列被示于圖10和11中。8.用計算機進行設(shè)計使人源化F919可變區(qū)模型化為了保持人源化抗體的高結(jié)合親和性，進行Queen等所述的一般方法(見，Queen等，《國家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86卷10029(1989)和WO90/07861，在此引入作為參考)。在保持高結(jié)合親和性方面中重要的是框架殘基的選擇。原則上，從任何人抗體中得到的框架序列都能作為CDR移植的模板；但是，已經(jīng)證實直接將CDR置換進這種框架將導(dǎo)致對抗原的結(jié)合親和性明顯喪失(Glaser等，《免疫學(xué)雜志)》(J.Immunol.)149卷2606頁(1992)；Tempest等，《生物技術(shù)》(Biotechnology)9卷266頁(1992)；shalabg等，《實驗醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)17卷217頁(1992))。人抗體(受者)與起源的小鼠抗體(供者)越同源，人框架越不可能引起能誘導(dǎo)親和性的小鼠CDRs的改變。依據(jù)對抗體序列數(shù)據(jù)庫進行的序列同源性檢索，選出人抗體Eu作為與小鼠F919抗體同源的優(yōu)良框架，雖然其它高度同源的人抗體鏈也可能是適合的，尤其人亞組I的Kappa輕鏈和人亞組I的重鏈(此為Kabat等所述，《免疫學(xué)相關(guān)蛋白的序列》(SequenceofProteinofImmunologicalInterest)，第5版，U.S.DepartmentofHealth和HumanServices，1991)。利用計算機程序ENCAD(Levitt等，《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.)168卷595頁(1983)，在此引入作為參考)來構(gòu)建F919可變區(qū)的分子模型，其用來在F919框架中確定與CDRs緊密相鄰從而有可能與它們相互作用的氨基酸。為設(shè)計人源化F919重鏈和輕鏈的可變區(qū)，將小鼠F919抗體的CDRs插入到人Eu抗體的框架區(qū)。在計算機模型提示與CDRs有明顯接觸的框架位置上；用來自小鼠抗體的氨基酸置換最初人框架區(qū)的氨基酸。對人源化F919來說，該置換發(fā)生在重鏈27、30、45、46、68、70、72和97位上的殘基以及輕鏈7、22、70、71、和87位上的殘基。構(gòu)建另一序列變體的人源化輕鏈以保留兩個人框架區(qū)的殘基(變體2)，即，變體1中7和22位的T和S在變體2中分別替換為S和T。在后面所示的結(jié)果表明在輕鏈的兩個變體之間結(jié)合親和力沒有明顯的差別。因此優(yōu)選變體2作人源化的輕鏈，因為它保留了更多的人殘基。進一步，在人抗體數(shù)據(jù)庫中其位置上只有極少數(shù)情況下才出現(xiàn)的框架殘基用這些位置的人共有氨基酸置換。對人源化F919抗體來說，該置換發(fā)生于重鏈的74、93、95、98、107、108、109和111位上的殘基以及輕鏈48和63位上的殘基。人源化F919抗體重鏈和輕鏈(變體2)可變區(qū)的序列示于圖13和12中。然而，許多潛在的接觸CDR的殘基可以替換成仍能使抗體保留對抗原的基本親和力的其它氨基酸。下面的表中(表4)列舉了框架區(qū)的許多位置，在該位置上可供選擇的氨基酸也是合適的(LC＝輕鏈，HC＝重鏈)。表4</tables>同樣，在人源化F919輕鏈和重鏈中不與CDRs接觸的許多框架殘基可進行以下氨基酸的置換以來自人EU抗體、其它人的抗體、小鼠F919抗體或其它小鼠抗體相應(yīng)位置的氨基酸置換，許多框架殘基可進行這樣的置換而沒有明顯喪失親和性或人源化抗體的無免疫原性。下面的表中(表5)列舉了框架區(qū)中可供選擇的氨基酸可能是適合的許多其它的位置。表5選擇可供選擇的氨基酸的組合可用于產(chǎn)生人源化F919的許多變體，這些變體具有親和性、特異性、無免疫原性、制備的容易程度、和其它所需特性的各種不同組合。因此提供上述表中的實例是用來舉例說明，而不是限制。9.構(gòu)建人源化的F919按上面所述，一旦設(shè)計了人源化可變區(qū)的氨基酸序列，便構(gòu)建基因以編碼該序列，該序列包括信號肽，剪接供位信號和適當?shù)南拗菩晕稽c(圖12和13)。構(gòu)建重鏈的可變區(qū)基因并用8個長度為61-79個堿基、相互重疊的合成寡核苷酸進行擴增。寡核苷酸成對退火并用DNA聚合酶的Klenow片斷延伸，產(chǎn)生4個雙鏈片斷。所得的片斷進行變性、退火并用Klenow延伸，產(chǎn)生兩個片斷。這些片斷再變性、成對退火和延伸，產(chǎn)生全長的基因。所獲得的產(chǎn)物用Taq聚合酶通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進行擴增，凝膠純化，用XbaI酶切，再次凝膠純化，并亞克隆進pVg1(見Co等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)148卷1149頁(1992))或pVg4表達載體的XbaI位點。pVg4載體的構(gòu)建是通過將pVg1中含有γ1恒定區(qū)基因的XbaI-BamHI片斷替換為大約2000bp的人γ4恒定區(qū)基因片斷(Ellison和Hood，《國家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)79卷1984頁(1982))，后者是從γ4基因的CH1外顯子之前的HindIII位點到該基因CH4外顯子后的NsiI位點之后的270bp。通過核苷酸測序和限制性圖譜分析來證實所得到的質(zhì)粒。輕鏈可變區(qū)序列被發(fā)現(xiàn)是與HuC4G1高度同源的，HuC4G1是以前構(gòu)建的對gpIIb/IIIa特異的人源化抗體。在全部的可變區(qū)中，HuC4G1輕鏈與HuF919的輕鏈(變體1)只在30、53、70和92位上有四個氨基酸殘基不同。因此我們用合成的寡核苷酸和PCR通過定點誘變將所需要的氨基酸殘基在這四個位置上引入在pVk質(zhì)粒中所構(gòu)建的HuC4G1輕鏈基因中，從而構(gòu)建了HuF919輕鏈可變區(qū)基因。輕鏈的第2變體序列在7和22位上有另外的兩個氨基酸殘基不同并以相似的方式進行構(gòu)建。因此在含有人Ck基因的pVk載體中所得的質(zhì)粒每個都包含人源化的F919的可變區(qū)基因(見Co等，出處同上)。最終獲得的質(zhì)粒也通過核苷酸測序和限制性圖譜分析進行證實。所有的操作都依據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標準方法進行。如下所述，通過重鏈和輕鏈的不同組合而構(gòu)建了4種人源化的F919抗體表6<tablesid="table5"num="005"><tablewidth="675">抗體名稱重鏈輕鏈HuF919G1.v1gamma1鏈Kappa鏈變體1HuF919G1.v2gamma1鏈Kappa鏈變體2HuF919G4.v1gamma4鏈Kappa鏈變體1HuF919G4.v2gamma4鏈Kappa鏈變體2</table></tables>為了構(gòu)建分泌上述每一種抗體的細胞系，重鏈和輕鏈質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進小鼠骨髓瘤細胞系SPZ-O-ag14(ATCCCRL1581)。轉(zhuǎn)染前，含重鏈和輕鏈的質(zhì)粒分別用BamHI和FspI酶切使之線性化。每種質(zhì)粒大約20μg于PBS中轉(zhuǎn)染進1×107個細胞中。轉(zhuǎn)染過程是依據(jù)生產(chǎn)商的說明書在360伏和25μFD電容值下利用基因脈沖器(GenePulserapparatusBioRad)進行電穿孔來完成的。將每次轉(zhuǎn)染的細胞置于4塊96孔組織培養(yǎng)板中，并在2天后，加入選擇培養(yǎng)基(D-MEM，10％FCS，1×HT補充物(Sigma)，0.25mg/ml黃嘌呤，1μg/ml霉酚酸)。大約兩周后，通過ELISA篩選出產(chǎn)生抗體的克隆。來自每一種轉(zhuǎn)染的高分泌性克隆的抗體制備如下在常規(guī)培養(yǎng)基(含10％FCS的D-MEM)中培養(yǎng)細胞至匯合，然后替換成無血清的培養(yǎng)基(雜交瘤SMF；Gibco)并繼續(xù)培養(yǎng)直至在培養(yǎng)物中獲得最高的抗體滴度。培養(yǎng)上清過蛋白A-Sepharose柱(Pharmacia)；抗體用0.1M甘氨酸，0.1MNaCl，pH3.0進行洗脫，并隨后改成磷酸緩沖鹽溶液(PBS)?？贵w的純度通過在丙烯酰胺凝膠上分析加以證實，其濃度通過OD280的讀數(shù)進行確定，同時假定1.0mg抗體蛋白質(zhì)的OD280讀數(shù)為1.13。10.人源化F919的特性為了證明小鼠和人源化的F919抗體能與Fas配體抗原結(jié)合，每種抗體2.5ng(小鼠F919，HuF919G1.v1，HuF919G1.v2，HuF919G4.v1和HuF919G4.v2)分別與1A12細胞共同冰浴30分鐘，其中1A12細胞為經(jīng)轉(zhuǎn)染并表達Fas配體的小鼠淋巴瘤細胞系WR19L。細胞用冰冷的PBS洗滌，再與FITC-標記的山羊抗人或抗小鼠抗體(TagoImmunologicals)共育30分鐘，并通過流式細胞儀(FACS)分析。FACS直方圖證實了小鼠和四種人源化的F919抗體能特異地與1A12細胞結(jié)合，而不能與未轉(zhuǎn)染的細胞系WR19L結(jié)合。為了評定人源化的F919抗體與小鼠F919抗體競爭結(jié)合受體(結(jié)合Fas配體)的能力，逐步增加濃度(0.01-50μg/ml)的小鼠F919抗體和人源化F919每一變體的抗體分別在4℃與5×105個1A12細胞和固定量(5ng)的示蹤物125I-標記的小鼠抗體共同孵育90分鐘。小鼠和人源化的F919抗體以基本相同的效率競爭(圖14和15)。從數(shù)據(jù)中計算出的每種抗體的結(jié)合親和力是非常相似的；如下表所示(表7)。因此人源化的過程沒有明顯改變其來源抗體的結(jié)合親和力。表7</tables>11.評定人源化F919抗體抑制凋亡的活性利用抑制1A12細胞對WC8細胞的細胞毒性的活性作為指標來檢測對凋亡的抑制。1A12細胞是小鼠WR19L細胞被轉(zhuǎn)化以表達人Fas配體的轉(zhuǎn)化子(TanakaM.等，《自然醫(yī)學(xué)》(NatureMedicine)2卷317-322頁，1996)，而WC8細胞是WR19L細胞被轉(zhuǎn)化以表達人Fas抗原的轉(zhuǎn)化子。WR19L細胞幾乎不表達小鼠Fas抗原并對TNF的細胞毒性作用敏感。根據(jù)RouvierE.等所述的方法(《實驗醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.，177卷195-200頁，1993)檢測細胞毒性。首先，1A12細胞用含10％熱滅活的胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌，然后用作效應(yīng)細胞。另一方面，在100μl含10％滅活FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，1×106WC8細胞與20μCi[51Cr]鉻酸鈉[NEN]于37℃孵育2小時，隨后用含10％滅活FBS的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌并用作靶細胞。在總體積100μl中，1×104個1A12細胞和1×104靶細胞與各種遞增濃度的小鼠或人源化的F919抗體于37℃孵育4小時。利用下面所示的公式，從每孔中用γ計數(shù)儀測定的培養(yǎng)上清的放射活性計算出特異裂解率。通過靶細胞在培養(yǎng)基中單獨孵育測定51Cr的自發(fā)釋放，并通過0.1％TritonX-100溶解靶細胞測定最大51Cr釋放。每一種人源化的F919抗體表現(xiàn)出了與小鼠F919抗體幾乎相同或稍強的凋亡抑制活性(圖16和17)。12.用兩種類型的單克隆抗體通過夾心EIA系統(tǒng)測定血中Fas配體的濃度制備采用兩種單克隆抗體(F919-20-2，F(xiàn)919-9-18)的兩步夾心EIA系統(tǒng)以測定人血中Fas配體的濃度。(1)制備多聚過氧化物酶標記的抗體依據(jù)PIERCE中說明書26101X所述的方法，用2-iminothiolane·鹽酸(Trant′s試劑)將SH基團引入單克隆抗體F919-9-18中。更具體地舉例說明，15mg抗體(15mg/ml)在凝膠過濾柱中(NAP-10，Pharmacia)以50mM含有0.1MNaCl和1mMEDTA的鹽酸三乙醇胺緩沖液pH8.0(此后稱為TEA)更換緩沖液。9克所得到的抗體(6mg/ml)加入容器中，每容器1.4mg，并且每容器中加入100ng/mlTEA中的Trants試劑溶液，以使抗體與Trant′s試劑的摩爾比率分別為1∶5，1∶10和1∶50。用氮氣排除空氣后，室溫下分別為反應(yīng)60分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液在NAP-5(Pharmacia)中以含0.1MNaCl和5mMEDTA的0.1M磷酸鹽緩沖液，pH7.0更換緩沖液。依據(jù)PIERCE中說明書26101X所述的方法，利用Ellman′s試劑(5，5′-二硫-雙-2-硝基苯甲酸)計算出所引入的SH基團的數(shù)目。當抗體與Trant′s試劑的摩爾比率是1∶5時，每分子抗體的SH基團數(shù)目是1.4；當摩爾比率是1∶10時為1.0；而當摩爾比率是1∶50時為1.3。在抗體與Trant′s試劑的摩爾比率為1∶5時所獲得的最高SH基團引入率的抗體被用來制備多聚過氧化物酶(PolyPOD)標記的抗體。PolyPOD(MH)(Boehringer-Mannheim)用純水溶解成5mg/ml，并將200μg(1.67mg/ml)上述抗體加入到PolyPOD溶液中以使抗體與PolyPOD的摩爾比率分別是4∶1，2∶1和1∶1。反應(yīng)于30℃進行1小時。每種反應(yīng)液中加入10μl5mMN-乙基馬來酰亞胺以終止反應(yīng)，并將反應(yīng)液對0.076M含0.45％NaCl的磷酸鹽緩沖液，pH6.4(此后稱為PBS)于4℃過夜透析。在280nm和403nm處測定標記抗體的吸收值，并通過下述的公式計算出標記抗體的濃度。透析后測定溶液的體積，并向溶液中加入一半體積的18％蔗糖/0.3％BSA/PBS。所獲得的溶液保存-40℃。標記抗體的濃度(mg/ml)＝10×A280-(A403×10/7.58×104)×2.29×104(2)制備F(ab′)2片斷下面依據(jù)《超高敏感性酶免試驗》(UltrahighSensitivityEnzymeImmunoassay)(EijiISHIKAWA，Gakkai，ShuppanCentr，1993)中所述的方法，從單克隆抗體F918-20-2中制備F(ab′)2片斷。更詳細舉例說明，10mg(5mg/ml)抗體對含0.1MNaCl的0.1M乙酸鈉緩沖液，pH4.2于40℃過夜透析。加入40μl(0.4mg)在相同緩沖液中的豬胃蛋白酶(Sigma)溶液，并于37℃反應(yīng)24小時。反應(yīng)液冰浴致冷，并用三(羥甲基)氨基甲烷調(diào)pH至大約7。然后溶液上樣至用PBS平衡的蛋白A-固定化玻璃樹脂柱(Prosep-A，BioProcessing)中以除去裂解的Fc片斷?；厥瘴次接谥南疵撐?，并于4℃將洗脫物對PBS過夜透析，然后加入疊氮化鈉至終濃度0.05％溶液保存在4℃。從280nm的吸收值計算出F(ab)2片斷的濃度。(3)測定人血清中Fas配體的數(shù)量從正常獻血者中收集血清，利用F919-9-18抗體的吸附除去血清中的Fas配體，利用這樣處理的血清作為稀釋劑，并進行一系列的倍比稀釋，來制備實例4-1中所述的純化Fas配體胞外區(qū)的系列稀釋物，從5ng/ml到0.08ng/ml。稀釋劑被用作空白對照(0ng/mlFas配體)。按下述方法測定示于表8的一組血清的Fas配體濃度，以此闡明與臨床癥狀的關(guān)系。表8產(chǎn)品名稱管號代號抗-HIV血清轉(zhuǎn)變組I8PRB909B甲肝血清轉(zhuǎn)變組A5PHT901A乙肝血清轉(zhuǎn)變組6PHM910A丙肝血清轉(zhuǎn)變組7PHV902B用PBS稀釋至30μg/ml的F918-20-2F(ab)2片斷以70μl/孔加入免疫培養(yǎng)板(MaxisorpNunc)的孔中，于45℃孵育30分鐘使抗體固定于孔中。用離子交換水洗滌各孔5次，并且每孔中加入200μl0.1％BSA/PBS以進行封閉。室溫下封閉30分鐘。從免疫培養(yǎng)板中棄去用作封閉的溶液后，F(xiàn)as配體系列稀釋物的每稀釋度20μl和標本加入每孔中，并且每孔加入80μl含0.1％吐溫20和0.9％NaCl的0.076M磷酸鹽緩沖液，pH6.4作為第一輪反應(yīng)的緩沖液。反應(yīng)于37℃進行2小時，然后用含0.005％吐溫20的0.9％NaCl洗滌各孔5次。接著，100μl0.5μg/ml稀釋度的反應(yīng)性最強的PolyPOD-標記的抗體(抗體PolyPOD，41)與含10％兔血清和1％小鼠血清的第一輪反應(yīng)緩沖液加入孔中，反應(yīng)于37℃進行1小時。用含0.005％吐溫20的0.9％NaCl洗滌各孔5次；并用離子交換水洗滌2次。每孔中加入100μl含有0.2mg/mlN-四甲聯(lián)苯胺和0.01％過氧化氫的0.16M乙酸鈉緩沖液，pH5.5，并室溫下無光照反應(yīng)15分鐘。每孔中加入100μl1N硫酸以終止反應(yīng)，用吸收光度計測定波長450nm處的吸收值。圖18是根據(jù)Fas配體系列稀釋物測定值繪制標準曲線。該標準曲線用于計算每個標本的Fas配體濃度。圖19-22表示各組血清與時間相關(guān)的Fas配體濃度和其它項目(描述于BostonBiomedical各組血清所附的說明書中)的測定值。利用適合轉(zhuǎn)氨酶GPT(AutocellerGPT-2，DaiichiKagakuYakuhinK.K.)體外診斷的藥用試劑采用Hitachi自動分析儀7070(Hitachi，Ltd.)測定甲型和乙型肝炎患者的血清組的ALT值。在懷疑患原發(fā)性HIV感染的病人的各組血清中，F(xiàn)as配體值的增加見于感染的早期階段(圖19)?；技仔秃捅透窝椎牟∪说母鹘M血清被懷疑為原發(fā)性感染，并可見隨ALT值的增加Fas配體的濃度增加(圖20和22)。另一方面，乙型肝炎病人也估計是原發(fā)性感染的病例。然而，在此情況下，既未見ALT值的變化也未見Fas配體濃度的增加(圖21)。因此，結(jié)果表明在Fas配體和疾病的臨床狀況之間可能存在某種關(guān)系，并且Fas/Fas配體系統(tǒng)可能參與臨床疾病狀況的進展。施用抑制凋亡的抗Fas配體抗體很有可能對這些疾病是有效的。工業(yè)實用性根據(jù)本發(fā)明用抗Fas配體抗體測定人體液中Fas配體的方法，以及在這種測定方法中所用的抗體可被用來檢測與各種已表明有Fas配體參與的疾病有關(guān)的Fas配體數(shù)量的增加/減少或異常，因此本發(fā)明的測定方法和抗體可用以預(yù)測、檢測和診斷特定的疾病和它們的病理狀況，以及用于選擇適當?shù)闹委?，本發(fā)明的測定方法和抗體也有助于監(jiān)測，以及確定治療效果和已用Fas配體、Fas配體相關(guān)的物質(zhì)或影響Fas配體表達的試劑治療過的病人的預(yù)后。能夠調(diào)節(jié)Fas配體作用的抗體可被用來調(diào)節(jié)內(nèi)源性或外源性Fas配體誘導(dǎo)在體內(nèi)發(fā)生的凋亡，因此，該抗體可用于治療和診斷疾病。AIDS病毒感染的晚期所出現(xiàn)的免疫力的降低以及暴發(fā)性肝炎中的肝功能衰竭被認為是免疫細胞功能障礙以由于肝細胞凋亡所致的肝組織功能障礙的結(jié)果。在這些病理狀況下，有必要抑制Fas配體的作用從而預(yù)防細胞的凋亡。應(yīng)用抑制Fas配體誘導(dǎo)凋亡功能的抗Fas配體抗體應(yīng)有助于治療這些病理狀況。本發(fā)明的抗Fas配體中和抗體在低濃度表現(xiàn)出強烈的抑制凋亡的效果，因此，預(yù)期本發(fā)明的中和抗體在體內(nèi)低劑量使用時可獲得所需要的治療效果并抑制副作用。于是將可能獲得理想的高效性，安全性和成本。進一步說，本發(fā)明的抗Fas配體抗體有助于預(yù)防和治療推測與Fas配體/Fas抗體有關(guān)的疾病，比如與心臟梗死有關(guān)的再灌注紊亂，移植物抗宿主病(GVHD)，Cokitis潰瘍病(ulcerosa)，以及Crohn病。本發(fā)明的人源化的抗體用于對人治療時相對小鼠以及在某些情況下相對于嵌合抗體來說，具有至少3種潛在優(yōu)勢1)因為效應(yīng)部分是人的，它可以更好地與人免疫系統(tǒng)的其它部分發(fā)生相互作用(如，通過補體依賴的細胞毒(CDC)或抗體依賴的細胞毒(ADCC)更有效地破壞靶細胞。2)人免疫系統(tǒng)不應(yīng)將人源化抗體的框架區(qū)或C區(qū)識別為異物，因而針對這種注射抗體的抗體反應(yīng)應(yīng)小于針對完全為異源的小鼠抗體或部分異源的嵌合抗體的抗體反應(yīng)。3)據(jù)報道，當注射的小鼠抗體在人體內(nèi)循環(huán)時，其半衰期比天然存在的人抗體的半衰期短(ShawD.等《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol)138卷4534-4538頁(1987))。注射的人源化抗體的半衰期將可能有更類似于天然存在的人抗體，這允許給藥劑量和頻度更低。另一方面，增加Fas配體誘導(dǎo)的凋亡的抗Fas配體抗體可用于除去機體不需要的細胞。例如，如上面所述，AIDS病毒感染的細胞表達Fas抗原，因而，早期的AIDS可用這種抗Fas配體治療，從而人工增加Fas配體誘導(dǎo)的凋亡并在更早期階段除去感染的細胞。在其它自身免疫病中，通過人工增加Fas抗原介導(dǎo)的Fas配體誘導(dǎo)的凋亡，可除去自體抗原反應(yīng)性T細胞。根據(jù)Morimoto，H等(《癌癥研究》(CancerRes.)，53卷2591-2596頁，1993)報導(dǎo)，通過給予阿霉素和順氯氨鉑誘導(dǎo)Fas抗原介導(dǎo)的癌細胞凋亡能帶來協(xié)同抑癌效果，所以能增加Fas配體誘導(dǎo)的凋亡的抗Fas配體抗體也應(yīng)有助于治療癌癥。Fas配體本身對治療和研究的應(yīng)用應(yīng)該需要大量制備高純度的Fas配體蛋白質(zhì)。本發(fā)明的抗Fas配體抗體有助于純化這種Fas配體。本發(fā)明的抗Fas配體抗體尤其有助于活性Fas配體的特異性高效純化而不損害其活性，并且它是應(yīng)能作為重要治療試劑的活性Fas配體。序列表SEQIDNO1序列長度20序列類型氨基酸序列分子類型蛋白質(zhì)初始來源人序列SerLeuGluLysGlnIleGlyHisProSerProProProGluLysLys151015GluLeuArgLys20SEQIDNO2序列長度14序列類型氨基酸序列分子類型蛋白質(zhì)初始來源人序列LeuThrG1yLysSerAsnSerArgSerMetProLeuGluTrp1510SEQIDNO3序列長度13序列類型氨基酸序列分子類型蛋白質(zhì)初始來源人序列TrpGluAspThrTyrGlyIleValLeuLeuSerGlyVal1510SEQIDNO4序列長度11序列類型氨基酸序列分子類型蛋白質(zhì)初始來源人序列LeuValIleAsnGluThrGlyLeuTyrPheVal1510SEQIDNO5序列長度19序列類型氨基酸序列分子類型蛋白質(zhì)初始來源人序列ValTyrSerLysValTyrPheArgGlyGlnSerCysAsnAsnLeu151015ProLeuSerHisSEQIDNO6序列長度18序列類型氨基酸序列分子類型蛋白質(zhì)初始來源人序列LysValTyrMetArgAsnSerLysTyrProGlnAspLeuValMet151015MetGluGlySEQIDNO7序列長度16序列類型氨基酸序列分子類型蛋白質(zhì)初始來源人序列LysMetMetSerTyrCysThrThrGlyGlnMetTrpAlaArgSer151015SerSEQIDNO8序列長度11序列類型氨基酸序列分子類型蛋白質(zhì)初始來源人序列LeuValAsnPheGluGluSerGlnThrPhePhe1510SEQIDNO9序列長度179序列類型氨基酸序列分子類型蛋白質(zhì)初始來源人序列GlnLeuPheHisLeuGlnLysGluLeuAlaGluLeuArgGluSerThr151015SerGlnMetHisThrAlaSerSerLeuGluLysGlnIleGlyHisPro202530SerProProProGluLysLysGluLeuArgLysValAlaHisLeuThr354045GlyLysSerAsnSerArgSerMetProLeuGluTrpGluAspThrTyr505560GlyIleValLeuLeuSerGlyValLysTyrLysLysGlyGlyLeuVal65707580IleAsnGluThrGlyLeuTyrPheValTyrSerLysValTyrPheArg859095GlyGlnSerCysAsnAsnLeuProLeuSerHisLysValTyrMetArg100105110AsnSerLysTyrProGlnAspLeuValMetMetGluGlyLysMetMet115120125SerTyrCysThrThrGlyGlnMetTrpAlaArgSerSerTyrLeuGly130135140AlaValPheAsnLeuThrSerAlaAspHisLeuTyrValAsnValSer145150155160GluLeuSerLeuValAsnPheGluGluSerGlnThrPhePheGlyLeu161165170175TyrLysLeu179SEQIDNO10序列長度23序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列AspIleGlnMetThrGlnThrThrSerSerLeuSerAlaSerLeuGly151015AspArgValThrIleSerCys20SEQIDN011序列長度11序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列ArgAlaSerGlnAspIleSerAsnTyrLeuAsn1510SEQIDNO12序列長度15序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列TrpTyrGlnGlnLysProAspGlyThrValLysLeuLeuIleTyr151015SEQIDNO13序列長度7序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列TyrThrSerArgLeuHisSer15SEQIDNO14序列長度32序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列GlyValProSerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAsnTyrSer151015LeuThrIleSerAsnLeuGluGlnGlyAspIleAlaThrTyrPheCys202530SEQIDNO15序列長度9序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列GlnGlnGlySerThrLeuProTrpThr15SEQIDNO16序列長度10序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列PheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLys1510SEQIDNO17序列長度127序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列MetMetSerSerAlaGlnPheLeuGlyLeuLeuLeuLeuCysPheGln151015GlyThrArgCysAspIleGlnMetThrGlnThrThrSerSerLeuSer202530AlaSerLeuGlyAspArgValThrIleSerCysArgAlaSerGlnAsp354045IleSerAsnTyrLeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProAspGlyThrVal505560LysLeuLeuIleTyrTyrThrSerArgLeuHisSerGlyValProSer65707580ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAsnTyrSerLeuThrIleSer859095AsnLeuGluGlnGlyAspIleAlaThrTyrPheCysGlnGlnGlySer100105110ThrLeuProTrpThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLys115120125SEQIDNO18序列長度30序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列GlnIleGlnLeuValGlnSerGlyProGluLeuLysLysProGlyGlu151015ThrValLysIleSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThr202530SEQIDNO19序列長度5序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列GluTyrProMetHis15SEQIDNO20序列長度14序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列TrpValLysGlnAlaProGlyLysGlyPheLysTrpMetGly1510SEQIDNO21序列長度17序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列MetIleTyrThrAspThrGlyGluProSerTyrAlaGluGluPheLys151015GlySEQIDNO22序列長度32序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列ArgPheAlaPheSerLeuGluThrSerAlaSerThrAlaTyrLeuGln151015IleAsnPheLeuLysAsnGluAspThrAlaThrTyrPheCysValArg202530SEQIDNO23序列長度8序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列PheTyrTrpAspTyrPheAspTyr15SEQIDNO24序列長度11序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列TrpGlyGlnGlyThrThrLeuThrValSerSer1510SEQIDNO25序列長度136序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列MetAspTrpValTrpThrLeuLeuPheLeuIleAlaAlaAlaGlnSer151015AlaGlnAlaGlnIleGlnLeuValGlnSerGlyProGluLeuLysLys202530ProGlyGluThrValLysIleSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPhe354045ThrGluTyrProMetHisTrpValLysGlnAlaProGlyLysGlyPhe505560LysTrpMetGlyMetIleTyrThrAspThrGlyGluProSerTyrAla65707580GluGluPheLysGlyArgPheAlaPheSerLeuGluThrSerAlaSer859095ThrAlaTyrLeuGlnIleAsnPheLeuLysAsnGluAspThrAlaThr100105110TyrPheCysValArgPheTyrTrpAspTyrPheAspTyrTrpGlyGln115120125GlyThrThrLeuThrValSerSer130135SEQIDNO26序列長度23序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列AspIleGlnMetThrGlnSerProSerThrLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCys20SEQIDMO27序列長度11序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列ArgAlaSerGlnAspIleSerAsnTyrLeuAsn1510SEQIDNO28序列長度15序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列TrpTyrGlnGlnLysproGlyLysAlaProLysLeuLeuIleTyr151015SEQIDNO29序列長度7序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列TyrThrSerArgLeuHisSer15SEQIDNO30序列長度32序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列GlyValProSerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAsnTyrThr151015LeuThrIleSerSerLeuGlnProAspAspPheAlaThrTyrPheCys202530SEQIDNO31序列長度9序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列GlnGlnGlySerThrLeuProTrpThr15SEQIDNO32序列長度10序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列PheGlyGlnGlyThrLysValGluValLys1510SEQIDNO33序列長度127序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列MetGluThrAspThrLeuLeuLeuTrpValLeuLeuLeuTrpValPro151015GlySerThrGlyAspIleGlnMetThrGlnSerProSerThrLeuSer202530AlaSerValGlyAspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGlnAsp354045IleSerAsnTyrLeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaPro505560LysLeuLeuIleTyrTyrTnrSerArgLeuHisSerGlyValProSer65707580ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAsnTyrThrLeuThrIleSer859095SerLeuGlnProAspAspPheAlaThrTyrPheCysGlnGlnGlySer100105110ThrLeuProTrpThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluValLys115120125SEQIDNO34序列長度30序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列GlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlySer151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThr202530SEQIDNO35序列長度5序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列GluTyrProMetHis15SEQIDNO36序列長度14序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列TrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyPheLysTrpMetGly1510SEQIDNO37序列長度17序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列MetIleTyrThrAspThrGlyGluProSerTyrAlaGluGluPheLys151015GlySEQIDNO38序列長度32序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列ArgPheThrPheThrLeuAspThrSerThrAshThrAlaTyrMetGlu151015LeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyrTyrCysValArg202530SEQIDNO39序列長度8序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列PheTyrTrpAspTyrPheAspTyr15SEQIDN040序列長度11序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列TrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSer1510SEQIDNO41序列長度136序列類型氨基酸拓撲構(gòu)型線性序列分子類型蛋白質(zhì)序列MetAspTrpValTrpThrLeuLeuPheLeuIleAlaAlaAlaGlnSer151015AlaGlnAlaGlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLys202530ProGlySerSerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPhe354045ThrGluTyrProMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyPhe505560LysTrpMetGlyMetIleTyrThrAspThrGlyGluProSerTyrAla65707580GluGluPheLysGlyArgPheThrPheThrLeuAspThrSerThrAsn859095ThrAlaTyrMetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaVal100105110TyrTyrCysValArgPheTyrTrpAspTyrPheAspTyrTrpGlyGln115120125GlyThrLeuValThrValSerSer13013權(quán)利要求1.一種抗Fas配體抗體，其為抑制Fas抗原表達細胞的Fas配體誘導(dǎo)的凋亡的中和抗體，抑制率50％或更高。2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗Fas配體抗體，其為抑制Fas抗原表達細胞的Fas配體誘導(dǎo)的凋亡的中和抗體，濃度為1μg/ml時，抑制率為50％或更高。3.一種抗Fas配體抗體，其為與具有凋亡誘導(dǎo)活性的Fas配體發(fā)生反應(yīng)而不與沒有凋亡誘導(dǎo)活性的Fas配體發(fā)生反應(yīng)的中和抗體。4.根據(jù)權(quán)利要求1到3任一項的抗Fas配體抗體，其為以至少107M-1的親和常數(shù)與人Fas配體結(jié)合的中和抗體。5.根據(jù)權(quán)利要求1到4任一項的抗Fas配體抗體，其為包括至少一個含有示于圖10或圖11中序列鑒定號11、13、15、19、21和23的氨基酸序列的互補決定區(qū)(CDRs)的中和抗體。6.一種特異性與選自序列表中序列鑒定號1到8的氨基酸序列的一段肽發(fā)生反應(yīng)的抗Fas配體抗體。7.根據(jù)權(quán)利要求6的抗Fas配體抗體，其特異性與序列表中序列鑒定號1的肽發(fā)生反應(yīng)，而不與序列表中序列鑒定號2到8的肽發(fā)生反應(yīng)。8.根據(jù)權(quán)利要求6的抗Fas配體抗體，其特異性與序列表中序列鑒定號6的肽發(fā)生反應(yīng)，而不與序列表中序列鑒號1到5和序列鑒定號7到8的肽發(fā)生反應(yīng)。9.一種屬于人源化免疫球蛋白(Ig)的抗Fas配體抗體，包括人受者的框架區(qū)(FR)和特異性與人Fas配體結(jié)合的非人供者Ig來源的CDR。10.根據(jù)權(quán)利要求1到8任一項的抗Fas配體抗體，它是一種人源化免疫球蛋白(Ig)，包括人受者的框架區(qū)(FR)和特異性與人Fas配體結(jié)合的非人供者Ig來源的CDR。11.根據(jù)權(quán)利要求9或10的抗Fas配體抗體，其為抑制Fas抗原表達細胞的Fas配體誘導(dǎo)的凋亡的中和抗體。12.根據(jù)權(quán)利要求9到11任一項的抗Fas配體抗體，其中人源化免疫球蛋白重鏈可變區(qū)框架氨基酸序列65％或65％以上等同于但95％或95％以下等同于供者免疫球蛋白重鏈可變區(qū)框架的氨基酸序列。13.根據(jù)權(quán)利要求9到12任一項的抗Fas配體抗體，其中受者免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的氨基酸序列在與供者免疫球蛋白重鏈可變區(qū)氨基酸序列最為同源的人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)代表性序列庫的5段序列中。14.根據(jù)權(quán)利要求9到13任一項的抗Fas配體抗體，其中所說的人源化免疫球蛋白包括取代受者免疫球蛋白重鏈或輕鏈框架中相應(yīng)氨基酸的供者免疫球蛋白的氨基酸以及下述的每一個氨基酸(i)與供者免疫球蛋白氨基酸序列中的CDR緊密相鄰的已測序的氨基酸，或(ii)含有一個與所說的人源化免疫球蛋白或供者免疫球蛋白的CDR的距離在大約5埃之內(nèi)的原子。15.一種測定Fas配體的方法，其中一種抗Fas配體抗體被用于人體液中Fas配體的測定。16.一種測定Fas配體的方法，其中根據(jù)權(quán)利要求1到8任一項的抗Fas配體抗體被用于人體液中Fas配體的測定。17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的測定Fas配體的方法，其中測定出人體液中Fas配體量的增加或減少從而預(yù)測、檢測或診斷Fas抗原/Fas配體系統(tǒng)的功能障礙，與這種功能障礙有關(guān)的疾病，或這種疾病的病理學(xué)。18.根據(jù)權(quán)利要求17的測定方法，其中所述的疾病至少是選自乙型肝炎、丙型肝炎和HIV感染的一種疾病。19.根據(jù)權(quán)利要求15到17任一項的測定方法，其中所說的測定是通過夾心法進行的。20.根據(jù)權(quán)利要求15到19任一項的測定方法，其中所說的抗Fas配體抗體是根據(jù)權(quán)利要求1到8任一項的抗Fas配體抗體。21.根據(jù)權(quán)利要求15到20任一項的測定方法，其中組合應(yīng)用根據(jù)權(quán)利要求1到5任一項的相同類型或不同類型的兩種或更多種抗Fas配體的中和抗體。22.根據(jù)權(quán)利要求15到20任一項的測定方法，其中組合應(yīng)用根據(jù)權(quán)利要求6到8任一項的相同類型或不同類型的兩種或更多種抗Fas配體抗體。23.根據(jù)權(quán)利要求15到20任一項的測定方法，其中根據(jù)權(quán)利要求1到5任一項的一種或多種抗Fas配體抗體與根據(jù)權(quán)利要求6到8任一項的一種或多種抗Fas配體抗體組合應(yīng)用。24.根據(jù)權(quán)利要求21的測定方法，其中登記號為FERMBP-5535的雜交瘤所產(chǎn)生的單克隆抗體F919-9-18和特異性與序列表中序列鑒定號1的肽發(fā)生反應(yīng)的單克隆抗體組合應(yīng)用。25.能分泌根據(jù)權(quán)利要求1到14任一項的抗體的雜交瘤或細胞系。26.根據(jù)權(quán)利要求25的雜交瘤，其中所說的雜交瘤是登記號為FERMBP-5533、FERMBP-5534或FERMBP-5535的雜交瘤。27.一種包含根據(jù)權(quán)利要求1到14任一項的抗Fas配體抗體的組合物。28.一種治療伴隨、起因于或涉及Fas/Fas配體系統(tǒng)異?；騀as抗原誘導(dǎo)的凋亡異常的全身性或局部性病理狀況或疾病的方法，包括給病人使用治療有效量的能抑制Fas抗原表達細胞發(fā)生Fas配體誘導(dǎo)的凋亡的抗Fas配體抗體。29.一種測定人體液中Fas配體量的試劑或試劑盒，它包括根據(jù)權(quán)利要求1到14任一項的抗Fas配體抗體。30.通過根據(jù)權(quán)利要求15到21任一項的方法測定人體液中Fas配體量的試劑或試劑盒，它包括抗Fas配體抗體作為必要成分。全文摘要本發(fā)明涉及抗Fas配體抗體和利用Fas配體抗體的測定方法。更具體地講,本發(fā)明涉及應(yīng)用一種抗Fas配體抗體來測定人體液中Fas配體的方法和適合用于這種測定的抗體。本發(fā)明也涉及高度抑制Fas配體誘導(dǎo)的凋亡的抗Fas配體抗體。本發(fā)明還涉及能分泌這種抗體的雜交瘤或細胞系。本發(fā)明的一個目的是提供抗Fas配體抗體和利用這種抗體的測定方法,更具體地說是利用抗Fas配體抗體測定人體液中Fas配體的方法和適合用于這種測定方法的抗體。本發(fā)明的另一目的是提供高度,比如50%或更高,抑制Fas配體所誘導(dǎo)的凋亡的抗Fas配體抗體,以及屬于人源化抗體的上述抗體。本發(fā)明的再一目的是提供能分泌這種抗體的雜交瘤和細胞系。更進一步,本發(fā)明也提供包含至少一種本發(fā)明的上述抗Fas配體抗體作為不可缺少的成分或活性成分的新型組合物或藥劑,以及治療伴隨,起因于或涉及Fas/Fas配體系統(tǒng)異?；蛲ㄟ^Fas抗原誘導(dǎo)的凋亡異常的全身性或局部性病理狀況或疾病的方法,也涉及給病人注射治療有效的抗Fas配體抗體以抑制Fas抗原表達細胞發(fā)生凋亡。文檔編號C07K16/28GK1196733SQ96196690公開日1998年10月21日申請日期1996年7月1日優(yōu)先權(quán)日1995年6月30日發(fā)明者白川嘉門,松末朋和,長田重一,M·S·寇,M·巴斯克斯申請人:持田制藥株式會社,財團法人大阪生物科學(xué)研究所