專利名稱：通過檢測kras突變和rtk表達(dá)水平來測定細(xì)胞對b-raf抑制劑治療的敏感性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥診斷和治療，且具體而言，涉及檢測診斷和/或預(yù)后性的突變或RTK過表達(dá)及將所述檢測與癌癥治療聯(lián)系起來。發(fā)明背景
受體酪氨酸激酶(RTK)及其配體是腫瘤細(xì)胞増殖、血管發(fā)生、和轉(zhuǎn)移的重要調(diào)節(jié)物。例如，RTK 的 ErbB 家族包括 EGFR (HER1 和 ErbBl)、HER2 (neu 或 ErbB2)、HER3 (ErbB3)、和HER4 (ErbB4)，并且具有獨(dú)特的配體結(jié)合和信號傳導(dǎo)活性。結(jié)合ErbB受體的配體包括表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子a(TGFa)、肝素結(jié)合EGF樣配體(HB-EGF)、雙調(diào)蛋白(amphiregulin, AR)、3 細(xì)胞調(diào)節(jié)素(betacellulin, BTC)、上皮調(diào)節(jié)蛋白(epiregulin, EPR)、Epigen (EPG)、調(diào)蛋白(heregulin, HRG)、和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(neuregulin, NRG)。這些配體直接結(jié)合EGFR、HER3、或HER4，并且觸發(fā)多種下游信號傳導(dǎo)級聯(lián)，包括RAS-ERK和P13K-Akt途徑。EGF和其它生長因子和細(xì)胞因子，諸如血小板衍生的生長因子O3DGF)經(jīng)由Ras發(fā)信號。Ras突變以其活性的、GTP結(jié)合的狀態(tài)永久地鎖定Ras (ffislez, M %= , Cancer Drug Discovery and Development:EGFR Signaling Networksin Cancer Therapy, J. D. Haley 和 WJ. Gullick編，HumanaPress,第 89 頁-第 95 頁，2008)。MET是另ー種RTK，其被其配體肝細(xì)胞生長因子(HGF)的活化誘導(dǎo)MET激酶催化活性，這觸發(fā)酪氨酸Tyr 1234和Tyr 1235的轉(zhuǎn)磷酸化。這兩個酪氨酸銜接各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物，如此啟動由MET驅(qū)動的生物學(xué)活性的全譜。HGF誘導(dǎo)持續(xù)的RAS激活，并且如此延長MAPK活性。K-ras是在多種癌癥中經(jīng)歷突變的ras基因之一。密碼子12和13處的K_ras基因突變參與腫瘤發(fā)生，其導(dǎo)致對P21-ras蛋白，即ー種K-ras基因產(chǎn)物的功能修飾，導(dǎo)致將過多的生長信號轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核以刺激細(xì)胞生長和分裂。因此，已經(jīng)廣泛使用K-ras基因突變的鑒定作為癌癥診斷，例如胰腺、結(jié)腸直腸和非小細(xì)胞肺癌中的有用工具，并且研究已經(jīng)提不了，它可能與一些腫瘤表型有關(guān)(Samowitz W S等，Cancer Epidemiol. BiomarkersPrev. 9:1193-1197, 2000 ；Andreyev H J等，Br. J. Cancer 85:692-696, 2001 ;及Brink M等,Carcinogenesis24:703-710, 2003)。Ras在致癌性轉(zhuǎn)化和發(fā)生中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。致癌性H-、K-、和N-Ras源自限于少數(shù)位點(diǎn)(氨基酸12、13、59和61)的點(diǎn)突變。與正常的Ras不同，致癌性ras蛋白缺乏固有的GTP酶活性，并且因此保持組成性活化的(Trahey，M.和McCormick，F(xiàn). (1987)Science 238:542-5 ;Tabin, C. J.等(1982)Nature. 300:143-9 ；Taparowsky, E.等(1982)Nature. 300:762-5)。人癌癥中的致癌性 ras 參與估計為 30%(Almoguera, C.等(1988)Cell.53:549-54)。突變經(jīng)常僅限于ras基因之一，并且頻率是組織和腫瘤類型特異性的。K_ras是人癌癥中的最常見突變的癌基因，尤其是密碼子12突變。雖然已經(jīng)在30%的人癌癥中觀察到源自單ー核苷酸替代的H-、K-、和N-Ras的致癌性活化(Bos, J. L. (1989)CancerRes 49, 4682-9),但是超過90%的人胰腺癌表明密碼子12K_ras突變(Almoguera, C.等(1988)Cell 53, 549-54 ；Smit, V. T.等(1988)Nucleic Acids Res 16, 7773-82 ；Bos, J.L. (1989)Cancer Res 49,4682-9)。胰管腺癌，即最常見的胰腺癌以其快速發(fā)作和對治療的抗性而出名。人胰腺腫瘤中的K-ras突變的高頻率提示了組成性Ras活化在胰腺腫瘤發(fā)生期間發(fā)揮至關(guān)重要的作用。外分泌胰腺腺癌占據(jù)西方國家的癌癥相關(guān)死亡率的第四位原因。治療已經(jīng)獲得有限的成功，并且五年存活仍然小于5%，其中具有手術(shù)不可切除的腫瘤的患者具有4個月的平均存活(Jemal, A等(2002) CA Cancer J Clin 52, 23-47 ；Burris, H. A.，3rd 等(1997) J Clin Oncol 15,2403-13)。此點(diǎn)突變可以在正常的立方 胰管上皮進(jìn)展成平坦的增生性損傷時在疾病過程早期鑒定，并且認(rèn)為在胰腺癌的發(fā)病機(jī)制中成為原因(Hruban, R. H.等(2000)Clin Cancer Res 6, 2969-72 ；Tada, M.等(1996)Gastroenterology 110, 227-31)。然而,人胰腺癌中的致癌性K_ras信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)很大程度上仍然未知。K-ras突變存在于50%的結(jié)腸和肺癌中(Bos, J. L.等(1987)Nature. 327:293-7;Rodenhuis, S.等(1988)Cancer Res. 48:5738-41)。在泌尿道和膀胱癌中，突變主要在 H_ras 基因中(Fuita, J.等(1984)Nature. 309:464-6 ；Visvanathan, K.V.等(1988)Oncogene Res. 3:77-86)。N_ras基因突變存在于30%的白血病和肝癌中。約25%的人皮膚損傷牽涉Ha-Ras突變(對于鱗狀細(xì)胞癌為25%，而對于黑素瘤為28%)(Bos, J. L. (1989) Cancer Res. 49:4683-9 ;Migley, R. S和Kerr, D. J. (2002) Crit Rev OncolHematoI. 44:109-20)。50-60%的甲狀腺癌在具有所有三種基因中的突變方面是獨(dú)特的(Adjei, A.A. (2001)JNatl Cancer Inst. 93:1062-74)?？梢越?jīng)由致癌性突變或者經(jīng)由超活化的生長因子受體諸如EGFR來實(shí)現(xiàn)Ras的組成性活化。EGFR家族成員，尤其是EGFR和HER2的表達(dá)和/或擴(kuò)增升高已經(jīng)牽涉各種形式的人惡性腫瘤(如綜述于 Prenzel, N.等(2001) Endocr Relat Cancer. 8:11-31 的)。在這些癌癥中的ー些(包括胰腺、結(jié)腸、膀胱、肺)中，EGFR/HER2過表達(dá)由于致癌性Ras突變的存在而增加(compound)。腫瘤中的這些受體的異?；罨梢詺w因于過表達(dá)、基因擴(kuò)增、組成性激活突變或自分泌生長因子環(huán)(Voldborg, B. R.等(1997)Ann Oncol. 8:1197-206)。對于生長因子受體，尤其是EGFR，這些受體的擴(kuò)增或/和過表達(dá)經(jīng)常在乳腺、卵巣、胃、食管、胰腺、肺、結(jié)腸癌和成神經(jīng)細(xì)胞瘤中發(fā)生。RAS-MAPK信號傳導(dǎo)途徑控制細(xì)胞生長、分化和存活?；诖诵盘杺鲗?dǎo)途徑在調(diào)節(jié)來自廣譜人腫瘤的細(xì)胞的生長和存活中的中心作用，它長期被視為ー種用于抗癌療法的有吸引力的途徑，并且此信號傳導(dǎo)途徑的組分中的突變成為哺乳動物細(xì)胞中腫瘤啟動的基礎(chǔ)(Sebolt-Leopold 等(2004)Nat Rev Cancer 4, pp 937-47)。RAS-MAPK信號傳導(dǎo)途徑受多種胞外信號(激素和生長因子)激活，所述胞外信號通過用GTP交換⑶P來激活RAS。然后，Ras將RAF募集至質(zhì)膜，在那里發(fā)生其活化。如上文所記錄的，導(dǎo)致組成性活化的信號傳導(dǎo)途徑組分中的突變成為哺乳動物細(xì)胞中腫瘤啟動的基礎(chǔ)。例如，生長因子受體，諸如表皮生長因子受體(EGFR)在許多癌癥(占非小細(xì)胞肺癌的多至25%和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的60%)中進(jìn)行擴(kuò)增和突變。Braf也經(jīng)常突變，特別地在黑素瘤(約70%的病例)和結(jié)腸癌(約15%的病例)中。此外，ras是最常突變的癌基因，在所有人癌癥的約30%中發(fā)生。突變的ras基因(H-ras、K_ras或N_ras)的頻率和類型隨腫瘤類型而廣泛變化。然而，K-ras是最常突變的基因，在胰腺癌(約90%)和結(jié)腸直腸癌(約45%)中檢出最高的發(fā)生率。這使其及所述信號傳導(dǎo)途徑的其它組分成為ー種適合于抗癌療法的靶物。實(shí)際上，為了靶向此途徑的各個步驟而設(shè)計的小分子量抑制劑已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。此夕卜，針對腎細(xì)胞癌最近已經(jīng)批準(zhǔn)索拉非尼(soragenib) (Nexavar. RTM. , Bayer HealthCarePharmaceuticals),即ー種導(dǎo)致RAS信號傳導(dǎo)抑制的RAF-激酶抑制劑。遵循這些數(shù)據(jù),在靶向RAS-MAPK途徑以開發(fā)改良的癌癥療法方面仍然有高水平的興趣。RAS-MAPK信號傳導(dǎo)途徑受多種胞外信號(激素和生長因子)激活，所述胞外信號通過用GTP交換⑶P來激活RAS。然后，Ras將RAF募集至質(zhì)膜，在那里發(fā)生其活化。如上文所記錄的，導(dǎo)致組成性激活的信號傳導(dǎo)途徑組分中的突變成為哺乳動物細(xì)胞中腫瘤啟動的基 礎(chǔ)。例如，生長因子受體，諸如表皮生長因子受體(EGFR)在許多癌癥(占非小細(xì)胞肺癌的多至25%和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的60%)中進(jìn)行擴(kuò)增和突變。Braf也經(jīng)常突變，特別地在黑素瘤(約70%的病例)和結(jié)腸癌(約15%的病例)中。此外，ras是最常突變的癌基因，在所有人癌癥的約30%中發(fā)生。突變的ras基因(H-ras、K_ras或N_ras)的頻率和類型隨腫瘤類型而廣泛變化。然而，K-ras是最常突變的基因，在胰腺癌(約90%)和結(jié)腸直腸癌(約45%)中檢出最高的發(fā)生率。這使其及所述信號傳導(dǎo)途徑的其它組分成為ー種適合于抗癌療法的靶物。實(shí)際上，為了靶向此途徑的各個步驟而設(shè)計的小分子量抑制劑已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。此外，針對腎細(xì)胞癌最近已經(jīng)批準(zhǔn)索拉非尼(Nexavar. RTM.，Bayer HealthCare Pharmaceuticals),即ー種導(dǎo)致RAS信號傳導(dǎo)抑制的RAF-激酶抑制劑。遵循這些數(shù)據(jù)，在靶向RAS-MAPK途徑以開發(fā)改良的癌癥療法方面仍然有高水平的興趣。如Downward, J. (2002) Nature Reviews Cancer,第 3卷，第 11 頁-第 22 頁中所描述的，RAS蛋白是低分子量GTP結(jié)合蛋白大型超家族的成員，其可以依照序列保守程度分成幾個家族。不同家族對于不同細(xì)胞過程是重要的。例如，RAS家族控制細(xì)胞生長，而RHO家族控制肌動蛋白細(xì)胞骨架。常規(guī)地，RAS家族被描述為由三個成員H-、N-和K-RAS組成，其中 K-RAS 生成主要(4B)和次要(4A)剪接變體(Ellis, C. A 和 Clark, G. (2000) CellularSignalling, 12:425-434)。發(fā)現(xiàn)人腫瘤中RAS家族成員通過突變而活化，并且具有有力的轉(zhuǎn)化潛力。RAS成員是極其緊密相關(guān)的，具有85%氨基酸序列同一性。雖然RAS蛋白以非常相似的方式發(fā)揮功能，但是它們間細(xì)微差異的一些指標(biāo)最近已經(jīng)眾所周知。H-ras、K-ras和N-ras蛋白被廣泛表達(dá)，其中K-ras在幾乎所有的細(xì)胞類型中表達(dá)。敲除研究已經(jīng)顯示了単獨(dú)或組合的H-ras和N-ras不是小鼠中的正常發(fā)育需要的，而K-ras是至關(guān)重要的(Downward, J. (2002)在第 12 頁)。此外，如Downward, J. (2002)中所描述的，經(jīng)由RAS途徑的異常信號傳導(dǎo)由于腫瘤細(xì)胞中的幾種不同類突變性損傷而發(fā)生。這些突變最明顯的是在ras基因自身中。約20%的人腫瘤具有ras中，最經(jīng)常地K-ras (占總共的約85%),然后是N_ras (約15%),然后是H-ras(小于1%)中的激活性點(diǎn)突變。這些突變都危害RAS的GTP酶活性，阻止GAP促進(jìn)RAS上的GTP水解，并且因此引起RAS以GTP結(jié)合的活性形式積累。腫瘤中的幾乎所有RAS活化由密碼子12、13和61中的突變造成(Downward, J. (2002)在第15頁)。若可以使癌癥治療適應(yīng)特定的癌癥，則會是有用的。特別地，本發(fā)明提供了ー種測定某些批準(zhǔn)的且可得的治療是否仍然不會對特定類型的癌癥有益的手段。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于鑒定對B-Raf 抑制劑治療不易感的腫瘤的預(yù)后方法，其通過檢測K-ras基因或蛋白中的突變來進(jìn)行。該方法牽涉測定樣品中突變的K-ras基因或蛋白的存在或缺乏，由此鑒定不響應(yīng)B-Raf抑制劑治療的腫瘤。還公開了用于實(shí)施所述方法的試劑盒。在另一方面，本發(fā)明涉及用于鑒定對B-Raf 抑制劑治療不易感的腫瘤的預(yù)后方 法，其通過檢測RTK的異常表達(dá)水平來進(jìn)行。該方法牽涉測定樣品中某些RTK的表達(dá)水平，由此RTK的過表達(dá)與對B-Raf抑制劑治療的非響應(yīng)性相關(guān)聯(lián)。與B-Raf治療的響應(yīng)性相關(guān)聯(lián)的RTK的例子包括但不限于EGFR和cMet。該方法還牽涉測定樣品中某些RTK配體的誘導(dǎo)水平，由此異常高水平的配體誘導(dǎo)與對B-Raf抑制劑治療的非響應(yīng)性相關(guān)聯(lián)。與B-Raf治療的響應(yīng)性相關(guān)聯(lián)的配體的例子包括但不限于EGF和HGF。所述方法還牽涉測定樣品中Ras-GTP的水平，由此異常高水平的Ras-GTP與對B-Raf抑制劑治療的非響應(yīng)性相關(guān)聯(lián)。還公開了用于實(shí)施所述方法的試劑盒。在另一方面，本發(fā)明涉及治療不響應(yīng)B-Raf 抑制劑治療的腫瘤的方法。該方法包括與EGFR抑制劑組合施用B-Raf抑制劑。附圖簡述圖I描繪了生物化學(xué)酶測定法數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)顯示了在生理學(xué)[ATP]時，僅⑶C-0879維持針對B-Rafv_E和WT Raf同等型兩者的有效效カ。圖2描繪了不同Raf/Ras突變狀態(tài)的腫瘤系中的存活力測定法。圖3描繪了僅在非B_RafV6°°E系中Raf抑制劑的持續(xù)pMEK誘導(dǎo)。相對于抑制劑針對WT Raf的IC5Q，pMEK水平達(dá)到平臺。圖4描繪了 C-Raf是主要負(fù)責(zé)非B_Rafv_E系中Raf抑制劑的pMEK誘導(dǎo)的Raf同等型。圖5描繪了僅在非B_RafV6°°E系中由兩種抑制劑誘導(dǎo)的C-Raf特異性活性。在Raf誘導(dǎo)條件下沒有Sprouty水平的降低。圖6描繪了沒有pERK水平的誘導(dǎo)。抑制劑的相對效カ與其生物化學(xué)IC5tl相關(guān)聯(lián)。圖7描繪了基礎(chǔ)條件下對pMEK水平的鐘形影響。⑶C-0879的抑制效果在血清刺激后占優(yōu)勢。圖8A描繪了 BRAF途徑抑制的持續(xù)時間和程度決定原發(fā)性人腫瘤異種移植物模型中的B-Raf抑制劑⑶C-0879功效。Kaplan-Meier圖顯示了每天用100mg/kg ( C-0879或媒介物處理的患者衍生的黑素瘤和非小細(xì)胞肺癌腫瘤模型的腫瘤加倍前時間。標(biāo)示BRAF、N-ras和K-ras的基因型。對MEXF 989、MEXF 276、和MEXF 355腫瘤記錄到腫瘤進(jìn)展中的統(tǒng)計學(xué)顯著性(P〈0. 05)延遲。⑶C-0879施用顯著加速ー些K-ras突變體非小細(xì)胞肺癌，諸如 LXFA 1041 和 LXFA 983 的生長。
圖8B描繪了⑶C-0879處理下調(diào)BRAFv6qcie原發(fā)性人異種移植物腫瘤中的ERK1/2磷酸化。在時間過程藥效學(xué)研究中，將小鼠用100mg/kg⑶C-0879處理，并在最后ー劑(第21天-第24天)后I或8小時處死。顯示了磷酸化的和總的ERK1/2的免疫印跡。持續(xù)到8小時的有力的磷酸-ERK1/2抑制與BRAFv6toe狀態(tài)和⑶C-0879抗腫瘤功效強(qiáng)烈相關(guān)聯(lián)。在所有樣品中檢查總的ERK1/2表達(dá)作為加載對照。圖9A、B、C和D描繪了 K_ras突變體腫瘤細(xì)胞系在體內(nèi)和在體外顯示對⑶C-0879RAF和MEK抑制劑的不同敏感性。A和B，對MEK，而不是RAF的抑制阻止K-RAS突變體HCT116腫瘤的體內(nèi)生長。在腫瘤達(dá)到約200mm3時將小鼠隨機(jī)化，并用100mg/kg⑶C-0879(A)或25mg/kgMEK抑制劑(MEKInh;B)按每日日程表啟動處理。點(diǎn)，均值；柱，SE。C，顯示了 130種細(xì)胞系的⑶C-0879EC5(i值作為BRAF和K-RAS突變狀態(tài)的函數(shù)。⑶C-0879介導(dǎo)的對細(xì)胞生長的抑制與BRAF突變強(qiáng)烈相關(guān)聯(lián)。D，依照基因型組織MEK抑制劑EC5tl值的點(diǎn)圖。MEK抑制對顯著分?jǐn)?shù)的表達(dá)野生型BRAF的細(xì)胞系也是有力的。數(shù)據(jù)代表一式四份測量的均值。


圖10-18描繪了用⑶C-0879劑量給藥后肺腫瘤異種移植物中的生長。圖19A和B描繪了 Raf抑制劑在非B-RAFV600E細(xì)胞中誘導(dǎo)野生型RAF向質(zhì)膜的 RAS 依賴性移位。(A)將 MeWo (RAS/RAFWT)細(xì)胞用 GDC-0879 (2-{4_[ (IE)-I-(羥基亞氨基)-2，3- ニ氫-IH-卻-5-基]-3-(吡啶-4-基)-IH-吡唑-I-基}乙-ト醇)、PLX4720(N-[3-[(5-氯-IH-吡咯并[2，3_b]吡啶 _3_ 基)羰基]-2，4-ニ氟苯基]-1-丙磺酰胺)或八2-628(3-(2-氰基丙-2-基),-(4-甲基-3-(3-甲基-4-氧-3，4-ニ氫喹唑啉-6-基氨基)苯基)苯甲酰胺)(均為0. I、I、IOmM)處理I小吋，并分級成膜(P100)和胞質(zhì)(S100)級分。用指定的抗體對膜和胞質(zhì)級分的等分試樣進(jìn)行免疫印跡。(B)用Venus-C-RAF (綠色)、CFP-K-RAS (紅色)和 mCherry_H2B (藍(lán)色)瞬時轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞。加Venus標(biāo)簽的C-RAF與CFP-KRAS在細(xì)胞中的質(zhì)膜上共定位，所述細(xì)胞用IOmM⑶C-0879或AZ-628處理4小時，接著使用共焦熒光顯微術(shù)進(jìn)行活細(xì)胞成像。在替代KRASWT轉(zhuǎn)染顯性負(fù)性加CFP標(biāo)簽的KRASS17N (右側(cè)小圖)時阻斷膜移位。圖20A、B、C和D描繪了活性Ras在RAF抑制劑的C-RAF活化和磷酸-MEK誘導(dǎo)中發(fā)揮的作用的重要性。(A)將A375 (B-RAFV600E)細(xì)胞用⑶C-0879或PLX4720處理I小時，并在低滲緩沖液中裂解以進(jìn)行膜分級。用指定的抗體將膜(P100)和胞質(zhì)(S 100)級分兩者進(jìn)行免疫印跡。(B)將MeWo細(xì)胞用KRASWT或KRASS17N瞬時轉(zhuǎn)染，用⑶C-0879或PLX4720 (為0. l、l、10mM)處理I小吋，并分級成膜(P100)和胞質(zhì)(S100)級分。用抗磷酸和抗總MEK抗體將膜和胞質(zhì)級分的等分試樣進(jìn)行免疫印跡。(C)使用固定化的C-RAF-RBD作為誘餌來捕捉 RAS-GTP，用 Ras-GTP ELISA 方案自 MeWo (RAS/RAFWT)、A375 (B-RAFV600E)和H2122 (KRASMT)細(xì)胞溶胞物測量RAS-GTP水平。相對發(fā)光單位代表結(jié)合RBD的抗RAS抗體的 RAS 檢測。RAS-GTPH2122 Mewo>A375。(D) A375 (B-RAFV600E)細(xì)胞中的突變體KRASGl2D(而不是KRASWT)的轉(zhuǎn)染容許細(xì)胞在存在RAF抑制劑⑶C-0879 (以0. I、I、IOmM給藥)的情況中誘導(dǎo)B-RAF = C-RAF異ニ聚體和C-RAF激酶活化。自對照和經(jīng)抑制劑處理的細(xì)胞免疫沉淀C-RAF，并測定蛋白質(zhì)活性和B-RAF異ニ聚化。通過免疫沉淀物中的WB顯示的總C-RAF水平指示每道的加載。圖21A、B、C和D描繪了測量B_RafV600E和WT B-Raf細(xì)胞系中Raf抑制劑的基礎(chǔ)的和EGF刺激的pERK敲低。(A)測試的系中的基因型和EGFR水平的表。(B)測量基礎(chǔ)的和刺激的PERK水平用無血清培養(yǎng)基中的0. 0004-10mM化合物處理細(xì)胞I小吋。對于刺激，添加20ng/ml EGF, 5分鐘之后，將細(xì)胞裂解。將溶胞物轉(zhuǎn)移至MSD板，其中測量磷酸和總ERK水平。(C)對兩種Raf抑制劑(CHR-265，I-甲基-5-[[2_[5_(三氟甲基)-IH-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧基]-N-[4-(三氟甲基)苯基]-IH-苯并咪唑-2-胺和⑶C-0879)在基礎(chǔ)的和EGF刺激的條件下將pERK IC50數(shù)據(jù)繪圖。(D)用Raf抑制劑處理指定的WTB-Raf系I小時后的pERK誘導(dǎo)的劑量響應(yīng)曲線。圖22A和B描繪了 EGF刺激使得B-RAF V600E突變體細(xì)胞系的磷酸-MEK水平和細(xì)胞增殖對RAF抑制劑有抗性。(A)將細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基中的0. 0004-10mM化合物處理I小吋。對于刺激，添加20ng/ml EGF, 5分鐘之后，將細(xì)胞裂解。將溶胞物轉(zhuǎn)移至MSD板，其中測量磷酸和總ERK水平。在基礎(chǔ)的和EGF刺激的條件下對指定的兩種Raf抑制劑將磷酸MEK(pMEK) IC50數(shù)據(jù)繪圖。⑶C-0879在敲低磷酸-MEK水平方面更有效，因?yàn)樗萈LX4720具有更低的針對野生型C-RAF和B-RAF同等型的調(diào)整的IC50。(B)EGF處理使B-RAFV600E細(xì)胞對RAF抑制劑有抗性，但是與Tarceva (或MEK抑制劑，例如ro-0325901)的組合克服 所述抗性。在存在培養(yǎng)基中的20ng/ml EGF的情況中單獨(dú)或組合地用指定的抑制劑對細(xì)胞給藥。圖23描繪了 EGF刺激在B-RAFV600E突變體系(L0X，888是黑素瘤，而HT29是結(jié)腸)中誘導(dǎo)B-RAF和C-RAF活性。所有細(xì)胞系都表達(dá)表面EGFR水平。888就B-RAF V600E等位基因而言是純合的，所有其它細(xì)胞系是雜合的，因此也攜帯野生型B-RAF等位基因。雜合細(xì)胞系誘導(dǎo)B-RAF和C-RAF活性兩者，而純合系僅誘導(dǎo)C-RAF活性。此野生型RAF活性不可被B-RAF V600E選擇性RAF抑制劑抑制，因此EGF的磷酸-MEK誘導(dǎo)水平對這些系中的RAF抑制有抗性，而由B-RAF V600E驅(qū)動的內(nèi)源磷酸MEK水平對B-RAF V600E選擇性RAF抑制劑敏感。圖24描繪了高EGF mRNA水平(x軸)和RAF抑制劑IC50 (uM，在y軸中)間負(fù)相關(guān)的趨勢。對B-RAF V600E黑素瘤細(xì)胞系顯示了細(xì)胞功效數(shù)據(jù)，并且其代表對B-RAF V600E同等型生物化學(xué)選擇性且針對野生型RAF同等型具有較低的相應(yīng)生物化學(xué)和細(xì)胞效力的RAF抑制劑。圖25描繪了各種腫瘤類型中的RAS-GTP水平。RAS-GTP水平在K-RASwt腫瘤中較低，而在攜帶突變的K-RAS的腫瘤，例如H2122腫瘤中較高。通過RBD-Elisa測定法測定Ras-GTP 水平。圖26描繪了在B-Raf V600E細(xì)胞中在有(+EGF)和沒有(NI)EGF誘導(dǎo)的情況中的Ras-GTP水平。EGF刺激提高BRAF V600E細(xì)胞中的Ras-GTP水平。圖27描繪了在B-Raf V600E細(xì)胞中在有(刺激)和沒有(未刺激)EGF誘導(dǎo)的情況中的pERK水平。EGF刺激提高BRAF V600E細(xì)胞中的Ras-GTP水平，導(dǎo)致經(jīng)由活化C-Raf (見圖23中顯示的C-Raf活化)在B-RAF V600E細(xì)胞系中的pERK水平升高。所有4種細(xì)胞系都是B-Raf V600E突變體，但是那些之中，A375具有最低的Ras-GTP水平(最低水平的活性Ras),而且沒有顯示響應(yīng)EGF的pMEK和pERK水平的強(qiáng)カ誘導(dǎo)。已知A375細(xì)胞對Raf抑制劑敏感。圖28描繪了在B-Raf V600E細(xì)胞中在有(刺激)和沒有(未刺激)EGF誘導(dǎo)的情況中的pMEK水平。EGF刺激提高BRAF V600E細(xì)胞中的Ras-GTP水平，導(dǎo)致經(jīng)由活化C-Raf (見圖23中顯示的C-Raf活化)在B-RAF V600E細(xì)胞系中的pMEK水平升高。圖29 匯總了某些 RAF 抑制劑(⑶ C-0879、PLX-4720 和“ Raf inh a”，其是 2，6- ニ氟-N-(3-甲氧基-IH-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-基)-3-(丙基磺酰氨基)苯甲酰胺)響應(yīng)EGF刺激阻斷細(xì)胞pERK誘導(dǎo)的效カ。將表達(dá)EGFR的BRAF V600E細(xì)胞進(jìn)行血清饑餓，然后在存在不同劑量的指定RAF抑制劑的情況中保持未刺激(-EGF)或用EGF刺激(+EGF)。生成pERK抑制曲線，并將IC5tl值繪圖。如圖I中所顯示的，⑶C-0879可以更有效地阻斷野生型RAF信號傳導(dǎo)，而剩余的兩種抑制劑是BRAF V600E選擇性的。圖30描繪了 HGF刺激(+HGF)如何導(dǎo)致過表達(dá)c_MET的細(xì)胞中的pERK誘導(dǎo)。此誘導(dǎo)不被RAF抑制劑阻斷。然而，由BRAF V600E驅(qū)動的基礎(chǔ)pERK水平被RAF抑制劑有效阻斷。這表明c-MET信號傳導(dǎo)也經(jīng)由野生型RAF同種型。
因此受體酪氨酸激酶(RTK)，包括EGFR的異常表達(dá)，或由相應(yīng)配體的異常誘導(dǎo)可以使細(xì)胞對RAF抑制劑有抗性。圖31顯示了 EGFR表達(dá)如何與B-RAFV600E細(xì)胞中對RAF抑制劑的抗性關(guān)聯(lián)。此圖代表在存活力測定前用RAF抑制劑處理4天的B-RAF V600E突變體黑素瘤和結(jié)腸細(xì)胞系的細(xì)胞存活力EC50值(uM)。通過Western印跡測定EGFR水平，并在細(xì)胞溶胞物用抗EGFR抗體通過Western印跡未能檢出條帶時分類為陰性。在EGFR陽性細(xì)胞系中，存在著從低至中等和高的表達(dá)范圍?？剐?>20uM EC50)的單ー EGFR陰性細(xì)胞系是PTEN空的。圖32A-C描繪了具有不同EGFR表達(dá)水平的結(jié)腸腫瘤系中的RAF抑制劑和EGFR抑制劑(Tarceva)的組合研究。在圖32A中，來自兩種BRAF V600E結(jié)腸系的溶胞物的Western印跡顯示其不同的總EGFR水平C0L0201具有低的EGFR水平，而CX-I具有相對較高的EGFR水平。在圖32B中，顯示了用單獨(dú)的RAF抑制劑、單獨(dú)的Tarceva或RAF抑制劑和Tarceva的組合聯(lián)合處理C0L0201細(xì)胞的效果。在圖32C中，顯示了用單獨(dú)的RAF抑制劑、單獨(dú)的Tarceva或RAF抑制劑和Tarceva的組合聯(lián)合處理CX-I細(xì)胞的效果。單獨(dú)的RAF抑制劑或單獨(dú)的Tarceva都不如組合一樣有效地抑制増殖。在對CX-I細(xì)胞一起施用吋，這兩種抑制劑都顯示良好的協(xié)同。因此，在表達(dá)EGFR的BRAFV600E細(xì)胞中，高水平的EGFR預(yù)示RAF抑制劑和EGFR抑制劑間的強(qiáng)烈協(xié)同。特別地在結(jié)腸癌(其中高EGFR表達(dá)在BRAFV600E腫瘤中是普遍的)中，這些RAF抑制劑和Tarceva的組合在抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面顯示協(xié)同。圖33顯示了表達(dá)高EGFR水平的BRAFV600E腫瘤細(xì)胞中RAF抑制劑和Tarceva間協(xié)同的機(jī)制基礎(chǔ)。對沒用抑制劑(第I道、第5道、第9道、第13道)或用等于其細(xì)胞EC50值的濃度的單獨(dú)的RAF抑制劑(第2道、第6道、第10道、第14道)、單獨(dú)的Tarceva (第3道、第7道、第11道、第15道)或RAF抑制劑和Tarceva的組合(第4道、第8道、第12道、第16道)處理I小時或24小時的細(xì)胞制備Western印跡。24小時時間點(diǎn)顯示具有高EGFR表達(dá)的B-RAFV600E突變體細(xì)胞(CX-I)中的ERK磷酸化具有降低的對RAF抑制劑抑制的敏感性，并且需要RAF抑制劑和EGFR抑制劑組合以實(shí)現(xiàn)最大功效。對ERK的激活信號的一部分來自野生型RAF，其在EGFR的下游激活，并且可以不被BRAF V600E選擇性RAF抑制劑阻斷。
圖34A-C顯示了來自對攜帶皮下HT-29BRAF V600E人結(jié)腸直腸癌異種移植物的NCR裸(Taconic)鼠組合給予的RAF抑制劑a和厄洛替尼(erlotinib) (Tarceva)的相互作用和功效的結(jié)果。在圖34A中，與劑量漸增的Tarceva—起以100mg/kg給予RAF inh a。在圖34B中，對所有動物與濃度漸增的RAF inh a—起給予Tarceva。在組合施用這兩種化合物時觀察到升高的功效。在圖34C中，通過Western印跡對來自圖34A和B中的指定劑量的抑制劑處理的腫瘤的溶胞物分析磷酸ERK(pERK)水平。RAF抑制劑a和Tarceva在小鼠中共施用時在降低腫瘤中的磷酸ERK水平方面協(xié)同。發(fā)明詳述在一個實(shí)施方案中，本文中所公開的主題涉及鑒定不響應(yīng)用B-Raf抑制劑治療的患者的方法，包括測定RTK和/或其配體的表達(dá)或誘導(dǎo)量。該方法牽涉測定樣品中某些RTK和/或其配體的表達(dá)或誘導(dǎo)水平，由此RTK和/或其配體的過表達(dá)與對B-Raf抑制劑治療的非響應(yīng)性相關(guān)聯(lián)。在一個實(shí)施方案中，所述樣品表達(dá)B-RafV600E突變體。與B-Raf治療的響應(yīng)性相關(guān)聯(lián)的RTK的例子包括但不限于EGFR和cMet。該方法還牽涉測定樣品中某些 RTK配體的表達(dá)水平，由此異常高水平的配體表達(dá)與對B-Raf抑制劑治療的非響應(yīng)性相關(guān)聯(lián)。與B-Raf治療的響應(yīng)性相關(guān)聯(lián)的配體的例子包括但不限于EGF和HGF。在一個實(shí)施方案中，本文中所公開的主題涉及鑒定不響應(yīng)用B-Raf抑制劑治療的患者的方法，包括測定樣品中Ras-GTP的量，由此升高的量指示患者不會響應(yīng)所述B-Raf■抑制劑治療。在一個例子中，升高的量大于正常的未刺激樣品中找到的量。用于測量樣品中Ras-GTP水平的方法是已知的，例如使用ELISA測定法(例如來自Upstate, Inc.的Ras-GTP酶ELISA測定法)。在一個例子中，所述方法進(jìn)ー步包括對所述非響應(yīng)性患者施用有效量的MEK或ERK抑制劑。在另ー個例子中，所述方法進(jìn)ー步包括施用有效量的EGFR信號傳導(dǎo)抑制劑。在另ー個例子中，所述方法進(jìn)ー步包括與B-Raf抑制劑組合施用有效量的EGFR信號傳導(dǎo)抑制劑。在一個實(shí)施方案中，本文中所公開的主題涉及鑒定不響應(yīng)用B-Raf抑制劑治療的患者的方法，包括測定樣品中EGF或EGFR表達(dá)的水平，由此EGF或EGFR的過表達(dá)水平指示患者不會響應(yīng)所述B-Raf 抑制劑治療。在一個例子中，測定EGF mRNA的量。用于測量樣品中EGF和EGFR表達(dá)水平的方法是已知的，例如，使用ELISA免疫測定法(例如來自R&DSystems, Inc.的QXJANTiKlNE .免疫測定法)。在一個例子中，所述方法進(jìn)ー步包括對所述非響應(yīng)性患者施用有效量的MEK或ERK抑制劑。在另ー個例子中，所述方法進(jìn)ー步包括施用有效量的EGFR信號傳導(dǎo)抑制劑。在另ー個例子中，所述方法進(jìn)ー步包括與B-Raf抑制劑組合施用有效量的EGFR信號傳導(dǎo)抑制劑。在一個實(shí)施方案中，本文中所公開的主題涉及鑒定不響應(yīng)用B-Raf抑制劑治療的患者的方法，包括測定樣品中HGF或cMET表達(dá)的水平，由此HGF或cMET的過表達(dá)水平指示患者不會響應(yīng)所述B-Raf抑制劑治療。在一個例子中，患者表達(dá)B-Raf V600E。在ー個例子中，測定HGF mRNA的量。用于測量樣品中HGF和cMET表達(dá)水平的方法是已知的，例如，使用定量RT-實(shí)時PCR測定法。在另ー個例子中，使用ELISA免疫測定法(例如來自EMDChemicals, Inc 的 PhosphoDetect cMET ELISA 試劑盒，或來自 Invitrogen, Inc.的cMET人ELISA試劑盒)。在一個例子中，所述方法進(jìn)ー步包括對所述非響應(yīng)性患者施用有效量的cMET或HGF抑制劑。在另ー個例子中，所述方法進(jìn)ー步包括與B-Raf抑制劑組合施用有效量的cMET或HGF抑制劑。在一個實(shí)施方案中，本文中所公開的主題涉及鑒定不響應(yīng)用B-Raf抑制劑治療的患者的方法，包括測定K-ras突變的存在或缺乏，由此K-ras突變的存在指示患者不會響應(yīng)所述B-Raf抑制劑治療。在一個例子中，所述方法進(jìn)ー步包括對所述非響應(yīng)性患者施用有效量MEK或ERK抑制劑。在另ー個例子中，所述方法進(jìn)ー步包括施用有效量的EGFR信號傳導(dǎo)抑制劑。在另ー個例子中，所述方法進(jìn)ー步包括與B-Raf抑制劑組合施用有效量的EGFR信號傳導(dǎo)抑制劑。在某些實(shí)施方案中，本文中所公開的主題涉及測定腫瘤是否會響應(yīng)用B-Raf抑制劑治療的方法，包括在所述腫瘤的樣品中測定突變體K-ras蛋白或基因的存在，由此突變體K-ras蛋白或基因的存在指示腫瘤不會響應(yīng)用B-Raf抑制劑的治療。在一個例子中，所述方法進(jìn)ー步包括對所述非響應(yīng)性腫瘤施用有效量的MEK或ERK抑制劑。在另ー個例子中，所述方法進(jìn)ー步包括施用有效量的EGFR信號傳導(dǎo)抑制劑。在另ー個例子中，所述方法進(jìn)ー步包括與B-Raf抑制劑組合施用有效量的EGFR信號傳導(dǎo)抑制劑。 在某些實(shí)施方案中，提供了預(yù)測患者是否會不響應(yīng)用B-Raf 抑制劑治療的方法。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括測定患者腫瘤中K-ras突變的存在或缺乏，其中K-ras突變在密碼子12或密碼子13中。在某些實(shí)施方案中，若存在K-ras突變，則預(yù)示患者不響應(yīng)用B-Raf 抑制劑的治療。在某些實(shí)施方案中，提供了預(yù)測腫瘤是否會不響應(yīng)用B-Raf 抑制劑治療的方法。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括測定所述腫瘤的樣品中K-ras突變的存在或缺乏，其中K-ras突變在密碼子12或密碼子13中。在某些實(shí)施方案中，K_ras突變的存在指示腫瘤會不響應(yīng)用B-Raf 抑制劑的治療。在某些實(shí)施方案中，提供了依照治療方案將人受試者分層的方法。該方法包括測定來自受試者的樣品中突變體K-ras基因或其蛋白的存在，由此突變體K-ras基因或蛋白的存在指示受試者不會響應(yīng)B-Raf 抑制劑治療，并且自用B-Raf 抑制劑的治療排除受試者。此方法可以包括將受試者分層成例如臨床試驗(yàn)中的特定亞組。在另ー個實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)ー步包括對具有所述突變體K-ras基因或蛋白的所述受試者施用有效量的MEK或ERK抑制劑。在另ー個例子中，所述方法進(jìn)ー步包括施用有效量的EGFR信號傳導(dǎo)抑制劑。在另ー個例子中，所述方法進(jìn)ー步包括與B-Raf 抑制劑組合施用有效量的EGFR信號傳導(dǎo)抑制劑。在一個實(shí)施方案中，提供了將乳腺、肺、結(jié)腸、卵巣、甲狀腺、黑素瘤或胰腺腫瘤分類的方法。該方法包括下列步驟獲得或提供腫瘤樣品；檢測所述樣品中(i)編碼B-RafV600E突變體的基因和(ii)編碼k-Ras突變體的基因的表達(dá)或活性。該方法可以進(jìn)ー步包括基于所述檢測步驟的結(jié)果將所述腫瘤分類為屬于腫瘤亞類；并基于所述分類步驟選擇治療，其中若所述k-RAS突變體在所述腫瘤樣品中過表達(dá)，則所述治療與B-Raf V600E特異性抑制劑不同。在一個例子中，治療包括對所述非響應(yīng)性腫瘤施用有效量的MEK或ERK抑制齊U。在另ー個例子中，該方法進(jìn)ー步包括施用有效量的EGFR信號傳導(dǎo)抑制劑。在另ー個例子中，所述方法進(jìn)ー步包括與B-Raf抑制劑組合施用有效量的EGFR信號傳導(dǎo)抑制劑。在另ー個實(shí)施方案中，提供了治療結(jié)腸直腸或肺癌的方法。該方法包括測定癌癥是K-ras還是B-Raf驅(qū)動的，由此在治療測定為K_ras驅(qū)動的此類癌癥中，治療不包括B-Raf抑制劑。在一個例子中，治療包括對所述K-ras驅(qū)動的癌癥施用有效量的MEK或ERK抑制劑。還提供了ー種試劑盒，其包含用于檢測癌癥是K-ras驅(qū)動的還是B-Raf驅(qū)動的特異性材料和用于鑒定不響應(yīng)B-Raf抑制劑治療的患者或腫瘤的指令。在某些實(shí)施方案中，測定受試者中ー項或多項K-ras突變的存在或缺乏包括測定來自受試者的樣品中突變體K-ras多肽的表達(dá)的存在或量。在某些實(shí)施方案中，測定受試者中ー項或多項K-ras突變的存在或缺乏包括測定來自受試者的樣品中突變體K-ras多核苷酸的轉(zhuǎn)錄或翻譯的存在或量。在某些實(shí)施方案中，測定受試者中ー項或多項K-ras突變的存在或缺乏包括測定包含至少ー種選自下組的氨基酸序列的多肽的表達(dá)的存在或量US2009/0075267中所列的下列 SEQ ID NO SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12、SEQ ID N0:14、和SEQ IDNO: 160在某些實(shí)施方案中，測定受試者中ー項或多項K_ras突變的存在或缺乏包括測定來自受試者的樣品中編碼至少ー種選自下組的氨基酸序列的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄或翻譯的存在或量US2009/0075267中所列的下列SEQ ID NO. SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:14JPSEQ ID NO:16。 在某些實(shí)施方案中，提供了測定編碼突變體K-ras多肽的多核苷酸的存在或缺乏。在某些實(shí)施方案中，測定樣品中編碼突變體K-ras多肽的多核苷酸的存在或缺乏的方法包括(a)將樣品暴露于與編碼突變體K-ras多肽的下述區(qū)域的多核苷酸雜交的探針，其中所述區(qū)域包含至少ー項選自G12S、G12V、G12D、G12A、G12C、G13A、和G13D的K_ras突變，并(b)測定樣品中編碼突變體K-ras多肽的多核苷酸的存在或缺乏。在某些實(shí)施方案中，測定樣品中突變體K-ras多肽的存在或缺乏的方法包括(a)將樣品暴露于與編碼突變體K-ras多肽的下述區(qū)域的多核苷酸雜交的探針，其中所述區(qū)域包含至少ー項選自G12S、G12V、G12D、G12A、G12C、G13A、和G13D的K-ras突變，并(b)測定樣品中突變體K_ras多肽的存在或缺乏。在某些實(shí)施方案中，提供了測定編碼突變體B-Raf 多肽的多核苷酸的存在或缺乏。在某些實(shí)施方案中，測定樣品中編碼突變體B-Raf多肽的多核苷酸的存在或缺乏的方法包括(a)將樣品暴露于與編碼突變體B-Raf多肽的下述區(qū)域的多核苷酸雜交的探針，其中所述區(qū)域包含V600E突變，并(b)測定樣品中編碼突變體B-Raf多肽的多核苷酸的存在或缺乏。在某些實(shí)施方案中，測定樣品中突變體B-Raf多肽的存在或缺乏的方法包括(a)將樣品暴露于與編碼突變體B-Raf多肽的下述區(qū)域的多核苷酸雜交的探針，其中所述區(qū)域包含V600E突變，并(b)測定樣品中突變體B-Raf多肽的存在或缺乏。在某些實(shí)施方案中，提供了用于檢測受試者中編碼突變體K-ras多肽的多核苷酸的試劑盒。在某些此類實(shí)施方案中，試劑盒包含與編碼突變體K-ras多肽的下述區(qū)域的多核苷酸雜交的探針，其中所述區(qū)域包含至少ー項選自G12S、G12V、G12D、G12A、G12C、G13A、和G13D的K-ras突變。在某些實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)ー步包含兩種或更多種擴(kuò)增引物。在某些實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)ー步包含檢測組分。在某些實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)ー步包含核酸取樣組分。任選地，試劑盒可以含有用于檢測B-Raf突變的材料。這些材料是本領(lǐng)域中已知的。能夠檢測K-ras和B-Raf突變體基因或蛋白的試劑盒組合特別可用于治療結(jié)腸和肺癌。試劑盒中包含的是用于鑒定在癌癥是K-ras驅(qū)動時不響應(yīng)B-Raf 抑制的患者或腫瘤的指令。RAS驅(qū)動的癌癥是本領(lǐng)域中已知的。Ras驅(qū)動的癌癥是Ras蛋白的異?；钚詫?dǎo)致經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生成或癌癥或腫瘤形成的任何癌癥或腫瘤。在某些實(shí)施方案中，對于測定為不響應(yīng)B-Raf抑制劑的那些樣品、腫瘤、癌癥、受試者或患者，所述方法進(jìn)ー步包括對所述非響應(yīng)性樣品、腫瘤、癌癥、受試者或患者施用有效量的MEK抑制劑。在某些實(shí)施方案中，對于測定為不響應(yīng)B-Raf抑制劑的那些樣品、腫瘤、癌癥、受試者或患者，所述方法進(jìn)ー步包括對所述非響應(yīng)性樣品、腫瘤、癌癥、受試者或患者施用有效量的ERK抑制劑。在另ー個例子中，所述方法進(jìn)ー步包括施用有效量的EGFR信號傳導(dǎo)抑制劑。在另ー個例子中，所述方法進(jìn)ー步包括與B-Raf抑制劑組合施用有效量的EGFR信號傳導(dǎo)抑制劑。可以通過多種方法，包括抑制EGFR激酶活性，結(jié)合EGFR的胞外域以抑制活化或者通過抑制EGF配體的活性和信號傳導(dǎo)來抑制EGFR信號傳導(dǎo)。
EGFR信號傳導(dǎo)抑制劑是本領(lǐng)域中已知的，并且包括例如厄洛替尼(erlotinib) (TARCEVA )、吉非替尼(gefitinib) (IRESSA )、拉帕替尼(Iapatinib)、培利替尼(pelitinib)、西妥昔單抗(Cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)、扎魯木單抗(zalutumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)和馬妥珠單抗(matuzumab),及那些記載于美國專利No. 5，747，498的。B-Raf抑制劑是本領(lǐng)域中已知的，并且包括例如索拉非尼(sorafenib)、PLX4720、PLX-3603、GSK2118436、GDC-0879、N-(3-(5-(4-氯苯基)-IH-吡咯并[2，3_b]吡啶-3-羰基)-2，4- ニ氟苯基)丙-1-磺酰胺，和那些記載于W02007/002325、W02007/002433,W02009111278、TO2009111279、TO2009111277、TO2009111280 和美國專利 No. 7，491，829 的。cMET抑制劑是本領(lǐng)域中已知的，并且包括但不限于AMG208、ARQ197、ARQ209、PHA665752 (3Z) -5- [ (2，6- ニ氯芐基)磺?；鵠-3- [ (3，5- ニ 甲基-4- {[ (2R) -2-(吡咯烷-I-基甲基)吡咯烷-I-基]羰基}-IH-吡咯-2-基)亞甲基]-1，3_ ニ氫-2H-吲哚-2-酮、N-(4-(3-((3S，4R)-l-こ基-3-氟哌啶-4-基氨基)-IH-吡唑并[3，4_b]吡啶-4-基氧基)-3-氟苯基)-2- (4-氟苯基)-3-氧-2，3- ニ氫噠嗪-4-甲酰胺和SUl 1274，及那些記載于美國專利No. 7，723，330的。MEK抑制劑是本領(lǐng)域中已知的，并且包括但不限于ARRY-162、AZD8330、AZD6244、U0126、GDC-0973、PD184161 和 PD98059,及那些記載于 W02003047582、W02003047583、W02003047585、W02003053960、W02007071951、W02003077855、W02003077914、W02005023251、W02005051300、W02005051302、W02007022529、W02006061712、W02005028426、W02006018188、US20070197617、WO 2008101840、W02009021887、W02009153554、US20090275606、W02009129938、W02009093008、W02009018233、W02009013462、TO2008125820、TO2008124085、TO2007044515、TO2008021389、TO2008076415和 TO2008124085 的。ERK抑制劑是本領(lǐng)域中已知的，并且包括但不限于FR180204和3_(2_氨基こ基)-5-((4-こ氧基苯基)亞甲基)-2，4-噻唑烷ニ酮，和那些記載于W02006071644、W02007070398, W02007097937, W02008153858、W02008153858, W02009105500 和W02010000978 的。用于檢測突變體K-ras基因或蛋白的任何已知方法適合于本文中所公開的方法。外顯子 I 中檢出的特定突變是G12C ;G12A ;G12D ;G12R ;G12S ;G12V ;G13C ;G13D。用于測定K-ras突變的存在的方法也與那些用于鑒定K-ras和EGFR突變的方法類似，例如如已公布的美國專利申請No. US2009/0202989A1記載的，以SEQ ID No. 55、56、57和58列出的用于PCR的K-ras寡聚物，通過提及而將其完整收入本文。舉例而言，用于檢測突變體K-ras基因或蛋白的其它方法和引物、寡聚物及SEQ ID No.披露于已公布的美國專利申請 No. US2009/0202989AU US2009/0075267A1、US20090143320、US20040063120 和US2007/0003936。一般地，依照本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法且如遍及本說明書引用并討論的各種一般的和更具體的參考文獻(xiàn)中所描述的那樣來實(shí)施技術(shù)和規(guī)程。參見例如Samtoook等 Molecular Cloning: ALaboratory Manual (桌 2 te，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N. Y(1989)),通過提及而將其收入本文。檢測多核苷酸中的突變的某些方法是本領(lǐng)域中已知的。某些例示性的方法包括但不限于測序、引物延伸反應(yīng)、電泳、Picogreen測定法、寡核苷酸連接測定法、雜交測定法、TaqMan測定法、SNPlex測定法、和記載于例如美國專利No. 5，470，705、5，514，543、5，580，732,5, 624，800,5, 807，682,6, 759，202,6, 756，204,6, 734，296,6, 395，486、和美國 專利公開文本No. US 2003-0190646A1的測定法。在某些實(shí)施方案中，檢測多核苷酸中的突變包括首先擴(kuò)增可能包含突變的多核苷酸。用于擴(kuò)增多核苷酸的某些方法是本領(lǐng)域中已知的。此類擴(kuò)增產(chǎn)物可以在本文中所描述的或本領(lǐng)域中已知的用于檢測多核苷酸中的突變的任何方法中使用。檢測多肽中的突變的某些方法是本領(lǐng)域中已知的。某些例示性的此類方法包括但不限于使用對突變體多肽特異性的特異性結(jié)合劑來檢測。檢測突變體多肽的其它方法包括但不限于電泳和肽測序。檢測多核苷酸和/或多肽中的突變的某些例示性方法記載于例如Schimanski等(1999)Cancer Res.，59:5169-5175 ;Nagasaka 等(2004)J. Clin. Oncol.，22:4584-4596 ;PCT 公開文本 No. WO 2007/001868A1 ;美國專利公開文本 No. 2005/0272083A1 ;及 Lievre 等(2006)Cancer Res. 66:3992-3994。在某些實(shí)施方案中，提供了包含編碼ー種或多種突變體K-ras多肽的ー種或多種多核苷酸的微陣列。在某些實(shí)施方案中，提供了包含與編碼ー種或多種突變體K-ras多肽的ー種或多種多核苷酸互補(bǔ)的ー種或多種多核苷酸的微陣列。在某些實(shí)施方案中，提供了包含編碼ー種或多種突變體B-Raf多肽的ー種或多種多核苷酸的微陣列。在某些實(shí)施方案中，提供了包含與編碼ー種或多種突變體B-Raf多肽的ー種或多種多核苷酸互補(bǔ)的ー種或多種多核苷酸的微陣列。在某些實(shí)施方案中，使用微陣列技術(shù)來評估兩種或更多種細(xì)胞或組織樣品中ー種或多種突變體K-ras多核苷酸的存在或缺乏。在某些實(shí)施方案中，使用微陣列技術(shù)來評估兩種或更多種細(xì)胞或組織樣品中一種或多種突變體K-ras多核苷酸的數(shù)量。在某些實(shí)施方案中，使用微陣列技術(shù)來評估兩種或更多種細(xì)胞或組織樣品中ー種或多種突變體B-Raf多核苷酸的存在或缺乏。在某些實(shí)施方案中，使用微陣列技術(shù)來評估兩種或更多種細(xì)胞或組織樣品中一種或多種突變體B-Raf多核苷酸的數(shù)量。在某些實(shí)施方案中，使用微陣列技術(shù)來評估兩種或更多種細(xì)胞或組織樣品中ー種或多種突變體K-ras多肽的存在或缺乏。在某些此類實(shí)施方案中，首先自細(xì)胞或組織樣品提取mRNA，隨后轉(zhuǎn)化成cDNA，該cDNA與微陣列雜交。在某些此類實(shí)施方案中，特異性結(jié)合微陣列的cDNA的存在或缺乏指示突變體K-ras多肽的存在或缺乏。在某些此類實(shí)施方案中，通過定量特異性結(jié)合微陣列的cDNA量來評估ー種或多種突變體K-ras多肽的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，使用微陣列技術(shù)來評估兩種或更多種細(xì)胞或組織樣品中ー種或多種突變體B-raf多肽的存在或缺乏。在某些此類實(shí)施方案中，首先自細(xì)胞或組織樣品提取mRNA，隨后轉(zhuǎn)化成cDNA，該cDNA與微陣列雜交。在某些此類實(shí)施方案中，特異性結(jié)合微陣列的cDNA的存在或缺乏指示突變體B-Raf多肽的存在或缺乏。在某些此類實(shí)施方案中，通過定量特異性結(jié)合微陣列的cDNA量來評估ー種或多種突變體B-Raf多肽的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，提供了包含針對ー種或多種突變體K-ras多肽的ー種或多種特異性結(jié)合劑的微陣列。在某些此類實(shí)施方案中，評估細(xì)胞或組織中ー種或多種突變體K-ras多肽的存在或缺乏。在某些此類實(shí)施方案中，評估細(xì)胞或組織中ー種或多種突變體K-ras多肽的數(shù)量。在某些實(shí)施方案中，提供了包含針對ー種或多種突變體B-Raf多肽的ー種或多種 特異性結(jié)合劑的微陣列。在某些此類實(shí)施方案中，評估細(xì)胞或組織中ー種或多種突變體B-Raf多肽的存在或缺乏。在某些此類實(shí)施方案中，評估細(xì)胞或組織中ー種或多種突變體B-raf多肽的數(shù)量。在此通過提及而將本文中所引用的所有參考文獻(xiàn)，包括專利、專利申請、文章、教科書等，及其中所引用的參考文獻(xiàn)(就尚未收錄而言)完整收入本文。在通過提及而收錄的一份或多份文件對某術(shù)語的定義與本申請中對該術(shù)語的定義矛盾的情況中，以本申請為準(zhǔn)。本文中所使用的標(biāo)題部分僅出于組織目的，而不應(yīng)解釋為限制所描述的主題。定義除非另有定義，與本發(fā)明結(jié)合使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語應(yīng)當(dāng)與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的通常理解具有相同的意義。此外，除非上下文另有需要，単數(shù)術(shù)語應(yīng)當(dāng)包括復(fù)數(shù)，而復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng)當(dāng)包括単數(shù)。術(shù)語“B-Raf抑制劑”指抑制降低B-Raf激酶活性的任何化合物或藥劑。此類抑制劑可能還抑制其它激酶，包括其它raf激酶?！疤禺愋訠-Raf激酶抑制劑”指與野生型B-Raf相比對突變體B-Raf，諸如氨基酸位置600的纈氨酸殘基處的突變，例如V600E突變具有選擇性的抑制劑。與野生型B-Raf相比，此類抑制劑的效力為至少2倍，更經(jīng)常至少3倍或更多。效カ也可以就測量生長抑制的細(xì)胞測定法的IC5tl值而言進(jìn)行比較。術(shù)語“治療方案”指施用一種或多種藥劑以治療病癥或疾病的治療方式或過程。這包括臨床試驗(yàn)。術(shù)語“X#Y”在多肽序列中的突變的上下文中是本領(lǐng)域公認(rèn)的，其中“#，，指示就多肽的氨基酸編號而言的突變位置，“ X”指示野生型氨基酸序列中所述位置處找到的氨基酸，而“Y”指示所述位置處的突變體氨基酸。例如，提及K-ras多肽的標(biāo)記“G12S”指示野生型K-ras序列的氨基酸編號12處有甘氨酸，并且在突變體K_ras序列中該甘氨酸用絲氨酸替換。術(shù)語“突變體K-ras多肽”和“突變體K_ras蛋白”可互換使用，指包含至少ー項選自 G12S、G12V、G12D、G12A、G12C、G13A、和 G13D 的 K-ras 突變的 K-ras 多肽。某些例示性的突變體K-ras多肽包括但不限于等位變體、剪接變體、衍生變體、替代變體、刪除變體、和/或插入變體、融合多肽、直向同系物、和種間同系物。在某些實(shí)施方案中，突變體K-ras多肽包括C-或N-端的額外殘基，諸如但不限于前導(dǎo)序列殘基、靶向殘基、氨基端甲硫氨酸殘基、賴氣酸殘基、標(biāo)簽殘基和/或融合蛋白殘基。術(shù)語“突變體B-Raf多肽”和“突變體B-Raf蛋白”可互換使用，指包含V600E突變的B-Raf多肽。某些例示性突變體B-Raf多肽包括但不限于等位變體、剪接變體、衍生變體、替代變體、刪除變體、和/或插入變體、融合多肽、直向同系物、和種間同系物。在某些實(shí)施方案中，突變體B-Raf多肽包括C-或N-端的額外殘基，諸如但不限于前導(dǎo)序列殘基、靶向殘基、氣基端甲硫氣酸殘基、賴氣酸殘基、標(biāo)簽殘基和/或融合蛋白殘基。術(shù)語“突變體K-ras多核苷酸”、“突變體K_ras寡核苷酸”、和“突變體K_ras核酸”可互換使用，指編碼包含至少ー項選自G12S、G12V、G12D、G12A、G12C、G13A、和G13D的K-ras突變的K-ras多肽的多核苷酸。術(shù)語“突變體B-Raf多核苷酸”、“突變體B-Raf寡核苷酸”、和“突變體B-Raf核酸”可互換使用，指編碼包含V600E突變的B-Raf多肽的多核苷酸。 術(shù)語“藥劑”在本文中用于意指化學(xué)化合物、化學(xué)化合物的混合物、生物學(xué)大分子、或自生物學(xué)材料生成的提取物。如本文中所使用的，術(shù)語“藥用藥劑或藥物”指在對患者適當(dāng)施用時能夠誘導(dǎo)期望的治療效果的化學(xué)化合物或組合物。本文中其它化學(xué)術(shù)語依照本領(lǐng)域中常規(guī)的用法使用，如由 The McGraw-Hi11 Dictionary of Chemical TermsCParker, S.編，McGraw-Hill, SanFrancisco (1985),通過提及而將其收入本文)例示的。術(shù)語“患者”包括人和動物受試者。出于治療的目的，術(shù)語“哺乳動物”和“動物”指分類為哺乳動物的任何動物，包括人、家畜和牲畜，和動物園、運(yùn)動、或?qū)櫸飫游?，諸如犬、馬、貓、牛等。優(yōu)選地，哺乳動物是人。術(shù)語“疾病狀態(tài)”指細(xì)胞或整個哺乳動物的生理學(xué)狀態(tài)，其中已經(jīng)發(fā)生細(xì)胞或身體功能、系統(tǒng)、或器官的中斷、停止、或紊亂。術(shù)語“治療”或“處理”指治療性處理和預(yù)防性或防范性措施兩者，其中目的是阻止或減緩(減輕)不想要的生理學(xué)變化或病癥，諸如癌癥的形成或擴(kuò)散。出于本發(fā)明的目的，有益的或期望的臨床結(jié)果包括但不限于癥狀的減輕、疾病程度的減弱、疾病的穩(wěn)定化(即不惡化)狀態(tài)、疾病進(jìn)展的延遲或減緩、疾病狀態(tài)的改善或減輕、和消退(不論部分還是完全)，無論可檢出還是不可檢出?！爸委?處理”還可以意指與若沒有接受治療預(yù)期的存活相比延長的存活。需要治療的主體包括那些已經(jīng)患有狀況或病癥的及那些易于患上狀況或病癥的或那些要預(yù)防狀況或病癥的。如本文中所使用的，術(shù)語“響應(yīng)”意指依照RECIST (實(shí)體瘤響應(yīng)評估標(biāo)準(zhǔn))，患者或腫瘤在施用藥劑后顯示完全響應(yīng)或部分響應(yīng)。如本文中所使用的術(shù)語“非響應(yīng)”意指依照RECIST，患者或腫瘤在施用藥劑后顯示穩(wěn)定的疾病或進(jìn)展性疾病。RECIST記載于例如Therasse 等，2000 年 2 月，“New Guidelines to Evaluate the Response to Treatmentin Solid Tumors, ” J. Natl. Cancer Inst. 92 (3) : 205-216，通過提及而將其完整收入本文?！安“Y”指會受益于ー種或多種治療的任何狀況。這包括慢性和急性病癥或疾病，包括那些使哺乳動物傾向于所討論病癥的病理學(xué)狀況。本文中要治療的病癥的非限制性例子包括良性和惡性腫瘤、白血病、和淋巴樣惡性腫瘤?！澳[瘤”包括一種或多種癌性細(xì)胞。癌癥的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤(blastoma)、肉瘤、和白血病或淋巴樣惡性腫瘤。此類癌癥的更具體的例子包括鱗狀細(xì)胞癌(例如，上皮鱗狀細(xì)胞癌)、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌(“NSCLC”)、肺的腺癌和肺的鱗癌)、腹膜癌、肝細(xì)胞癌(hepatocellular cancer)、胃癌(包括胃腸癌)、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤(h印atoma)、乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、夕卜陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、及頭頸癌。特別地，本方法適合于乳腺、結(jié)腸直腸、卵巣、胰腺或肺癌。更特別地，癌癥是結(jié)腸、肺或卵巣的。癌癥可以是Ras驅(qū)動的癌癥。與突變體K-ras有關(guān)的疾病或狀況包括下列ー種或多種由突變體K_ras基因或蛋白引起的疾病或狀況；由突變體K-ras基因或蛋白促成的疾病或狀況；和與突變體K-ras基因或蛋白的存在有關(guān)的疾病或狀況。在某些實(shí)施方案中，與突變體K-ras有關(guān)的疾病或狀況是癌癥?！芭c突變體K-ras多肽有關(guān)的疾病或狀況”包括下列ー種或多種由突變體K_ras多肽引起的疾病或狀況；由突變體K-ras多肽促成的疾病或狀況；引起突變體K-ras多肽的疾病或狀況；和與突變體K-ras多肽的存在有關(guān)的疾病或狀況。在某些實(shí)施方案中，與突 變體K-ras多肽有關(guān)的疾病或狀況可以在沒有突變體K-ras多肽的情況中存在。在某些實(shí)施方案中，與突變體K-ras多肽有關(guān)的疾病或狀況可以由于突變體K-ras多肽的存在而惡化。在某些實(shí)施方案中，與突變體K-ras多肽有關(guān)的疾病或狀況是癌癥。以下實(shí)施例(包括進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)和實(shí)現(xiàn)的結(jié)果)僅為了例示目的而提供，而不應(yīng)解釋為對權(quán)利要求的限制。
實(shí)施例實(shí)施例I :B-RAF刪除和藥理學(xué)抑制增強(qiáng)K-ras驅(qū)動的腫瘤發(fā)生Ras GTP酶家族響應(yīng)調(diào)節(jié)細(xì)胞過程，包括増殖和存活的信號而控制許多下游信號傳導(dǎo)級聯(lián)。雖然Ras是人腫瘤中的功能獲得性突變的最普遍的靶物之一，但是仍存在關(guān)于Ras效應(yīng)器途徑在突變體K-ras驅(qū)動的腫瘤發(fā)生中如何發(fā)揮功能的問題。因?yàn)镵-ras的重要功能牽涉規(guī)范的MAPK信號傳導(dǎo)途徑內(nèi)的B-Raf活化，所以我們啟動了ー項研究以測定B-Raf在突變體K-ras驅(qū)動的腫瘤促進(jìn)和維持的背景中的作用。在ー些K_ras突變體腫瘤中，B-Raf抑制不僅沒有顯示任何腫瘤益處，它甚至加速腫瘤生長。見圖8A，其顯示了腫瘤加倍前的時間。將表達(dá)Cre重組酶的腺病毒投遞至擁有條件K-raSG12D等位基因(K-raSi_G12D)和0、1或兩拷貝的側(cè)翼有LoxP位點(diǎn)的B-raf基因(B-rafeK°)的遺傳工程小鼠的肺。此規(guī)程導(dǎo)致在存在或缺乏小鼠肺內(nèi)刪除的ー個或兩個B-raf等位基因的情況中突變體K-ras01211的表達(dá)。令人驚訝地，B-Raf 刪除顯著增加肺腫瘤數(shù)目和負(fù)荷，并降低總體存活。在含有K-ra,211突變的鼠非小細(xì)胞肺癌系中使用靶向B-Raf的高度特異性小分子抑制劑時，我們觀察到細(xì)胞增殖和軟瓊脂集落形成増加。進(jìn)ー步的調(diào)查掲示了用B-Raf抑制劑處理表達(dá)K-ra,211的細(xì)胞增強(qiáng)MEK和Erk磷酸化。因此，這些數(shù)據(jù)提示了雖然B-Raf刪除沒有抑制K-ras驅(qū)動的腫瘤啟動和疾病進(jìn)展，但是其存在可以在建立組成性突變體K-ras活性的負(fù)反饋調(diào)節(jié)中發(fā)揮樞要的作用。實(shí)施例2 : 了解B-RAFv6cicie突變體對野生型腫瘤中的RAF信號傳導(dǎo)
為了了解在Ras和Raf基因中具有不同突變的Raf途徑的作用，我們表征了針對野生型(WT)B-Raf和c-Raf對突變體(MT) B_RafV_E具有獨(dú)特的效カ概況的兩種選擇性小分子Raf抑制劑。盡管其生物化學(xué)差異，它們具有相同的細(xì)胞概況，針對B_RafV6°°E，而非WT或Ras MT腫瘤是有效カ的。這兩種抑制劑主要經(jīng)由c-Raf同等型在非BRAFv6cicie系中誘導(dǎo)Raf/MEK/ERK途徑的激活。相反，它們依照其預(yù)測的生物化學(xué)效カ抑制佛波醇酯和生長因子刺激的Raf/MEK/ERK活性。如此，選擇性Raf抑制劑對B_RafV6°°E系的細(xì)胞特異性不僅是其對B-Rafve-同等型的選擇性的反映，而且反映不同細(xì)胞背景中Raf活性的復(fù)雜調(diào)節(jié)。B-Rafv600e的生物化學(xué)選擇性不是Raf抑制劑的細(xì)胞功效概況的唯一驅(qū)動物。抑制劑經(jīng)由c-Raf在非V600E突變體系中選擇性誘導(dǎo)pMEK水平。抑制劑依照其效カ快速地且以劑量依賴性方式誘導(dǎo)c-Raf特異性活性和pMEK水平。在基礎(chǔ)條件下，GDC-0879的鐘形曲線提示對c-Raf的雙重刺激對抑制效果。不同背景中的B-和c-Raf途徑狀態(tài)確定Raf抑制藥效學(xué)。圖1-7中顯示了表征結(jié)果。實(shí)施例3 :用B-Raf抑制劑給藥后肺腫瘤異種移植物中的生長
下文顯示了數(shù)據(jù)，并且圖10-14中顯示了關(guān)于實(shí)驗(yàn)H331的數(shù)據(jù)，而圖15-18中顯示了關(guān)于實(shí)驗(yàn)H327的數(shù)據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種鑒定不響應(yīng)用B-Raf抑制劑治療的患者的方法，包括測定K-ras突變的存在或缺乏，由此K-ras突變的存在指示患者不會響應(yīng)所述B-Raf抑制劑治療。
2.一種測定腫瘤是否會響應(yīng)用B-Raf抑制劑治療的方法，包括在所述腫瘤的樣品中測定突變體K-ras蛋白或基因的存在，由此突變體K-ras蛋白或基因的存在指示所述腫瘤不會響應(yīng)用B-Raf抑制劑的治療。
3.權(quán)利要求I的方法，其中所述K-ras突變是激活突變。
4.權(quán)利要求I的方法,其中所述K-ras突變是下列至少一項G12C；G12A ；G12D ；G12R ；G12S ；G12V ；G13C ;和 G13D。
5.權(quán)利要求I的方法，其中所述B-Raf抑制劑是特異性B-Raf抑酶抑制劑。
6.權(quán)利要求I的方法，其中通過擴(kuò)增來自所述腫瘤的K-ras核酸，或懷疑含有突變的其片段，并對所述擴(kuò)增核酸測序來測定K-ras突變的存在。
7.權(quán)利要求I的方法，其中通過擴(kuò)增來自所述腫瘤的K-RAS核酸，或懷疑含有突變的其片段，并比較所述擴(kuò)增核酸的電泳遷移率與相應(yīng)的野生型K-ras核酸或片段的電泳遷移率來測定K-ras突變的存在。
8.一種預(yù)測患者是否會不響應(yīng)用特定(specific) B-Raf抑制劑治療的方法，包括測定所述患者的腫瘤中K-ras突變的存在或缺乏，其中所述K-ras突變在密碼子12或密碼子13中；且其中若存在K-ras突變，則預(yù)測所述患者不響應(yīng)用特定B-Raf抑制劑的治療。
9.權(quán)利要求I的方法，其中所述測定腫瘤中K-ras突變的存在或缺乏包括擴(kuò)增來自所述腫瘤的K-ras核酸，并對所述擴(kuò)增核酸測序。
10.權(quán)利要求I的方法，其中所述測定腫瘤中K-ras突變的存在或缺乏包括使用針對突變體K-ras多肽的特異性結(jié)合劑來檢測所述腫瘤樣品中的突變體K-ras多肽。
11.權(quán)利要求I的方法，其中所述K-ras突變選自G12S、G12V、G12D、G12A、G12C、G13A、和 G13D。
12.可用于權(quán)利要求I的方法的試劑盒，其包含對檢測K-ras突變體基因或蛋白特異性的材料，和對檢測B-Raf突變體基因或蛋白特異性的材料。
13.權(quán)利要求12的試劑盒，其進(jìn)一步包含在鑒定不響應(yīng)用B-Raf抑制劑治療的患者中使用的指令。
14.權(quán)利要求13的試劑盒，其中所述患者具有肺或結(jié)腸直腸癌。
15.一種將乳腺、肺、結(jié)腸、卵巢、甲狀腺、黑素瘤或胰腺腫瘤分類的方法，包括下列步驟獲得腫瘤樣品；檢測所述樣品中(i)編碼B-Raf V600E突變體的基因和(ii)編碼k_Ras突變體的基因的表達(dá)或活性。
16.權(quán)利要求15的方法，其進(jìn)一步包括基于所述檢測步驟的結(jié)果將所述腫瘤分類為屬于腫瘤亞類；并基于所述分類步驟選擇治療，其中若所述k-RAS突變體在所述腫瘤樣品中過表達(dá)，則所述治療與B-Raf V600E特異性抑制劑不同。
17.—種鑒定不響應(yīng)用B-Raf抑制劑治療的腫瘤的方法，包括測定受體酪氨酸激酶(RTK)的表達(dá)水平，由此所述RTK的異常表達(dá)或誘導(dǎo)指示所述患者不會響應(yīng)所述B-Raf抑制劑治療，且其中所述腫瘤表達(dá)B-RafV600E。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述RTK是EGFR或cMET。
19.權(quán)利要求18的方法，其進(jìn)一步包括通過與B-Raf抑制劑組合施用有效量的所述EGFR或cMET的抑制劑來治療所述腫瘤。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述EGFR抑制劑是厄洛替尼(erlotinib)。
21.權(quán)利要求20的方法，其中以協(xié)同量施用所述組合。
22.權(quán)利要求17的方法，其中所述腫瘤類型是結(jié)腸或黑素瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于鑒定對B-Raf抑制劑治療不易感的腫瘤的預(yù)后方法，其通過檢測K-ras基因或蛋白中的突變或者通過檢測RTK和/或其配體的過表達(dá)來進(jìn)行。還公開了用于實(shí)施所述方法的試劑盒。
文檔編號G01N33/48GK102859355SQ201080048007
公開日2013年1月2日 申請日期2010年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月24日
發(fā)明者G.哈齊瓦西利奧, S.馬利克 申請人:基因泰克公司