專利名稱：丙型肝炎病毒抗體時間分辨免疫熒光分析法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及丙型肝炎病毒抗體檢測試劑盒，屬于時間分辨免疫熒光分析法檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒Ofepatitis C Virus, HCV)是引起輸血后非甲非乙型肝炎 (Post-transfusion non-A non-B Hepatitis, PT-NANBH)的主要病原因子。HCV 感染者急性期的癥狀不如HAV或HBV感染后的癥狀明顯，黃疸比例較低，但HCV感染者比HBV感染更易慢性化，約有50%的HCV感染者發(fā)展成慢性肝炎，其中的20%的患者最終變成肝硬化和肝癌。全世界目前約有1. 7億以上的HCV感染者；我國將近4000萬，為HCV的高流行區(qū)，感染率在0.9% 5. 之間，平均為3. 1%。HCV傳播最主要的途徑是輸血和輸入血液制品，此外，目前認為可能的傳播方式還包括共用針頭及注射器(如通過靜脈注射吸毒者)、性接觸及家庭成員的密切接觸、母嬰垂直傳播、醫(yī)源性傳播等；我國HCV感染的主要途徑是通過輸血及血液制品傳播。丙型肝炎病毒(HCV)自從1989年被發(fā)現(xiàn)以來，科學家們已進行了大量研究，建立了各種檢測方法。我國的抗HCV試劑自1994年問世以來，已逐步完善并被普遍用于血源篩查和臨床診斷。當前HCV抗體診斷試劑為第三代試劑，在靈敏度和特異性方面均比前代試劑有很大提高，但是在早期診斷和低危人群的診斷方面仍有一些不足。時間分彭爭免疫焚光分析(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)利用具有獨特熒光特性的鑭系元素，代替酶、同位素等，做為發(fā)光免疫分析中的一種重要方法，具有靈敏度高、示蹤物穩(wěn)定、不受樣品自然熒光干擾、無放射性污染等許多優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于丙型肝炎病毒(HCV)抗體檢測的時間分辨免疫熒光分析法及試劑盒，主要解決現(xiàn)有技術(shù)存在的靈敏度低、穩(wěn)定性差、操作煩瑣及污染環(huán)境等技術(shù)問題。本發(fā)明采用銪標記技術(shù)，提供銪標記試劑盒，以提高方法的靈敏度及穩(wěn)定性。本發(fā)明的技術(shù)方案是丙型肝炎病毒抗體時間分辨免疫熒光分析法，包括下列步驟①固相抗體制備將HCV重組抗原用碳酸鹽緩沖液稀釋至Ι-lOug/mL作為包被液，包被反應板，形成固相抗體，并用封閉液(磷酸鹽緩沖液及2% (W/V)的牛血清白蛋白 (BSA))封閉；②生物素標記抗原的制備用生物素對配對抗原進行標記；③鑭系元素離子標記抗體制備鏈親和素用常規(guī)方法進行鑭系元素離子標記；④在步驟①制得的具有固相抗體的反應板上，每孔加入HCV陰陽性對照或待測樣品，以及用反應緩沖液稀釋的標記抗體進行孵育，經(jīng)熒光增強液解離后，最后進行熒光測定。
步驟①中包被液中HCV重組抗原的濃度為l-10ug/mL，步驟②中配對抗原和步驟 ③鏈親和素需用反應緩沖液(PH 7. 8的50mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)，內(nèi)含 0. 9% NaCl，1 % BSA, 0. 5%酪蛋白，0. 08%吐溫(Tween) 20 和 0. 1 % NaN3 (反應緩沖液組分％指的是W/V))以體積比1 21稀釋。步驟③中的鑭系元素離子優(yōu)選為Eu3+。步驟④ 中的反應緩沖液同步驟②，步驟④在時間分辨熒光免疫分析儀器上自動完成，熒光增強液為β 二酮體。丙型肝炎病毒抗體檢測試劑盒，其特征是試劑盒包括包被抗原的緩沖液(碳酸鹽緩沖液)、封閉液(磷酸鹽緩沖液及2% (W/V)的BSA)、反應緩沖液(ρΗ 7. 8的50mmol/L Tris-HCl,內(nèi)含 0. 9% NaCl, 1% BSA,0. 5%酪蛋白，0. 08% Tween20 和 0. 1 % NaN3)、工作洗滌液(磷酸鹽緩沖液)、熒光增強液，作為包被HCV重組抗原，生物素標記抗原和鑭系元素離子標記的鏈親和素。本發(fā)明使用雙抗體夾心法，反應步驟包括試劑準備、加樣反應、洗滌拍干、加增強液、測熒光值。本發(fā)明的有益效果是分析靈敏度高(符合或者超過HCV國家參比品的要求)，檢測時間短(60min)，特異性好，與干擾物質(zhì)的交叉反應小。


圖1為本發(fā)明的反應原理圖本發(fā)明采用雙抗原夾心法。HCV重組抗原包被于96孔熒免板，陰陽性對照或樣品中的HCV抗體與包被抗原和生物素標記抗原于微孔內(nèi)表面發(fā)生免疫反應；洗滌后，加入銪離子(Eu3+)標記的鏈親和素，免疫反應后，微孔表面的夾心免疫復合物與游離標記鏈親和素通過洗滌分離。微孔表面免疫復合物中的Eu3+被熒光增強液解離后形成穩(wěn)定的熒光配合物，熒光強度與陰陽性對照或樣品中的HCV抗體濃度呈正比例，通過Cutoff值計算公式判斷陰陽性結(jié)果。圖2為本發(fā)明操作流程圖第一步復融生物素標記抗原，第二步稀釋生物素標記物，第三步加入陰陽性對照和待測樣品，第四步加入稀釋后的生物素標記抗原，第五步孵育，第六步洗板，第七步加入稀釋后銪標記物，第八步孵育，第九步洗板，第十步加入增強液，第十一步 檢測。
具體實施例方式下面參照圖1、2通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。在進行時間分辨免疫熒光分析檢測法前需完成下列準備工作首先制備包被板，所用的包被板為重組抗原包被的板，HCV包被板條的制備包括以下步驟(1)將純化的HCV重組抗原用碳酸鹽緩沖液稀釋，然后加入包被板條各孔內(nèi)，經(jīng)吸附、洗滌、封閉、干燥后獲得HCV重組抗原包被板條；(2)將HCV重組抗原包被板條裝入專用的鋁箔包裝袋，封口并冷藏備用。其次是HCV生物素標記抗原的制備，包括以下步驟
(1)取待標記抗原加入透析袋中，放入配制好的pH 9. 5碳酸鹽緩沖液的中，室溫透析過夜(PH 9. 5碳酸鹽緩沖液)；(2)次日，取出抗原，將透析過的抗原用pH 9. 5碳酸鹽緩沖液稀釋至0. 2_5mg/mL， 按質(zhì)量比為2 1的比例(生物素抗原)邊振蕩邊加入生物素，室溫下在振板機上慢速振蕩1小時，然后去除后在PH7. 5的磷酸鹽緩沖液(pH7. 5的磷酸鹽緩沖液)中透析過夜；(5)用孔徑0. 2um的過濾器過濾；(6)加入 0. 3% (W/V)優(yōu)級純 BSA，2-8°C保存。實施例丙型肝炎病毒抗體檢測1、生物素標記抗原用碳酸鹽緩沖液將HCV重組抗原透析過夜，之后加入生物素反應1小時，取出在 PH7. 5的磷酸鹽緩沖液中透析過夜。分裝，于+2 +8°C保存。2、操作步驟1.)試劑盒準備包被抗原的緩沖液(碳酸鹽緩沖液)、封閉液(磷酸鹽緩沖液及 2% (W/V)的 BSA)、反應緩沖液(pH 7. 8 的 50mmol/L Tris-HCl,內(nèi)含 0. 9% NaCl, 1% BSA,
0.5%酪蛋白，0.08%Tween20和0. 1 % NaN3)、工作洗滌液(磷酸鹽緩沖液)、熒光增強液 (β 二酮體)，作為包被HCV重組抗原，生物素標記抗原和鑭系元素離子標記的鏈親和素。A 工作洗滌液將40mL磷酸鹽緩沖液(25倍濃縮液)用蒸餾水或去離子水稀釋至
1,OOOmL 備用。B 生物素標記抗原工作液每瓶生物素標記HCV抗原的凍干粉加1，000 μ L純水， 靜置30分鐘，待其充分溶解。對每一條12孔板，取75 μ L復溶好的生物素標記HCV抗原 (21倍濃縮液)，加1.5mL反應緩沖液，充分混勻(1 21稀釋)。實驗前1小時內(nèi)配制。2)編號將樣品對應微孔按序編號，每板應設(shè)抗-HCV陰、陽性對照各2孔。3)加樣分別在相應孔中加入抗-HCV陰性對照、陽性對照及待測樣品25 μ L。4)加生物素標記抗原每孔加入稀釋好的生物素標記抗原工作液100 μ L05)第一步孵育室溫QO 25°C )慢速振蕩溫育45分鐘。6.配Eu標記鏈親和素工作液對每一條12孔板，取75 μ L Eu標記鏈親和素(21 倍濃縮液)，加1.5mL反應緩沖液，充分混勻(1 21稀釋)。第二步孵育前45分鐘內(nèi)配制。7)洗滌用工作洗滌液充分洗板5遍，扣干。8)加Eu標記鏈親和素每孔加入Eu標記鏈親和素工作液100 μ L。9)第二步孵育室溫OO 25°C )慢速振蕩溫育15分鐘。10)洗滌用工作洗滌液充分洗板5遍，扣干。11)加熒光增強液每孔加入熒光增強液100 μ L，室溫(+20 +25°C )慢速振蕩5 分鐘后測定熒光計數(shù)值。12)測量熒光計數(shù)值用時間分辨熒光檢測儀測定熒光計數(shù)值。
權(quán)利要求
1.丙型肝炎病毒抗體時間分辨免疫熒光分析法，其特征是包括下列步驟①固相抗體制備將HCV重組抗原用碳酸鹽緩沖溶液稀釋至Ι-lOug/mL作為包被液，包被反應板，形成固相抗體，并用封閉液封閉；②生物素標記抗原的制備用生物素對配對抗原進行標記；③鑭系元素離子標記抗體制備鏈親和素用常規(guī)方法進行鑭系元素離子標記；④在步驟①制得的具有固相抗體的反應板上，每孔加入HCV陰陽性對照或待測樣品， 以及用反應緩沖液稀釋的標記抗原進行孵育，洗板后加入稀釋好的銪標記鏈親和素再次進行孵育，最后進行熒光測定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述丙型肝炎病毒抗體時間分辨免疫熒光分析法，其特征是步驟② 中配對抗原和步驟③鏈親和素用反應緩沖液以體積比為1 21稀釋。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述丙型肝炎病毒抗體時間分辨免疫熒光分析法，其特征是步驟③ 中的鑭系元素離子為Eu3+。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述丙型肝炎病毒抗體時間分辨免疫熒光分析法，其特征是所述的反應緩沖液為 PH 7. 8 的 50mmol/L iTris-HCl,內(nèi)含 0. 9% NaCl，1 % BSA，0. 5%酪蛋白， 0. 08 % 吐溫 20 禾口 0. 1 % Na^。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述丙型肝炎病毒抗體時間分辨免疫熒光分析法，其特征是步驟④ 在時間分辨熒光免疫分析儀器上自動完成。
6.丙型肝炎病毒抗體檢測試劑盒，其特征是試劑盒包括包被抗原的緩沖液、封閉液、 反應緩沖液、工作洗滌液、熒光增強液，作為包被HCV重組抗原，生物素標記抗原和鑭系元素離子標記的鏈親和素。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的丙型肝炎病毒抗體檢測試劑盒，其特征是包被抗原的緩沖液碳酸鹽緩沖液，封閉液磷酸鹽緩沖液及2%的BSA，反應緩沖液PH 7. 8 的 50mmol/L Tris-HCl，內(nèi)含 0. 9% NaCl，1 % BSA，0. 5%酪蛋白， 0. 08 % 吐溫 20 和 0. 1 % NaN3,工作洗滌液磷酸鹽緩沖液，熒光增強液β 二酮體。
全文摘要
本發(fā)明公開了丙型肝炎病毒抗體診斷時間分辨免疫熒光分析法及試劑盒，其選用多片段融合HCV重組抗原作為包被抗原，用碳酸鈉緩沖溶液稀釋至1-10ug/mL作為包被液；配對HCV重組抗原用生物素標記作為標記抗原；鏈親和素用鑭系元素標記；實驗時用反應緩沖液按1∶21稀釋使用；在包被抗原的反應板上，每孔依次加入25uL的HCV陰陽性對照或待測樣品、以及稀釋的生物素標記抗原，孵育洗板后在加入稀釋好的鏈親和素銪標記，孵育后進行熒光檢測。本發(fā)明還提供相應的試劑盒。本發(fā)明具有較高的靈敏度、特異性及穩(wěn)定性；且分析系統(tǒng)高度自動化，可提高臨床檢驗結(jié)果的速度，可大幅度降低人為誤差和增加檢出結(jié)果的可靠性。
文檔編號G01N33/543GK102236020SQ201010152498
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月20日
發(fā)明者張小寒 申請人:上海新波生物技術(shù)有限公司