專利名稱：：一種檢測(cè)單純皰疹病毒Ⅱ型IgM抗體的化學(xué)發(fā)光試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及一種4企測(cè)單純皰滲病毒II型IgM抗體的化學(xué)發(fā)光試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：?jiǎn)渭儼挐B病毒(Herpessimplexvirus,HSV)呈圓形，內(nèi)層為雙鏈線狀DNA構(gòu)成的核心，外部為三層殼體結(jié)構(gòu)。HSV有兩種血清型，HSV-I型感染占10%，常為口腔粘膜、上身皮膚、淋巴結(jié)腫大，主要引起上半身皮膚、粘膜或器官皰滲，但極少感染胎兒。HSV-II型為生殖器皰滲，占90%,主要引起生殖器、肛門及腰以下的皮膚皰滲，直接有性傳播占絕大多數(shù)。孕婦感染HSV的癥狀主要為子宮頸陰道及外生殖器的皰滲、潰瘍并有疼痛，新生兒在產(chǎn)道中感染的表現(xiàn)為眼、皮膚或口腔出現(xiàn)皰瘆。機(jī)體遭受病原體感染時(shí)，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體來(lái)抵抗病原體，以保護(hù)機(jī)體功能的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。一般先產(chǎn)生IgM抗體，然后產(chǎn)生IgG抗體，IgM抗體滴度在達(dá)到高峰后很快開(kāi)始逐漸下降至較低水平，下降后一般不易檢出，而IgG抗體達(dá)到高峰后則基本穩(wěn)定在一個(gè)較高的滴度且持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間。檢查出特異性IgM抗體說(shuō)明患者近期感染，潛伏的病毒被激活產(chǎn)生復(fù)發(fā)感染時(shí)亦可一企出IgM抗體；^r查出IgG抗體說(shuō)明曾經(jīng)感染過(guò)，而且有一定的免疫水平。當(dāng)患者發(fā)生繼發(fā)感染時(shí)，IgM抗體和IgG抗體都能較快地上升到較高滴度，其中IgG上升極其顯著。單純皰滲病毒抗體的檢測(cè)方法主要有放射免疫分析法，熒光免疫分析法和酶聯(lián)免疫分析法等。放射免疫分析雖然高靈敏、高特異，但存在有效期短、具有放射性污染的缺點(diǎn)。焚光免疫分析法雖然特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快，但非特異性染色問(wèn)題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，程序也比較復(fù)雜。酶聯(lián)免疫分析雖然靈敏度高、特異性強(qiáng)，但存在內(nèi)源性酶干擾、底物大部分有毒或?yàn)橹掳┪镔|(zhì)等缺點(diǎn)，而且劃痕等外在因素也會(huì)對(duì)吸光度的測(cè)定產(chǎn)生影響。1977年，Halman第一次把化學(xué)發(fā)光與免疫分析結(jié)合，1980年化學(xué)發(fā)光免疫分才斤(ChemiluminescenceImmunoassay,CIIA)—詞開(kāi)始出玉見(jiàn)，i口今CLIA發(fā)展更為成熟，應(yīng)用領(lǐng)域更為廣泛?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析是借助于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的高靈敏性和免疫反應(yīng)的高特異性而建立的一種測(cè)定方法，是繼熒光免疫分析法、酶免疫分析法和放射免疫分析法之后迅速發(fā)展起來(lái)的一種新型免疫分析技術(shù)。它包括標(biāo)記化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的化學(xué)發(fā)光免疫分析、標(biāo)記酶的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析和標(biāo)記熒光物質(zhì)的熒光化學(xué)發(fā)光免疫分析。血清中針對(duì)某種抗原的特異性IgM抗體和IgG抗體同時(shí)存在，所以間接法測(cè)定IgM抗體時(shí)，IgG抗體可干護(hù)LIgM抗體的測(cè)定。因此捕獲法的工作原理設(shè)計(jì)為先將針對(duì)IgM抗體的抗人(IgM)ia鏈抗體連接于固相載體，用以結(jié)合樣品中所有特異或非特異的IgM抗體，洗滌除去IgG等無(wú)關(guān)物質(zhì)，然后加入特異抗原與待4會(huì)IgM抗體結(jié)合，再加入抗原特異性酶標(biāo)抗體，最后形成固相二抗-IgM抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加入示蹤底物，即可測(cè)定樣品中待檢IgM抗體的含量。
發(fā)明內(nèi)容為了解決間接法測(cè)定IgM抗體的不足，同時(shí)避免多種外在因素對(duì)結(jié)果測(cè)定的影響，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)單純皰瘆病毒II型IgM抗體的化學(xué)發(fā)光試劑盒，包含陰性、陽(yáng)性對(duì)照品，抗人p鏈單克隆抗體包被的固相載體，中和抗原，酶標(biāo)記的單純皰滲病毒II型抗體，化學(xué)發(fā)光底物液和濃縮洗滌液。其中，所述的固相載體為微孔板和塑料管，所述的酶為^5威性磷酸酶，所述的化學(xué)發(fā)光底物液的發(fā)光劑為1,2-二氧乙烷類衍生物，包括(金剛烷)-l,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-曱氧基-4-(3'-磷酰氧基)苯基-l、2-二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star。在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明優(yōu)選優(yōu)選方案為所述化學(xué)發(fā)光底物液含有0.20mol/LTris-HCl，16%NaCl,0.4%KC1，0.1%proclin300，2%AMPPD,pH7.4。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)單純皰滲病毒II型IgM抗體的化學(xué)發(fā)光試劑盒的制備方法，包括以下步驟A、陰性、陽(yáng)性對(duì)照品的制備陰性對(duì)照品HSV-IIIgM陰性人血清，56°C1小時(shí)滅活，除菌過(guò)濾，冷凍保存。陽(yáng)性對(duì)照品已確定的高滴度HSV-IIIgM陽(yáng)性人血清，56°C1小時(shí)滅活后，用含10%新生牛血清，0.1%防腐劑，pH7.2~7.4的0.02mol/LTris-HCl緩沖液稀釋后制成陽(yáng)性對(duì)照品，稀釋比例為1:200，冷凍保存。B、酶標(biāo)記的單純皰滲病毒II型抗體的制備單純皰滲病毒II型抗體用戊二醛法與堿性磷酸酶偶聯(lián)，對(duì)O.Olmol/LpH7.07.5的磷酸鹽緩沖液充分透析，加入等體積甘油，-20。C以下保存?zhèn)溆?；將酶?biāo)抗體用酶標(biāo)記物用含O.lmol/LTris-HCl、0.5%BSA、0.1%proclin300、pH7.2~7.6的稀釋液稀釋，采用方陣法選擇酶標(biāo)抗原的稀釋度為1:3000-1:5000。C、中和抗原的制備釆用方陣法選S奪中和抗原的稀釋度為1:2500-1:4500。稀釋液采用上述B步驟中的稀釋液配方。D、抗人p鏈單克隆抗體包被的固相載體的制備將抗人(i鏈單克隆抗體加入到含0.03mol/L無(wú)水碳酸鈉、0.07mol/L碳酸氫鈉、pH9.2~9.8的包被液中至1.5嗎/mL,加到微孔板各孔中，每孔110(JL,4。C放置24小時(shí)；甩掉包被液，每孔分別加入含0.01mol/L磷酸鹽緩沖液、1%BSA、0.1%proclin300、pH7.0-7.5的封閉液30(VL，室溫放置3小時(shí)，甩掉封閉液，拍干，室溫除濕干燥24小時(shí)，封袋，置28。C保存；E、化學(xué)發(fā)光底物液的制備；F、濃縮洗滌液的制備。根據(jù)本發(fā)明的方法，所述的固相載體為微孔板和塑料管，所述的酶為堿性磷酸酶，所述的化學(xué)發(fā)光底物液含有1,2-二氧乙烷類衍生物，包括(金剛烷)-l,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-曱氧基-4-(3'-磷酰氧基)苯基-l、2-二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star。在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明優(yōu)選優(yōu)選方案為所述化學(xué)發(fā)光底物液含有0.20mol/LTris-HCl,16%NaCl，0.4%KC1,0.1%proclin300，2%AMPPD,pH7.4。所述濃縮洗滌液含有0.20mol/LTris-HCl,16%NaCl,0.4%KCl，0.1%proclin300,2%AMPPD,pH7.4。該方法便于生產(chǎn)、易于監(jiān)控生產(chǎn)過(guò)程，保證了批次間的穩(wěn)定性。具體實(shí)施例方式以下所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1單純皰瘆病毒II型IgM抗體的化學(xué)發(fā)光試劑盒的制備陰性對(duì)照品HSV-IIIgM陰性人血清56°C1小時(shí)滅活，除菌過(guò)濾，2-8'C保存。陽(yáng)性對(duì)照品已確定的高滴度HSV-IIIgM陽(yáng)性人血清，56°C1小時(shí)滅活后，用含10%新生牛血清，0.1%防腐劑,pH7.2的0,02mol/LTris-HCl緩沖液稀釋后制成陽(yáng)性對(duì)照品，稀釋比例為1:200,2-8。C保存。酶標(biāo)記的單純皰滲病毒II型抗體的制備單純皰滲病毒II型抗體用戊二醛法與堿性磷酸酶偶聯(lián)，對(duì)0.01mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液充分透析，加入等體積甘油，-20。C以下保存?zhèn)溆谩７Q取Tris12.120g，HC110mL，牛血清白蛋白(BSA)5g,proclin300lmL，用雙蒸水定容至1000mL，pH7.2,配制稀釋液。將酶標(biāo)抗體用酶標(biāo)記物稀釋液稀釋，采用方陣法選擇酶標(biāo)抗體的稀釋度為1:3000。中和抗原的制備采用方陣法選擇中和抗原的稀釋度為1:2500。稀釋液使用上一步驟中的稀釋液?？谷?_i鏈單克隆抗體包被的固相載體的制備稱取Na2C031.59g,NaHC032.94g，溶解于雙蒸水并定容到500mL,混勻后，調(diào)整pH至9.6,加入抗人ja鏈單克隆抗體至1.5jig/mL混勻，然后加到微孔板各孔中，每孔110pL,4t:放置24h后甩掉包被液。取NaH2PCV2H2O0.2g,Na2HP04'12H202.9g,BSA10g，Proclin300lmL，用雙蒸水定容至1000mL,pH值為7.07.5,配制成封閉液。每孔分別加入封閉液300(xL,室溫放置3小時(shí)。甩掉封閉液，在吸水紙上拍干。室溫除濕干燥24小時(shí)。立即進(jìn)行封袋，貼簽后置2~8。C保存?；瘜W(xué)發(fā)光底物液的制備。采用如下配方取Tris24g，HC115ml，NaCl160g,KC14g,proclin300lmL,AMPPD20mL，加入雙蒸水溶解后，定容至1000mL。濃縮洗滌液的制備。采用如下配方取Tris24g,HC115mL，NaCl160g，Tween-2010mL，用去離子水定容至1000mL。使用時(shí)用蒸餾水稀釋20倍。實(shí)施例2單純皰滲病毒II型IgM抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒除以塑料管作為固相載體外，其余均以與實(shí)施例l相同的方法制備單純皰滲病毒II型IgM抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒。實(shí)施例3單純皰滲病毒II型IgM抗體的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒的制備酶標(biāo)記的單純皰滲病毒II型抗體的制備將酶標(biāo)抗體用酶標(biāo)記物稀釋液稀釋，選擇酶標(biāo)抗體的稀釋度為1:5000。中和抗原的制備選擇中和抗原的稀釋度為1:4500。其余與實(shí)施例1相同。實(shí)施例4單純皰滲病毒II型IgM抗體的化學(xué)發(fā)光試劑盒的使用方法。A.自4。C冰箱中取出實(shí)施例1所制單純皰滲病毒II型IgM抗體的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，室溫平衡15分鐘；B.將待測(cè)樣本用生理鹽水1:100稀釋；C.設(shè)空白1孑L，陰性對(duì)照2孑L,陽(yáng)性對(duì)照2孔，除空白孔外各孔加稀釋后的陰性對(duì)照品、陽(yáng)性對(duì)照品或樣本50pL,用孩t量震蕩器充分振蕩混勻，37。C溫育30分鐘；D.甩去反應(yīng)液，每孔加滿20倍稀釋后的洗滌液，洗^反5次，最后在干凈的吸水紙上扣干；E.除空白孔外各孔加酶標(biāo)抗體和中和抗原各50(iL,用^f效量震蕩器充分振蕩混勻，37。C溫育30分鐘；F.甩去反應(yīng)液，每孔加滿20倍稀釋后的洗滌液，洗板5次，最后在干凈的吸水紙上扣干；G.各孔加入化學(xué)發(fā)光底物液50pL，用微量震蕩器充分振蕩混合均勻，室溫(20~25°C)避光反應(yīng)30分鐘；H.在化學(xué)發(fā)光測(cè)量?jī)x上依序測(cè)量各孔的發(fā)光強(qiáng)度(RLU),測(cè)量時(shí)間1秒/孔；結(jié)果判定樣品的RLU>2.1x陰性對(duì)照品的平均值，判斷為陽(yáng)性，否則為陰性。實(shí)施例5單純皰疹病毒II型IgM抗體的化學(xué)發(fā)光試劑盒精密度的測(cè)定。采用實(shí)施例1中所制備純皰滲病毒II型IgM抗體的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒按實(shí)施例4所述方法對(duì)同一份陽(yáng)性標(biāo)本，進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定，每次10孔，計(jì)算發(fā)光強(qiáng)度RLU變異系數(shù)，數(shù)據(jù)如下表l本發(fā)明試劑盒精密性測(cè)定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結(jié)果可見(jiàn)，CV。/。均小于10%,說(shuō)明本發(fā)明的試劑盒精密性良好，符合要求。實(shí)施例6單純皰滲病毒II型IgM抗體的化學(xué)發(fā)光試劑盒特異性的檢定。采用實(shí)施例1中所制備的單純皰滲病毒II型IgM抗體的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒按實(shí)施例4所述方法與酶聯(lián)試劑盒同時(shí)檢測(cè)HSV-IIIgM陽(yáng)性樣本54例，陰性樣本28例，比較二者檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果如下表2兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果對(duì)照表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表2可知，本發(fā)明的試劑盒與單純皰滲病毒II型IgM酶聯(lián)試劑盒的結(jié)果完全一致。實(shí)施例7單純皰滲病毒II型IgM抗體的化學(xué)發(fā)光試劑盒靈敏度的測(cè)定。將一份高滴度的陽(yáng)性樣本按1:50、1:100、1:200、1:400、1:800的比例稀釋，采用實(shí)施例1中所制備純皰滲病毒II型IgM抗體的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒按實(shí)施例4所述方法與酶聯(lián)試劑盒同時(shí)檢測(cè)，比較二者的靈敏度。結(jié)果如下表3兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果對(duì)照表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>當(dāng)高滴度陽(yáng)性樣本1:501:400稀釋時(shí)，兩種試劑盒均可檢測(cè)為陽(yáng)性；當(dāng)高滴度陽(yáng)性樣本1:800稀釋時(shí)，兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果都為陰性。由上表可知,本發(fā)明的試劑盒與酶聯(lián)試劑盒靈敏度相當(dāng)。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1.一種檢測(cè)單純皰疹病毒II型IgM抗體的化學(xué)發(fā)光試劑盒，包含陰性、陽(yáng)性對(duì)照品，抗人μ鏈單克隆抗體包被的固相載體，中和抗原，酶標(biāo)記的單純皰疹病毒II型抗體，化學(xué)發(fā)光底物液和濃縮洗滌液，其特征在于，所述的酶為堿性磷酸酶，所述的化學(xué)發(fā)光底物液含有1，2-二氧乙烷類衍生物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光試劑盒，其特征在于，所述的固相載體為微孔板和塑料管。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光試劑盒，其特征在于，所述的1,2-二氧乙烷類衍生物含有(金剛烷)-l,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-曱氧基畫(huà)4畫(huà)(3'-磷酰氧基)苯基-1、2-二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光試劑盒，其特征在于，所述的化學(xué)發(fā)光底物液含有0.20mol/LTris-HCl，16%NaCl,0.4%KC1，0.1%proclin300,2%AMPPD，pH7.4。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光試劑盒，其特征在于，所述的濃縮洗滌液含有0.2mol/LTris-HCl,16%NaCl,1%Tween-20,pH7.2。使用時(shí)用去離子水稀釋20倍。6.檢測(cè)單純皰瘆病毒II型IgM抗體的化學(xué)發(fā)光試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟A、陰性、陽(yáng)性對(duì)照品的制備；B、酶標(biāo)記的單純皰瘆病毒II型抗體的制備；C、中和抗原的制備；D、抗人^鏈單克隆抗體的固相載體的制備；E、化學(xué)發(fā)光底物液的制備;F、濃縮洗滌液的制備。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的固相載體為微孔板或塑料管，所述的化學(xué)發(fā)光底物液含有1,2-二氧乙烷類衍生物。8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述酶標(biāo)記的單純皰瘆病毒II型抗體的制備采用以下方法用戊二醛聯(lián)法將單純皰滲病毒II型抗體與堿性磷酸酶偶聯(lián)，對(duì)0.01mol/LpH7.0~7.5的磷酸鹽緩沖液充分透析，加入等體積甘油，-2(TC以下保存?zhèn)溆茫?.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述抗人p鏈單克隆抗體的固相載體的制備采用以下方法將抗人fi鏈單克隆抗體加入到0.1Omol/LpH9.2~9.8的碳酸鹽包被液中至1.5嗎/mL,將包被液加到微孔板各孔中，每孔110pL,4。C放置24小時(shí)；甩掉包被液，每孔分別加入含0.01mol/L磷酸鹽、1%BSA、0.1%proclin300、pH7.0~7.5的封閉液300|iL，室溫放置3小時(shí)，甩掉封閉液，拍干，室溫除濕干燥24小時(shí)，封袋，置28。C保存。10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述1，2-二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-1,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-曱氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的化學(xué)發(fā)光底物液的組成為0.20mol/LTris-HCl，16%NaCl，0.4%KC1,0.1%proclin300,2%AMPPD,pH7.4。全文摘要本發(fā)明提供了一種檢測(cè)單純皰疹病毒II型IgM抗體的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒及其制備方法。本發(fā)明試劑盒采用捕獲法檢測(cè)單純皰疹病毒II型IgM抗體的原理為，將抗人μ鏈單克隆抗體吸附于固相載體，加入待測(cè)樣本，洗滌后再加入特異抗原和酶標(biāo)抗體，形成免疫復(fù)合物，最后加入化學(xué)發(fā)光底物液，測(cè)定其發(fā)光值即可得出IgM抗體的含量。所述的酶為堿性磷酸酶，所述的化學(xué)發(fā)光底物液含有1，2-二氧乙烷類衍生物。本發(fā)明易操作，精密性良好，樣本檢測(cè)結(jié)果與酶聯(lián)免疫分析方法檢驗(yàn)結(jié)果相符。文檔編號(hào)G01N33/535GK101368963SQ200810105410公開(kāi)日2009年2月18日申請(qǐng)日期2008年4月29日優(yōu)先權(quán)日2008年4月29日發(fā)明者于尚永,宋勝利,應(yīng)希堂,胡國(guó)茂,蔣冰飛,鄭金來(lái)申請(qǐng)人:北京科美東雅生物技術(shù)有限公司