專利名稱：原料乳中抗生素殘留物的快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種原料乳中抗生素殘留物的快速檢測法，就是測定原料乳中含有微量抗生素殘留物，它屬于微量物質(zhì)的檢測領(lǐng)域。
原料乳是用來加工各種乳制品的主要原料，只有優(yōu)質(zhì)的無異物污染的原料乳才能生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)安全的乳及乳制品。
1979年，世界衛(wèi)生組織正式將抗生素列入被檢測污染物后，規(guī)定原料乳及消毒乳中不得有抗生素殘留，歐美國家多年前就對牛乳中抗生素殘留有明確的規(guī)定，禁止含有抗生素殘留物的牛乳上市，超過允許殘留量的牛乳和乳制品全部廢棄，不準(zhǔn)食用。其中對青霉素類藥物的限量是4μg/kg～10μg/kg。
1985年，我國發(fā)布GB5408-85消毒牛乳標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，用抗生素或其他對牛乳有影響的藥物，或治療期間的母牛所產(chǎn)的牛乳和停藥后3日內(nèi)的牛乳不得收購。
2001年，農(nóng)業(yè)部發(fā)布無公害食品生產(chǎn)鮮牛乳行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，對新鮮牛乳的衛(wèi)生指標(biāo)明確了抗生素不得檢出。
2000年，利用TTC法對西寧市市售全年牛乳77份標(biāo)品中，檢測出抗生素殘留樣品9份，其陽性為11.7％。
2003年，135份當(dāng)年乳標(biāo)品中檢測到含有抗生素陽性樣品72份，占被檢測樣品的53.3％，其中含有兩種以上抗生素的樣品49份，占被檢樣品的36.3％。
2002年，從北京市50份市售消毒牛乳樣品中，TTC法檢測出，4份陽性，3份可疑，陽性率為8％，可疑率為6％；微生物法檢測出青霉素類殘留陽性5份，陽性率占10％。酶標(biāo)免疫分析法檢測出四環(huán)素類陽性4份，陽性率為8％；鏈霉素殘留物陽性11份，陽性率為22％。
對福建省生牛乳抗生素殘留物進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果86件鮮乳中共檢出抗生素殘留陽性樣品17件，檢出率為19.8％。
從以上檢測報道來看，我國目前的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)并沒有嚴(yán)格執(zhí)行，致使我國牛乳及制品中抗生生素殘留問題一直未能得到解決。
基于上述現(xiàn)實問題，本發(fā)明的目的是要研制一種快速檢測法，檢測原料乳中抗生素殘留物。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，利用嗜熱脂肪芽胞桿菌的芽胞對多種抗生素物質(zhì)敏感性高，芽胞發(fā)育溫度高，不易在常溫下生長繁殖的特點進(jìn)行研究。
生產(chǎn)工藝流程及其說明1.嗜熱脂肪芽胞桿菌芽胞的培養(yǎng)和收集純化制備工藝嗜熱脂肪芽胞桿菌凍干菌種→活化培養(yǎng)，增菌液、55℃、24h→擴(kuò)大培養(yǎng)，同活化培養(yǎng)→產(chǎn)芽胞培養(yǎng)，產(chǎn)芽胞培養(yǎng)基、0.1ml/平皿；55℃、24h～72h55℃鏡檢芽胞產(chǎn)率，產(chǎn)量達(dá)80％以上→收集→離心洗滌純化(4000rpm，10min)→再次離心洗滌(2000rpm，10min)→收集芽胞(1500rpm，15min)→純化分離芽胞懸液，1×1010cfu/ml以上。
2.反應(yīng)管的生產(chǎn)工藝配料→加熱溶解→加指示劑→滅菌121℃，20min→加芽胞懸液混勻→無菌分裝→封口→檢驗→成品試劑盒。
3.菌種及配料表1)嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacilus staerothermophilus Var.calidolactis)，該菌種對于廣譜性抗生素殘留的檢測敏感強(qiáng)，特別對于青霉素類和磺胺類藥物很靈敏。
2)增菌液配制酵母浸膏粉(Oxoid)1g胰蛋白胨(Trypton)2g葡萄糖 0.05g蒸餾水 100mlpH值8.0±0.1；121℃，15min滅菌3)保存菌種瓊脂培養(yǎng)基配制酵母浸膏粉(Oxoid)2g蛋白胨 5g牛肉膏 1g氯化鈉 5g瓊脂粉 15g蒸餾水 1000mlpH值7.4±0.1；121℃，15min滅菌4)產(chǎn)芽胞瓊脂培養(yǎng)基配制酵母浸膏粉(Oxoid) 0.2g蛋白胨(Bacto-Peptone，Difco) 0.5g牛肉膏(Difco) 0.1gNaCl 0.5g瓊脂粉2g蒸餾水1000mlpH值8.0±0.1；121℃，15min滅菌
5)反應(yīng)管基質(zhì)配制NaCl 0.8g指示劑(0.2％BCP50％乙醇溶液) 2ml芽胞最終數(shù)量 1～5×108cfu/ml瓊脂 0.5g蒸餾水100mlpH值8.0±0.1；121℃，15min滅菌6)促反應(yīng)藥物粉配制酵母浸膏粉(Oxoid) 0.5g蛋白胨(Bacto-Peptone，Difco) 0.2g葡萄糖1.0gNaCl 0.5g準(zhǔn)確稱取配料表中所列各成分，預(yù)混后放入研缽內(nèi)充分研磨混合均勻即可成為促反應(yīng)藥物粉。將其按一定量分裝，足夠共100支反應(yīng)管使用量，每支反應(yīng)管使用量為0.02g?；蛘邔⑺幏刍靹虬韬煤笾苯釉趬浩瑱C(jī)上壓成0.02g/片的藥片。
快速檢測法檢測原理原料乳或消毒乳、乳粉等乳制品中含有一定量抗生素時，反應(yīng)管基質(zhì)中的嗜熱脂肪芽胞桿菌芽胞的萌發(fā)繁殖受到抑制，基質(zhì)中不能產(chǎn)生有機(jī)酸，pH指示劑不顯顏色變化；否則相反。
本方法的特征是1.它是由反應(yīng)試劑管(1)，促反應(yīng)藥片(2)、原乳樣品(3)和加熱測溫器件(9)組成，其特征在于反應(yīng)試劑管(1)內(nèi)含營養(yǎng)基質(zhì)(4)和嗜熱芽胞桿菌芽胞(5)組成，促反應(yīng)應(yīng)藥片(6)由促反應(yīng)物質(zhì)按一定比例配制而成，把反應(yīng)基(7)放入試劑管(8)中，再把反應(yīng)藥片(6)也投入試劑管中，同時放入加熱器中，加熱器在65℃保溫2:30′～3:00′觀看顏色變化檢測乳中抗生素類藥物殘留物。
2.試劑管中的溶液顏色變化，顏色由紫變黃表示乳中無有抗生素類藥物殘留；試劑管(8)中的溶液顏色紫色不變，表示有抗生素類藥物殘留。
3.芽胞的培養(yǎng)和收集純化的制備工藝嗜熱脂肪芽胞桿菌凍干菌種→活化培養(yǎng)增菌液、55℃、24h→擴(kuò)大培養(yǎng)同活化培養(yǎng)→產(chǎn)芽胞培養(yǎng)產(chǎn)芽胞培養(yǎng)基、0.1ml/平皿；55℃、24h～72h→鏡檢芽胞產(chǎn)率，產(chǎn)量達(dá)80％以上→收集→離心洗滌純化，4000rpm，10min→再次離心洗滌，2000rpm，10min→收集芽胞，1500rpm，15min→純化分離芽胞懸液，1×1010cfu/ml以上。
4.反應(yīng)試劑管(1)的生產(chǎn)工藝配料→加熱溶解→加指示劑→滅菌121℃，20min→加芽胞懸液混勻→無菌分裝→封口→檢驗→成品試劑盒。
5.嗜熱芽胞桿菌(5)，該菌種對廣譜性抗生素殘留物的檢測敏感性強(qiáng)，特別是對于青霉素和磺胺類藥物很靈敏。
6.增菌液的配制酵母浸膏粉(Oxoid)1g胰蛋白胨(Trypton)2g葡萄糖 0.05g蒸餾水 100mlpH值8.0±0.1；121℃，15min滅菌7.保存菌種用瓊脂培養(yǎng)基配制酵母浸膏粉(Oxoid)2g蛋白胨 5g牛肉膏 1g氯化鈉 5g瓊脂粉 15g蒸餾水 1000mlpH值7.4±0.1；121℃，15min滅菌8.產(chǎn)芽胞瓊脂培養(yǎng)基配制酵母浸膏粉(Oxoid)0.2g蛋白胨(Bacto-Peptone，Difco) 0.5g牛肉膏(Difco)0.1gNaCl0.5g瓊脂粉 2g蒸餾水 1000mlpH值8.0±0.1；121℃，15min滅菌9.反應(yīng)管基質(zhì)配制NaCl0.8g指示劑(0.2％BCP50％醇溶液) 2ml芽胞最終數(shù)量 1～5×108cfu/ml瓊脂 0.5g蒸餾水 100mlpH值8.0±0.1；121℃，15min滅菌
10.促反應(yīng)藥粉配制酵母浸膏粉(Oxoid) 0.5g蛋白胨(Bacto-Peptone，Difco) 0.2g葡萄糖1.0gNaCl 0.5g本快速檢測法的附表、附圖及說明如下表1 表示嗜熱脂肪芽胞桿菌對各種抗生素敏感性實驗結(jié)果表1
表2表示對不同濃度青霉素的反應(yīng)時間表2
表3 表示嗜熱脂肪芽胞桿菌芽胞制備的試管與其它檢測方法比較試驗結(jié)果。
表3


圖1表示快速檢測法的工藝流程。
本快速檢測法的關(guān)鍵、創(chuàng)新與優(yōu)越性該法是利用嗜熱脂肪芽胞桿菌的芽胞在短時間內(nèi)萌發(fā)生長的過程中，若遇生長抑制物質(zhì)而不能繼續(xù)代謝繁殖的特點開發(fā)的研究課題。其技術(shù)關(guān)鍵點在于微生物芽胞最適萌發(fā)條件的確定以及促激活劑成分的篩選和劑量的選定。另外，對乳中殘留的不同劑量各種抗生素的檢測靈敏與反應(yīng)現(xiàn)象判讀時間之間的關(guān)系的掌握和使其檢測性能穩(wěn)定化都是本發(fā)明成功的關(guān)鍵技術(shù)。
權(quán)利要求
1.一種原料乳中抗生素殘留物的快速檢測方法，它是由反應(yīng)試劑管(1)，促反應(yīng)藥片(2)、原乳樣品(3)和加熱測溫器件(9)組成，其特征在于反應(yīng)試劑管(1)內(nèi)含營養(yǎng)基質(zhì)(4)和嗜熱芽胞桿菌(5)組成，促反應(yīng)應(yīng)藥片(6)由促反應(yīng)物質(zhì)按一定比例配制而成，把反應(yīng)基(7)放入試劑管(8)中，再把反應(yīng)藥片(6)也投入試劑管中，同時放入加熱器中，加熱器在65℃保溫2:30′～3:00′觀看顏色變化檢測乳中殘留物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原料乳中抗生素殘留物的快速檢測方法，其特征在于試劑管中的溶液顏色變化，顏色由紫變黃表示乳中無有抗生素殘留；試劑管(8)中的溶液顏色紫色不變，表示有抗生素殘留。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原料乳中抗生素殘留物的快速檢測方法，其特征在于嗜熱脂肪芽胞桿菌芽胞的培養(yǎng)和收集純化的制備工藝嗜熱脂肪芽胞桿菌凍干菌種→活化培養(yǎng)增菌液、55℃、24h→擴(kuò)大培養(yǎng)同活化培養(yǎng)→產(chǎn)芽胞培養(yǎng)產(chǎn)芽胞培養(yǎng)基、0.1ml/平皿；55℃、24h～72h→鏡檢芽胞產(chǎn)率，產(chǎn)量達(dá)80％以上→收集→離心洗滌純化，4000rpm，10min→再次離心洗滌，2000rpm，10min→收集芽胞，1500rpm，15min→純化分離芽胞懸液，1×1010cfu/ml以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原料乳中抗生素殘留物的快速檢測方法其特征在于反應(yīng)試劑管(1)的生產(chǎn)工藝配料→加熱溶解→加指示劑→滅菌121℃，20min→加芽胞懸液混勻→無菌分裝→封口→檢驗→成品試劑盒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原料乳中抗生素殘留物的快速檢測方法，其特征在于嗜熱脂肪芽胞桿菌(5)，該菌種對廣譜性抗生素殘留物的檢測敏感性強(qiáng)，特別是對于青霉素和磺胺類藥物很靈敏。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原料乳中抗生素殘留物的快速檢測方法，其特征在于增菌液的配制酵母浸膏粉(Oxoid)1g胰蛋白胨(Trypton)2g葡萄糖 0.05g蒸餾水 100mlpH值8.0±0.1；121℃，15min滅菌
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原料乳中抗生素殘留物的快速檢測方法，其特征在于保存菌種用瓊脂培養(yǎng)基配制酵母浸膏粉(Oxoid) 2g蛋白胨5g牛肉膏1g氯化鈉5g瓊脂粉15g蒸餾水1000mlpH值7.4±0.1；121℃，15min滅菌
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原料乳中抗生素殘留物的快速檢測方法，其特征在于產(chǎn)芽胞瓊脂培養(yǎng)基配制酵母浸膏粉(Oxoid)0.2g蛋白胨(Bacto-Peptone，Difco) 0.5g牛肉膏(Difco)0.1gNaCl 0.5g瓊脂粉 2g蒸餾水 1000mlpH值8.0±0.1；121℃，15min滅菌
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原料乳中抗生素殘留物的快速檢測方法，其特征在于反應(yīng)管基質(zhì)配制NaCl0.8g指示劑(0.2％BCP50％乙醇溶液)2ml芽胞最終數(shù)量1～5×108cfu/ml瓊脂0.5g蒸餾水 100mlpH值8.0±0.1；121℃，15min滅菌
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原料乳中抗生素殘留物的快速檢測方法，其特征在于促反應(yīng)藥粉配制酵母浸膏粉(Oxoid) 0.5g蛋白胨(Bacto-Peptone，Difco)0.2g葡萄糖 1.0gNaCl0.5g
全文摘要
本發(fā)明涉及一種原料乳中抗生素殘留的快速檢測方法，是測定乳中含有微量的抗生素殘留物，它屬于微量物質(zhì)的檢測領(lǐng)域。其特點是在反應(yīng)試劑管內(nèi)含有營養(yǎng)基質(zhì)和嗜熱脂肪芽胞桿菌，放入促反應(yīng)藥片，再把反應(yīng)基放入試劑管中并在加熱器中加熱，觀看顏色變化檢測原料乳中殘留物。該法價格低廉，準(zhǔn)確靈敏、操作方便，是一種實用性很強(qiáng)的檢測技術(shù)。
文檔編號G01N33/50GK1696692SQ20041003782
公開日2005年11月16日 申請日期2004年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月11日
發(fā)明者張和平, 孟和畢力格, 孫志宏 申請人:張和平, 孟和畢力格, 孫志宏