專利名稱：牛奶中β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種牛奶中內(nèi)酰胺類抗生素殘留檢測方法，特別涉及用于牛奶中
e-內(nèi)酰胺類抗生素殘留快速檢測的定性與初步定量方法。
背景技術(shù)：
牛奶是一種僅次于人類母乳的營養(yǎng)成分最全、營養(yǎng)價(jià)值最高的液體食品。牛奶中 富含蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、糖類、鹽類、鈣、磷、鐵等營養(yǎng)物質(zhì)，以及維生素、酶和抗體等，最 容易被人體消化吸收。然而，在實(shí)際生產(chǎn)中牛奶存在抗生素問題，具有e-內(nèi)酰胺環(huán)的抗 生素如青霉素G、阿莫西林、氨芐西林、頭孢菌素、鄰氯青霉素等作為一種高效的獸藥在奶牛 飼養(yǎng)業(yè)中可醫(yī)治乳房炎等疾病，隨著生活水平的提高，牛奶中抗生素殘留問題日益受到消 費(fèi)者的重視，已成為乳業(yè)管理和技術(shù)監(jiān)督的聚焦問題之一。牛奶中不允許殘留抗生素，其 主要原因一方面是人們長期飲用或食用有抗生素殘留的奶制品，也就相當(dāng)于長期低劑量的 攝取抗生素，使人體產(chǎn)生耐藥性，給今后患病使用抗生素治療帶來不良影響，且對抗生素過 敏體質(zhì)的人會出現(xiàn)過敏反應(yīng)，危及健康，并對人體內(nèi)正常菌群的平衡狀態(tài)造成破壞，使菌群 失調(diào)，甚至造成二重感染，使重癥患者病情難以控制。另外，乳制品生產(chǎn)過程中發(fā)酵奶制品 (酸奶和干酪)的生產(chǎn)依賴于乳酸菌的生長，而乳酸菌的生長受抗菌素的強(qiáng)烈抑制，會導(dǎo)致 發(fā)酵失敗。世界糧農(nóng)組織(FA0)、世界衛(wèi)生組織(WHO)的食品法對牛奶中抗生素最高殘留 限量都有明確規(guī)定，歐盟亦對最大殘留量(MRLs)作了詳細(xì)的規(guī)定。我國農(nóng)業(yè)部2001年頒 布實(shí)施了《無公害食品生鮮牛乳行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》，對新鮮牛乳的衛(wèi)生指標(biāo)明確了 "抗生素不得檢 出"。 現(xiàn)有技術(shù)中，已應(yīng)用的13 -內(nèi)酰胺類抗生素殘留技術(shù)有微生物檢測法如TTC法，理 化檢測方法包括分光光度法、熒光、色譜、化學(xué)發(fā)光等技術(shù)，以及免疫分析法等。上述方法在 檢測精密度等方面各有所長，有的靈敏度低、選擇性差；有的操作過程步驟較為繁瑣，有的 需購置昂貴儀器，但大都存在檢測耗時(shí)長、成本高的缺點(diǎn)，使乳品加工企業(yè)造成諸多不便。
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)之不足，提供一種操作方法簡便、快速、檢測結(jié)果 準(zhǔn)確、試劑用量小減輕對環(huán)境污染、無需價(jià)格昂貴設(shè)備的牛奶中13-內(nèi)酰胺類抗生素殘留 檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明方法的特征是，所說的方法包括以下步驟 (1)將無抗牛奶作為空白樣品和待測樣品分別與離心試劑酸化乙腈按照體積比=
2 : (l-4)混合，然后離心分離，所說的酸化乙腈是由鹽酸乙腈按體積比=i : (l-5)混
合配制的； (2)用l-10X的稀硫酸調(diào)節(jié)離心后樣品上清液pH值為2-6，加入濃度為0. l_2g/L 的重金屬鹽溶液與離心上清液搖勻后靜置反應(yīng)5-15min，重金屬鹽溶液加入量為上清液與 重金屬鹽溶液體積比2 : 1 ;
3
(3)用紫外分光光度計(jì)測試反應(yīng)后產(chǎn)物紫外吸收光度值，記錄并對比數(shù)據(jù)判斷待 測牛奶樣品是否殘留有內(nèi)酰胺類抗生素；判斷方法與空白牛奶樣品比較，樣品吸收度 比空白吸收度大，即含有抗生素且會影響奶制品發(fā)酵結(jié)塊狀態(tài)，其吸收度差值越大，則牛奶 中內(nèi)酰胺類抗生素含量越高并可能會使酸奶發(fā)酵無法結(jié)塊，抗生素的具體含量可以根 據(jù)標(biāo)準(zhǔn)13-內(nèi)酰胺類抗生素制作的工作曲線求得，本方法對13-內(nèi)酰胺類抗生素含量的檢 測范圍為0. 01-50mg/L。所說的離心分離條件為800-3000r/min，離心3_10min。 所說的重金屬鹽溶液為硫酸銅溶液、硫酸鋅溶液、硫酸錳溶液、硫酸鎘溶液、醋酸 鉛溶液、氯化鈷溶液、硝酸鎳溶液中任一種。所述的紫外分光光度法測試波長選擇范圍為240-380nm。
同現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)或積極效果
1、本發(fā)明所需樣品量及各種試劑用量少對環(huán)境為害小； 2、檢測速度快，全部操作過程可在30min內(nèi)完成，抗生素的快速檢測為乳品加工 企業(yè)生產(chǎn)降低成本減輕運(yùn)作風(fēng)險(xiǎn)提供了保證； 3、無需購置昂貴抗生素檢測儀器，只需配備低速離心機(jī)與紫外分光光度計(jì)即可完 成檢測； 4、本方法經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，準(zhǔn)確率高； 5、操作方法簡單，對操作人員無特殊技術(shù)要求； 6、本方法對|3 _內(nèi)酰胺類抗生素總含量檢測范圍寬，檢測靈敏度高。
具體實(shí)施例方式
下面用實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此，保護(hù)范
圍以權(quán)利要求為準(zhǔn)。本發(fā)明實(shí)施例中牛奶樣品均為市購新鮮牛奶。
實(shí)施例1 1、將100毫升無抗生素牛奶(空白)樣品和100毫升待測牛奶樣品分別與50毫 升酸化乙腈混合，然后在3000r/min條件下離心3min，所說的酸化乙腈是由鹽酸乙腈按 體積比=1:l配制的； 2、然后用1 %的稀硫酸調(diào)節(jié)離心后樣品上清液pH值至6，按照與上清液體積比 1 : 2加入0. lg/L硫酸銅溶液，搖勻后靜置反應(yīng)15min; 3、用紫外分光光度計(jì)于240nm測試反應(yīng)后上清液紫外吸收光度值，記錄并對比數(shù) 據(jù)判斷待測牛奶樣品是否殘留有P-內(nèi)酰胺類抗生素。 記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算得出其中空白樣品13-內(nèi)酰胺類抗生素含量為0.01mg/L，待測樣 品P _內(nèi)酰胺類抗生素含量為45. 91mg/L，對待測樣品進(jìn)行酸奶發(fā)酵沒有結(jié)塊，不能用作酸 奶制品原料奶。該法檢測結(jié)果與用GB-19301-2003檢測結(jié)果一致。
實(shí)施例2 : 1、將100毫升無抗生素牛奶(空白)樣品和100毫升待測牛奶樣品分別200毫升 酸化乙腈混合，然后在800r/min條件下離心10min，所說的酸化乙腈是由鹽酸乙腈按體 積比=1:2配制的； 2、然后用10X的稀硫酸調(diào)節(jié)離心后樣品上清液pH值至2，按照與上清液體積比1 : 2加入2g/L醋酸鉛溶液搖勻后靜置反應(yīng)5min ; 3、用紫外分光光度計(jì)于380nm測試反應(yīng)后上清液紫外吸收光度值，記錄并對比數(shù)據(jù)判斷待測牛奶樣品是否殘留有P-內(nèi)酰胺類抗生素。 記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算得出其中空白樣品13-內(nèi)酰胺類抗生素含量為0.85mg/L，待測樣品P-內(nèi)酰胺類抗生素含量為1.04mg/L，對待測樣品進(jìn)行酸奶發(fā)酵結(jié)塊狀態(tài)良好，可用作酸奶制品原料奶。該法檢測結(jié)果與用GB-19301-2003檢測結(jié)果一致。
實(shí)施例3 : l，將100毫升無抗生素牛奶(空白)樣品和100毫升待測牛奶樣品分別100毫升酸化乙腈混合，然后在1500r/min條件下離心8min，所說的酸化乙腈是由鹽酸乙腈按體積比=1:5配制的； 2，用6X稀硫酸調(diào)節(jié)離心后樣品上清液pH值至3，按照與上清液體積比l : 2加入lg/L氯化鈷溶液搖勻后靜置反應(yīng)8min ; 3，用紫外分光光度計(jì)于320nm測試反應(yīng)后上清液紫外吸收光度值，記錄并對比數(shù)據(jù)判斷待測牛奶樣品是否殘留有P-內(nèi)酰胺類抗生素。 記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算得出其中空白樣品13-內(nèi)酰胺類抗生素含量為0.93mg/L，待測樣品P-內(nèi)酰胺類抗生素含量為1.21mg/L，對待測樣品進(jìn)行酸奶發(fā)酵結(jié)塊狀態(tài)良好，可用作酸奶制品原料奶。該法檢測結(jié)果與用GB-19301-2003檢測結(jié)果一致。
實(shí)施例4 : 1、將100毫升無抗生素牛奶(空白)樣品和100毫升待測牛奶樣品分別與50毫升酸化乙腈混合后在3000r/min條件下離心3min;，所說的酸化乙腈是由鹽酸乙腈按體積比=1:3配制的； 2，用1X的稀硫酸調(diào)節(jié)離心后樣品上清液pH值至6，按照與上清液體積比1 : 2加入0. 5g/L硫酸鋅溶液搖勻后靜置反應(yīng)15min ; 3，用紫外分光光度計(jì)于240nm測試反應(yīng)后上清液紫外吸收光度值，記錄并對比數(shù)據(jù)判斷待測牛奶樣品是否殘留有P-內(nèi)酰胺類抗生素。 記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算得出其中空白樣品13-內(nèi)酰胺類抗生素含量為0.73mg/L，待測樣品P _內(nèi)酰胺類抗生素含量為27. 91mg/L，對待測樣品進(jìn)行酸奶發(fā)酵沒有結(jié)塊，不能用作酸奶制品原料奶。該法檢測結(jié)果與用GB-19301-2003檢測結(jié)果一致。
實(shí)施例5 : 與實(shí)施例1基本相同，只是將重金屬鹽溶液變更為lg/L硫酸錳溶液，在波長285nm紫外檢測條件下實(shí)施，記錄數(shù)據(jù)計(jì)算得出其中空白樣品P _內(nèi)酰胺類抗生素含量為1.45mg/L，待測樣品13-內(nèi)酰胺類抗生素含量為1.59mg/L，對待測樣品進(jìn)行酸奶發(fā)酵結(jié)塊狀態(tài)良好，可用作酸奶制品原料奶。該法檢測結(jié)果與用GB-19301-2003檢測結(jié)果一致。
實(shí)施例6 : 與實(shí)施例2基本相同，只是將重金屬鹽溶液變?yōu)?g/L硫酸鎘溶液，在波長305nm紫外檢測條件下實(shí)施，記錄數(shù)據(jù)計(jì)算得出其中空白樣品13-內(nèi)酰胺類抗生素含量為0.82mg/L，待測樣品13-內(nèi)酰胺類抗生素含量為1.43mg/L，對待測樣品進(jìn)行酸奶發(fā)酵結(jié)塊狀態(tài)良好，可用作酸奶制品原料奶。該法檢測結(jié)果與用GB-19301-2003檢測結(jié)果一致。
實(shí)施例7 :
5
與實(shí)施例2基本相同，只是將重金屬鹽溶液變?yōu)?. 5g/L硝酸鎳，在波長265nm紫外檢測條件下溶液實(shí)施，記錄數(shù)據(jù)計(jì)算得出其中空白樣品13-內(nèi)酰胺類抗生素含量為1. 32mg/L，待測樣品13 -內(nèi)酰胺類抗生素含量為2. 01mg/L，對待測樣品進(jìn)行酸奶發(fā)酵結(jié)塊狀態(tài)一般，可用作酸奶制品原料奶。該法檢測結(jié)果與用GB-19301-2003檢測結(jié)果一致。
權(quán)利要求
一種牛奶中β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留的檢測方法，其特征是，所說的方法包括以下步驟(1)將無抗牛奶作為空白樣品和待測樣品分別與離心試劑酸化乙腈按照體積比＝2∶1-4混合，然后離心分離，所說的酸化乙腈是由鹽酸∶乙腈按體積比＝1∶1-5混合配制的；(2)用1-10％的稀硫酸調(diào)節(jié)離心后樣品上清液pH值為2-6，加入濃度為0.1-2g/L的重金屬鹽溶液與離心上清液搖勻后靜置反應(yīng)5-15min，重金屬鹽溶液加入量為上清液與重金屬鹽溶液體積比2∶1；(3)用紫外分光光度計(jì)測試反應(yīng)后產(chǎn)物紫外吸收光度值，記錄并對比數(shù)據(jù)判斷待測牛奶樣品是否殘留有β-內(nèi)酰胺類抗生素；判斷方法與空白牛奶樣品比較，樣品吸收度比空白吸收度大，即含有抗生素且會影響奶制品發(fā)酵結(jié)塊狀態(tài)，其吸收度差值越大，則牛奶中β-內(nèi)酰胺類抗生素含量越高并可能會使酸奶發(fā)酵無法結(jié)塊，抗生素的具體含量可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)β-內(nèi)酰胺類抗生素制作的工作曲線求得，本方法對β-內(nèi)酰胺類抗生素含量的檢測范圍為0.01-50mg/L。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的檢測方法，所說的離心分離條件為800-3000r/min，離心3-10min。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的檢測方法，所說的重金屬鹽溶液為硫酸銅溶液、硫酸鋅溶液、硫酸錳溶液、硫酸鎘溶液、醋酸鉛溶液、氯化鈷溶液、硝酸鎳溶液中任一種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的檢測方法，其特征是，所述的紫外分光光度法測試波長選擇范圍為240-380nm。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3的檢測方法，其特征是，所述的紫外分光光度法測試波長選擇范圍為240-380nm。
全文摘要
本發(fā)明提供一種牛奶中β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留檢測方法。通過離心、β-內(nèi)酰胺類抗生素與重金屬化學(xué)反應(yīng)及紫外分光光度法測試三個(gè)步驟檢測牛奶中β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留，檢測過程中所需樣品量及各種試劑用量少，對環(huán)境危害?。粰z測速度快，全部操作過程可在30min內(nèi)完成；無需購置昂貴抗生素檢測儀器，只需配備低速離心機(jī)與紫外分光光度計(jì)即可完成檢測。
文檔編號G01N21/78GK101706440SQ200910218268
公開日2010年5月12日 申請日期2009年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月2日
發(fā)明者劉謀盛, 張丹揚(yáng), 張尹, 楊亞玲 申請人:昆明理工大學(xué)