技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及層析領(lǐng)域，且更具體地涉及適用于抗體分離的新穎的親和配體。因而，本發(fā)明包括這樣的親和配體，包含根據(jù)本發(fā)明的配體的層析基質(zhì)，和抗體分離方法，其中使用根據(jù)本發(fā)明的配體。
背景技術(shù)：
：術(shù)語(yǔ)層析包括一族密切相關(guān)的分離方法，它們基于2個(gè)互不混溶相的接觸，其中一個(gè)相是固定相，且另一個(gè)相是流動(dòng)相。一個(gè)在其中層析非常重要的領(lǐng)域是生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，例如用于藥物和診斷劑的大規(guī)模經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)。一般而言，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)地或通過(guò)分泌進(jìn)周?chē)呐囵B(yǎng)基中來(lái)生產(chǎn)蛋白。由于使用的細(xì)胞系是活生物，所以必須給它們飼喂含有糖、氨基酸、生長(zhǎng)因子等的復(fù)合生長(zhǎng)培養(yǎng)基。從飼喂給細(xì)胞的化合物的混合物和從其它細(xì)胞組分分離所需蛋白至足夠的純度，例如用作人治療劑，提出了巨大挑戰(zhàn)。在這樣的分離中，在第一步中，通常通過(guò)過(guò)濾來(lái)去除細(xì)胞和/或細(xì)胞碎片。一旦已經(jīng)得到含有目標(biāo)蛋白的澄清溶液，就經(jīng)常使用不同層析步驟(經(jīng)?；诓煌姆蛛x原理)的組合，將目標(biāo)蛋白與溶液的其它組分分離。因而，這種步驟基于電荷、疏水性程度、親和力性質(zhì)、大小等，從混合物分離蛋白。幾種不同的層析基質(zhì)，例如用于離子交換、疏水作用層析(HIC)、反相層析(RPC)、親和層析和固定化金屬親和層析(IMAC)的基質(zhì)，可用于這些技術(shù)的每種，從而允許使純化方案適合包含的特定蛋白。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有不斷增加的重要性的一種示例性的蛋白是免疫球蛋白，也稱(chēng)作抗體，例如免疫球蛋白G(IgG)。與在所有處理技術(shù)中一樣，重要的目的是保持低的生產(chǎn)成本。結(jié)果，經(jīng)常提出改進(jìn)的層析技術(shù)，并可能時(shí)重新使用基質(zhì)。但是，由于層析基質(zhì)的每次使用都會(huì)留下剛剛進(jìn)行的操作的某些痕跡，許多不同的清潔規(guī)程都可以用于清潔和/或恢復(fù)基質(zhì)到它的原始形式。需要去除的普遍已知的材料是例如未洗脫的蛋白和蛋白聚集體以及潛在有害的材料，例如病毒、內(nèi)毒素等，它們可以源自細(xì)胞培養(yǎng)。最常用的清潔是用緩沖液簡(jiǎn)單洗滌。為了更有效地清潔基質(zhì)，經(jīng)常使用酸和/或堿處理。為了甚至更有效地恢復(fù)基質(zhì)，常用稱(chēng)作原位清潔(CleaningInPlace)(CIP)的堿性方法。標(biāo)準(zhǔn)的CIP包含用1MNaOH、pH14處理基質(zhì)。這種苛刻處理將有效地去除上面討論的類(lèi)型的不希望的污垢，但是可能另外損害一些層析基質(zhì)材料。例如，其中配體是蛋白或基于蛋白的許多親和基質(zhì)不能耐得住標(biāo)準(zhǔn)的CIP，至少在維持它們的原始性質(zhì)時(shí)不能。已知結(jié)構(gòu)修飾，例如在堿性條件下天冬酰胺和谷氨酰胺殘基肽主鏈的脫酰胺作用和切割，是在堿性溶液中處理蛋白后喪失活性的主要原因，且天冬酰胺是這二者中最敏感的。還已知脫酰胺作用速率是高度特異性的和構(gòu)象依賴(lài)性的，且蛋白中最短的脫酰胺作用半衰期已經(jīng)與序列-天冬酰胺-甘氨酸-和-天冬酰胺-絲氨酸相關(guān)聯(lián)。參見(jiàn)例如Gülich，Linhult，Nygren，Uhlen和Hober(2000)JournalofBiotechnology80，169-178。對(duì)堿性條件的穩(wěn)定性可以被人工改造入蛋白配體。盡管有文件證明的堿敏感性，但A蛋白廣泛用作親和層析基質(zhì)中的配體，這是因?yàn)樗慕Y(jié)合IgG、而不顯著影響免疫球蛋白對(duì)抗原的親和力的能力。眾所周知，A蛋白是細(xì)菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的細(xì)胞壁的組分。這種葡萄球菌蛋白(稱(chēng)作SpA)由5個(gè)結(jié)構(gòu)域(按照從N末端的次序命名為E、D、A、B和C，它們能在Fc區(qū)域結(jié)合抗體)和不結(jié)合任何抗體的C-末端區(qū)域(或“X”區(qū)域)組成。Jansson等人(Jansson，Uhlen和Nygren(1998)FEMSImmunologyandMedicalMicrobiology20，69-78：“AllindividualdomainsofstaphylococcalproteinAshowFabbinding”)后來(lái)表明，所有個(gè)別的SpA結(jié)構(gòu)域也在Fab區(qū)域結(jié)合某些抗體。US5，151，350(Repligen)涉及編碼A蛋白和A蛋白-樣材料的基因的克隆和表達(dá)。該基因的克隆和它的核苷酸序列表征使得1982年首次能夠得到用于在不同的宿主-載體系統(tǒng)中克隆的大量A蛋白-樣材料和核苷酸序列。由于實(shí)現(xiàn)了A蛋白在重組系統(tǒng)中的生產(chǎn)，已經(jīng)提出其它的基因操作。例如，US5,260,373(Repligen)描述了重組蛋白A的基因操作，以促進(jìn)其與支持物的附著，且更具體地其通過(guò)精氨酸的偶聯(lián)。此外，US6,399,750(PharmaciaBiotechAB)描述了另一種重組A蛋白配體，其已經(jīng)通過(guò)半胱氨酸偶聯(lián)至支持物上。但是，為了維持選擇性和結(jié)合容量，需要在比常規(guī)CIP更溫和的條件下清潔上面討論的類(lèi)型的A蛋白層析基質(zhì)。在該上下文中，應(yīng)當(dāng)理解，清潔與層析基質(zhì)的壽命密切相關(guān)。例如，如果降低的性能是可接受的，那么可以用標(biāo)準(zhǔn)的CIP清潔敏感的基質(zhì)。因而，已經(jīng)作出努力來(lái)提供呈現(xiàn)出A蛋白的突出性質(zhì)(例如選擇性)、但是更耐受CIP所用堿性條件的層析基質(zhì)。因而，US6,831,161(Uhlén等人)涉及使用固定化的蛋白親和配體的親和分離方法，其中已經(jīng)修飾一個(gè)或多個(gè)天冬酰胺(Asn)殘基來(lái)增加堿穩(wěn)定性。該專(zhuān)利也描述了制備穩(wěn)定化的組合蛋白的方法，其通過(guò)修飾蛋白分子內(nèi)的Asn殘基，以增加蛋白在堿性條件下的穩(wěn)定性，并隨機(jī)化蛋白分子，以修飾它的結(jié)合特征實(shí)現(xiàn)，和組合蛋白，其中在與隨機(jī)化步驟分開(kāi)的步驟中，已經(jīng)通過(guò)修飾一個(gè)或多個(gè)它的Asn殘基，增加了蛋白在堿性條件下的穩(wěn)定性。此外，WO03/080655(AmershamBiosciences)涉及免疫球蛋白-結(jié)合蛋白，其中至少一個(gè)天冬酰胺殘基已經(jīng)突變成谷氨酰胺或天冬氨酸以外的氨基酸。根據(jù)該專(zhuān)利申請(qǐng)，這種更特異性的突變?cè)谧罡哌_(dá)約13-14的pH值賦予比親本分子增加的化學(xué)穩(wěn)定性。突變的蛋白可以例如源自能結(jié)合免疫球蛋白分子的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)以外的區(qū)域的蛋白，例如A蛋白，優(yōu)選源自葡萄球菌A蛋白的B-結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明也涉及親和分離基質(zhì)，它包含所述突變的免疫球蛋白-結(jié)合蛋白作為配體。盡管存在上述向更加堿穩(wěn)定的基于A蛋白的層析配體的發(fā)展，但改進(jìn)的配體和層析基質(zhì)領(lǐng)域中仍然需要抗體的高特異性分離和允許更容易生產(chǎn)的替代性的野生型配體構(gòu)建。在US2006/0134805(Berg等人)中描述了這樣的改進(jìn)的層析基質(zhì)的一個(gè)實(shí)例，它涉及包含已經(jīng)固定化了抗體-結(jié)合蛋白配體的多孔顆粒的分離基質(zhì)。更具體地，已經(jīng)在配體密度、凝膠相分配系數(shù)(Kav)和顆粒大小方面最優(yōu)化了公開(kāi)的層析基質(zhì)，以提供特別適合于抗體的高容量純化的基質(zhì)。公開(kāi)的基質(zhì)的配體可以包含抗體-結(jié)合蛋白例如A蛋白、G蛋白和/或L蛋白。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個(gè)方面是，提供新穎的層析配體，它能耐得住重復(fù)原位清潔循環(huán)。這可以由所附權(quán)利要求書(shū)定義的、基于來(lái)自SpA結(jié)構(gòu)域C的結(jié)構(gòu)域C的親和配體來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是，提供純化免疫球蛋白的經(jīng)濟(jì)方法。這可以由使用能耐得住重復(fù)原位清潔循環(huán)的親和層析配體的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。從下面的詳細(xì)公開(kāi)內(nèi)容中將明白本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點(diǎn)。附圖說(shuō)明圖1顯示了與其它基于蛋白的配體相比，根據(jù)本發(fā)明的配體的堿穩(wěn)定性的測(cè)試結(jié)果。圖2顯示了與其它基于蛋白的配體相比，根據(jù)本發(fā)明的配體的Fab-結(jié)合性質(zhì)的測(cè)試結(jié)果。具體實(shí)施方式定義術(shù)語(yǔ)結(jié)構(gòu)域C或“其功能片段或變體”包括SpA結(jié)構(gòu)域C的片段或變體，它們具有在Fc區(qū)域結(jié)合IgG的性質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“抗體”和“免疫球蛋白”在本文中可互換使用，且理解為也包括包含抗體和抗體片段的融合蛋白。術(shù)語(yǔ)“Fc-結(jié)合蛋白”是指能結(jié)合抗體的可結(jié)晶部分(Fc)的蛋白，且包括例如A蛋白和G蛋白或其維持所述結(jié)合性質(zhì)的任意片段或融合蛋白。術(shù)語(yǔ)“Fab片段”是指抗體的可變部分；因此“Fab-結(jié)合配體”能通過(guò)Fab-結(jié)合來(lái)結(jié)合完整抗體；或結(jié)合抗體片段，后者包括也稱(chēng)作Fab片段的可變部分。術(shù)語(yǔ)“層析”在本文中用于利用層析原理的任意種類(lèi)的分離，且因此包括分批以及HPLC方法。術(shù)語(yǔ)“親和層析”在本文中用于特定層析模式，其中配體通過(guò)生物親和力以“鎖-鑰”方式與靶相互作用。在親和層析中有用的相互作用的實(shí)例是例如酶-底物相互作用、生物素-抗生物素蛋白相互作用、抗體-抗原相互作用等。術(shù)語(yǔ)“基于蛋白的”配體在本文中指包含肽或蛋白的配體、或肽的部分或蛋白的部分。術(shù)語(yǔ)抗體的“分離”在本文中用作包括：從包含其它蛋白例如其它抗體和其它組分的混合物純化特定產(chǎn)物抗體，以及從產(chǎn)物液體分離抗體，即去除不希望的抗體。發(fā)明詳述因而，本發(fā)明涉及一種新穎的層析配體?；诘鞍椎那覍儆谝阎獮橛H和配體的類(lèi)型的根據(jù)本發(fā)明的層析配體包含來(lái)自葡萄球菌A蛋白(SpA)的全部或部分結(jié)構(gòu)域C。在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及層析配體，該配體包含一個(gè)或多個(gè)來(lái)自葡萄球菌A蛋白(SpA)的結(jié)構(gòu)域C單位或其功能片段或變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的層析配體基本上是堿穩(wěn)定的。在該上下文中，術(shù)語(yǔ)“基本上堿穩(wěn)定的”理解為是指，該配體能耐得住使用堿性洗液的重復(fù)原位清潔循環(huán)，而不釋放它的結(jié)合容量。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明是層析配體，它包含來(lái)自葡萄球菌A蛋白(SpA)的結(jié)構(gòu)域C，但是不包含SpA的其它結(jié)構(gòu)域。在替代方面，本發(fā)明涉及層析配體，該配體包含一個(gè)或多個(gè)來(lái)自葡萄球菌A蛋白(SpA)的結(jié)構(gòu)域C單位或其功能片段或變體，該層析配體能結(jié)合抗體的Fab部分，如下面更詳細(xì)討論的。如上面所討論的，Jansson等人已經(jīng)表明，結(jié)構(gòu)域C可以充當(dāng)獨(dú)立的免疫球蛋白吸附劑，不僅僅充當(dāng)A蛋白的部分。發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)，結(jié)構(gòu)域C的免疫球蛋白結(jié)合性質(zhì)完全適宜于它作為層析配體的應(yīng)用。也如上面所討論的，Gülich等人已經(jīng)表明，在堿性條件下的天冬酰胺和谷氨酰胺殘基是在堿溶液中處理后喪失A蛋白活性的主要原因，且天冬酰胺是這二者中最敏感的。結(jié)果，沒(méi)有預(yù)見(jiàn)到含有多至6個(gè)天冬酰胺殘基的結(jié)構(gòu)域C配體呈現(xiàn)出與A蛋白相比任何實(shí)質(zhì)的堿穩(wěn)定性。但是，如下面實(shí)驗(yàn)部分和圖1所示，本發(fā)明人已經(jīng)非常令人驚奇地表明，通過(guò)在堿性條件下溫育長(zhǎng)至20小時(shí)的時(shí)間，SpA結(jié)構(gòu)域C呈現(xiàn)出與可商業(yè)上得到的A蛋白產(chǎn)物(MabSelectTM，GEHealthcare，Uppsala，瑞典)相比提高許多的堿穩(wěn)定性。事實(shí)上，結(jié)構(gòu)域C配體呈現(xiàn)與銷(xiāo)售的堿穩(wěn)定的產(chǎn)物(MabSelectTMSuRe，GEHealthcare，Uppsala，瑞典)類(lèi)似的堿穩(wěn)定性值，其中天冬酰胺殘基已經(jīng)突變成其它氨基酸。除此以外，如上面所討論的，已經(jīng)表明，特別堿敏感的脫酰胺作用速率是高度特異性的和構(gòu)象依賴(lài)性的，且已經(jīng)將最短的脫酰胺作用半衰期與序列-天冬酰胺-甘氨酸-和-天冬酰胺-絲氨酸相關(guān)聯(lián)。非常令人驚奇地，本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域C配體呈現(xiàn)本文提出的有利的堿穩(wěn)定性，盡管在殘基28和29(使用結(jié)構(gòu)域C的殘基的常規(guī)編號(hào))之間存在一個(gè)天冬酰胺-甘氨酸鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的配體在0.5MNaOH中能耐得住至少10小時(shí)，而不偏離它的原始免疫球蛋白結(jié)合容量超過(guò)約10％、且優(yōu)選僅僅5％。因而，5小時(shí)后，它將不偏離它的原始結(jié)合容量超過(guò)10％、優(yōu)選5％。換而言之，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是上述配體，其在0.5MNaOH中溫育5小時(shí)后，保留它的原始結(jié)合容量的至少95％。在有利的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的配體能在0.5MNaOH中耐得住至少15小時(shí)，而不釋放它的原始免疫球蛋白結(jié)合容量超過(guò)約20％、且優(yōu)選僅僅10％。在更有利的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的配體能在0.5MNaOH中耐得住至少20小時(shí)，而不釋放它的原始免疫球蛋白結(jié)合容量超過(guò)約30％、且優(yōu)選僅僅15％。換而言之，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是上述配體，其在0.5MNaOH中溫育15小時(shí)后，保留它的原始結(jié)合容量的至少80％、有利地至少90％。通過(guò)使候選配體與氫氧化鈉溫育，例如如實(shí)驗(yàn)部分所述，并隨后通過(guò)常規(guī)層析實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)合容量，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地測(cè)試堿穩(wěn)定性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地明白的，根據(jù)本發(fā)明的層析配體可以由在本文中表示為Cwt的SEQIDNO1所示的野生型SpA結(jié)構(gòu)域C氨基酸序列組成。在替代實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的層析配體由SpA結(jié)構(gòu)域C的功能片段組成，例如SEQIDNO2所示的那個(gè)，它公開(kāi)了本文表示為Cdel的序列，其中與野生型SpA結(jié)構(gòu)域C序列相比已經(jīng)缺失了在位置3-6的Asn-Lys-Phe-Asn。在另外替代性的實(shí)施方案中，通過(guò)將例如一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加到野生型SpA結(jié)構(gòu)域C氨基酸序列的任一端，或通過(guò)野生型SpA結(jié)構(gòu)域C氨基酸序列的突變，制備SpA結(jié)構(gòu)域C的變體，前提是這種突變基本上不干擾本文所述的與免疫球蛋白-結(jié)合和堿穩(wěn)定性有關(guān)的性質(zhì)。因而，在特定的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的層析配體包含SEQIDNO1所示的SpA結(jié)構(gòu)域C，其另外包含突變G29A?；蛘?，根據(jù)該實(shí)施方案的層析配體包含SEQIDNO2所示的缺失的SpA結(jié)構(gòu)域C，其因而包含在位置25的所述突變(即G25A)。如技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的，與野生型序列相比這種氨基酸的添加、突變或缺失優(yōu)選地應(yīng)基本上不影響SpA結(jié)構(gòu)域C配體的折疊模式。因而，在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的配體的氨基酸序列是SEQIDNO1定義的序列。在具體的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的配體包含SEQIDNO1所示氨基酸的至少60％、有利地至少80％、更有利地至少90％和最有利地至少95％、例如約98％。在具體的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的配體包含SEQIDNO1所示氨基酸的至少35個(gè)、有利地至少46個(gè)、更有利地至少52個(gè)、和最有利地至少55個(gè)、例如57個(gè)。在替代實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的配體的氨基酸序列是SEQIDNO2定義的序列。在具體的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的配體包含SEQIDNO2所示氨基酸的至少40％、有利地至少77％、更有利地至少％和最有利地至少94％、例如約98％。在具體的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的配體包含SEQIDNO2所示氨基酸的至少31個(gè)、有利地至少42個(gè)、更有利地至少48個(gè)、和最有利地至少51個(gè)、例如53個(gè)。如上面背景部分所討論的，方法可以容易地用于通過(guò)某些氨基酸(優(yōu)選含有氮和/或硫原子的氨基酸)偶聯(lián)蛋白配體，參見(jiàn)例如USP6,399,750或USP5,084,559。因而，在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的配體另外包含末端偶聯(lián)基團(tuán)，所述基團(tuán)優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)氮和/或硫原子。在有利的實(shí)施方案中，所述末端偶聯(lián)基團(tuán)包含精氨酸或半胱氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述偶聯(lián)基團(tuán)在C末端區(qū)域中。此外，本發(fā)明也涉及包含至少2個(gè)上面定義的結(jié)構(gòu)域C單位或其功能片段或變體的多聚體層析配體(也表示為“多聚體”)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該多聚體不包含源自SpA的單位。在具體的實(shí)施方案中，該多聚體不包含其它基于蛋白的單位。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該多聚體不包含能與靶例如抗體或Fab片段發(fā)生任何實(shí)質(zhì)相互作用的其它單位，因而它不包含其它配體單位。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的，多聚體的制備可能需要加入一種或多種肽作為單位之間的接頭。因而，限于僅包含根據(jù)本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域C單位的多聚體可以另外包含允許構(gòu)建多聚體的接頭，在所述多聚體中，每個(gè)結(jié)構(gòu)域C單位充分暴露，以能參與靶的結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多聚體包含一個(gè)或多個(gè)另外的單位，它們不同于結(jié)構(gòu)域C，且優(yōu)選基于蛋白、且與結(jié)構(gòu)域C同樣堿穩(wěn)定。因而，在多聚體中，根據(jù)本發(fā)明的配體可以重復(fù)，和/或與來(lái)自其它來(lái)源(例如其它蛋白)的其它單位相組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，多聚體包含2-8個(gè)單位，例如4-6個(gè)單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，將一個(gè)或多個(gè)接頭序列插入多聚體單位之間。這種接頭可以例如插入，以允許實(shí)際的配體單位維持它們的折疊模式。在該上下文中的接頭是眾所周知的，技術(shù)人員可以容易地決定不干擾本文討論的配體的性質(zhì)的合適的氨基酸和鏈長(zhǎng)度。在具體的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的層析配體不包含除結(jié)構(gòu)域C以外的其它SpA結(jié)構(gòu)域。在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及編碼上述層析配體的核酸序列。因而，本發(fā)明包括編碼所述配體的本發(fā)明核酸序列的所有形式，例如RNA和DNA。本發(fā)明包括載體，例如質(zhì)粒，其除了編碼序列以外，還包含根據(jù)本發(fā)明的配體的表達(dá)所需的信號(hào)序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體包含編碼根據(jù)本發(fā)明的多聚體配體的核酸，其中編碼每個(gè)單位的分開(kāi)的核酸可以具有同源的或異源的DNA序列。這方面也包括包含編碼根據(jù)本發(fā)明的配體的核酸序列的表達(dá)系統(tǒng)。表達(dá)系統(tǒng)可以例如是原核宿主細(xì)胞系統(tǒng)，例如已經(jīng)修飾成表達(dá)本發(fā)明的配體的大腸桿菌(E.coli)。在替代實(shí)施方案中，表達(dá)系統(tǒng)是真核宿主細(xì)胞系統(tǒng)，例如酵母。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白的，根據(jù)本發(fā)明的配體可以替代地通過(guò)蛋白合成方法來(lái)生產(chǎn)，其中所述配體通過(guò)自動(dòng)化方法來(lái)得到，所述自動(dòng)化方法按照預(yù)定順序一次添加一個(gè)氨基酸。在有利的實(shí)施方案中，合成氨基酸序列的區(qū)段，并彼此連接，以制備根據(jù)本發(fā)明的配體。這種合成和連接程序是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。在第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含偶聯(lián)到不溶載體上的上述配體的層析基質(zhì)。這種載體可以是一個(gè)或多個(gè)顆粒，例如珠或不規(guī)則形狀；膜；濾器；毛細(xì)管；整體料(monolith)；和在層析中常用的任意其它形式。因而，在基質(zhì)的有利的實(shí)施方案中，所述載體包含基本上球形的顆粒，也稱(chēng)作珠。合適的顆粒大小可以在5-500μm、例如10-100μm、例如20-80μm的直徑范圍內(nèi)。在替代實(shí)施方案中，所述載體是膜。為了得到高吸附容量，所述載體優(yōu)選是多孔的，且然后將配體偶聯(lián)到外表面以及孔表面。因而，在根據(jù)本發(fā)明的基質(zhì)的有利的實(shí)施方案中，所述載體是多孔的。載體可以從有機(jī)或無(wú)機(jī)材料制備。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體從天然聚合物制備，例如交聯(lián)的碳水化合物材料，例如瓊脂糖、瓊脂、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、魔芋(koniac)、角叉菜聚糖、膠凝糖、藻酸鹽等。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，例如反向懸浮膠凝作用(SHjertén：BiochimBiophysActa79(2)，393-398(1964)，容易地制備和任選地交聯(lián)天然聚合物載體。在替代實(shí)施方案中，載體從合成的聚合物或共聚物制備，例如交聯(lián)的合成的聚合物，例如苯乙烯或苯乙烯衍生物、二乙烯基苯、丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯基酯、乙烯基酰胺等。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，參見(jiàn)例如“Styrenebasedpolymersupportsdevelopedbysuspensionpolymerization”(RArshady：ChimicaeL′Industria70(9)，70-75(1988))，容易地制備和任選地交聯(lián)這種合成的聚合物載體。天然的或合成的聚合物載體也可以從商業(yè)來(lái)源得到，例如GEHealthcareBio-SciencesAB，Uppsala，瑞典，例如以多孔顆粒形式。在另外替代性的實(shí)施方案中，載體從無(wú)機(jī)聚合物制備，例如二氧化硅。無(wú)機(jī)的多孔的和無(wú)孔的載體是該領(lǐng)域眾所周知的，且根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法容易地制備。在第四個(gè)方面，本發(fā)明涉及制備層析基質(zhì)的方法，該方法包含提供上述的配體，和將所述配體偶聯(lián)到載體上。在有利的實(shí)施方案中，所述偶聯(lián)通過(guò)配體的氮或硫原子進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，配體可以直接偶聯(lián)到載體上；或通過(guò)間隔基元件間接地偶聯(lián)，以在載體表面和配體之間提供適當(dāng)距離。將蛋白配體固定化到多孔的或無(wú)孔的表面上的方法是本領(lǐng)域眾所周知的；參見(jiàn)例如上面討論的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,399,750。在第五個(gè)方面，本發(fā)明涉及分離一種或多種靶化合物的方法，該方法包含，使包含所述化合物的液體接觸層析基質(zhì)；允許所述化合物吸附到存在于基質(zhì)上的配體，其中所述配體由一個(gè)或多個(gè)葡萄球菌A蛋白(SpA)結(jié)構(gòu)域C和/或其功能片段或變體組成；和，任選地，如下洗脫所述化合物：通過(guò)使液體穿過(guò)所述基質(zhì)，這使化合物從配體釋放出來(lái)。因而，在該實(shí)施方案中，配體不包含除結(jié)構(gòu)域C以外的其它SpA-衍生的結(jié)構(gòu)域或其功能片段或變體。在替代實(shí)施方案中，所述配體是包含2個(gè)或更多個(gè)SpA結(jié)構(gòu)域C單位或其功能片段或變體的多聚體。在有利的實(shí)施方案中，配體是上述的配體。靶化合物可以是任意有機(jī)化合物、生物分子或其它生物學(xué)材料，例如蛋白，例如抗體；肽；細(xì)胞，例如真核和原核細(xì)胞；核酸，例如DNA，例如質(zhì)粒，和RNA；病毒；等。在有利的實(shí)施方案中，靶化合物是一個(gè)或多個(gè)單克隆或多克隆抗體，例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶化合物是抗體片段，例如Fab片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，靶化合物是融合蛋白，其中至少一個(gè)部分是抗體或抗體片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，層析基質(zhì)是一次性產(chǎn)物，且如果該方法的目的是從產(chǎn)物液體取出靶化合物例如抗體，則將不需要洗脫。該實(shí)施方案可以例如用于從液體(例如醫(yī)學(xué)液體或其中生產(chǎn)許多抗體的液體，例如來(lái)自重組動(dòng)物的乳)取出不希望的抗體。在替代實(shí)施方案中，當(dāng)吸附的化合物是所需產(chǎn)物時(shí)，在該方法中包含洗脫步驟。為了得到最適合吸附的條件，使液體樣品與合適的緩沖液或其它液體(例如水)相組合，以提供流動(dòng)相。本發(fā)明的方法有利地在親和層析的常規(guī)條件下運(yùn)行，且特別對(duì)于A蛋白層析，如本領(lǐng)域眾所周知的。在第六個(gè)方面，本發(fā)明涉及SpA的結(jié)構(gòu)域C或其功能片段或變體作為堿穩(wěn)定的免疫球蛋白吸附劑的應(yīng)用。在該上下文中，“堿穩(wěn)定的”理解為是指，在0.5MNaOH中溫育的前5小時(shí)期間，吸附劑堿穩(wěn)定性低于銷(xiāo)售的堿穩(wěn)定的商業(yè)產(chǎn)品例如MabSelectTMSuRe(GEHealthcareBio-SciencesAB，Uppsala，瑞典)不超過(guò)約10％、例如約5％。在有利的實(shí)施方案中，吸附劑是如上所述的配體。因?yàn)樗鯩abSelectTMSuRe在這種時(shí)間和條件后應(yīng)當(dāng)呈現(xiàn)最小的退化，吸附劑的抗體結(jié)合容量在這種時(shí)間和條件后低于它的原始結(jié)合容量應(yīng)不超過(guò)約10％、例如約5％。在該上下文中，術(shù)語(yǔ)“原始”是指它在任何堿再生之前的容量，且使用本文公開(kāi)的類(lèi)型的程序，作為并行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用包含如上所述的方法，其中抗體從基質(zhì)洗脫，且其進(jìn)行至少一次，例如2-300次，任選地在其之間有洗滌步驟；基質(zhì)的堿再生；和最后重復(fù)所述分離抗體的方法。洗滌可以例如用合適的緩沖液進(jìn)行，例如用于平衡柱的緩沖液。在有利的實(shí)施方案中，通過(guò)與0.5MNaOH溫育，進(jìn)行再生。本發(fā)明也包括純化一種或多種如上面所討論的靶化合物的方法，該方法除了使用根據(jù)本發(fā)明的層析基質(zhì)純化以外，包含一個(gè)或多個(gè)層析步驟。根據(jù)該方面的方法可以例如包含使用本發(fā)明基質(zhì)的第一個(gè)層析步驟；使用離子交換或疏水作用層析(HIC)的中間層析步驟；和最后使用離子交換、HIC或反相層析的精制步驟。在具體的實(shí)施方案中，該方法包含在具有本文所述的結(jié)構(gòu)域C配體的層析基質(zhì)之前的步驟。這樣的在先步驟可以例如是常規(guī)的過(guò)濾、沉降、絮凝或其它步驟，以去除細(xì)胞碎片和其它不希望的組分。在替代實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用是分析或診斷應(yīng)用，例如免疫測(cè)定。附圖詳述圖1顯示了與其它基于蛋白的配體相比，根據(jù)本發(fā)明的配體的堿穩(wěn)定性的測(cè)試結(jié)果。X軸顯示了按小時(shí)計(jì)的溫育時(shí)間；而Y軸顯示了如實(shí)施例1所述在0.5MNaOH中X小時(shí)后剩余的容量。更具體地，含有A蛋白的產(chǎn)物MabselectTM(◆)；銷(xiāo)售的堿更穩(wěn)定的最近的A蛋白產(chǎn)物MabSelectTMSuRe(x)；SEQIDNO1定義的來(lái)自SpA的結(jié)構(gòu)域C(Δ)；和最后SEQIDNO2定義的來(lái)自SpA的結(jié)構(gòu)域C的缺失實(shí)施方案(■)。如從圖1可以看出的，根據(jù)本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域C配體顯示出與堿穩(wěn)定的產(chǎn)物MabSelectTMSuRe非常相當(dāng)?shù)膲A穩(wěn)定性。圖2顯示了與其它基于蛋白的配體相比，根據(jù)本發(fā)明的配體的Fab-結(jié)合性質(zhì)的測(cè)試結(jié)果。如從該圖可以看出的，包含來(lái)自SpA的結(jié)構(gòu)域C(Cwt和Cdel)的層析配體呈現(xiàn)出比其它測(cè)試的配體高得多的Fab-結(jié)合水平。實(shí)驗(yàn)部分本發(fā)明實(shí)施例僅為解釋目的而提供，且不應(yīng)當(dāng)解釋為限制所附權(quán)利要求書(shū)定義的本發(fā)明。實(shí)施例1：4種A蛋白-衍生的配體的堿穩(wěn)定性的柱研究在該實(shí)施例中，通過(guò)一系列層析運(yùn)行，測(cè)試了4種層析基質(zhì)的堿穩(wěn)定性，其中的2種用于對(duì)比，且其中的2種是根據(jù)本發(fā)明的。-MabSelectTM和MabSelectSuReTM(兩種包含基于蛋白的配體的對(duì)比產(chǎn)物，GEHealthcareBio-Sciences，Uppsala，瑞典)，和-Cwt(SEQIDNO.1定義的來(lái)自SpA的野生型結(jié)構(gòu)域C，和Cdel(SEQIDNO.2定義的來(lái)自SpA的缺失的野生型結(jié)構(gòu)域C)。在開(kāi)始和在0.5MNaOH溫育步驟后，測(cè)量IgG-結(jié)合容量。溫育時(shí)間是1-5小時(shí)不等，累積溫育時(shí)間是20小時(shí)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序，將根據(jù)本發(fā)明的配體固定化在瓊脂糖顆粒上，并填充在柱(GEHealthcare)中。2種基質(zhì)MabSelectTM和MabSelectTMSuRe是銷(xiāo)售的用于純化單克隆抗體的GEHealthcare生產(chǎn)的商業(yè)產(chǎn)品。兩種產(chǎn)物的配體都基于結(jié)合IgG的金黃色葡萄球菌A蛋白。MabSelectTM配體主要是重組A蛋白，它由5個(gè)同源結(jié)構(gòu)域(E、D、A、B、C)組成。比較起來(lái)，MabSelectTMSuRe配體由源自結(jié)構(gòu)域B類(lèi)似物“Z”(它又通過(guò)蛋白工程方法針對(duì)高pH穩(wěn)定化)的4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。結(jié)果，MabSelectTMSuRe耐受最高達(dá)0.5MNaOH的原位清潔(CIP)條件。MabSelectTM和MabSelectTMSuRe配體都偶聯(lián)至瓊脂糖顆粒。配體Cwt和Cdel構(gòu)建成具有C-末端半胱氨酸殘基用于根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序偶聯(lián)至基質(zhì)上的相同結(jié)構(gòu)域的四聚體。材料和方法靶化合物10x10ml注射液，溶液，165mg/ml(Octapharmano.008664)，人正常免疫球蛋白，用于皮下輸注或肌內(nèi)注射，用作層析實(shí)驗(yàn)的靶化合物。層析柱如下面的表1所述進(jìn)行配體偶聯(lián)和柱填充：表1：在實(shí)驗(yàn)1中使用的柱“柱ID”是指為每個(gè)柱給出的獨(dú)特編號(hào)。這些編號(hào)包含在層析方法中，且可以在結(jié)果文件的日志中找到。例如，表1中的第一個(gè)柱稱(chēng)作“MabSelectSuReU669082柱420060310(9.)”?！爸?hào)”是填充號(hào)，即用相同批次的基質(zhì)填充的柱在填充后接受不同的柱號(hào)。通過(guò)測(cè)量床高度，估計(jì)柱體積。緩沖液和溶液緩沖液A：50mM磷酸鈉，0.15MNaCl，pH7.2緩沖液B：50mM檸檬酸，0.15MNaCl，pH2.5儀器和實(shí)驗(yàn)室設(shè)備層析系統(tǒng)：explorer10(GEHealthcare)柱硬件：TricornTM5/100GL(GEHealthcare)真空脫氣裝置：CT2003-2，2通道脫氣裝置，ChromTechAB分光光度計(jì)：ND-1000分光光度計(jì)，NanoDropTechnologies離心機(jī)：BeckmanCoulterTMAvantiTMJ-20XPI，具有JLA8.1000轉(zhuǎn)子pH計(jì)(緩沖液A)：BeckmanΦ360pH/Temp/mV計(jì)pH計(jì)(緩沖液B)：實(shí)驗(yàn)室(Laboratory)pH計(jì)CG842，SCHOTT氦：AGAGasAB，101H20577708，儀器緩沖液和樣品的過(guò)濾器：75mm瓶頂過(guò)濾器(BottleTopFilter)-500ml，0.2μm孔徑，Nalgene用于0.5MNaOH的過(guò)濾器：75mm瓶頂過(guò)濾器(BottleTopFilter)-500ml，0.45μm孔徑，Nalgene軟件通過(guò)UNICORNTM5.01(GEHealthcare)控制10。除了在層析運(yùn)行中控制系統(tǒng)以外，UNICORN用于方法編程和結(jié)果評(píng)價(jià)。緩沖液制備緩沖液A：將磷酸二氫鈉和NaCl溶于水。使用pH4、pH7和pH10標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校正pH計(jì)。在向緩沖液加入NaOH(水溶液)的同時(shí)監(jiān)視pH，直到pH達(dá)到7.2。過(guò)濾緩沖液，且在使用前用氦脫氣。緩沖液B：將檸檬酸和NaCI溶于水。使用pH7和pH2標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校正pH計(jì)。在向緩沖液加入NaOH(水溶液)的同時(shí)監(jiān)視pH，直到pH達(dá)到2.5。過(guò)濾緩沖液，且在使用前用氦脫氣。0.5MNaOH的制備將NaOH(固體)溶于水中，至0.5M。過(guò)濾溶液，且在使用前用氦脫氣。樣品制備實(shí)驗(yàn)1用4950ml緩沖液A稀釋30mlGammanorm(165mg/ml)至1mg/ml。通過(guò)0.2μm，將樣品過(guò)濾進(jìn)無(wú)菌的5升瓶中。使用NanoDrop分光光度計(jì)，對(duì)樣品進(jìn)行3次280nm吸光度測(cè)量：1.2573AU、1.2432AU和1.2101AU。平均吸光度：1.2369AU。也在10上測(cè)量在280nm的吸光度。用系統(tǒng)泵以旁路模式將樣品抽吸通過(guò)系統(tǒng)。使用10mm紫外線池(UVcell)，且流速是0.83ml/分鐘。在280nm的吸光度是1510mAU。當(dāng)進(jìn)行容量計(jì)算時(shí)，該值用作參照。方法描述通常，MabSelectSuRe的CIP循環(huán)包含CIP溶液(通常是0.1-0.5MNaOH)的10-15分鐘接觸時(shí)間。為了減少在該研究中的CIP循環(huán)的量，使用更長(zhǎng)的接觸時(shí)間。以1、2和5小時(shí)間隔溫育柱，總接觸時(shí)間是20小時(shí)。這對(duì)應(yīng)于10-15分鐘接觸時(shí)間的80-120個(gè)循環(huán)。在CIP溫育之前，每個(gè)柱進(jìn)行2次起始容量測(cè)量。容量測(cè)量后，在0.5MNaOH中溫育柱。每個(gè)CIP溫育后，每個(gè)柱進(jìn)行一次容量測(cè)量。概要地，如下設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)：·每個(gè)柱2次起始容量測(cè)量?！IP溫育，1小時(shí)?！っ總€(gè)柱一次容量測(cè)量?！IP溫育，2小時(shí)?！っ總€(gè)柱一次容量測(cè)量。·CIP溫育，2小時(shí)?！っ總€(gè)柱一次容量測(cè)量?！IP溫育，5小時(shí)?！っ總€(gè)柱一次容量測(cè)量。·CIP溫育，5小時(shí)?！っ總€(gè)柱一次容量測(cè)量?！IP溫育，5小時(shí)?！っ總€(gè)柱一次容量測(cè)量。系統(tǒng)設(shè)置：在室溫進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。但是，將樣品放置在冰上，以避免微生物生長(zhǎng)。為了避免在將冷樣品加熱至室溫時(shí)形成氣泡，在樣品和泵之間連接脫氣裝置。給10配備10mm紫外線池，用于紫外線檢測(cè)。將緩沖液和樣品抽吸通過(guò)系統(tǒng)泵。使用下述入口：·樣品：B泵(入口B1)·緩沖液A：A泵(入口A11)·緩沖液B：A泵(入口A12)·0.5MNaOH：A泵(入口A13)容量測(cè)量，詳述在容量測(cè)量(由每個(gè)柱一次容量測(cè)量組成)之前，以旁路模式抽吸樣品，即不使用柱。其目的是使“新鮮的”樣品用于每次容量測(cè)量，并避免將第一體積的在CIP溫育期間在室溫殘留于管和泵中的樣品裝載上第一柱。每個(gè)柱的容量測(cè)量方法由下述部分組成：·用5柱體積(CV)緩沖液A平衡柱。·樣品裝載。通過(guò)把樣品裝載上用目標(biāo)層析介質(zhì)填充的柱，測(cè)定動(dòng)態(tài)結(jié)合容量。當(dāng)介質(zhì)變得越來(lái)越被樣品飽和時(shí)，在280nm的吸光度水平將增加，這是由于未結(jié)合的樣品穿過(guò)柱。在該方法中，將樣品裝載上柱，直到UV280nm曲線達(dá)到樣品的280nm吸光度的15％。·洗出未結(jié)合的樣品。用緩沖液A洗滌柱，直到UV280nm曲線降落到低于樣品的280nm吸光度的10％?！は疵摗Ｓ?0CV緩沖液B洗脫結(jié)合的材料。·用5CV緩沖液A再次平衡。樣品裝載流速是0.83ml/分鐘。CIP溫育除了2次起始測(cè)量的第一次以外，每次容量測(cè)量后，進(jìn)行CIP溫育。在CIP溫育方法中，以0.83ml/分鐘的流速，將3CV的0.5MNaOH抽吸通過(guò)每個(gè)柱。此后，將系統(tǒng)設(shè)定在暫停。暫停長(zhǎng)度依賴(lài)于CIP溫育時(shí)間的長(zhǎng)度，即1小時(shí)、2小時(shí)或5小時(shí)。但是，從暫停時(shí)間扣除系統(tǒng)將NaOH抽吸通過(guò)柱所需的時(shí)間。CIP溫育后，以0.83ml/分鐘的流速，將3CV緩沖液A抽吸通過(guò)每個(gè)柱，以去除NaOH。通過(guò)該程序，將所有柱暴露于NaOH相同的時(shí)間量。最后用3CV緩沖液A進(jìn)行另外一個(gè)洗滌循環(huán)。層析結(jié)果的評(píng)價(jià)通過(guò)測(cè)量應(yīng)用到柱上的樣品的體積，測(cè)定容量，直到280nm吸光度達(dá)到樣品吸光度的10％。從該體積扣除死體積，即柱體積、混合器和從抽吸到紫外線池的管。測(cè)得沒(méi)有柱的延遲體積是1，02ml。將容量值相對(duì)于累積CIP溫育時(shí)間繪圖。通過(guò)將CIP循環(huán)后的容量值除以起始容量值的平均值，得到相對(duì)容量值。相對(duì)容量值用于不同基質(zhì)之間的更容易對(duì)比。表2：結(jié)果實(shí)驗(yàn)1-容量(mgGammanorm/ml層析基質(zhì)(凝膠))MabSelectSuReCwtMabSelectCdel起始容量128，3827，4328，9830，86起始容量228，1327，4028，9830，951小時(shí)后的容量29，3227，7926，9830，753小時(shí)后的容量28，4227，2623，0829，885小時(shí)后的容量28，2526，9420，3029，2510小時(shí)后的容量27，8826，0715，7926，8715小時(shí)后的容量27，0124，6512，5223，7020小時(shí)后的容量25，9323，0210，1420，35實(shí)驗(yàn)2：Fab-結(jié)合的測(cè)試在96-孔濾板測(cè)定中，評(píng)價(jià)不同層析介質(zhì)的Fab-結(jié)合能力。在板渦旋儀器上混合液體和層析介質(zhì)1分鐘。孔的底部由保持液體的過(guò)濾器和層析介質(zhì)顆粒組成。當(dāng)進(jìn)行離心時(shí)，液體穿過(guò)過(guò)濾器，且收集在附著到濾板底部的分開(kāi)的96孔收集紫外線板中。在板讀數(shù)器中測(cè)量收集的液體在280nm的吸光度，并用于檢測(cè)和估計(jì)Fab。在不同板中收集來(lái)自不同步驟(例如洗滌、洗脫)的液體，并分別測(cè)量，以能測(cè)量在個(gè)別級(jí)分中的Fab的量。制備每種層析介質(zhì)的10％漿。給濾板裝載200μl漿/孔，即20μl介質(zhì)/孔。平衡-在PBS中5×200μl洗滌樣品溫育-在PBS中的100μl人多克隆Fab/Kappa，IgG片段(B乙基)，15分鐘洗滌-5×100μlPBS洗脫-3×100μl0.1M甘氨酸，pH3.0CIP-用0.5MNaOH進(jìn)行2×10分鐘分析具有液體的板于280nm的UV實(shí)驗(yàn)2的結(jié)果如圖2所示。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3