金黃色葡萄球菌EsxA蛋白的免疫保護應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫疫苗技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種金黃色葡萄球菌EsxA蛋白的免疫 保護應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus auresu，S. Aureus)是引起社區(qū)和醫(yī)院感染的 最主要的病原菌之一，目前尚無防控該菌引起的感染性疾病的理想疫苗。金黃色葡萄球菌 分泌系統(tǒng)所產(chǎn)生的毒力因子是其重要的致病因素，其中VII分泌系統(tǒng)是新近發(fā)現(xiàn)的，EsxA 是VII分泌系統(tǒng)分泌的ESAT-6樣毒力蛋白，研宄表明EsxA蛋白編碼基因的缺失導致該菌 致病力的大大減弱。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種金黃色葡萄球菌 EsxA蛋白的免疫保護應用。
[0004] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種金黃色葡萄球菌EsxA蛋白的免疫保 護應用，通過將金黃色葡萄球菌EsxA蛋白制備為用于防控金黃色葡萄球菌感染的EsxA疫 苗。
[0005] 所述的EsxA疫苗的制備方法，以EsxA蛋白：氫氧化鋁佐劑質(zhì)量比為I :2. 5的比例 配制獲得EsxA疫苗。
[0006] 本發(fā)明通過我們前期制備的重組EsxA蛋白免疫小鼠制備相應的抗體，通過抗體 的體外殺菌試驗和細菌攻擊小鼠試驗，檢測小鼠體內(nèi)的免疫相關(guān)細胞因子，揭示了 EsxA蛋 白的免疫保護作用，應用該蛋白制備了有效防控金黃色葡萄球菌感染的疫苗。
[0007] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：
[0008] 本發(fā)明首次揭示了 EsxA蛋白的免疫保護作用，應用該蛋白制備了有效防控金黃 色葡萄球菌感染的EsxA疫苗，并且獲得的EsxA疫苗對于防控金黃色葡萄球菌感染具有顯 著的效果。
【附圖說明】
[0009] 圖1為實施例1中免疫組小鼠和對照組小鼠的生存率檢測結(jié)果圖。
[0010] 圖2為EsxA免疫組和對照組小鼠免疫相關(guān)因子IFN-γ和IL-17的相對表達量的 結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0011] 下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[0012] 實施例1
[0013] l. EsxA疫苗的制備
[0014] 以EsxA蛋白/氫氧化鋁佐劑質(zhì)量比為I :2. 5的比例分別配制EsxA疫苗。
[0015] 2.免疫 BALB/c 小鼠
[0016] 免疫小鼠：
[0017] EsxA疫苗組：在第1、7、21天，每只四周齡的小鼠背部皮下注射200 yL含200 yg/ mL EsxA和500 μ g/mL氫氧化錯佐劑的疫苗，第28天靜脈取血，檢測抗EsxA抗體的產(chǎn)生。
[0018] 對照組：在第1、7、21天，每只小鼠背部皮下注射200 μ L含500 μ g/mL氫氧化鋁佐 劑的疫苗，第28天靜脈取血。
[0019] 免疫小鼠后續(xù)試驗：
[0020] I) ELISA檢測小鼠血清抗EsxA抗體的產(chǎn)生
[0021] ELISA檢測小鼠血清抗EsxA抗血清的效價的具體方法為：
[0022] (1)將獲得的小鼠血液，離心3000rpm，lOmin，收集血清，置-20°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br>[0023] ⑵將抗血清37°C凍融，將第一次免疫（一免）后獲得的抗血清1 :10、1:500、 1:1000、1:5000 稀釋，將二免所得的抗血清 1:500、1:5000、1:10000、1:50000、1:100000、 1:500000、1:1000000 稀釋；
[0024] (3)將純化的抗原（EsxA蛋白）用包被液稀釋至20ng/ μ 1，每孔100 μ 1體積包被 96孔聚苯乙烯ELISA板，放4°C過夜，棄去包被抗原；
[0025] (4)每孔加入緩沖液PBST 350 μ 1，浸泡3min后，棄去洗滌液，拍干；
[0026] (5)再重復⑷步驟2次，拍干；
[0027] (6) 10%的小牛血清封閉Ih(室溫），洗滌，步驟同⑷和（5);
[0028] (7)每孔加入待檢血清100 μ 1，37°C水浴孵育lh，洗絳，步驟同⑷和（5);
[0029] (8)每孔加入辣根過氧化物酶標記的羊抗人HRP-IgG 100 μ 1，37°C水浴孵育lh， PBST洗滌5次，步驟同⑷和（5)，拍干；
[0030] (9)每孔中各加入底物緩沖液A、B各50 μ 1，混勾，避光孵育30min ;
[0031] (10)每孔加入2mol/L硫酸100 μ 1終止反應，混勾，酶標儀測定OD45tl值。
[0032] 結(jié)果顯示，ELISA法檢測小鼠 EsxA抗血清的效價，一免后第21天其效價為 1:5000,二免后第7天（即一免后第28天）其效價為1:100000。而對照小鼠每次檢測效價 均為陰性。
[0033] 2)補體介導的抗體殺菌試驗
[0034] (1)將金黃色葡萄球菌的標準菌株ATCC29213接種于3ml LB肉湯，37°C培養(yǎng)12小 時至對數(shù)生長期。用0. 9% NaCl (生理鹽水）調(diào)至菌液濃度OD6tltl= 0. 1 (約I X 10 7ml)，再 用生理鹽水稀釋至約1.0 X IO4個菌/ml備用；
[0035] (2)免疫小鼠28天的血清37°C凍融，混合，56°C 30min滅活補體，然后用生理鹽水 以 1:10、1:50、1:250、1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000 稀釋后取各 0· Iml,分別加入 調(diào)節(jié)好的菌液〇. lml、0. 2ml補體和0.6ml LB肉湯，混合后37°C孵育2h作為殺菌作用時間；
[0036] (3)充分混勻混合菌液，取0.1 ml再加入0. 9ml LB肉湯，使每毫升含細菌約為 I X IO2個；將菌液均勻涂于預先制備好的血瓊脂平皿，37°C培養(yǎng)過夜24小時后記數(shù)菌落； 每次試驗設血清對照（對照組小鼠血清1:10稀釋加補體）和補體對照（實驗小鼠血清1:10 倍稀釋不加補體）；以50%殺菌的血清最高稀釋度為抗體殺菌效價；
[0037] (4)每份抗血清均一式三份，取平均值。
[0038] 小鼠 EsxA抗體殺菌實驗結(jié)果見表1。以50%殺菌（52個菌落/平板）的小鼠 血清最高稀釋度為抗體殺菌效價，本實驗的有效抗體殺菌效價1:4000。小鼠血清10、50、 250、500、1000、2000、4000稀釋后的抗體殺菌實驗結(jié)果與對照組相比較，結(jié)果有統(tǒng)計學差異 (Ρ〈0· 05) 〇
[0039] 表1抗EsxA抗體殺菌實驗結(jié)果
[0040]
【主權(quán)項】
1. 一種金黃色葡萄球菌EsxA蛋白的免疫保護應用，其特征在于：通過將金黃色葡萄球 菌EsxA蛋白制備為用于防控金黃色葡萄球菌感染的EsxA疫苗。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的金黃色葡萄球菌EsxA蛋白的免疫保護應用，其特征在于：所 述的EsxA疫苗的制備方法為，以EsxA蛋白：氫氧化鋁佐劑質(zhì)量比為I :2. 5的比例配制獲得 EsxA疫苗。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種金黃色葡萄球菌EsxA蛋白的免疫保護應用，屬于免疫疫苗技術(shù)領(lǐng)域。所述的金黃色葡萄球菌EsxA蛋白的免疫保護應用，通過將金黃色葡萄球菌EsxA蛋白制備為用于防控金黃色葡萄球菌感染的EsxA疫苗。所述的EsxA疫苗的制備方法為，以EsxA蛋白：氫氧化鋁佐劑質(zhì)量比為1：2.5的比例配制獲得EsxA疫苗。本發(fā)明首次揭示了金黃色葡萄球菌EsxA蛋白的免疫保護作用，應用該蛋白制備了有效防控金黃色葡萄球菌感染的EsxA疫苗，并且獲得的EsxA疫苗對于防控金黃色葡萄球菌感染具有顯著的效果。
【IPC分類】A61K39-085, A61P31-04
【公開號】CN104873964
【申請?zhí)枴緾N201510221243
【發(fā)明人】杜鴻, 張海方, 朱雪明, 王敏, 張萍
【申請人】蘇州大學附屬第二醫(yī)院
【公開日】2015年9月2日
【申請日】2015年5月4日