一種金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法，包括以下步驟：配制金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液I；將待測(cè)樣品加入上述培養(yǎng)液I中并進(jìn)行富集培養(yǎng)，作為培養(yǎng)液II備用；光纖生物傳感器的制備，將金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體I通過(guò)疏水力、分子間作用力或共價(jià)鍵固定在光纖生物傳感器上；制備空白檢測(cè)液及待檢測(cè)液，所述空白檢測(cè)液包括培養(yǎng)液I與緩沖液，所述待檢測(cè)液包括培養(yǎng)液II與緩沖液；先將上述制備的光纖生物傳感器沒(méi)入所述空白檢測(cè)液進(jìn)行平衡處理，接著沒(méi)入所述待檢測(cè)液進(jìn)行檢測(cè)。較現(xiàn)有技術(shù)的檢測(cè)方法具有實(shí)時(shí)檢測(cè)、檢測(cè)時(shí)間短、操作方便等優(yōu)勢(shì)，具有良好的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus),是一種常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性菌，在自然界分布極其廣泛，存在于空氣、水、土壤、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中，是一種條件性致病菌。由于金黃色葡萄球菌廣泛存在于周?chē)h(huán)境中，因而食品很容易遭受金黃色葡萄球菌污染，誤食受金黃色葡萄球菌污染的食物會(huì)引發(fā)人和動(dòng)物皮膚軟組織感染、敗血癥、乳房炎、心內(nèi)膜炎、肺炎、腸炎、腦膜炎、骨髓炎、筋膜炎、關(guān)節(jié)炎、中毒性休克綜合征等。由金黃色葡萄球菌引發(fā)的中毒在北美及歐洲等發(fā)達(dá)國(guó)家最為多見(jiàn)。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)每年由金葡菌引起的食物中毒病例數(shù)量?jī)H次于由沙門(mén)氏菌引起的食物中毒病例數(shù)量。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在美國(guó)由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件占到整個(gè)細(xì)菌性食物中毒事件的33%，在加拿的統(tǒng)計(jì)中更是達(dá)到45%。在我國(guó)每年由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件也屢有報(bào)道。
[0003]金黃色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal Protein A,簡(jiǎn)稱(chēng)SPA)是金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁抗原的主要成分，幾乎90%以上的金黃色葡萄球菌菌株均含有這種成分，但不同的菌株含量差別十分懸殊。SPA是一種蛋白質(zhì)，由亮、繳、脯、丙、蘇、甘、絲、谷丙、天門(mén)冬及賴(lài)氨酸等十種氨基酸組成。由于不含有胱氨酸及半胱氨酸，所以無(wú)二硫鍵。紫外光譜和吸收系數(shù)為A275nm %=1.65，等電點(diǎn)為PH值5.1。SPA十分穩(wěn)定，用4mol/L尿素、硫氰鹽酸、6mol/L的鹽酸胍和PH值2.5的酸性條件，以及加熱煮沸均不影響其活性。
[0004]傳統(tǒng)的金黃色葡萄球菌多采用分離培養(yǎng)、生化檢定和血衆(zhòng)凝固酶實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的檢測(cè)方法，這種方法不僅耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣、成本高、要求檢測(cè)人員經(jīng)驗(yàn)豐富。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，分子生物學(xué)檢測(cè)方法被廣泛應(yīng)用于微生物的檢測(cè)，但是分子生物學(xué)檢測(cè)同樣依賴(lài)于專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員、特殊的環(huán)境設(shè)施、昂貴的設(shè)備。
[0005]上世紀(jì)90年代初，一種簡(jiǎn)便快速的檢測(cè)方法被開(kāi)發(fā)出來(lái)，迅速成為檢測(cè)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)，它就是免疫層析技術(shù)。免疫層析技術(shù)具有簡(jiǎn)便快速、費(fèi)用低廉、易于操作等優(yōu)勢(shì)得到廣泛認(rèn)可。如今，免疫層析技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)、臨床檢測(cè)等領(lǐng)域。在金黃色葡萄球菌檢測(cè)方面，免疫層析檢測(cè)也得到了廣泛應(yīng)用，大大加快了金黃色葡萄球菌的檢測(cè)速度，降低了檢測(cè)工作量。如有報(bào)道(Gold nanoparticle-basedimmunochromatographic assay for the detect1n of Staphylococcus aureus， Su-HuaHuang，Sensors and Actuators B: Chemical,Volume 127， Issue 2， 15 November 2007，Pages 335 - 340)采用免疫層析試紙條可在25小時(shí)內(nèi)，檢測(cè)出食品中污染濃度達(dá)到25CFU/g以上的金黃色葡萄球菌。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法，利用金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)過(guò)程中分泌的A蛋白(SPA)與檢測(cè)抗體發(fā)生結(jié)合的特性，通過(guò)固定有檢測(cè)抗體的光纖生物傳感器對(duì)待測(cè)樣品中SPA進(jìn)行檢測(cè)，引起光電信號(hào)發(fā)生變化進(jìn)而推知金黃色葡萄球菌的存在，生物膜干涉技術(shù)(B1-Layer Interferometry ,BLI)檢測(cè)金黃色葡萄球菌較現(xiàn)有技術(shù)的檢測(cè)方法具有無(wú)需標(biāo)記、實(shí)時(shí)檢測(cè)、檢測(cè)時(shí)間短、操作方便等優(yōu)勢(shì)，具有良好的應(yīng)用前景。
[0007]一種金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法，包括以下步驟:
a.配制金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液I;
b.將待測(cè)樣品加入步驟a的培養(yǎng)液I中并進(jìn)行富集培養(yǎng)，離心，取上清，作為培養(yǎng)液II備用;
c.將金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體I固定在光纖生物傳感器上；
d.制備空白檢測(cè)液及待檢測(cè)液，所述空白檢測(cè)液包括培養(yǎng)液I與緩沖液，所述待檢測(cè)液包括培養(yǎng)液II與緩沖液；
e.先將步驟c制備的光纖生物傳感器沒(méi)入所述空白檢測(cè)液進(jìn)行平衡處理，接著沒(méi)入所述待檢測(cè)液中檢測(cè)。
[0008]優(yōu)選地，述培養(yǎng)液I為PH值7.4的7.5%氯化鈉肉湯、PH值7.3的10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯、與葡萄球菌選擇性肉湯SSB的任一種，所述7.5%氯化鈉肉湯配制方法為1g蛋白胨、5g牛肉浸粉與75g氯化鈉加水定容至1000ml，121°C高壓滅菌15min，再加入磺胺二甲嘧啶0.005g ;所述10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯配制方法為7g胰蛋白胨、3g大豆蛋白胨、10g氯化鈉、2.5g磷酸氫二鉀、1g丙酮酸鈉、2.5g葡萄糖加水定容至1000ml, 121°C高壓滅菌15min,再加入磺胺二甲B密唳0.005g ;所述葡萄球菌選擇性肉湯SSB配制方法為:15g胰蛋白胨，1g丙酮酸鈉，12g甘氨酸，5g氯化鋰，3g酵母提取物、0.02g磺胺二甲嘧啶加水定容到1000ml，121 °C高壓滅菌15min，再加入磺胺二甲嘧啶0.005g。
[0009]優(yōu)選地，步驟c所采用的固定方法為疏水力、分子間作用力或共價(jià)鍵。
[0010]優(yōu)選地，所述步驟b的培養(yǎng)溫度為25°C至39°C。
[0011 ] 優(yōu)選地，步驟d中所述待檢測(cè)液還包括金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體II，所述金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體II與所述金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體I相同或不同。
[0012]優(yōu)選地，步驟d中所述空白檢測(cè)液還包括金磁顆粒標(biāo)記的BSA或納米金顆粒，所述金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體II標(biāo)記有金磁顆?；蚣{米金顆粒。
[0013]優(yōu)選地，金磁顆粒標(biāo)記所述金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體II的制備方法為:取lmg/ml的金磁顆粒Iml,加入2 μ g金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體II，混勻，室溫靜置15min ;加入100 μ L 10%BSA，混勻，室溫靜置15min，置于磁場(chǎng)中l(wèi)min，去掉上清；再加入100 μ L復(fù)溶液重懸顆粒，備用；
所述金磁顆粒標(biāo)記BSA的制備方法為:取lmg/ml的金磁顆粒1ml，加入100 μ L10%BSA,混勻，室溫靜置15min，置于磁場(chǎng)中l(wèi)min，去掉上清；再加入100 μ L復(fù)溶液重懸顆粒，備用；
優(yōu)選地，納米金顆粒標(biāo)記金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體II的方法為:取粒徑5nnT50nm的納米金顆粒Iml,加入1、μ g金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體II,混勻,室溫靜置15min ;加入100 μ L 10%BSA,混勻，室溫靜置15min，1000rpm離心lOmin，去掉上清；加入100 μ L復(fù)溶液重懸顆粒；
納米金顆粒標(biāo)記BSA的方法:取粒徑5nnT50nm的納米金顆粒Iml,加入100 μ L10%BSA,混勻，室溫靜置15min, 1000rpm離心1min,去掉上清；加入100 μ L復(fù)溶液重懸顆粒;
優(yōu)選地，所述復(fù)溶液由10mM PH值為7.5的Tris-HCl緩沖液、0.5%Tween20、5%海藻糖組成。
[0014]優(yōu)選地，所述待檢測(cè)液制備方法如下:取5ml所述培養(yǎng)液II，并加入5 μ L金磁顆粒標(biāo)記金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體II，置于37°C下300rpm振蕩孵育30min，置于磁場(chǎng)中l(wèi)min，棄掉上清液；再加入200 μ L緩沖液，作為待檢測(cè)液備用。
[0015]優(yōu)選地，所述金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體I及金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體II均為鼠、兔、馬、羊、牛中的任一種抗體，所述金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體I及金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體II均為單克隆抗體或多克隆抗體。
[0016]優(yōu)選地，所述緩沖液由10mM PH值7.5的Tris-HCl緩沖液、l%BSA、20mM NaCl、及
0.5%Tween20 組成。
[0017]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果:
1)利用生物膜干涉技術(shù)(B1-LayerInterferometry ,BLI)檢測(cè)待測(cè)金黃色葡萄球菌分泌的金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有無(wú)需標(biāo)記、實(shí)時(shí)檢測(cè)、檢測(cè)穩(wěn)定性好、檢測(cè)簡(jiǎn)單快速等優(yōu)點(diǎn)；
2)采用雙抗體夾心方式進(jìn)行BLI檢測(cè)，可以有效提高BLI檢測(cè)的靈敏性；
3)利用金磁顆?；蚣{米金顆粒標(biāo)記檢測(cè)抗體，且進(jìn)行雙抗體夾心方式的BLI檢測(cè)，可以進(jìn)一步提聞BLI檢測(cè)的靈敏性。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1是不同培養(yǎng)液I進(jìn)行無(wú)標(biāo)記BLI檢測(cè)結(jié)果；
圖2是SSB培養(yǎng)液1、不同培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行無(wú)標(biāo)記BLI檢測(cè)結(jié)果；
圖3是SSB培養(yǎng)液1、不同培養(yǎng)溫度進(jìn)行金磁顆粒標(biāo)記且雙抗體夾心(富集濃縮)BLI檢測(cè)結(jié)果；
圖4是不同BLI檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果；
圖5是特異性檢測(cè)結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0019]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0020]本發(fā)明提供了一種金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法，采用生物膜干涉技術(shù)(BLI)檢測(cè)出金黃色葡萄球菌分泌的A蛋白(SPA)，其具體過(guò)程為:所述金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體I (SPA特異性抗體I)通過(guò)疏水力、分子間作用力或共價(jià)鍵固定在光纖生物傳感器上，在檢測(cè)過(guò)程中，所述待檢測(cè)液中待測(cè)樣品的SPA會(huì)與所述光纖生物傳感器上的SPA特異性抗體I發(fā)生結(jié)合，從而引起B(yǎng)LI光電信號(hào)發(fā)生變化。
[0021]一種金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法，包括以下步驟:
a.配制金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液I,培養(yǎng)液I可以是氯化鈉肉湯、氯化鈉胰酪胨大豆肉湯、及葡萄球菌選擇性肉湯SSB等任一種；
b.將待測(cè)樣品加入步驟a的培養(yǎng)液I中并進(jìn)行富集培養(yǎng)，離心，取上清作為培養(yǎng)液II備用;
c.光纖生物傳感器的制備，將SPA特異性抗體I通過(guò)疏水力、分子間作用力或共價(jià)鍵固定在光纖生物傳感器上，所述SPA特異性抗體I用于與待測(cè)樣品中的SPA發(fā)生結(jié)合；
d.制備空白檢測(cè)液及待檢測(cè)液，所述空白檢測(cè)液包括200μ L培養(yǎng)液I與50 μ L緩沖液，所述待檢測(cè)液包括200 μ L培養(yǎng)液II與50 μ L緩沖液，所述緩沖液由10mM PH值7.5的 Tris-HCl 緩沖液、l%BSA、20mM NaCl、及 0.5%Tween20 配制組成；
e.BLI檢測(cè):先將步驟c制備的光纖生物傳感器沒(méi)入所述空白檢測(cè)液進(jìn)行平衡處理，接著沒(méi)入所述待檢測(cè)液中檢測(cè)。
[0022]上述培養(yǎng)液I按照如下配方配制:
(1)卩!1值7.4±0.1,7.5 %氯化鈉肉湯:蛋白胨10.0g、牛肉浸粉5.0g、氯化鈉75.0g，加水定容至1000ml，121 °C高壓滅菌15min，加入磺胺二甲嘧啶0.005g，備用；
(2)?!1值7.3±0.2、10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯:胰蛋白胨7.0g、大豆蛋白胨3.0g、氯化鈉100.0g、磷酸氫二鉀2.5g、丙酮酸鈉10.0 g、葡萄糖2.5g，加水定容至1000ml，121°C高壓滅菌15min，加入磺胺二甲嘧啶0.005g，備用；
(3)SSB:胰蛋白胨15.0g，丙酮酸鈉10.0g，甘氨酸10.0g，氯化鋰5.0g，酵母提取物3.0g、加水定容到1000ml，121°C高壓滅菌15min，加入磺胺二甲嘧啶0.005g，備用。
[0023]所述SPA特異性抗體I為單克隆抗體或多克隆抗體，可以是鼠、兔、馬、羊、牛中的任一種抗體。所述SPA特異性抗體I通過(guò)疏水力、分子間作用力或共價(jià)鍵固定在光纖生物傳感器制備固定有所述SPA特異性抗體I的光纖生物傳感器，其具體方法如下:
(1)疏水力:將所述光纖生物傳感器沒(méi)入濃度為40μ g/ml的SPA特異性抗體I中l(wèi)min。取出，0.0lM磷酸鹽緩沖液(PBS，PH7.0)洗滌2次，沒(méi)入15%蔗糖溶液中l(wèi)min，取出，室溫干燥2h,置于4°C保存,備用。(疏水力(hydrophobie bonds)在蛋白質(zhì)多肽鏈的空間折疊、生物膜的形成、生物大分子之間的相互作用以及酶對(duì)底物分子的催化過(guò)程中常常起著關(guān)鍵的作用。非極性分子之間或分子的非極性基團(tuán)之間在水環(huán)境中相互吸引并聚集在一起，而把原來(lái)處在非極性基團(tuán)附近的水分子排擠出去，結(jié)果使周?chē)肿拥撵刂翟黾印?
(2)分子間作用力:將所述SPA特異性抗體I進(jìn)行生物素化標(biāo)記，標(biāo)記之后再與親和素傳感器進(jìn)行反應(yīng)，獲得固定有所述SPA特異性抗體I的光纖生物傳感器。
[0024](3)共價(jià)鍵:將表面修飾有羧基的傳感器置于0.lmg/ml的EDC溶液(雙功能偶聯(lián)齊U、PH 6.0)中20min。取出，用0.0lM磷酸鹽緩沖液(PBS，PH7.0)洗滌2次。沒(méi)入濃度為20 μ g/ml的SPA特異性抗體I中120min。取出，沒(méi)入濃度為1%牛血清白蛋白(BSA)中120min。取出，0.0lM磷酸鹽緩沖液(PBS, PH7.0)洗滌2次，沒(méi)入15%蔗糖溶液中l(wèi)min,取出，室溫干燥2h，置于4°C保存，備用。(共價(jià)鍵本質(zhì)是原子軌道重疊后，高概率地出現(xiàn)在兩個(gè)原子核之間的電子與兩個(gè)原子核之間的電性作用。)
無(wú)標(biāo)記的BLI檢測(cè)過(guò)程如下: 511、富集培養(yǎng):取25g待測(cè)樣品于225ml所述培養(yǎng)液I中，均質(zhì)培養(yǎng)，3000rpm轉(zhuǎn)速下離心5min，取上清作為培養(yǎng)液II ；
512、BLI檢測(cè):所述空白檢測(cè)液由200μ L培養(yǎng)液Ι、50 μ L緩沖液組成，所述待檢測(cè)液由200 μ L培養(yǎng)液I1、50 μ L緩沖液組成。將固定有所述SPA特異性抗體I的光纖生物傳感器末端沒(méi)入所述空白檢測(cè)液中60iTl80S進(jìn)行平衡處理，再將該光纖生物傳感器末端沒(méi)入所述待檢測(cè)液中180iT600S進(jìn)行檢測(cè)。
[0025]本發(fā)明還采用雙抗體夾心的方式檢測(cè)SPA，具體過(guò)程為:所述SPA特異性抗體I通過(guò)疏水力、分子間作用力或共價(jià)鍵固定在所述光纖生物傳感器上，所述待檢測(cè)液中的金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體II (SPA特異性抗體II)與所述待檢測(cè)液中待檢樣品的SPA發(fā)生結(jié)合，再與所述光纖生物傳感器上的檢測(cè)抗體發(fā)生結(jié)合，從而引起B(yǎng)LI光電信號(hào)發(fā)生變化。所述SPA特異性抗體II與SPA特異性抗體I可以相同或不同，所述SPA特異性抗體II可以是鼠、兔、馬、羊、牛中的任一種的多克隆抗體或單克隆抗體。
[0026]無(wú)標(biāo)記的雙抗體夾心BLI檢測(cè)過(guò)程如下:
521、富集培養(yǎng):取25g待測(cè)樣品于225ml所述培養(yǎng)液I中，均質(zhì)培養(yǎng)，3000rpm轉(zhuǎn)速下離心5min，取上清作為培養(yǎng)液II ；
522、BLI檢測(cè):所述空白檢測(cè)液由200μ L培養(yǎng)液Ι、50 μ L緩沖液組成，所述待檢測(cè)液由200 μ L培養(yǎng)液I1、50 μ L緩沖液、及2 μ g所述SPA特異性抗體II組成。將固定有所述SPA特異性抗體I的光纖生物傳感器末端沒(méi)入所述空白檢測(cè)液中60iTl80S進(jìn)行平衡處理，再將該光纖生物傳感器末端沒(méi)入所述待檢測(cè)液中l(wèi)SOiTeOOs進(jìn)行檢測(cè)。
[0027]本發(fā)明還采用金磁顆粒或納米金顆粒標(biāo)記所述SPA特異性抗體II進(jìn)行雙抗體夾心方式檢測(cè)SPA，其中SPA特異性抗體I通過(guò)疏水力、分子間作用力或共價(jià)鍵固定在所述光纖生物傳感器上，所述SPA特異性抗體II被金磁顆粒所標(biāo)記(即金磁顆粒-SPA特異性抗體
II)。所述SPA特異性抗體II與SPA特異性抗體I可以相同或不同，所述SPA特異性抗體II可以是鼠、兔、馬、羊、牛中的任一種的多克隆抗體或單克隆抗體。
[0028]金磁顆粒標(biāo)記且雙抗體夾心的BLI檢測(cè)過(guò)程如下:
5311、富集培養(yǎng):取25g待測(cè)樣品于225ml所述培養(yǎng)液I中，均質(zhì)培養(yǎng)，3000rpm轉(zhuǎn)速下離心5min，取上清作為培養(yǎng)液II ；
5312、金磁顆粒標(biāo)記SPA特異性抗體II(金磁顆粒-SPA特異性抗體II)制備過(guò)程:取lmg/ml的金磁顆粒1ml，加入2μ g SPA特異性抗體II，混勻，室溫靜置15min ;加入10yL10%BSA，混勻，室溫靜置15min，置于磁場(chǎng)中l(wèi)min，去掉上清；加入100 μ L復(fù)溶液(10mM PH值 7.5 的 Tris-HCl 緩沖液、0.5%Tween20、5% 海藻糖)；
金磁顆粒標(biāo)記BSA(金磁顆粒-BSA)制備過(guò)程:取lmg/ml的金磁顆粒Iml,加入100 μ L10%BSA，混勻，室溫靜置15min，置于磁場(chǎng)中l(wèi)min，去掉上清；加入100 μ L復(fù)溶液(10mM PH值 7.5 的 Tris-HCl 緩沖液、0.5%Tween20、5% 海藻糖)；
5313、BLI檢測(cè):所述空白檢測(cè)液由200μ L培養(yǎng)液Ι、50 μ L緩沖液、及5 μ L金磁顆粒標(biāo)記的BSA組成，所述待檢測(cè)液由200 μ L培養(yǎng)液ΙΙ、50 μ L緩沖液、及5 μ L金磁顆粒-SPA特異性抗體II組成。將固定有所述SPA特異性抗體I的光纖生物傳感器末端沒(méi)入所述空白檢測(cè)液中60iTl80S進(jìn)行平衡處理，再將該光纖生物傳感器末端沒(méi)入所述待檢測(cè)液中180s?600s。
[0029]納米金顆粒標(biāo)記且雙抗體夾心的BLI檢測(cè)過(guò)程如下:
5321、富集培養(yǎng):取25g待測(cè)樣品于225ml所述培養(yǎng)液I中，均質(zhì)培養(yǎng)，作為培養(yǎng)液II；
5322、納米金顆粒標(biāo)記SPA特異性抗體II(納米金顆粒-SPA特異性抗體II)的工藝:取納米金顆粒(粒徑:5nnT50nm) Iml,加入1^5 μ g SPA特異性抗體II,混勻，室溫靜置15min ；加入100 μ L 10%BSA,混勻，室溫靜置15min, 1000rpm離心1min,去掉上清；加入100 μ L復(fù)溶液(10mM ΡΗ7.5 的 Tris-HCl 緩沖液、0.5%Tween20、5% 海藻糖)；
納米金顆粒標(biāo)記BSA工藝:取納米金顆粒(粒徑:5nnT50nm) 1ml,加入100 μ L 10%BSA,混勻，室溫靜置15min, 1000rpm離心lOmin，去掉上清；加入100 μ L復(fù)溶液(10mM ΡΗ7.5的 Tris-HCl 緩沖液、0.5%Tween20、5% 海藻糖)；
5323、BLI檢測(cè):所述空白檢測(cè)液由200μ L培養(yǎng)液Ι、50 μ L緩沖液、及5 μ L納米金顆粒標(biāo)記的BSA組成，所述待檢測(cè)液由200 μ L培養(yǎng)液ΙΙ、50 μ L緩沖液、及2飛μ L納米金顆粒-SPA特異性抗體II組成。將固定有所述SPA特異性抗體I的光纖生物傳感器末端沒(méi)入所述空白檢測(cè)液中60iTl80S進(jìn)行平衡處理，再將該光纖生物傳感器末端沒(méi)入所述待檢測(cè)液中180s?600s。
[0030]金磁顆粒標(biāo)記且雙抗體夾心的BLI檢測(cè)還可以在富集培養(yǎng)之后，對(duì)液體中的SPA進(jìn)行富集濃縮，然后再進(jìn)行BLI檢測(cè)，即金磁顆粒-SPA特異性抗體II首先與所述待檢液中待檢樣品的SPA發(fā)生結(jié)合，獲得金磁顆粒-SPA特異性抗體I1-SPA復(fù)合物；在磁場(chǎng)作用下，金磁顆粒-SPA特異性抗體I1-SPA復(fù)合物被分離出來(lái)；金磁顆粒-SPA特異性抗體I1-SPA復(fù)合物再與所述光纖生物傳感器上的SPA特異性抗體I發(fā)生結(jié)合，從而引起B(yǎng)LI光電信號(hào)發(fā)生變化。所述SPA特異性抗體II與SPA特異性抗體I可以相同或不同，所述SPA特異性抗體II可以是鼠、兔、馬、羊、牛中的任一種的多克隆抗體或單克隆抗體。其具體過(guò)程如下:
541、金磁顆粒標(biāo)記SPA特異性抗體II(金磁顆粒-SPA特異性抗體II)制備過(guò)程:取lmg/ml的金磁顆粒1ml，加入2μ g SPA特異性抗體II，混勻，室溫靜置15min ;加入10yL10%BSA，混勻，室溫靜置15min，置于磁場(chǎng)中l(wèi)min，去掉上清；加入100 μ L復(fù)溶液(10mM PH值 7.5 的 Tris-HCl 緩沖液、0.5%Tween20、5% 海藻糖)；
金磁顆粒標(biāo)記BSA(金磁顆粒-BSA)制備過(guò)程:取lmg/ml的金磁顆粒Iml,加入100 μ L10%BSA，混勻，室溫靜置15min，置于磁場(chǎng)中l(wèi)min，去掉上清；加入100 μ L復(fù)溶液(10mM PH值 7.5 的 Tris-HCl 緩沖液、0.5%Tween20、5% 海藻糖)；
542、富集濃縮:取25g待測(cè)樣品于225ml所述培養(yǎng)液I中，均質(zhì)，培養(yǎng)，3000rpm轉(zhuǎn)速下離心5min，取上清作為培養(yǎng)液II ;取5ml所述培養(yǎng)液II，并加入5 μ L金磁顆粒-SPA特異性抗體II,置于37°C下振蕩(300rpm)孵育30min,置于磁場(chǎng)中l(wèi)min,棄掉上清液。加入200 μ L緩沖液，作為待檢測(cè)液備用。
[0031]S43、BLI檢測(cè):所述空白檢測(cè)液由200 μ L培養(yǎng)液Ι、50 μ L緩沖液、及5 μ L金磁顆粒標(biāo)記的BSA組成。將固定有所述SPA特異性抗體I的光纖生物傳感器末端沒(méi)入所述空白檢測(cè)液中60iTl80S進(jìn)行平衡處理，再將該光纖生物傳感器末端沒(méi)入步驟S42中獲得的待檢測(cè)液中180s?600S。
[0032]本發(fā)明實(shí)施例具體檢測(cè)過(guò)程如下:
S51、配制金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液I，從PH值為7.4的7.5%氯化鈉肉湯、PH值為7.3的10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯、與葡萄球菌選擇性肉湯SSB中選擇一種作為培養(yǎng)液I ;552、取25g待測(cè)樣品于225ml所述培養(yǎng)液I中，均質(zhì)培養(yǎng)，3000rpm轉(zhuǎn)速下離心5min，取上清作為培養(yǎng)液II ；
553、將所述SPA特異性抗體I通過(guò)疏水力、分子間作用力或共價(jià)鍵固定在所述光纖生物傳感器上；
554、BLI檢測(cè):無(wú)標(biāo)記BLI檢測(cè)、雙抗體夾心的無(wú)標(biāo)記BLI檢測(cè)、雙抗體夾心且金磁顆粒標(biāo)記BLI檢測(cè)、雙抗體夾心且金磁顆粒標(biāo)記(富集濃縮)BLI檢測(cè)、納米金顆粒標(biāo)記且雙抗體夾心BLI檢測(cè)中的任一種。
[0033]不同培養(yǎng)液I進(jìn)行富集培養(yǎng)2至48h，再進(jìn)行多次重復(fù)無(wú)標(biāo)記BLI檢測(cè)，所述待測(cè)樣品為牛奶，所述SPA特異性抗體I為鼠單克隆抗體，共計(jì)3組試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果如表1、圖1和圖2所示。圖1為不同培養(yǎng)液I進(jìn)行富集培養(yǎng)6h，再進(jìn)行無(wú)標(biāo)記BLI檢測(cè)的檢測(cè)結(jié)果；圖2為培養(yǎng)液I為BBS、不同培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行無(wú)標(biāo)記BLI檢測(cè)的檢測(cè)結(jié)果。
[0034]不同溫度下富集培養(yǎng)12h，再進(jìn)行多次重復(fù)雙抗體夾心且金磁顆粒標(biāo)記(富集濃縮)BLI檢測(cè)，所述測(cè)待測(cè)樣品為肉包，所述SPA特異性抗體I為馬多克隆抗體，所述SPA特異性抗體II為鼠源單克隆抗體，共計(jì)27組試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果如表2、圖3所示。圖3為培養(yǎng)液I為SSB、不同溫度下富集培養(yǎng)12h，進(jìn)行雙抗體夾心且金磁顆粒標(biāo)記(富集濃縮)BLI檢測(cè)的檢測(cè)結(jié)果。
[0035]針對(duì)不同的所述SPA特異性抗體I或/和SPA特異性抗體11，梯度添加金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(lO^K^CFU/g)至SSB配制培養(yǎng)液I，富集培養(yǎng)后分別進(jìn)行無(wú)標(biāo)記BLI檢測(cè)、雙抗體夾心的無(wú)標(biāo)記BLI檢測(cè)、雙抗體夾心且金磁顆粒標(biāo)記BLI檢測(cè)、雙抗體夾心且金磁顆粒標(biāo)記(富集濃縮)BLI檢測(cè)、雙抗體夾心且納米金顆粒標(biāo)記BLI檢測(cè),共計(jì)5組試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果如表3、圖4所示。圖4為菌種濃度102CFU/g、培養(yǎng)液I為SSB，不同BLI檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果。
[0036]特異性試驗(yàn)
分別用空腸彎曲桿菌、糞腸球菌、綠膿桿菌、志賀氏菌、霍亂孤菌、阪崎桿菌、沙門(mén)氏菌、單增李斯特氏菌、大腸桿菌、腐生酵母菌接種空白樣品(即金黃色葡萄球菌陰性樣品)，采用本發(fā)明的BLI檢測(cè)方法(雙抗體夾心且金磁顆粒標(biāo)記(富集濃縮)BLI檢測(cè))檢測(cè)接種后的樣品，以評(píng)價(jià)該方法的特異性，共計(jì)I組實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果如表5、圖5所示。圖5為不同菌種在SSB培養(yǎng)液富集培養(yǎng)12h，進(jìn)行雙抗體夾心且金磁顆粒標(biāo)記(富集濃縮)BLI檢測(cè)300s的檢測(cè)結(jié)果。
[0037]對(duì)比試驗(yàn)
在空白樣品中梯度添加金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(410:6538,10^10-1 CFU/g)，采用標(biāo)準(zhǔn)方法(GB4789.10-2010，第一法)進(jìn)行檢測(cè)，共計(jì)6組試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果如表4所示。
[0038]1、穩(wěn)定性及優(yōu)化過(guò)程的檢測(cè)結(jié)果
(I)將待測(cè)樣品(牛奶)置于不同培養(yǎng)液I進(jìn)行富集培養(yǎng)2至48h，再進(jìn)行BLI檢測(cè)(無(wú)標(biāo)記BLI檢測(cè))，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。由表1可以看出在相同條件下，采用SSB配制的培養(yǎng)液I培養(yǎng)效果最好。
[0039]表1為不同培養(yǎng)液I不同培養(yǎng)時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果

【權(quán)利要求】
1.一種金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法，包括以下步驟: 配制金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液I ; 將待測(cè)樣品加入步驟a的培養(yǎng)液I中并進(jìn)行富集培養(yǎng)，離心，取上清，作為培養(yǎng)液II備用； 將金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體I固定在光纖生物傳感器上； 制備空白檢測(cè)液及待檢測(cè)液，所述空白檢測(cè)液包括培養(yǎng)液I與緩沖液，所述待檢測(cè)液包括培養(yǎng)液II與緩沖液； 先將步驟c制備的光纖生物傳感器沒(méi)入所述空白檢測(cè)液進(jìn)行平衡處理，接著沒(méi)入所述待檢測(cè)液中檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法，其特征在于，步驟d中所述待檢測(cè)液還包括金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體II，所述金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體II與所述金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體I相同或不同。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法，其特征在于，步驟d中所述空白檢測(cè)液還包括金磁顆?；蚣{米金顆粒標(biāo)記的BSA，所述金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體II標(biāo)記有金磁顆?；蚣{米金顆粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法，其特征在于，金磁顆粒標(biāo)記所述金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體II的制備方法為:取lmg/ml的金磁顆粒lml,加入2 μ g金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體II，混勻，室溫高壓滅菌15min ;加入100 μ L 10%BSA,混勻，室溫高壓滅菌15min，置于磁場(chǎng)中l(wèi)min，去掉上清；再加入100 μ L復(fù)溶液重懸顆粒，備用； 所述金磁顆粒標(biāo)記BSA的制備方法為:取lmg/ml的金磁顆粒1ml，加入100 μ L10%BSA，混勻，室溫高壓滅菌15min，置于磁場(chǎng)中l(wèi)min，去掉上清；再加入100 μ L復(fù)溶液重懸顆粒，備用； 所述復(fù)溶液由10mM PH值為7.5的Tris-HCl緩沖液、0.5%Tween20、5%海藻糖組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法，其特征在于，納米金顆粒標(biāo)記金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體II的方法為:取Iml粒徑5?50nm的納米金顆粒，力口Λ T5yg金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體II，混勻，室溫靜置15min ;加入10yL10%BSA,混勻，室溫靜置15min, 1000rpm離心1min,去掉上清；加入100 μ L復(fù)溶液重懸顆粒; 納米金顆粒標(biāo)記BSA的方法:取Iml粒徑5nnT50nm的納米金顆粒，加入100 μ L10%BSA,混勻，室溫靜置15min, 1000rpm離心1min,去掉上清；加入100 μ L復(fù)溶液重懸顆粒; 所述復(fù)溶液由10mM PH值為7.5的Tris-HCl緩沖液、0.5%Tween20、5%海藻糖組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法，其特征在于，所述待檢測(cè)液制備方法如下:取5ml所述培養(yǎng)液II，并加入5 μ L金磁顆粒標(biāo)記金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體II,置于37°C下300rpm振蕩孵育30min,置于磁場(chǎng)中l(wèi)min,棄掉上清液；再加入200 μ L緩沖液，作為待檢測(cè)液備用。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法，其特征在于，所述金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體I及金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體II均為鼠、兔、馬、羊、牛中的任一種抗體，所述金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體I及金黃色葡萄球菌A蛋白特異性抗體II為單克隆抗體或多克隆抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)液I為PH值為7.4的7.5%氯化鈉肉湯、PH值為7.3的10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯、與葡萄球菌選擇性肉湯SSB的任一種，所述7.5%氯化鈉肉湯配制方法為1g蛋白胨、5g牛肉浸粉與75g氯化鈉加水定容至1000ml，121°C高壓滅菌15min，再加入磺胺二甲嘧啶0.005g ;所述10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯配制方法為7g胰蛋白胨、3g大豆蛋白胨、10g氯化鈉、2.5g磷酸氫二鉀、1g丙酮酸鈉、2.5g葡萄糖加水定容至1000ml, 121°C高壓滅菌15min,再加入磺胺二甲喃唳0.005g ;所述葡萄球菌選擇性肉湯SSB配制方法為:15g胰蛋白胨，1g丙酮酸鈉，12g甘氨酸，5g氯化鋰，3g酵母提取物、0.02g磺胺二甲嘧啶加水定容到1000ml，121°C高壓滅菌15min，再加入磺胺二甲嘧啶0.005g。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法，其特征在于，步驟c所采用的固定方法為疏水力、分子間作用力或共價(jià)鍵。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟b的培養(yǎng)溫度為25°c至39°C。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104198734SQ201410439423
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月1日
【發(fā)明者】趙芳, 黃李華, 吳鳳琪, 呂敬章, 洪小柳, 葛麗雅, 肖峰 申請(qǐng)人:深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心