一種利用lamp技術(shù)檢測菊苣假單胞菌的引物組與試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用LAMP技術(shù)檢測菊苣假單胞菌的引物組與試劑盒及方法。該引物組包括一對外側(cè)引物F3和B3以及一對內(nèi)側(cè)引物FIP和BIP，序列分別如SEQ ID NO.1～4所示。試劑盒包括前述引物組，還可包括其他檢測試劑。用LAMP技術(shù)檢測菊苣假單胞菌的方法，是以待測樣品的基因組DNA為模板，利用引物組或試劑盒進行LAMP擴增反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后觀察LAMP擴增反應(yīng)液顏色變化，如反應(yīng)液為綠色的渾濁液體，即判斷為陽性反應(yīng)；如反應(yīng)液為橙色透明液體，即判斷為陰性反應(yīng)。本發(fā)明具有如下優(yōu)點：結(jié)果可靠、特異性強、靈敏性高、快速高效、簡便易操作。
【專利說明】
一種利用LAMP技術(shù)檢測菊苣假單胞菌的引物組與試劑盒及 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于植物保護領(lǐng)域，特別涉及一種利用LAMP技術(shù)檢測菊苣假單胞菌的引物 組與試劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 番前髓部壞死病(Tomato pith necrosis)是近年來我國大陸番前生產(chǎn)上出現(xiàn)的 一種新病害。由菊苣假單胞菌(Pseudomonas cichorii)侵染引起番前髓部壞死病于1974年 在愛爾蘭首次被報道，目前該病害已在土耳其、希臘、坦桑尼亞和我國臺灣等地區(qū)被報道。 2015年在廣東省廣州市首次發(fā)現(xiàn)了由菊苣假單胞菌侵染引起番茄髓部壞死病。番茄髓部壞 死病的田間癥狀包括植株的莖表面、葉柄和果柄形成黃色、棕色或黑色的斑點或損傷，隨后 莖髓部出現(xiàn)水浸狀、褪色、空心、軟腐等癥狀，最終導(dǎo)致番茄植株枯萎，嚴重影響番茄的產(chǎn)量 和品質(zhì)。目前，對菊苣假單胞菌的檢測方法主要有傳統(tǒng)的植物病原細菌分離與鑒定方法、 BI0L0G GEHIMicroStation微生物鑒定系統(tǒng)和PCR檢測方法。傳統(tǒng)的植物病原細菌分離與鑒 定方法的鑒定過程至少需要1個月以上，工作量大，且需要專業(yè)技術(shù)人員操作。BI0L0G GEM MicroStation微生物鑒定系統(tǒng)，的鑒定過程需要5-7天，且需要購買昂貴的儀器設(shè)備和標準 數(shù)據(jù)庫。PCR方法應(yīng)用最為廣泛，該方法較特異、快速、靈敏，成本也較低，但需要購買PCR儀 凝膠成像系統(tǒng)等專業(yè)儀器設(shè)備，且擴增和產(chǎn)物檢測時間較長(約3h)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點和不足，提供一種利用LAMP技術(shù)檢測 菊苣假單胞菌的引物組。
[0004] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種利用LAMP技術(shù)檢測菊苣假單胞菌的試劑盒。
[0005] 本發(fā)明的又一目的在于提供一種利用LAMP技術(shù)檢測菊苣假單胞菌的方法，該方法 快速、簡便。
[0006] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):一種利用LAMP技術(shù)檢測菊苣假單胞菌的引 物組，包括一對外側(cè)引物F3和B3以及一對內(nèi)側(cè)引物FIP和BIP，其核苷酸序列如下所示：
[0007] F3:5 '-CAGCCGCGGTAATACAGAG-3 '
[0008] B3:5 '-GCCACTGGTGTTCCTTCC-3 '
[0009] FIP:5 '-GCCCGGGGATTTCACATCCAACGGTGCGAGCGTTAATCGG-3 '
[0010] BIP:5 '-ACTGCATCCAAAACTGGCGAGCGCATTTCACCGCTACACAGG-3 '。
[0011] -種利用LAMP技術(shù)檢測菊苣假單胞菌的試劑盒，包括上述引物組。
[0012] 所述的利用LAMP技術(shù)檢測菊苣假單胞菌的試劑盒，還包含以下組分:LAMP反應(yīng)液、 酶溶液和核酸熒光染料。
[0013] 所述的LAMP反應(yīng)液包含如下組分：Tris-HCl(pH8.8)40mM、KCl 20mM、MgS〇4 16mM、 (順4)23〇4 2〇1111、丁￥6611-20 0.2%(￥八）、甜菜堿（86七&1116)1.61、(1犯138 2.81111;
[0014] 所述的酶溶液為Bst DNA聚合酶，8U/yL;
[0015] 所述的核酸熒光染料為Loopamp?熒光目視檢測試劑。
[0016] -種利用LAMP技術(shù)檢測菊苣假單胞菌的方法，包含以下步驟：
[0017] 以待測樣品的基因組DNA為模板，利用LAMP引物組或LAMP檢測試劑盒進行LAMP擴 增反應(yīng);反應(yīng)結(jié)束后觀察LAMP擴增反應(yīng)液顏色變化，如反應(yīng)液為綠色的渾濁液體，即判斷為 陽性反應(yīng);如反應(yīng)液為橙色透明液體，即判斷為陰性反應(yīng)；
[0018] 所述的LAMP擴增反應(yīng)的反應(yīng)體系為25yL反應(yīng)體系，包括DNA模板lyL、2 X反應(yīng)緩沖 液12.5yL、濃度為20μΜ引物FIP和BIP各3yL、濃度為ΙΟμΜ引物F3和B3各lyL、Bst DN聚合酶1μ L、Loopamp?熒光目測反應(yīng)液IyL以及去離子水1 · 5yL;
[0019] 所述的LAMP擴增反應(yīng)的條件為63°C恒溫條件下，擴增反應(yīng)lh，95°C恒溫2min使酶 失活。
[0020] 所述的引物組或試劑盒在植物菊苣假單胞菌檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：
[0022] (1)結(jié)果可靠:本發(fā)明所設(shè)計的LAMP引物組，已經(jīng)對5種不同細菌進行檢測驗證，其 結(jié)果可靠性有保證。
[0023] (2)特異性強:本發(fā)明通過2對引物識別靶序列上6個特異區(qū)域，常規(guī)PCR是通過識 別靶序列上2個特異區(qū)域，而BI0L0G微生物鑒定系統(tǒng)因操作差異和檢測板不同等原因，導(dǎo)致 獲得的數(shù)據(jù)中部分與標準數(shù)據(jù)庫不一致，難以定論。因此本發(fā)明大大提高了特異性。
[0024] (3)靈敏性高：環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法所需模板濃度比PCR方法所需模板濃度還要低， 相比PCR方法，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法靈敏度提高10倍。
[0025] (4)快速高效:本方面的檢測方法鑒定周期為1小時，傳統(tǒng)的植物病原細菌鑒定方 法至少需要1個月，且需要專業(yè)技術(shù)人員操作;BI0L0G鑒定方法需要5-7天，而且需要購買昂 貴的儀器設(shè)備和數(shù)據(jù)庫;PCR鑒定方法則至少需要3h，本發(fā)明大大提高了檢測效率。
[0026] (5)簡便易操作:本發(fā)明的方法只需要有恒溫水浴鍋或穩(wěn)定熱源的設(shè)備即可進行， 試驗結(jié)果通過肉眼觀察反應(yīng)液顏色變化即可判斷，不需要專業(yè)人員操作，非專業(yè)人員均可 操作，鑒定方法適應(yīng)性強?？朔藗鹘y(tǒng)的植物病原細菌鑒定方法、BI0L0G鑒定方法和PCR方 法的專業(yè)性強以及需要專業(yè)儀器設(shè)備等局限性，從而達到實際生產(chǎn)中快速鑒定植物病害的 要求。
【附圖說明】
[0027]圖1為實施例2的LAMP特異性反應(yīng)結(jié)果圖，其中：管1-3是以菊苣假單胞菌基因組 DNA為模板、管4是以茄科青枯菌基因組DNA為模板、管5是以黑腐果膠桿菌基因組DNA為模 板、管6是以Pectobacterium carotovorum subsp·brasiliense菌基因組DNA為模板、管7為 陰性對照。
[0028] 圖2為實施例3的LAMP靈敏度反應(yīng)結(jié)果圖，其中：管1-8模板濃度分別為Ι,ΠΓ1，10 -2，10- 3，10-4，10-5，10-6，10-7，管9為陰性對照。
[0029] 圖3為實施例3的不同濃度的菊苣假單胞菌基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果 圖，其中：泳道1為標準分子量（IOObp LadderMarker);泳道2-8DNA模板濃度分別為1，10一1， 10-2，10- 3，10-4，10-5，10-6，10-7，泳道9 為陰性對照。
[0030]圖4為實施例4未知番茄病樣的LAMP反應(yīng)結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0031]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[0032]實施例1引物的設(shè)計
[0033] 根據(jù)Genbank中已登錄的侵染我國番前的菊苣假單胞菌16SrRNA基因（Genebank登 錄號KU923372)特異區(qū)域，設(shè)計外側(cè)引物F3和B3以及內(nèi)側(cè)引物FIP和BIP，最終確定以下引物 組：
[0034] F3:5 '-CAGCCGCGGTAATACAGAG-3 '
[0035] B3:5 '-GCCACTGGTGTTCCTTCC-3 '
[0036] FIP:5 '-GCCCGGGGATTTCACATCCAACGGTGCGAGCGTTAATCGG-3 '
[0037] BIP:5 '-ACTGCATCCAAAACTGGCGAGCGCATTTCACCGCTACACAGG-3 '。
[0038] 實施例2 LAMP引物對菊苣假單胞菌的特異性擴增 [0039] 一、實驗材料
[0040] 以菊苣假單胞菌(菌株編號為Pc-Gd-3,該菌株已在GenBank上公開，其16Sr RNA的 登錄號為KU923372)、茄科青枯菌（菌株編號為SSf-4,該菌株已在GenBank上公開，其16Sr RNA的登錄號為FJ744124)、黑腐果膠桿菌（菌株編號為Pl，該菌株已在GenBank上公開，其 165『1?熟的登錄號為1(〇695819)、？6(31：(^&(^61'；[11111。&1'01：0￥01'111118油8。.13瓜8；[1丨61186(菌株 編號為Pcb-Z j-Ι，該菌株的16Sr RNA序列已在國際基因庫上登錄http:// www.ncbi · nlm.nih.gov，登錄號KX377593)為材料。
[0041 ]菊苣假單胞菌LAMP檢測試劑盒包括以下組分:實施例1中設(shè)計的LAMP引物組、LAMP 反應(yīng)液、酶溶液和核酸熒光染料。
[0042] 2 X LAMP反應(yīng)液（榮研生物科技（中國）有限公司產(chǎn)品）包含如下組分：Tr i s-HCl (ρΗ8·8)濃度為 40mM、KCl 濃度為 20mM、MgS〇4 濃度為16mM、（NH4)2S〇4 濃度為 20mM、0.2% Tween20(v/v)、Betaine濃度為1.6M、dNTPs濃度為2.8mM。
[0043] 酶溶液(榮研生物科技（中國）有限公司產(chǎn)品）為Bst DNA聚合酶。
[0044] 核酸熒光染料(榮研生物科技（中國）有限公司產(chǎn)品）為LQOpanip?熒光目視檢測試 劑。
[0045] 二、實驗方法
[0046] (1)基因組DNA提取:方法按照細菌基因組DNA提取試劑盒進行；
[0047] (2)配制環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)反應(yīng)混合物，包括基因組DNA IyL、2 X LAMP反應(yīng)液 12.5yL、濃度為20μΜ引物FIP和BIP各3yL、濃度為ΙΟμΜ引物F3和B3各lyL、Bst DN聚合酶lyL、 Loopmnp?熒光目測反應(yīng)液IyL以及去離子水1.5yL;
[0048] (3)環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)反應(yīng)條件:反應(yīng)溫度為63 °C恒溫Ihour，95 °C恒溫2min;
[0049] (4)反應(yīng)結(jié)束后觀察PCR管中反應(yīng)液顏色是否有變化，根據(jù)反應(yīng)液顏色變化做出判 定，并拍照。
[0050] 三、實驗結(jié)果與分析
[0051] 如圖1所示，應(yīng)用本發(fā)明的方法，以1此菊苣假單胞菌基因組DNA為模板，可成功使 各LAMP反應(yīng)液顏色呈綠色，而以前科青枯菌侵染、黑腐果膠桿菌以及Pectobacterium carotovorum subsp.brasiliense菌的基因組DNA為模板的LAMP反應(yīng)液顏色呈橘紅色(見圖 1)，說明本發(fā)明所述的試劑盒和檢測方法對菊苣假單胞菌具有很好的特異性。
[0052]實施例3:對菊苣假單胞菌檢測的敏感度測定
[0053] 一、實驗材料
[0054]以菊苣假單胞菌為材料。
[0055] 菊苣假單胞菌LAMP檢測試劑盒同實施例2。
[0056] 二、實驗方法
[0057] (1)基因組DNA提取:方法按照細菌基因組DNA提取試劑盒進行；
[0058] (2)取上述基因組DNAlOyL于PCR管中作為模板母液，將模板母液分別稀釋HT1，10 -2，10-3，10-4，10-5，10- 6，10-7倍，從各梯度稀釋液中取IyL作為模板；
[0059] (3)配制環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)反應(yīng)混合物，包括各梯度稀釋液DNAlyL、2 X LAMP 反應(yīng)液12.5yL、濃度為20μΜ引物FIP和BIP各3yL、濃度為ΙΟμΜ引物F3和B3各lyL、Bst DN聚合 酶lyL、Loopamp?熒光目測反應(yīng)液IyL以及去離子水1 · 5yL;
[0060] (4)環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)反應(yīng)條件:反應(yīng)溫度為63°C恒溫lhour，95°C恒溫2min;
[0061] (5)結(jié)果鑒定
[0062] 反應(yīng)結(jié)束后，觀察PCR管中反應(yīng)液顏色是否有變化，根據(jù)反應(yīng)液顏色變化做出判 定，并拍照；
[0063] 如圖2所示，應(yīng)用本發(fā)明的方法，以UiL母液以及10'10'10'10'和1(^倍稀釋 液為模板的LAMP反應(yīng)液均呈綠色，I(T 6和I(T7倍稀釋液為模板的和陰性對照LAMP反應(yīng)液為 橘紅色。
[0064] (6)PCR 反應(yīng)
[0065] 配制PCR反應(yīng)體系，25yL反應(yīng)體系包括各梯度稀釋液DNA lyL，Premix Taq(dNTP Mixture 0.4mM，TaKaRa Taq 0.05UAiL，Mg2+3mM)12.5yL、濃度分別為ΙΟμΜ的菊苣假單胞菌 的特異引物肚？1&(5 /-〇^1'1^厶1^61^厶1^6厶0：1'-3/)和!1印2&(5/-(^61^〇^〇厶了6厶1'(^6661'-3')各IyL，加滅菌的雙蒸水9.5yL至總體積為25yL;
[0066] PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性4min，94°C變性45s、55°C退火45s、72°C延伸90s，35個 循環(huán)，72°C最終延伸10min。
[0067] (7)結(jié)果鑒定
[0068] PCR反應(yīng)結(jié)束后，取各反應(yīng)產(chǎn)物IOyL分別點樣于質(zhì)量體積百分比(w/v)為1%瓊脂 糖凝膠的點樣孔中，進行電泳，120V恒壓電泳25min;在凝膠成像系統(tǒng)中觀察，并拍照;根據(jù) 電泳結(jié)果做出判定。
[0069] 電泳結(jié)果如圖3所示，泳道1:標準分子量（100bp Ladder Marker);泳道2-8:母液、 10-1、10-2、10-3、10- 4、10-5、10-6和 10-7;泳道9:陰性對照。分別以母液、10-1、10-2、10- 3和 10-4倍 稀釋液為模板，可成功地擴增到預(yù)期大小為897bp的特異目的片段，這些片段大小與預(yù)期片 段大小一致，10- 5、10-6和KT7倍稀釋液和陰性對照均未擴增出特異條帶。
[0070] 由圖2圖3相比可知，LAMP檢測鑒定菊苣假單胞菌的敏感度比PCR反應(yīng)擴增鑒定菊 苣假單胞菌的敏感度高10倍。
[0071] 實施例4對未知番茄病樣的檢測與鑒定
[0072] 一、實驗材料
[0073] 以田間采集的10株疑似髓部壞死病番茄植株為材料。
[0074] 菊苣假單胞菌LAMP檢測試劑盒同實施例2。
[0075]二、實驗方法
[0076]對采集到的10株病株進行取樣并進行編號。檢測鑒定所采用的方法同實施例2所 用方法相同，并用PCR方法加以比較驗證，PCR所采用的方法同實施例3所用方法相同。
[0077] 三、實驗步驟
[0078] (1)基因組DNA提取:方法按照細菌基因組DNA提取試劑盒進行；
[0079] (2)配制環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)反應(yīng)混合物，包括（1)所述基因組DNAlyL、2 X LAMP 反應(yīng)液12.5yL、濃度為20μΜ引物FIP和BIP各3yL、濃度為ΙΟμΜ引物F3和B3各lyL、Bst DN聚合 酶lyL、Loopamp?熒光目測反應(yīng)液IyL以及去離子水1 · 5yL;
[0080] (3)環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)反應(yīng)條件:反應(yīng)溫度為63°C恒溫lhour，95°C恒溫2min;
[0081 ] (4)反應(yīng)結(jié)束后觀察PCR管中反應(yīng)液顏色是否有變化，根據(jù)反應(yīng)液顏色變化做出判 定，并拍照。
[0082] (5)PCR驗證：采用對應(yīng)量的DNA模板，以菊苣假單胞菌的特異引物HrplaW- CCGTTCATCGTCATCGACCT-3')和HrpSaG' -CTGTCCCACATGATCTGGGT-3')進行PCR驗證。
[0083] PCR反應(yīng)體系為25yL，包含（1)所述基因組DNA lyL，Premix Taq(dNTP Mixture各 0.4mM，TaKaRa TaqO.05U/yL，Mg2+濃度為3mM) 12.5yL、濃度分別為ΙΟμΜ的菊苣假單胞菌的特 異引物Hrpla和Hrp2a各lyL，加滅菌的雙蒸水9.5yL至總體積為25μΙ^ΡΟ?反應(yīng)條件為：94°C 預(yù)變性4min，94°C變性45s、55°C退火45s、72°C延伸9〇8,35個循環(huán)，72°(：最終延伸1〇1^11。？0? 反應(yīng)結(jié)束后，取各反應(yīng)產(chǎn)物1〇此分別點樣于質(zhì)量體積百分比為(w/v)l%瓊脂糖凝膠的點樣 孔中，進行電泳，120V恒壓電泳25min;在凝膠成像系統(tǒng)中觀察，并拍照;根據(jù)電泳結(jié)果做出 判定。
[0084]四、實驗結(jié)果與分析
[0085] 如圖4所示，采用LAMP檢測方法，對10份疑似病樣進行檢測，結(jié)果如圖4,疑似病樣1 號、4號、5號、6號、7號、8號和9號為陽性，2號、3號和10號為陰性;進一步用PCR驗證，檢測結(jié) 果與LAMP檢測結(jié)果一致，二者符合率100%。
[0086] 上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本方面的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任務(wù)未背離本方明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種利用LAMP技術(shù)檢測菊宦假單胞菌的引物組，其特征在于:包括一對外側(cè)引物F3 和B3 W及一對內(nèi)側(cè)引物FIP和BIP，其核巧酸序列如下所示： F3:5 '-CAGCCGCGGTAATACAGAG-3， B3:5 '-GCCACTGGTGTTCCTTCC-3 ' 巧P: 5 ' -GCCCGGGGATTTCACATCCAACGGTGCGAGCGTTMTCGG-3， BIP:5 '-ACTGCATCCAAAACTGGCGAGCGCATTTCACCGCTACACAGG-3 '。2. -種利用LAMP技術(shù)檢測菊宦假單胞菌的試劑盒，其特征在于:包括權(quán)利要求1所述的 引物組。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用LAMP技術(shù)檢測菊宦假單胞菌的試劑盒，其特征在于:還包 含W下組分:LAMP反應(yīng)液、酶溶液和核酸巧光染料。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用LAMP技術(shù)檢測菊宦假單胞菌的試劑盒，其特征在于:所述 的LAMP反應(yīng)液包含如下組分：p服.8的T ris-HCl 40mM、KCl 20mM、MgS〇4 16mM、（NH4)2S〇4 20mM、Tween-20 0.2%(v/v)、甜菜堿 1.6M、dNTPs 2.8mM; 所述的酶溶液為Bst DM聚合酶，洲AiL; 所述的核酸巧光染料為Loopamp?巧光目視檢測試劑。5. -種利用LAMP技術(shù)檢測菊宦假單胞菌的方法，其特征在于包含W下步驟： W待測樣品的基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物組或權(quán)利要求2~4任一項 所述的試劑盒進行LAMP擴增反應(yīng);反應(yīng)結(jié)束后觀察LAMP擴增反應(yīng)液顏色變化，如反應(yīng)液為 綠色的渾濁液體，即判斷為陽性反應(yīng);如反應(yīng)液為澄色透明液體，即判斷為陰性反應(yīng)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述利用LAMP技術(shù)檢測菊宦假單胞菌的方法，其特征在于：所述的 LAMP擴增反應(yīng)的反應(yīng)體系為25化反應(yīng)體系，包括DNA模板化L、2 X反應(yīng)緩沖液12.5化、濃度 為20μΜ引物FIP和BIP各化L、濃度為ΙΟμΜ引物F3和B3各化L、Bst DN聚合酶化L、L00阱mp? 巧光目測反應(yīng)液化LW及去離子水1. 所述的LAMP擴增反應(yīng)的條件為63°C恒溫條件下，擴增反應(yīng)lh，95°C恒溫2min使酶失活。7. 權(quán)利要求1所述的引物組在植物菊宦假單胞菌檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求2~4任一項所述的試劑盒在植物菊宦假單胞菌檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK106086207SQ201610598755
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月26日 公開號201610598755.5, CN 106086207 A, CN 106086207A, CN 201610598755, CN-A-106086207, CN106086207 A, CN106086207A, CN201610598755, CN201610598755.5
【發(fā)明人】佘小漫, 何自福, 湯亞飛, 藍國兵
【申請人】廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所