一種檢測(cè)jak2 v617f基因突變的引物及其方法
【專利摘要】本發(fā)明公布了一種檢測(cè)JAK2V617F基因突變的引物，其中引物包括用于擴(kuò)增JAK2V617F的正常序列內(nèi)引物JAK2WF、突變序列內(nèi)引物JAK2MF、正常序列和突變序列的反向引物JAK2WR、封閉引物JAK2WF?P，并將該引物對(duì)JAK2V617F基因突變列進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。本發(fā)明所述的JAK2V617F基因突變的檢測(cè)方法相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的檢測(cè)方法檢測(cè)靈敏度提高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于20％，且檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，成本低廉，報(bào)告周期短，適用于一般篩查。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因檢測(cè)方法，具體涉及一種檢測(cè)JAK2 V617F基因突變的引物及其方 法。 一種檢測(cè)JAK2 V617F基因突變的引物及其方法
【背景技術(shù)】
[0002] 骨髓增殖性疾病(Myeloproliferative Disorder，MPD)是一系或多系分化相對(duì)成 熟的骨髓細(xì)胞不斷的克隆性增殖所致的一組腫瘤性疾病的統(tǒng)稱，其中以真性紅細(xì)胞增多癥 (Polycythemia Vera，PV)、原發(fā)性血小板增多癥（Essential Thrombocythemia，ET)、骨髓 纖維化(Myelof ibros is，MF)最為常見(jiàn)。
[0003] JAK2與JAK1、JAK3和TYK2同屬于JAK家屬，為非受體型即細(xì)胞內(nèi)激酶。V617F突變位 于JAK2的JH2假激酶區(qū)，此與該激酶活性的抑制有關(guān)。V617F突變導(dǎo)致JAK2持續(xù)激活，導(dǎo)致不 受控制的細(xì)胞持續(xù)增殖從而導(dǎo)致MPD的發(fā)生。世界衛(wèi)生組織于2008年將JAK2 V617F基因突 變列為骨髓增殖性疾病的主要確診指標(biāo)之一。
[0004] JAK2(Janus Tyrosine Kinase 2)V617F基因突變常見(jiàn)于PV、MF和ET中。目前的研 究報(bào)道表明，JAK2 V617F(c.l849G>T)的突變率在PV中約為65%~97%、ET中約為23%~ 57%、MF中約為35%~57%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是:現(xiàn)有JAK2 V617F基因突變序列的檢測(cè)方法是測(cè)序 和定量PCR，測(cè)序檢測(cè)靈敏度低，檢測(cè)下限只有20%，而定量PCR檢測(cè)，需要采用特定的實(shí)驗(yàn) 儀器，檢測(cè)成本高?，F(xiàn)提供一種檢測(cè)JAK2 V617F基因突變的引物及其方法。解決了現(xiàn)有檢 測(cè)方法檢測(cè)靈敏度低、準(zhǔn)確度低等技術(shù)缺陷。
[0006] 本發(fā)明的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] 一種檢測(cè)JAK2 V617F基因突變的引物，包括用于擴(kuò)增JAK2 V617F的正常序列內(nèi)引 物JAK2 WF、突變序列內(nèi)引物JAK2 MF、正常序列和突變序列的反向引物JAK2 WR、封閉引物 JAK2 WF-P，各引物的核苷酸序列為：
[0008] JAK2 WF ：
[0009] ATCTGCTACAGTACTGCGTAGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTG
[0010] JAK2 MF：
[0011] GCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGAT
[0012] JAK2 WR:
[0013] ACTGACACCTAGCTGTGATCCTG
[0014] JAK2 WF-P：
[0015] ATCTGCTACAGTACTGCGTAGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTG-P。
[0016] 現(xiàn)有的對(duì)于JAK2 V617F基因突變的檢測(cè)方法是直接測(cè)序和定量PCR，測(cè)序是指直 接對(duì)JAK2 V617F的某一段進(jìn)行測(cè)序，確定突變點(diǎn)，該檢測(cè)方法靈敏度低，檢測(cè)下限不超過(guò) 20% ο
[0017] 發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究設(shè)計(jì)：引物JAK2 WF，用于對(duì)正常序列JAK2 V617F進(jìn)行擴(kuò) 增，并作為內(nèi)參。引物JAK2 MF，針對(duì)突變序列(G>T)，由于將最后堿基G換成T造成正常序列 里沒(méi)有突變基因也會(huì)擴(kuò)增，故將jak2 MF的最后兩個(gè)堿基進(jìn)行改變，該突變序列的內(nèi)引物 JAK2 MF可高度特異性擴(kuò)增突變序列。
[0018] 反向引物JAK2 WR為正常序列和突變序列共用。
[0019] 封閉引物JAK2 WF-P的采用，可進(jìn)一步增加檢測(cè)的靈敏度，該封閉引物在突變反應(yīng) 體系中特異性的封閉正常序列，從而使突變序列獲得更好的擴(kuò)增。如此突變序列的引物就 可特異性的擴(kuò)增突變序列，正常序列中則不會(huì)出現(xiàn)突變條帶。
[0020] 本發(fā)明技術(shù)方案中封閉引物JAK2 WF-P加入到正常序列中，能結(jié)合沒(méi)有突變的序 列，從而使檢測(cè)體系中突變序列擴(kuò)增比例相對(duì)增高，提高整個(gè)檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度。
[0021] 本發(fā)明還提供了一種JAK2 V617F基因突變的檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0022] 1)提取受試者的骨髓、外周血或組織的基因組DNA;
[0023] 2)以受試者骨髓或外周血的基因組DNA為模板，使用權(quán)利要求1所述的正常序列內(nèi) 引物JAK2 WF、突變序列內(nèi)引物JAK2 MF、正常序列和突變序列的反向引物JAK2 WR、封閉引 物JAK2 WF-P進(jìn)行擴(kuò)增；
[0024] 3)對(duì)步驟2)的擴(kuò)增反應(yīng)獲得的擴(kuò)增條帶，分別進(jìn)行測(cè)序。
[0025] 進(jìn)一步地，為了更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，所述擴(kuò)增方法為PCR擴(kuò)增。
[0026] 進(jìn)一步地，為了更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，PCR擴(kuò)增反應(yīng)具體操作方法為：
[0027] 1)將檢測(cè)樣本DNA稀釋至100ug/ml;
[0028] 2)在PCR反應(yīng)管中加入ddH20、Taq PCR Mastermix、引物工作液制備PCR反應(yīng)體系， 離心；
[0029] 3)在PCR反應(yīng)管中加入檢測(cè)樣本后稀釋至lOOng/yL樣本DNA模板；
[0030] 4)震蕩混勻，轉(zhuǎn)移至PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
[0031]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：
[0032] (1)本發(fā)明在檢測(cè)突變序列中加入正常序列的封閉引物jak2 WF-P，該封閉引物能 結(jié)合沒(méi)有突變的序列，從而使檢測(cè)突變體系中突變序列的比例相對(duì)增高，從而提高檢測(cè) JAK2 V617F基因突變的靈敏度和準(zhǔn)確度。
[0033] (2)本發(fā)明所采用的檢測(cè)方法相對(duì)于一般的采用定量PCR和測(cè)序方法不同，本發(fā)明 引入競(jìng)爭(zhēng)性抑制物封閉引物，可提高檢測(cè)靈敏度高于20%，滿足初診患者，成本低，且本發(fā) 明所述的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、成本低廉、報(bào)告周期短、適用于一般篩查。
【附圖說(shuō)明】
[0034] 此處所說(shuō)明的附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本申請(qǐng)的一部 分，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的限定。在附圖中：
[0035]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中陽(yáng)性樣本a管的擴(kuò)增條帶圖；
[0036]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中陽(yáng)性樣本b管的擴(kuò)增條帶圖；
[0037] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中靈敏度檢測(cè)結(jié)果圖；
[0038] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例1中野生型序列擴(kuò)增結(jié)果圖；
[0039] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例1中突變型序列擴(kuò)增結(jié)果圖；
[0040] 圖6為本發(fā)明檢測(cè)JAK2 V617F基因突變方法的結(jié)構(gòu)示意框圖。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合實(shí)施例和附圖，對(duì)本 發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明的示意性實(shí)施方式及其說(shuō)明僅用于解釋本發(fā)明，并不作 為對(duì)本發(fā)明的限定。
[0042] 實(shí)施例1:
[0043] 一種檢測(cè)JAK2 V617F基因突變的引物，包括用于擴(kuò)增JAK2 V617F的正常序列引物 JAK2 WF、突變序列引物JAK2 MF、正常序列和突變序列的反向引物JAK2 WR、封閉引物JAK2 WF-P，各引物的核苷酸序列為：
[0044] JAK2 WF ：
[0045] ATCTGCTACAGTACTGCGTAGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTG
[0046] JAK2 MF ：
[0047] GCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGAT
[0048] JAK2 WR：
[0049] ACTGACACCTAGCTGTGATCCTG
[0050] JAK2 WF-P：
[0051 ] ATCTGCTACAGTACTGCGTAGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTG-P。
[0052]其中，正常序列的封閉引物JAK2 WF-P，加入到檢測(cè)突變的體系中，該封閉引物能 結(jié)合沒(méi)有突變的序列，而從使體系中突變序列相對(duì)比例相對(duì)增高，從而提高檢測(cè)的靈敏度 和準(zhǔn)確度。
[0053] 一種JAK2 V617F基因突變的檢測(cè)方法:將實(shí)施例1中的引物序列對(duì)JAK2 V617F基 因突變列進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
[0054]本實(shí)施例所述的檢測(cè)方法主要檢測(cè)JAK2編碼序列的1849位點(diǎn)上由G到T的突變。因 而在設(shè)計(jì)引物時(shí)，采用的對(duì)照就是沒(méi)有突變的序列:GCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTG，而 JAK2突變序列中由序列最后一位的G變成T，我們?cè)谠O(shè)計(jì)突變引物時(shí)，把最后兩個(gè)堿基都換 掉，序列為:GCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGAT，此引物可特異的擴(kuò)增出突變基因。其中設(shè)計(jì) 的JAK2 WF-P為正常引物最后一個(gè)堿基磷酸化:GCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTG-p，該引 物可特異結(jié)合到正常序列上不會(huì)擴(kuò)增，且此序列不會(huì)結(jié)合到突變序列上。因此突變序列引 物能特異性的擴(kuò)增突變序列，而正常人中就不會(huì)出現(xiàn)突變條帶。
[0055]具體操作方法為，如圖6所示：
[0056] 1)提取受試者的骨髓、外周血或組織的基因組DNA;
[0057] 2)以受試者骨髓或外周血的基因組DNA為模板，使用權(quán)利要求1所述的正常序列內(nèi) 引物JAK2 WF、突變序列內(nèi)引物JAK2 MF、正常序列和突變序列的反向引物JAK2 WR、封閉引 物JAK2 WF-P進(jìn)行擴(kuò)增；
[0058] 3)對(duì)步驟2)的擴(kuò)增反應(yīng)獲得的擴(kuò)增條帶，分別進(jìn)行凝膠電泳。
[0059]其中PCR擴(kuò)增反應(yīng)操作步驟為：
[0060] 1、標(biāo)本制備區(qū)使用檢測(cè)樣本DNA稀釋至100yg/mL;
[0061 ] 2、從試劑儲(chǔ)備區(qū)取出Taq PCR Mastermix(天根生物），ddH20和引物工作液，低速 離心IOs;
[0062] 3、反應(yīng)體系配制；
[0063] 反應(yīng)體系配制表
[0065] 4、震蕩混勻，短暫離心后，分裝20μ1至標(biāo)記好的PCR反應(yīng)管，轉(zhuǎn)移至標(biāo)本制備區(qū)；
[0066] 5、向分裝好的PCR反應(yīng)管中加入5μ1稀釋后稀釋至IOOngAiL樣本DNA模板；
[0067] 6、蓋好PCR反應(yīng)管管蓋后，震蕩混勻，短暫離心，轉(zhuǎn)移至PCR儀。
[0068]其中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)具體操作方法為：
[0069] 步驟 1:95°C 預(yù)變性 2min;
[0070] 步驟 2:95 Γ 變性 5s;
[0071] 步驟 3:6(TC 退火 30s;
[0072] 步驟 4:72Γ 延伸 30s;
[0073] 步驟5:循環(huán)步驟2-4,35次；
[0074] 步驟 6:72。(：延伸1〇11^11。
[0075] 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果：如圖1、圖2所示，陽(yáng)性樣本a管、b管都有擴(kuò)增帶，a管帶為野生型 162bp，b管帶為突變型擴(kuò)增142bp，陰性樣本只有野生型條帶a管有擴(kuò)增，可見(jiàn)擴(kuò)增結(jié)果特異 性高。
[0076] 對(duì)陽(yáng)性樣本a管和b管的擴(kuò)增條帶進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示，a管和b管的擴(kuò)增條帶分別 正常的JAK2和突變JAK2的部分序列。將測(cè)序結(jié)果與NCBI(Homo sapiens Janus kinase 2 (JAK2)，RefSeqGene on chromosome 9Sequence ID:ref|NG_0〇99〇4.l|Length:149939)上 結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)。結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段與參考序列完全一致。
[0077]其中，圖4為野生型序列擴(kuò)增結(jié)果，與參考序列完全一致；圖5為突變序列，與參考 序列有兩個(gè)堿基不同，見(jiàn)引物設(shè)計(jì)，與預(yù)期相同。其中，圖4、圖5顯示部分測(cè)序結(jié)果。
[0078]本實(shí)施例所述的JAK2 V617F基因突變的檢測(cè)方法為：
[0079] (1)電泳前準(zhǔn)備:在電泳前確保所有的電泳用具為清潔干燥的，若電泳前電泳用具 較臟可用洗滌劑清潔再用II級(jí)水沖洗干凈。
[0080] (2)瓊脂糖凝膠制備瓊脂糖凝膠的配制:稱取足量的瓊脂糖，放入200ml的錐形瓶， 加入一定量的TBE緩沖液，在微波爐中以中高火加熱中高火3min或煮沸后至溶液澄清，室溫 冷卻至65°C，倒入另一100mL錐形瓶，加入適量DD核酸染料，倒膠，然后插入齒梳，室溫冷卻 10-15min后即可使用。
[0081 ] (3)點(diǎn)樣和電泳：吸取5ul擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣至凝膠孔內(nèi)，蓋上電泳槽蓋，以185V電泳 45min〇
[0082] 本檢測(cè)采用PCR后瓊脂糖凝膠電泳對(duì)標(biāo)本條碼號(hào)為2315231450、2314600796、 2315244749進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度以最低檢測(cè)下限（LOD)代替，檢測(cè)結(jié)果：如表6,本實(shí)驗(yàn)檢 測(cè)靈敏度為:5%突變型;DNA濃度>10ng/ul，DNA量輸入范圍>50ng，可保證突變樣本檢測(cè)結(jié) 果一致。
[0083] 表6 JAK2 V617檢測(cè)靈敏度結(jié)果

[0086]檢測(cè)結(jié)果：如圖3所示，在突變JAK2的含量低至0.5%時(shí)，可檢測(cè)到JAK2突變條帶， 靈敏度高，且DNA濃度低至5ng/ul時(shí)，仍可檢測(cè)出突變。
[0087]準(zhǔn)確度的檢測(cè)：
[0088]對(duì)標(biāo)本號(hào)2314346686、2314214965、2313183578、2314376660、2314198499、 2314198497、2315244749、2314600796、2315190409、2315231450、2314467891、2314650882、 2315162691、2315006446、2315006445、2314719491、2315310714、2315290221、2315231450、 2315229846、2314650910、2315307221、2315081322、2314719618、2314719709、2315288336、 2315252562、2315133418、2315335127、2314628299、2314661522、2314744343進(jìn)行準(zhǔn)確度檢 測(cè)：
[0089]檢測(cè)結(jié)果:如下表7所示，

[0092] 檢測(cè)結(jié)果:準(zhǔn)確度100 %。
[0093]本實(shí)施例所述的JAK2 V617F基因突變的檢測(cè)方法相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的檢測(cè)方法檢 測(cè)靈敏度提高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于20%，且檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，成本低廉，報(bào)告周期短，適用于一般篩查。
[0094]以上所述的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步 詳細(xì)說(shuō)明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】而已，并不用于限定本發(fā)明 的保護(hù)范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包 含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)JAK2V617F基因突變的引物，其特征在于：包括用于擴(kuò)增JAK2V617F的正常 序列內(nèi)引物JAK2WF、突變序列內(nèi)引物JAK2MF、正常序列和突變序列的反向引物JAK2WR、封閉 弓丨物JAK2WF-P，各引物的核苷酸序列為： JAK2WF： ATCTGCTACAGTACTGCGTAGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTG JAK2MF： GCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGAT JAK2WR： ACTGACACCTAGCTGTGATCCTG JAK2WF-P： ATCTGCTACAGTACTGCGTAGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTG-P。2. -種JAK2V617F基因突變的檢測(cè)方法，其特征在于:包括以下步驟， 1) 提取受試者的骨髓、外周血或組織的基因組DNA; 2) 以受試者骨髓或外周血的基因組DNA為模板，使用權(quán)利要求1所述的正常序列內(nèi)引物 JAK2WF、突變序列內(nèi)引物JAK2MF、正常序列和突變序列的反向引物JAK2WR、封閉引物 JAK2WF-P進(jìn)行擴(kuò)增； 3) 對(duì)步驟2)的擴(kuò)增反應(yīng)獲得的擴(kuò)增條帶，分別進(jìn)行測(cè)序。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種JAK2V617F基因突變的檢測(cè)方法，其特征在于:采用的擴(kuò) 增方法為PCR擴(kuò)增。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種JAK2V617F基因突變的檢測(cè)方法，其特征在于:所述PCR擴(kuò) 增反應(yīng)具體操作方法為： 1) 將檢測(cè)樣本DNA稀釋至100ug/ml; 2) 在PCR反應(yīng)管中加入ddH20、Taq PCR Mastermix、引物工作液制備PCR反應(yīng)體系，離 心； 3) 在PCR反應(yīng)管中加入檢測(cè)樣本后稀釋至100ng/yL樣本DNA模板； 4) 震蕩混勻，轉(zhuǎn)移至PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK106086204SQ201610553215
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月14日
【發(fā)明人】黃平, 周煒, 歐陽(yáng)小峰, 彭宇
【申請(qǐng)人】四川金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司