利用雙親混合dna鑒定水稻品種親緣關(guān)系的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是利用雙親混合DNA鑒定水稻品種親緣關(guān)系的方法，包括：提取雙親和待測(cè)樣品DNA，雙親DNA混合樣品和待測(cè)樣品分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后利用雙親DNA混合樣品的PCR產(chǎn)物和待檢測(cè)樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)進(jìn)行親緣關(guān)系比較。本發(fā)明利用雙親混合DNA與對(duì)照樣品進(jìn)行PCR產(chǎn)物比較確定水稻品種親緣關(guān)系，不僅減少了樣品量，而且準(zhǔn)確性強(qiáng)，直觀性好。
【專利說明】
利用雙親混合DNA鑒定水稻品種親緣關(guān)系的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是利用雙親混合DNA鑒定水稻品種親緣關(guān)系 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，基于PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于雜交種 子親緣關(guān)系的分析，打擊市場(chǎng)上的假冒種子。但目前采用的方法是利用中華人民共和國農(nóng) 業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的48對(duì)引物分別對(duì)父本、母本和檢測(cè)樣品進(jìn)行比較分析(圖1所示），確定子一代 與父本、母本是否存在親緣關(guān)系，子一代存在的多態(tài)性是否是父本和母本互補(bǔ)的帶型，此方 法存在直觀性較差的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是針對(duì)上述技術(shù)存在的問題，提供一種利用雙親混合DNA鑒定水稻 品種親緣關(guān)系的方法。本發(fā)明利用雙親混合DNA與對(duì)照樣品進(jìn)行PCR產(chǎn)物比較確定水稻品種 親緣關(guān)系，不僅感少了樣品量，而且準(zhǔn)確性強(qiáng)，直觀性好。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種利用雙親混合DNA鑒定水稻品種 親緣關(guān)系的方法，提取雙親和待測(cè)樣品DNA，雙親DNA混合樣品和待測(cè)樣品分別進(jìn)行PCR反 應(yīng)，然后利用雙親DNA混合樣品的PCR產(chǎn)物和待檢測(cè)樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)進(jìn)行親緣 關(guān)系比較。
[0005] 進(jìn)一步的，所述待測(cè)樣樣品DNA提取步驟為:剪取Icm長(zhǎng)的幼苗或葉片放入2mL的離 心管中，加入40yL DNA提取試劑I，沸水處理30s，然后加入40yL DNA提取試劑Π 和20yL DNA 提取試劑ΙΠ ，放入沸水處理2min備用。
[0006] 進(jìn)一步的，所述DNA提取試劑I為250mM的NaOH，所述DNA提取試劑Π 為250mM的HCl， 所述DNA提取試劑ΙΠ 為500mM的Tris (pH8 · 0)、0 · 25 % (V/V)的 IGEPAL-630。
[0007]進(jìn)一步的，所述雙親DNA提取步驟為:0.5g老葉用液氮研磨成粉末，加入裝有0.5mL 2倍CTAB提取緩沖液的2mL離心管中，充分混勻后，加入0.5mL CTAB緩沖液，55-65 °C恒浴 30min，加入0.5-lmL體積比為24:1的氯仿：異戊醇，充分搖動(dòng)5min，8000轉(zhuǎn)/min室溫下離心 5min，上清加入0.6倍體積的異丙醇，室溫下靜止30min，5000轉(zhuǎn)/min 4°C離心5min，沉淀用 0.8mL高鹽緩沖液充分溶解，15000轉(zhuǎn)/min離心2min，上清加入0.6倍體積的異丙醇，室溫下 靜止3〇111；[11，5000轉(zhuǎn)/111；[114 <€離心5111；[11，沉淀用40(^1^雙蒸水溶解，加入2.5倍體積95%的冷 乙醇，-20°C冰箱中2小時(shí)以上后15000轉(zhuǎn)離心20分鐘，用70 %的冷乙醇洗一次，自然干燥后， 用200μ1 0.1倍TE緩沖液溶解備用。
[0008]進(jìn)一步的，所述PCR反應(yīng)體系為 引物 1 μ moL. 聚合酶 0. 2 μ L
[0009] PCR 反應(yīng)液 IwL 模板 IQ ng dNTP I U mol
[00?0] 反應(yīng)體系用ddH2〇補(bǔ)足到總體積10yL。
[0011 ]進(jìn)一步的，所述PCR反應(yīng)條件為：94°C變性4min，94°C30s、55°C30s、72°C Imin、35個(gè) 循環(huán)，最后72°C延伸7min。
[0012] 本發(fā)明的有益技術(shù)效果是:本發(fā)明利用雙親混合DNA與對(duì)照樣品進(jìn)行PCR產(chǎn)物比較 確定水稻品種親緣關(guān)系，不僅檢少了樣品量，而且準(zhǔn)確性強(qiáng)，直觀性好。
【附圖說明】
[0013] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可 以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0014] 圖1是現(xiàn)有技術(shù)利用父本、母本和鑒定樣品DNA的PCR產(chǎn)物的電泳圖譜；圖中:M、DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)，1、不育系Y58S(母本），2、恢復(fù)系HR-2(父本），3、雜種F1代兩優(yōu)2號(hào)（鑒定樣品）； 引物依次為 RM274、RM336、RM219、RM1195、RM481、RM224、RM17、RM493。
[0015] 圖2是本發(fā)明利用父母本混合DNA和鑒定樣品DNA的PCR產(chǎn)物的電泳圖譜；圖中：M、 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1、不育系Y58S和恢復(fù)系HR-2的混合DNA(父、母本混合DNA)，2:雜種F1代兩 優(yōu)2號(hào)DNA(鑒定樣品），引物依次為RM274、RM336、RM219、RM1195、RM481、RM224、RM17、RM493。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于 本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他 實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0017] 實(shí)施例！
[0018] (1)幼苗的DNA提取
[0019] 剪取Icm長(zhǎng)的幼苗或葉片放入2mL的離心管中，加入40yL DNA提取試劑I(250mM NaOH)，沸水處理30s，然后加入40yL DNA提取試劑Π (250ι?Μ HC1)和20yL DNA提取試劑ΙΠ (500mM Tris(pH8 · 0)、0 · 25% (V/V) IGEPAL-630)，放入沸水處理2min備用；
[0020] (2)老葉的DNA提取(CTAB方法）
[0021] 0.5g老葉用液氮研磨成粉末，加入裝有0.5mL 2倍CTAB提取緩沖液（2 %CTAB(w/ v),IOOmM Tris(pH8.0),20mM EDTA(pH8.0), 1.4M NaCl, I%PVP(polyvinylpyrrolidone) Mw40，OOO)的2mL離心管中，充分混勻后，加入0.5mL CTAB緩沖液，55-65 °C恒浴30min，加入 0.5-lmL體積比為24:1的氯仿:異戊醇，充分搖動(dòng)5min，8000轉(zhuǎn)/min室溫下離心5min，上清加 入0.6倍體積的異丙醇，室溫下靜止30min，5000轉(zhuǎn)/min 4°C離心5min，沉淀用0.8mL高鹽緩 沖液（IOmM Tris(pH8.0)，lmM EDTA(pH8.0)，lM NaCl)充分溶解，15000轉(zhuǎn)/min離心2min，上 清加入0.6倍體積的異丙醇，室溫下靜止30min，5000轉(zhuǎn)/min 4°C離心5min，沉淀用400yL雙 蒸水溶解，加入2.5倍體積95%的冷乙醇，-20°C冰箱中2小時(shí)以上后15000轉(zhuǎn)離心20分鐘，用 70%的冷乙醇洗一次，自然干燥后，用200μl0.1倍TE緩沖液（10mmol/LTris-HCl(pH8.0) lmmol/L EDTA(pH8·0))溶解備用。
[0022] (3)PCR反應(yīng)及電泳分析
[0023] PCR所用引物如表1所示。
[0024] 衷1引物信息

[0027] ① PCR反應(yīng)在10μ1的反應(yīng)體積中進(jìn)行，包含Ιμπιο?引物，Ιμπιο? dNTP，0.2單位 AmpliTaq Gold DNA聚合酶，ΙμΙΙΟ倍PCR反應(yīng)液（IOOmmol Tris-Hcl，pH8.3，15mmol MgCl2， 500mmoIKCl，0.01 % 的明膠），模板DNA為IOng。擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94°C變性4min，94°C 30s、55 °〇3〇8、72°(：11^11、35個(gè)循環(huán)，最后72°(：延伸71^11。
[0028] ②反應(yīng)在PE公司9700型基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物在4%的Nusieve 3:1瓊脂糖 凝膠上進(jìn)行電泳分離，溴化乙錠染色后在紫外光下觀察拍照。所采用的引物為中華人民共 和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程，SSR標(biāo)記法，NY/T1433-2014。
[0029] (4)本發(fā)明方法(雙親混合DNA和待檢測(cè)樣品）和傳統(tǒng)方法(利用父本、母本和待檢 測(cè)樣品)進(jìn)行親緣關(guān)系結(jié)果的比較
[0030] 本研究用不育系Y58S、恢復(fù)系HR-2和雜種Fl代兩優(yōu)2號(hào)為材料，采用的48對(duì)引物為 中華人民共和國農(nóng)業(yè)彳丁業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程，SSR標(biāo)記法，NY/T1433-2014。
[0031] 研究表明，采用不育系Y58S、恢復(fù)系HR-2和雜種Fl代兩優(yōu)2號(hào)的電泳圖譜表明：除 完全表現(xiàn)一致的40對(duì)引物外，所有表現(xiàn)出雙帶的8對(duì)引物雜種Fl代具有不育系Y58S和恢復(fù) 系HR-2互補(bǔ)的帶型，表明雜種Fl代兩優(yōu)2號(hào)是不育系Y58S和恢復(fù)系HR-2的后代(如圖1)。 [0032] 而采用不育系Y58S和恢復(fù)系HR-2的混合DNA和雜種Fl代兩優(yōu)2號(hào)DNA，除完全表現(xiàn) 一致的40對(duì)引物外，通過具有不育系Y58S和恢復(fù)系HR-2互補(bǔ)的帶型的8引物進(jìn)行擴(kuò)增，DNA 指紋圖譜完全一致，表明雜種Fl代兩優(yōu)2號(hào)是不育系Y58S和恢復(fù)系HR-2的后代(如圖2)。
[0033] (5)利用雙親混合DNA和檢測(cè)樣品進(jìn)行親緣關(guān)系的優(yōu)點(diǎn)
[0034]從圖1我們可以看出，要根據(jù)圖譜來判斷3是1和2的后代(雜種Fl代兩優(yōu)2號(hào)是不育 系Y58S和恢復(fù)系HR-2的后代)必須具有較強(qiáng)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)和經(jīng)驗(yàn)。而從圖2我們可以很 清楚地看出1和2是同一品種，雜種Fl代兩優(yōu)2號(hào)是不育系Y58S和恢復(fù)系HR-2的后代，直觀性 大大加強(qiáng)。此外，樣本量由原來的3 X 48減為2 X 48。
[0035] 利用雙親混合DNA和檢測(cè)樣品進(jìn)行水稻親緣關(guān)系直觀性好，準(zhǔn)確性強(qiáng)。同時(shí)可以用 于其他農(nóng)作物和動(dòng)物及人類的親緣關(guān)系鑒定。
[0036]本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，除非另外定義，這里使用的所有術(shù)語(包括技術(shù)術(shù) 語和科學(xué)術(shù)語)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員的一般理解相同的意義。還應(yīng)該 理解的是，諸如通用字典中定義的那些術(shù)語應(yīng)該被理解為具有與現(xiàn)有技術(shù)的上下文中的意 義一致的意義，并且除非像這里一樣定義，不會(huì)用理想化或過于正式的含義來解釋。
[0037]最后所應(yīng)說明的是：以上實(shí)施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參 照上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解:依然可以對(duì)本 發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均 應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 利用雙親混合DM鑒定水稻品種親緣關(guān)系的方法，其特征在于，提取雙親和待測(cè)樣品 DNA，雙親DNA混合樣品和待測(cè)樣品分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后利用雙親DNA混合樣品的PCR產(chǎn)物 和待檢測(cè)樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)進(jìn)行親緣關(guān)系比較。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用雙親混合DNA鑒定水稻品種親緣關(guān)系的方法，其特征在于， 所述待測(cè)樣樣品DNA提取步驟為：剪取1cm長(zhǎng)的幼苗或葉片放入2mL的離屯、管中，加入40化 DNA提取試劑I，沸水處理30s，然后加入40化DNA提取試劑Π 和20化DNA提取試劑虹，放入 沸水處理2min備用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述利用雙親混合DNA鑒定水稻品種親緣關(guān)系的方法，其特征在于， 所述DNA提取試劑I為250mM的NaOH，所述DNA提取試劑Π 為250mM的肥1，所述DNA提取試劑虹 為500mM的Tris(P冊(cè).0)、0.25% (V/V)的IGEPAk630。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用雙親混合DNA鑒定水稻品種親緣關(guān)系的方法，其特征在于， 所述雙親DNA提取步驟為:0.5g老葉用液氮研磨成粉末，加入裝有0.5mL 2倍CTAB提取緩沖 液的2血離屯、管中，充分混勻后，加入0.5mL CTAB緩沖液，55-65°C恒浴30min，加入0.5-lmL 體積比為24:1的氯仿:異戊醇，充分搖動(dòng)5min，8000轉(zhuǎn)/min室溫下離屯、5min，上清加入0.6倍 體積的異丙醇，室溫下靜止30min，5000轉(zhuǎn)/min 4°C離屯、5min，沉淀用0.8血高鹽緩沖液充分 溶解，15000轉(zhuǎn)/min離屯、2min，上清加入0.6倍體積的異丙醇，室溫下靜止30min，5000轉(zhuǎn)/min 4°C離屯、5min，沉淀用40化L雙蒸水溶解，加入2.5倍體積95%的冷乙醇，-20°C冰箱中2小時(shí) W上后15000轉(zhuǎn)離屯、20分鐘，用70%的冷乙醇洗一次，自然干燥后，用20化10.1倍TE緩沖液 溶解備用。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用雙親混合DNA鑒定水稻品種親緣關(guān)系的方法，其特征在于， 所述PCR反應(yīng)體系為 引物 1 μ曲OL 聚合酶 0. 2 μ L PCR反應(yīng)液 1 μ L 模板 10 ng dNTP 1 μ mol 反應(yīng)體系用d地2〇補(bǔ)足到總體積10化。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用雙親混合DNA鑒定水稻品種親緣關(guān)系的方法，其特征在于， 所述 PCR 反應(yīng)條件為:94°C 變性 4111111，941：3〇3、551：3〇3、72°(：1111111、35個(gè)循環(huán)，最后72°(：延伸 7min〇
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK106086205SQ201610576328
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月20日 公開號(hào)201610576328.7, CN 106086205 A, CN 106086205A, CN 201610576328, CN-A-106086205, CN106086205 A, CN106086205A, CN201610576328, CN201610576328.7
【發(fā)明人】詹慶才, 陳靜萍, 李祖任
【申請(qǐng)人】湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心