一種用于建立珊瑚游離和內(nèi)寄生共生藻豐度以及珊瑚白化警示系數(shù)h的技術(shù)指標(biāo)的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于建立珊瑚游離和內(nèi)寄生共生藻豐度以及珊瑚白化警示系數(shù)H的技術(shù)指標(biāo)的方法。方法為：珊瑚生長的海域海洋環(huán)境游離狀態(tài)共生藻豐度指標(biāo)建立、珊瑚體內(nèi)寄生狀態(tài)的共生藻豐度指標(biāo)的建立、珊瑚白化警示系數(shù)H的建立。本發(fā)明所述方法可對各類海水野外樣品和水族館的實驗樣品采集的海水都可以準(zhǔn)確測定，在時間和空間動態(tài)都能進(jìn)行長期和短期的監(jiān)測，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種用于建立珊瑚游離和內(nèi)寄生共生藻豐度以及珊瑚白化警 示系數(shù)H的技術(shù)指標(biāo)的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及海洋珊瑚生態(tài)環(huán)境的評價技術(shù)及運用領(lǐng)域，一種用于建立珊瑚游離和 內(nèi)寄生共生藻豐度以及珊瑚白化警示系數(shù)H的技術(shù)指標(biāo)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 共生藻可以寄生于珊瑚的體內(nèi)，由于它可以進(jìn)行光合作用、合成必需氨基酸和為 珊瑚的鈣化提供能量支持和必要的營養(yǎng)物質(zhì)，作為最初級的生產(chǎn)者，是珊瑚生長和珊瑚造 礁中不可或缺的一個角色。由于海洋環(huán)境的污染，極端氣候的變化，厄爾尼諾的頻繁發(fā)生以 及人類活動的破壞，造成珊瑚礁的退化和珊瑚"白化"，因為共生藻對海洋環(huán)境及其敏感，珊 瑚"白化"的發(fā)生引發(fā)共生藻的"逃逸"出宿主，釋放到海水環(huán)境中，成為游離的共生藻，造成 珊瑚喪失營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，引發(fā)珊瑚的死亡。關(guān)于引發(fā)共生藻"逃逸"的機(jī)制目前尚不清楚， 但是珊瑚體內(nèi)共生藻細(xì)胞豐度的降低與珊瑚的死亡率呈現(xiàn)緊密的相關(guān)性以得到實驗證實， 還有研究指出珊瑚的白化現(xiàn)在使得共生藻的種群發(fā)生動態(tài)和轉(zhuǎn)變，可以讓珊瑚在面臨新的 環(huán)境變化中重新選擇適合的共生藻，從而克服逆境。而且，研究也證實如果能讓珊瑚重新構(gòu) 建與共生藻類群落的共生系統(tǒng)，有可能使白化的珊瑚得到恢復(fù)。
[0003] 但是目前缺乏一種有效的方法跟蹤共生藻的群落動態(tài)變化、共生藻的多樣性和生 物地理分布。目前公認(rèn)的共生藻的物種劃分，依據(jù)分子鑒定的方法，分為A-H八種類型，其中 五種類型的共生藻與珊瑚存在共生關(guān)系（即Clade A，B，C，D和F)。正是共生藻種類多樣性與 群落變化的復(fù)雜性，是評價和研究珊瑚共生藻之間關(guān)系的一個技術(shù)屏障。傳統(tǒng)上在觀察計 算共生藻細(xì)胞數(shù)量方法上以顯微鏡計數(shù)為主，但是由于共生藻在形態(tài)學(xué)上缺乏明顯的分類 特征，而且容易受到其他海藻的干擾。以外，顯微鏡技術(shù)只能計算Iul海水樣本，在統(tǒng)計上缺 少代表性。
[0004] 由于定量PCR技術(shù)具有統(tǒng)顯微視覺觀察所不可替代的優(yōu)越性，不僅能從分子水平 上檢測共生藻的分類鑒定，還可以定量計算共生藻的DNA攝入，以及檢測敏感性高等優(yōu)勢。 總之，定量PCR法具有直觀、準(zhǔn)確的優(yōu)點，克服了傳統(tǒng)顯微鏡計數(shù)方法通量低、準(zhǔn)確率低等缺 點，可以更加全面、準(zhǔn)確、快速地反映環(huán)境共生藻群落結(jié)構(gòu)，從而可以更加客觀地認(rèn)識環(huán)境 中共生藻原位的生態(tài)狀況。是研究共生藻珊瑚體內(nèi)寄生和體外游離狀態(tài)動態(tài)變化的有效手 段。
[0005] 另外本發(fā)明創(chuàng)先采用相對定量的方法，評估珊瑚共生藻的群體結(jié)構(gòu)。引入珊瑚白 化警示系數(shù)H評估珊瑚優(yōu)勢共生藻是否出現(xiàn)替換現(xiàn)象，直接聯(lián)系珊瑚所處的海洋環(huán)境變化， 對預(yù)測珊瑚的生長趨勢具有簡便、靈敏、預(yù)警的特點。因此，為了更好地促進(jìn)珊瑚礁的保護(hù) 管理和珊瑚健康狀態(tài)的評價，今后我國應(yīng)采用共生藻內(nèi)寄生狀態(tài)和游離狀態(tài)的豐度分析及 群體結(jié)構(gòu)評價指標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于建立珊瑚游離和內(nèi)寄生共生藻豐度以及珊瑚白 化警示系數(shù)H的技術(shù)指標(biāo)的方法
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于建立珊瑚游離和內(nèi)寄生共生藻豐度以及珊 瑚白化警示系數(shù)H的技術(shù)指標(biāo)的方法，其特征在于，方法為：
[0008] 珊瑚生長的海域海洋環(huán)境游離狀態(tài)共生藻豐度指標(biāo)建立、
[0009] 珊瑚體內(nèi)寄生狀態(tài)的共生藻豐度指標(biāo)的建立、
[0010] 珊瑚白化警示系數(shù)H的建立。
[0011] 進(jìn)一步，所述珊瑚生長的海域海洋環(huán)境游離狀態(tài)共生藻豐度指標(biāo)建立為：
[0012] 1)海水樣品的采集，即珊瑚生長海域水深3-5米，通過水柱取IOOmL海水，不同海水 位點重復(fù)三次；
[0013] 2)海水樣品的過濾膜處理；
[0014] 3)海水游離共生藻總DNA樣品的快速提??；
[0015] 4)海水游離共生藻通過熒光定量PCR進(jìn)行種類鑒定及豐度的測定。
[0016] 進(jìn)一步，所述珊瑚體內(nèi)寄生狀態(tài)的共生藻豐度指標(biāo)的建立為：
[0017] 1)珊瑚樣品的采集及前處理；
[0018] 2)珊瑚及內(nèi)寄生共生藻總DNA的快速提??；
[0019] 3)珊瑚體內(nèi)寄生共生藻通過熒光定量PCR進(jìn)行種類鑒定及豐度的測定。
[0020] 進(jìn)一步，所述海水游離共生藻豐度的測定或珊瑚體內(nèi)寄生共生藻定量PCR的種類 鑒定及豐度的測定步驟為：
[0021] 假設(shè)任意一種共生藻類型clade A，B，C，D或F的標(biāo)準(zhǔn)品從最高濃度Sng/ul，經(jīng)系列 10倍的稀釋，對應(yīng)共生藻的探針與引物組合進(jìn)行定量PCR，標(biāo)準(zhǔn)品定量PCR結(jié)果的Ct即X值與 標(biāo)準(zhǔn)品DNA稀釋倍數(shù)為10的底數(shù)值Ig之間為線性函數(shù)關(guān)系：
[0022] Y(clade A，B，C，D或F)=aX+b;
[0023] 根據(jù)所述各類型共生藻的Ct值計算出各類型共生藻的DNA總量的公式為：
[0024] [DNA含量(pg)] = δ X 1000 XlOa Gt+b，其中δ為經(jīng)紫外分光光度計測定所得的標(biāo)準(zhǔn) 品的最尚濃度;不超過20ng/ul;
[0025] [細(xì)胞總數(shù)(個）] = [DNA含量(pg)]/§;其中§為不同種類共生藻單細(xì)胞基因組DNA 的質(zhì)量，大小通常介于3.0~5. Opg/細(xì)胞；
[0026] 最后得到細(xì)胞豐度：
[0027]
[0028]其中Vl為實驗樣品提取所得DNA總量的體積ul，V2為定量PCR所用的DNA的體積ul， M代表用于提取DNA的海水體積ml。
[0029] 進(jìn)一步，所述珊瑚白化警示系數(shù)H的建立為：
[0030] 1)通過所述得到的珊瑚體內(nèi)寄生狀態(tài)的共生藻豐度確定珊瑚體內(nèi)寄生狀態(tài)的共 生藻豐度最大的類型為clade，，檢測結(jié)果為clade A，B，C，D或F中豐度最大的一個類型。
[0031] 2)通過所述得到的珊瑚生長的海域海洋環(huán)境游離狀態(tài)共生藻豐度，鑒定海水中存 在的游離共生藻中，除0外的其他類型cladeco，檢測結(jié)果為除cladeP外，可為clade A，B, C，D或F中的一個或者多個類型。
[0032] 3)待診斷評估的珊瑚樣品，提取總DNA，分別運用針對PAX(珊瑚內(nèi)參）Xladef及 Clade ω探針與引物組合進(jìn)行焚光定量PCR實驗，結(jié)果記錄為Ct pax，Ctf及Ct ω。計算珊瑚 白化警示系數(shù)Η:
<5)；
[0033] 完整描述珊瑚游離狀態(tài)共生藻及內(nèi)寄生狀態(tài)共生藻的豐度指標(biāo)，結(jié)合珊瑚白化警 示系數(shù)H的值，預(yù)測當(dāng)珊瑚白化警示系數(shù)H>1時，表明珊瑚共生藻clack#為優(yōu)勢種群，珊瑚趨 于正常狀態(tài)；當(dāng)HS 1時，警示珊瑚共生藻優(yōu)勢種群由clack#替換為clade ω現(xiàn)象，表明珊瑚 所處的海洋環(huán)境出現(xiàn)變化，在一定的程度上警示珊瑚已經(jīng)白化或者有白化的可能性。
[0034] 進(jìn)一步，所述探針與引物組合的序列如SEQ ID N0:1-3，SEQ ID N0:4-6，SEQ ID N0:7-9，SEQIDN0:10-12，SEQIDN0:13-15和SEQIDN0:16-18所示；其中SEQIDN0:2， 5,8，11，14，17為探針序列，其5'端和3'端分別帶有不同的熒光標(biāo)記。
[0035]進(jìn)一步，所述標(biāo)準(zhǔn)品是為clade A，B，C，D或F型珊瑚共生藻的純DNA樣品。
[0036]計算游離共生藻的細(xì)胞豐度：
[0037] 假設(shè)共生藻N(N代表Clade A，B，C，D和F中的任意一種），標(biāo)準(zhǔn)品從最高濃度Sng/ ul，經(jīng)系列10倍的稀釋，對應(yīng)共生藻的探針與引物組合進(jìn)行定量PCR，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品定量PCR結(jié) 果的Ct值(X)與標(biāo)準(zhǔn)品DNA稀釋倍數(shù)為10的底數(shù)值(Ig)之間為線性函數(shù)關(guān)系：
[0038] Y clade N=aX+b (1)
[0039] 計算當(dāng)實驗樣品的定量PCR結(jié)果為Ct時的DNA模板濃度：
[0040] [DNA含量(pg)] =δΧ1〇〇〇Χ1(Τ ct+b (2)
[0041 ]其中δ為經(jīng)紫外分光光度計測定所得的標(biāo)準(zhǔn)品的最高濃度，Ct為熒光定量PCR實驗 得到的閾值，即為公式(1)中的X。
[0042]根據(jù)LaJeunesse et al · (J.Phycol .41,880-886,2005)，流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果， 珊瑚的共生藻的基因組大小介于1.5-4.5pg/細(xì)胞，一定誤差允許的范圍內(nèi)，經(jīng)查的對應(yīng)實 驗共生藻的基因組大小為§pg/細(xì)胞（1·5〈§〈4·5)(詳見LaJeunesse T C，Lambert G, Andersen R A,et al.SYMBI0DINIUM(PYRRH0PHYTA)GEN0ME SIZES(DNA C0NTENT)ARE SMALLEST AMONG DIN0FLAGELLATES1[J]·Journal of Phycology,2005,41(4):880-886.)〇 計算對應(yīng)的細(xì)胞總數(shù)為：
[0043] [細(xì)胞總數(shù)(個）]=[DNA 含量(pg) ]/§ (3)
[0044] 綜合考虎這合海7k烊品的體葙TJDNA樽板的稀経倍教閔素，得出，
[0045]
[0046]公式中，其中Vl為實驗樣品提取所得DNA總量的體積(ul)，V2為定量PCR所用的DNA 的體積(ul)，M代表用于提取DNA的海水體積(ml)。
[0047] 計算珊瑚宿主內(nèi)寄生共生藻的細(xì)胞相對豐度：ACt = Ctm-Ctciade-specific its (5)
[0048] 其中C t P ax為針對珊瑚P A X內(nèi)參基因的探針經(jīng)定量P C R實驗檢測的C t值， Ctci^pWfi。ITS為珊瑚共生藻各種探針定量PCR實驗的響應(yīng)Ct值，ACt為兩者之間的差值。 [0049] ITS Clade-specif ic的拷貝數(shù)與珊瑚PAX拷貝數(shù)的關(guān)系為2的指數(shù)關(guān)系，即
[0050]
(6)
[0051] 大量研究表明，珊瑚健康狀態(tài)與共生藻群體的機(jī)構(gòu)有緊密的聯(lián)系。一般正常情況 下C型共生藻為占優(yōu)勢類群。最近，有大量的報道，發(fā)現(xiàn)當(dāng)海洋環(huán)境或者氣候變化引起的珊 瑚白化，會使原本C占優(yōu)勢變?yōu)镈占優(yōu)勢，又稱有共生藻的替換，如果珊瑚沒有適應(yīng)共生藻 優(yōu)勢群體結(jié)構(gòu)的變化，最終會導(dǎo)致珊瑚的死亡，另有研究表明，只有大約不到50%的珊瑚具 有這樣的適應(yīng)能力。所以通過相對定量PCR的方法檢測珊瑚的優(yōu)勢共生藻類群是否發(fā)生替 換現(xiàn)象，評價珊瑚所處的海洋環(huán)境的變化及珊瑚的健康狀態(tài)，具有一定的指導(dǎo)和警示意義。
[0052]本發(fā)明采用相對定量法計算珊瑚共生藻細(xì)胞數(shù)密度的計算及珊瑚白化警示系數(shù) H，計算步驟如下：
[0053] 1)通過定量PCR方法檢測調(diào)查海域中正常珊瑚體內(nèi)寄生狀態(tài)的共生藻細(xì)胞豐度指 標(biāo)，測定珊瑚體內(nèi)寄生狀態(tài)的共生藻豐度最大的類型為cladeP，檢測結(jié)果為clade A，B，C，D 或F中豐度最大的一個類型。
[0054] 2)通過定量PCR方法檢測該海域中海洋環(huán)境游離狀態(tài)共生藻細(xì)胞豐度指標(biāo)，鑒定 海水中存在的游離共生藻中，除爐外的其他類型clade ω，檢測結(jié)果為除cIadef外，可為 clade A，B，C，D或F中的一個或者多個類型。
[0055] 3)待診斷評估的珊瑚樣品，提取總DNA，分別運用針對PAX(珊瑚內(nèi)參）、Clade識及 Clade ω探針引物組合進(jìn)行焚光定量PCR實驗，結(jié)果記錄為Ctpax，C1#_及Ct ω。計算珊瑚白化 警示系數(shù)：
（7)
[0056] 當(dāng)珊瑚白化警示系數(shù)H>1時，表明珊瑚共生藻clack#為優(yōu)勢種群，珊瑚趨于正常狀 態(tài)；當(dāng)HSl時，警示珊瑚共生藻優(yōu)勢種群由clade#替換為cladeco現(xiàn)象，表明珊瑚所處的海 洋環(huán)境出現(xiàn)變化，在一定的程度上警示珊瑚已經(jīng)白化或者有白化的可能性。
[0057] 本發(fā)明擬解決的主要問題是如何體現(xiàn)海水中游離狀態(tài)的共生藻以及珊瑚組織內(nèi) 寄生狀態(tài)的共生藻的豐度及多樣性，旨在判斷共生藻在以上兩者狀態(tài)下之間的動態(tài)平衡對 珊瑚健康狀態(tài)的影響。從而開發(fā)一種易于標(biāo)準(zhǔn)化的實驗方法或者體系，創(chuàng)造了幾個相應(yīng)的 評價指標(biāo)，為未來的海洋生物及環(huán)境研究提供數(shù)據(jù)支持。本發(fā)明的
【申請人】在實驗中發(fā)現(xiàn)'白 化'珊瑚中出現(xiàn)優(yōu)勢共生種群替換的現(xiàn)象，這對為來珊瑚礁的'白化'診斷具有指導(dǎo)意義。而 且從技術(shù)本身來講，本發(fā)明涉及建立的指標(biāo)對未來的珊瑚生態(tài)研究或者給同行、相關(guān)領(lǐng)域 學(xué)者在在這一方面的研究將具有啟發(fā)和幫助。
[0058]本發(fā)明建立檢測這五種共生藻的目的主要是為了更加全面的建立評價海洋珊瑚 和藻類生態(tài)研究的指標(biāo)。
[0059]本發(fā)明有如下優(yōu)點：
[0060] 1.本發(fā)明運用珊瑚共生藻的游離狀態(tài)與內(nèi)寄生狀態(tài)的群落結(jié)構(gòu)相關(guān)指標(biāo)能綜合 評價反應(yīng)珊瑚生活環(huán)境的狀況，具有很強(qiáng)的敏感性，能更全面地反映珊瑚的健康狀況。
[0061] 2.本發(fā)明應(yīng)用Taqman PCR技術(shù)既有高度的特異性及敏感性，能獲得客觀全面的共 生藻群落結(jié)構(gòu)與多樣性，更直接全面地反映共生藻的生物地理分布及物種多樣性程度。 [0062] 3.對各類海水野外樣品和水族館的實驗樣品采集的海水都可以準(zhǔn)確測定，在時間 和空間動態(tài)都能進(jìn)行長期和短期的監(jiān)測，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0063] 4.本發(fā)明采用相對定量PCR的方法檢測珊瑚的優(yōu)勢共生藻類群是否發(fā)生替換現(xiàn) 象，引入珊瑚白化警示系數(shù)H，對評價珊瑚所處的海洋環(huán)境的變化及珊瑚的健康狀態(tài)，一定 程度上具有的指導(dǎo)和警示意義。
【附圖說明】
[0064] 圖1是野外珊瑚基于GPS定位的采集位點圖。
[0065] 圖2是DNA標(biāo)準(zhǔn)提取方法圖。
[0066] 圖3是海水游離共生藻的檢測(A，B)及細(xì)胞數(shù)量豐度計算結(jié)果(C)圖。
[0067] 圖4是健康珊瑚和白化珊瑚的珊瑚白化警示系數(shù)H的比較圖。
【具體實施方式】
[0068] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終 相同或類似的標(biāo)號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附 圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例 中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明 書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0069] 實施例1:珊瑚樣品的采集與共生藻的準(zhǔn)備培養(yǎng)試驗
[0070] 野外珊瑚樣品的采集:于海南島的東、西海域，采集健康的盔型珊瑚樣品（采集樣 品的GPS位置，見圖1 )，將部分樣品敲碎或者切成小塊，保存于液氮中。
[0071] 水族館樣品的采集：已經(jīng)在水族館環(huán)境中培養(yǎng)大約半年的盔型珊瑚樣品，采集健 康和白化的珊瑚樣品，切成小快，于液氮中低溫保存。
[0072] 另外收集水族館的海水樣品100ml，設(shè)置6次重復(fù)，作為檢測游離共生藻的檢測實 驗材料。
[0073] 共生藻純培養(yǎng)：珊瑚共生藻的藻株ITO 10(Clade A)，WZD 17(Clade C) ,SGAl (Clade D)和Symka(Clade F)光照培養(yǎng)于f/2培養(yǎng)基，27°C，光周期為12h光照：12h黑暗，培 養(yǎng)一個月，通過離心收集藻類細(xì)胞（以上藻種菌均保藏于中國海洋微生物菌種保藏管理中 心(MCCC)，MCCC屬于國家級公益性微生物資源共享平臺）。
[0074] 實施例2. DNA樣品的標(biāo)準(zhǔn)提取
[0075]圖2為珊瑚，海水樣品及共生藻培養(yǎng)物的DNA標(biāo)準(zhǔn)提取方法示圖。按照圖2所示步驟 來進(jìn)行DNA樣品的標(biāo)準(zhǔn)提取即可。
[0076]以海洋生物DNA提取試劑盒（北京天根生物科技有限公司）作為DNA提取方法的實 施。提取步驟如此下：以例1中采集的珊瑚樣品，切成~5mm2,0.1-0.2g的珊瑚組織，取數(shù)塊 置入2. Oml的EP管中，隨后加入500μ1裂解液GA得到珊瑚樣品。
[0077]通過離心收集后的藻類細(xì)胞，轉(zhuǎn)入2.Oml EP管中，加入500μ1裂解液GA得到共生藻 樣品。
[0078]取500ml海水樣品過濾，采用直徑0.45μπι的尼龍膜，過濾完后將過濾膜卸下，剪碎 置入2. Oml EP離心管，同樣加入500μ1裂解液GA，得到水樣過濾樣品。
[0079]將上述的珊瑚樣品，共生藻樣品及水樣過濾樣品分別加入50μ1的蛋白酶K(20mg/ ml )，震蕩15s，將EP管置于56°C加熱器裂解Ih。再加入500μ1 GB buffer于上述混合液中，再 于70 °C加熱IOmin，使細(xì)胞徹底，釋放出DNA。繼續(xù)離心10，000轉(zhuǎn)/minlmin，吸取Iml上清液轉(zhuǎn) 移至新的EP管中，加入無水乙醇500μ1，震蕩混勻。將全部的液體轉(zhuǎn)移入CB3柱并離心過柱， DNA吸附于CB3中，分別以600μ1⑶Buffer清洗過柱一次，500μ1 PW Buffer清洗兩次。最后 用100μΙ TE洗脫DNA JNA的濃度經(jīng)紫外分光光度計260mm測定，用雙蒸水調(diào)節(jié)DNA濃度至 20ng/yl〇
[0080] 實施例3:定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0081 ]表1.實驗所設(shè)及針對珊瑚宿主和共生藻的引物探針組合表
[0084] 注:其中Y和W為堿兼并堿基，Y代表C或T，W代表AST。
[0085] 上述Taqman探針的5 '端、3 '端分別用FAM報導(dǎo)熒光染料和TAMRA淬滅基團(tuán)標(biāo)記。擴(kuò) 增反應(yīng)總體積為20yL，其中上下游引物(Forward，Reverse) 200nM，探針(probe) IOOnM，10μ1 AceQ?qPCR Probe Master Mix(Vazyme,南京），模板ΙμΙΙΤΟ 10(Clade A),WZD 17(Clade C)，SGAl(Clade D)和Symka(Clade F)經(jīng)10倍系列稀釋的DNA，（以上藻種菌均保藏于中國海 洋微生物菌種保藏管理中心(MCCC)，MCCC屬于國家級公益性微生物資源共享平臺），余下用 雙蒸水補(bǔ)足20yL，置RG 6000(QIAGEN)熒光定量PCR系統(tǒng)運行分析，在每個循環(huán)的延伸結(jié)束 時進(jìn)行熒光信號檢測，熒光模式設(shè)為Green。反應(yīng)程序為 :95°C5min;95°C10s，60°C30s，45個 循環(huán)。
[0086] 根據(jù)珊瑚共生藻株ITO 10(Clade A),WZD 17(Clade C),SGAl(Clade DMPSymka (Clade F)的DNA樣品在6個稀釋度（HT1~HT5)稀釋。各種藻株以相應(yīng)的探針引物組合(所 設(shè)及引物探針組合見表1)進(jìn)行定量PCR，結(jié)果所得的Ct值與對應(yīng)的稀釋倍數(shù)呈線性關(guān)系，繪 制對應(yīng)共生藻類型的標(biāo)準(zhǔn)曲線，各個標(biāo)準(zhǔn)品的DNA稀釋倍數(shù)的IoglO值應(yīng)與Ct值線性函數(shù)關(guān) 系良好，R 2X). 99，實驗結(jié)果較為理想。
[0087]實施例4:海水樣品的游離共生藻的檢測與豐度計算
[0088]水族館收集的海水樣品100ml，設(shè)置6次重復(fù)，過0.45μπι濾膜提取的DNA，經(jīng)表1的引 物探針組合檢測，結(jié)果見表2及圖3。圖3可以看出，除了Clade B的Ct為0(陰性）以外，clade A，C，D和F的檢測結(jié)果均大于0,表明水族館的海水中經(jīng)檢測含有A，C，D和F四種共生藻的類 型。定量PCR檢測結(jié)果得到的Ct值經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式換算所對應(yīng)藻類細(xì)胞的個數(shù)。以Clade C藻類細(xì)胞的計算為例，其檢測結(jié)果為Ct = 24.45,由圖3的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出DNA的稀釋倍數(shù)Y與 Ct值(X)的關(guān)系為:Y = -0.2701X+4.3801。計算出所含的Clade C含有的DNA總量：
[0089] [DNA總量(pg) ] = 2 X IO4X 10(4·38Q1-Q·27Q1Gt); δ可以通過紫外分光光度計直接測定 得到，便于后續(xù)實驗數(shù)據(jù)的計算，各種藻類標(biāo)準(zhǔn)品的最高濃度盡量調(diào)整一致，可都稀釋至終 濃度為20ng/ul。
[0090]依據(jù)LaJeunesse et al · (J.Phycol .41,880-886,2005)，流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果， 珊瑚的共生藻Clade C的基因組大小介于3.Opg/細(xì)胞，計算對應(yīng)的細(xì)胞總數(shù)為：
[0091] [Clade C細(xì)胞數(shù)]= [DNA總量(pg)]/3.0(pg);
[0092] 綜合考慮所用測試海水為500ml的體積，DNA提取的總體積為100μΙ及定量PCR所用 的體積為ΙμL，計算clade C的共生藻豐度為：
[0093] Clade C(個數(shù)）/(mL海水）= (2Χ104Χ 10(4.3801-0.2701χ24. 45))/3·0Χ100/1·0 + 500 =8(個細(xì)胞)/m海水=8,000(個細(xì)胞)/海水。
[0094]以同樣的方法計算出Clade A，C，D和F的細(xì)胞個數(shù)，計算結(jié)果詳見表2。有實驗結(jié)果 顯示水族館的海水樣品中共生藻C和D型豐度最高，每升海水分別可達(dá)11789.17±5270.82 和8052.01 ±1700.56細(xì)胞數(shù)，A和F型豐都較低，每升海水分別為71.93 ±52.08和2.62 土 1.30個細(xì)胞。而在我們這次采集的海水樣品中沒有檢測出B型共生藻。綜上，說明本發(fā)明所 用的方法可以準(zhǔn)確檢測和計算出各種珊瑚游離共生藻的豐度。
[0095]表2.海水游離共生藻的檢測結(jié)果及細(xì)胞個數(shù)計算結(jié)果表
[0097] 實施例5:珊瑚組織內(nèi)共生藻的檢測與相對豐度計算
[0098] 海南島的東、西海域，采集健康的盔型珊瑚樣品及水族館采集健康和白化珊瑚樣 品DNA，以表1中的珊瑚PAX的探針引物組合及針對所有的共生藻的探針引物組合進(jìn)行定量 PCR，每個樣品重復(fù)三次，記錄每個樣品的Ct值，經(jīng)檢測所有的珊瑚樣品PAX基因的Ct都介于 25~40,說明所提取的珊瑚DNA含量符合定量PCR的檢測要求。除海南東海域的部分樣品未 能檢測出Clade D以外，其余的珊瑚樣品能檢測出Clade C和D兩種類型共生藻，實驗結(jié)果見 表3，各個樣品之間進(jìn)行顯著型分析(3?55,41^￥4分析，？〈0.05)，檢測得到(：1 &(16(：和0兩種 類型的共生藻的Ct值，在健康和白化珊瑚中均存在顯著性差異(見表3)。
[0099]表3:海南東海域和水族館采集的珊瑚樣品的結(jié)果表
[0101] 表格中考慮到定量PCR實驗不同批次的機(jī)械誤差和實驗的誤差的影響，做相對定 量分析建議共生藻的特異性ITS檢測和珊瑚內(nèi)參PAX檢測為同一次實驗的數(shù)據(jù)，ACt(PAX-Clade C)，表示為同一批次定量PCR實驗，PAX內(nèi)參的Ct值與共生藻Clade C探針的Ct值之 差。同樣ACt(PAX-Clade D)表示為同一批次定量PCR實驗，PAX內(nèi)參的Ct值與共生藻Clade D探針的Ct值之差。在本次實驗中，只檢測到C與D兩種共生藻，其他類型的藻為檢測到。
[0102] 由于考慮到珊瑚樣品的差異及提取DNA效率等差異，故采用相對定量的方法計算 各種共生藻的相對含量更加準(zhǔn)確。
[0103] 即珊瑚樣品的共生藻的相對豐度為:ACt = CtPAX-Ct Clade-specific ITS
[0104] 經(jīng)計算得到的結(jié)果見表三，健康珊瑚樣品（包括海南東，西海域的樣品及水族館的 樣品）中，共生藻Clade C的相對豐度大于Clade D。然而，在白化的珊瑚樣品中結(jié)果卻是D大 于C，即白化珊瑚中Clade D的相對豐度遠(yuǎn)高于Clade C,這一結(jié)果與國外大量的研究結(jié)果一 致，說明珊瑚在'白化'的過程中優(yōu)勢的內(nèi)寄生共生藻出現(xiàn)了替換的現(xiàn)象，即優(yōu)勢共生藻由C 變成了D，也說明了珊瑚的健康狀況與內(nèi)寄生共生藻的群落有直接的關(guān)系。珊瑚共生藻出現(xiàn) 了替換的現(xiàn)象，與珊瑚的白化有直接相關(guān)性。
[0105] 進(jìn)一步計算各樣品的珊瑚白化警示系數(shù)H，見圖4。以珊瑚樣品Hl為例，計算珊瑚白 化警示系數(shù)H，H=(Ct pax-Ct C)/(Ct pax-Ct D) = 11.21/6.14=1.83，H>1,表明珊瑚為正 ?；蛘呓】禒顟B(tài)。而珊瑚樣品Bl，計算H=(Ct pax-Ct C)/(Ct pax-Ct D)=5.79/19.77 = 0.29，H〈1，表明珊瑚已經(jīng)白化或者有白化的可能。結(jié)果與珊瑚形態(tài)學(xué)表現(xiàn)的觀察一致。
[0106] 本發(fā)明使用的定量PCR檢測及相對豐度的計算方法可以成功準(zhǔn)確的測定珊瑚內(nèi)寄 生的共生藻的豐度。由此采用相對定量PCR的方法檢測珊瑚的優(yōu)勢共生藻類群是否發(fā)生替 換現(xiàn)象，引入珊瑚白化警示系數(shù)H，對評價珊瑚所處的海洋環(huán)境的變化及珊瑚的健康狀態(tài)， 一定程度上具有的指導(dǎo)和警示意義。
[0107] 盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例 性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨 的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。
【主權(quán)項】
1. 一種用于建立珊瑚游離和內(nèi)寄生共生藻豐度W及珊瑚白化警示系數(shù)Η的技術(shù)指標(biāo)的 方法，其特征在于，方法為： 珊瑚生長的海域海洋環(huán)境游離狀態(tài)共生藻豐度指標(biāo)建立、 珊瑚體內(nèi)寄生狀態(tài)的共生藻豐度指標(biāo)的建立、 珊瑚白化警示系數(shù)Η的建立。2. 權(quán)利要求1所述用于建立評價海洋環(huán)境游離共生藻、珊瑚體內(nèi)寄生共生藻豐度和珊 瑚白化警示系數(shù)Η的技術(shù)指標(biāo)的方法，其特征在于，所述珊瑚生長的海域海洋環(huán)境游離狀態(tài) 共生藻豐度指標(biāo)建立為： 1) 海水樣品的采集，即珊瑚生長海域水深3-5米，通過水柱取lOOmL海水，不同海水位點 重復(fù)二次； 2) 海水樣品的過濾膜處理； 3) 海水游離共生藻總DNA樣品的快速提?。? 4) 海水游離共生藻通過巧光定量PCR進(jìn)行種類鑒定及豐度的測定。3. 權(quán)利要求1所述用于建立評價海洋環(huán)境游離共生藻、珊瑚體內(nèi)寄生共生藻豐度和珊 瑚白化警示系數(shù)Η的技術(shù)指標(biāo)的方法，其特征在于，所述珊瑚體內(nèi)寄生狀態(tài)的共生藻豐度指 標(biāo)的建立為： 1) 珊瑚樣品的采集及前處理； 2) 珊瑚及內(nèi)寄生共生藻總DNA的快速提??； 3) 珊瑚體內(nèi)寄生共生藻通過巧光定量PCR進(jìn)行種類鑒定及豐度的測定。4. 權(quán)利要求2或3所述用于建立評價海洋環(huán)境游離共生藻、珊瑚體內(nèi)寄生共生藻豐度和 珊瑚白化警示系數(shù)Η的技術(shù)指標(biāo)的方法，其特征在于，所述海水游離共生藻豐度的測定或珊 瑚體內(nèi)寄生共生藻定量PCR的種類鑒定及豐度的測定步驟為： 假設(shè)任意一種共生藻類型clade A，B，C，D或F的標(biāo)準(zhǔn)品從最高濃度Sng/ul，經(jīng)系列10倍 的稀釋，對應(yīng)共生藻的探針與引物組合進(jìn)行定量PCR，標(biāo)準(zhǔn)品定量PCR結(jié)果的Ct即X值與標(biāo)準(zhǔn) 品DNA稀釋倍數(shù)為10的底數(shù)值Ig之間為線性函數(shù)關(guān)系： Yklade A，B，C，D或F)=aX+b; 根據(jù)所述各類型共生藻的Ct值計算出各類型共生藻的DNA總量的公式為： [dm含量(pg)] = δX1000X10aα+b，其中δ為經(jīng)紫外分光光度計測定所得的標(biāo)準(zhǔn)品的最 高濃度;不超過20ng/ul; [細(xì)胞總數(shù)(個）] = [DNA含量(pg)]/§;其中§為不同種類共生藻單細(xì)胞基因組DM的質(zhì) 量，大小通常介于3.0~5.化g/細(xì)胞； 最后得到細(xì)胞豐度： I鍊，毅聲潑' C:奪》IMl海來-[麵薇穗穀{奪> ]X養(yǎng)單M; 其中VI為實驗樣品提取所得DNA總量的體積ul，V2為定量PCR所用的DNA的體積ul，M代 表用于提取DM的海水體積ml。5. 權(quán)利要求1所述用于建立評價海洋環(huán)境游離共生藻、珊瑚體內(nèi)寄生共生藻豐度和珊 瑚白化警示系數(shù)Η的技術(shù)指標(biāo)的方法，其特征在于，所述珊瑚白化警示系數(shù)Η的建立為： 1)通過所述珊瑚體內(nèi)寄生狀態(tài)的共生藻豐度確定珊瑚體內(nèi)寄生狀態(tài)的共生藻豐度最 大的類型為clade滬檢測結(jié)果為clade A，B，C，D或F中豐度最大的一個類型。 2) 通過所述珊瑚生長的海域海洋環(huán)境游離狀態(tài)共生藻豐度，鑒定海水中存在的游離共 生藻中，除巧外的其他類型cladew，檢測結(jié)果為除clade 9外，可為clade A，B，C，D或F中的 一個或者多個類型。 3) 待診斷評估的珊瑚樣品，提取總DNA，分別運用針對PAX(珊瑚內(nèi)參）、Cladep及Clade ω探針與引物組合進(jìn)行巧光定量PCR實驗，結(jié)果記錄為Ctpax，ΓΥ滬及^ ω。計算珊瑚白化警 示系數(shù)Η:計算珊瑚白化警示系數(shù)Η的值，預(yù)測當(dāng)珊瑚白化警示系數(shù)H〉1時，表明珊瑚共生藻 clade f為優(yōu)勢種群，珊瑚趨于正常狀態(tài)；當(dāng)1時，警示珊瑚共生藻優(yōu)勢種群由clade 口替換 為cladew現(xiàn)象，表明珊瑚所處的海洋環(huán)境出現(xiàn)變化，在一定的程度上警示珊瑚已經(jīng)白化或 者有白化的可能性。6. 權(quán)利要求4或5所述用于建立評價海洋環(huán)境游離共生藻、珊瑚體內(nèi)寄生共生藻豐度和 珊瑚白化警示系數(shù)Η的技術(shù)指標(biāo)的方法，其特征在于，所述探針與引物組合的序列如SEQ ID 顯：1-3，沈〇10顯：4-6,56〇10顯：7-9,56〇10顯：1〇-12,56〇10^):13-15和56〇10 NO: 16-18所示;其中SEQ ID N0:2,5,8,11，14,17為探針序列，其5'端和3'端分別帶有不同 的巧光標(biāo)記。7. 權(quán)利要求6所述用于建立評價海洋環(huán)境游離共生藻、珊瑚體內(nèi)寄生共生藻豐度和珊 瑚白化警示系數(shù)Η的技術(shù)指標(biāo)的方法，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)品是為clade A，B，C，D或F型珊 瑚共生藻的純DNA樣品。
【文檔編號】C12Q1/68GK106086200SQ201610531787
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月4日
【發(fā)明人】林鎮(zhèn)躍, 陳建明, 陳明諒
【申請人】國家海洋局第三海洋研究所