豬外周血單核淋巴細(xì)胞pd-l1重組質(zhì)粒的構(gòu)建、基因豐度實(shí)時(shí)檢測方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子病理學(xué)與免疫學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及豬外周血單核淋巴細(xì)胞PD-L1重組質(zhì)粒的構(gòu)建、基因豐度實(shí)時(shí)檢測方法及其應(yīng)用。通過采集豬外周血單核淋巴細(xì)胞的總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；采用普通PCR擴(kuò)增PD-L1目的基因片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收純化；將PD-L1目的基因片段與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，提取重組質(zhì)粒；經(jīng)克隆篩選后進(jìn)行測序分析，選取與目的基因片段相同序列的陽性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，按拷貝濃度繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)熒光信號(hào)變化及標(biāo)準(zhǔn)曲線測出PD-L1的基因豐度。本發(fā)明的豬PD-L1基因豐度實(shí)時(shí)檢測方法具有檢測通量高、敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡便、成本低及定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】豬外周血單核淋巴細(xì)胞PD-L1重組質(zhì)粒的構(gòu)建、基因豐度實(shí)時(shí)檢測方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子病理學(xué)與免疫學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及豬外周血單核淋巴細(xì)胞PD-Ll重組質(zhì)粒的構(gòu)建、基因豐度實(shí)時(shí)檢測方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]豬痕(Classicalswine fever, CSF)是由豬痕病毒(Classical swine fevervirus,CSFV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。研究表明，CSFV主要感染單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，引起嚴(yán)重的淋巴細(xì)胞減少、血小板凝集和凝血機(jī)能障礙，以及胸腺、骨髓等中樞免疫器官的萎縮。CSFV還能通過引起機(jī)體抗病毒反應(yīng)降低、抑制感染細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)未感染細(xì)胞的凋亡等途徑造成機(jī)體免疫功能損傷。
[0003]程序性死亡配體(PD-Ll)及其程序性死亡受體-1 (PD-1)是⑶28/B7超家族成員，廣泛表達(dá)于各種組織。PD-1/ro-L共刺激信號(hào)視機(jī)體的炎癥程度、免疫狀態(tài)和遺傳背景不同而激活或抑制，主要參與T細(xì)胞的中樞及外周免疫耐受。與其他CD28超家族成員相比，PD-1/PD-L信號(hào)通路發(fā)揮著更廣泛和復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)作用，與自身免疫病、腫瘤、慢性感染及炎癥密切相關(guān)。在免疫調(diào)節(jié)方面，PD-Ll與其受體TO-1共同介導(dǎo)ro-l:PD-L信號(hào)通路的激活，在中樞免疫和外周免疫反應(yīng)中傳遞免疫耐受和免疫抑制信號(hào)，對(duì)抗原特異性T、B細(xì)胞的功能、T細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子的分泌和殺傷能力都有抑制作用，阻斷該通路后可以恢復(fù)T細(xì)胞的大部分功能。經(jīng)相關(guān)研究證實(shí)，一些病毒的感染可以誘導(dǎo)ro-Li及其受體ro-1的表達(dá)，從而影響ro-l:PD-Ls通路，使病毒逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視與殺傷，引起機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制和持續(xù)性感染。因此，PD-Li及其受體ro-1近年來逐漸成為人們?cè)诼猿掷m(xù)性病毒感染、免疫耐受性疾病、腫瘤等免疫抑制性疾病研究中所關(guān)注的熱點(diǎn)，而在動(dòng)物免疫抑制性疾病或病毒持續(xù)性感染方面，T細(xì)胞免疫抑制通路ro-1=PD-Ls的研究才剛剛起步，特別是在豬病毒性疾病方面的研究還少見報(bào)道。
[0004]近年來，實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real-Time PCR)技術(shù)為基因豐度檢測提供了全新的方法，和傳統(tǒng)的方法相比，具有敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡便、成本低以及定量準(zhǔn)確被廣泛應(yīng)用，它可以通過檢測目標(biāo)序列PCR擴(kuò)增的熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到實(shí)時(shí)監(jiān)控的目的。然而對(duì)豬外周血單核細(xì)胞中ro-Ll基因的豐度的Real-Time PCR檢測體系建立及應(yīng)用的研究尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于:本發(fā)明提供了一種豬外周血單核淋巴細(xì)胞ro-Ll實(shí)時(shí)熒光定量PC R陽性標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法；
在此基礎(chǔ)上本發(fā)明建立了一種ro-Ll基因豐度的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，該方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)；
本發(fā)明通過研究外周血單核細(xì)胞中ro-Ll的變化規(guī)律，為豬ro-Ll分子檢測的定量分析提供了技術(shù)平臺(tái)，并能用于分析豬感染病毒性疾病如CSF后ro-Ll基因的轉(zhuǎn)錄水平的變化規(guī)律中。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:
豬外周血單核淋巴細(xì)胞PD-Ll實(shí)時(shí)熒光定量PCR陽性標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
采集仔豬的外周血，分離出外周血單核淋巴細(xì)胞，提取外周血單核淋巴細(xì)胞的總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將cDNA保存于_20°C，采用普通PCR方法擴(kuò)增I3D-Ll目的基因片段；
采用普通PCR方法擴(kuò)增H)-L1目的基因片段，將該目的基因片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收純化；然后將I3D-Ll目的基因純化片段與pMD 18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5 α中，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)克隆篩選后進(jìn)行測序分析，得到與目的基因片段相同序列的陽性標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒；
其中普通PCR擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)體系為25 μ L，反應(yīng)體系如下'2 μ L樣品cDNA模板，2.5 μ L10XPCR Buffer,2y L dNTP，濃度均為20Mmol/L的正向引物和反向引物各0.5 μ L，0.5 μ L的TaqDNA聚合酶，其余為無菌三蒸水；普通PCR反應(yīng)程序:95°C熱啟動(dòng)Imin ;94°C變性30s ;55°C退火30s ;72°C延伸30s, 30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin ；
其中，正向引物 F 為:5' - AATGGCGAGGAAGACCTGAA -3'，
反向引物 R 為:5' - CAGCAGTAAACCCCTGCATCT -3'。
[0007]所述目的基因片段為SEQ ID N0.1 ;所述普通PCR擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)程序:95°C熱啟動(dòng)Imin ;94°C變性 30s ;55°C退火 30s ;72°C延伸 30s, 30 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸 IOmin0
[0008]一種豬外周血單核淋巴細(xì)胞ro-Ll基因的豐度實(shí)時(shí)檢測方法，包括以下步驟:
(1)將回收純化的ro-LI目的基因片段與pMD 18-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5a中，提取重組質(zhì)粒；經(jīng)克隆篩選后進(jìn)行測序分析，選取與H)- LI目的基因片段相同序列的陽性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，測定標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的DNA濃度，并換算成質(zhì)粒的拷貝濃度，按I: 10倍的濃度梯度稀釋陽性質(zhì)粒；
(2)以稀釋的陽性質(zhì)粒為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測熒光信號(hào)，反應(yīng)結(jié)束后繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)熒光信號(hào)的變化及標(biāo)準(zhǔn)曲線測出樣品DNA中I3D-Ll的基因豐度；
其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20 μ L，包括2 μ L質(zhì)粒模板，濃度為20Mmol/L的正向引物F和反向引物R各0.2 μ L，SYBR Green I PreMix ΙΟμL，三蒸水7.6 μ L ；其中，正向引物 F 為:5' - AATGGCGAGGAAGACCTGAA -3'，
反向引物 R 為:5' - CAGCAGTAAACCCCTGCATCT -3'。
[0009]所述目的基因片段為SEQ ID N0.1。
[0010]所述熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?95°C熱啟動(dòng)30s ;94°C變性5s ;60°C退火和延伸34s，60°C時(shí)收集熒光信號(hào)，再40個(gè)循環(huán)。
[0011]所述稀釋的陽性質(zhì)粒濃度范圍為濃度范圍為9.66X 1ic1-1eexio1COPies/^ L ;所述標(biāo)準(zhǔn)曲線為Υ=_3.266Χ + 22.794。
[0012]所述的檢測方法在分析豬感染病毒性疾病后ro-Ll基因的轉(zhuǎn)錄水平變化規(guī)律中的應(yīng)用。[0013]本發(fā)明的積極有益效果:
本發(fā)明通過合成正向引物、反向引物和ro-Li目的基因片段，建立了豬外周血單核細(xì)胞中PD-Ll基因豐度的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，為更好的對(duì)豬病毒性疾病中ro-Ll的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行準(zhǔn)確定量，進(jìn)而研究外周血單核細(xì)胞中ro-Ll的變化規(guī)律，為豬ro-Ll分子檢測的定量分析提供了技術(shù)平臺(tái)，并為ro-Li在豬病毒性疾病中發(fā)揮的生物學(xué)功能及其應(yīng)用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
[0014]本發(fā)明的技術(shù)方案與傳統(tǒng)技術(shù)相比，敏感性較高，利用所建立的方法對(duì)IO9~IO1copies/μ L的9組不同濃度標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示:本發(fā)明中I3D-Ll的檢測下限為10 copies/μ L，其濃度與Ct值之間有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 ;利用建立的方法進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，變異系數(shù)均在3%以內(nèi)，具有較好的重復(fù)性；從溶解曲線圖可知，PD-Ll分子溶解曲線出現(xiàn)單一狹窄峰(圖4)，且瓊脂糖凝膠電泳分析表明，Real-time RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果為單一特異性目的片段(圖5)，說明本發(fā)明具有較好的特異性；另外本技術(shù)方案還具有檢測通量高、操作簡便、成本低以及定量準(zhǔn)確等特點(diǎn)。
[0015]本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，豬感染CSFV后，隨著病毒在機(jī)體內(nèi)復(fù)制ro-Ll的表達(dá)量逐漸升高，說明CSFV的感染及病毒載量與豬ro-Ll基因豐度的變化關(guān)系十分密切；并證實(shí)了豬感染CSFV后ro-Ll表達(dá)變化與IL-2和IL-10細(xì)胞因子的表達(dá)變化之間存在一定關(guān)系，豬ro-Ll表達(dá)升高后激活了 ro-Ll =PD-Ls信號(hào)通路，引起了豬T細(xì)胞免疫功能下降，導(dǎo)致感染豬免疫功能降低。
[0016]本發(fā)明的豬ro-Ll基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測方法，為檢測豬病毒性疾病如CSF(豬瘟)所導(dǎo)致的免疫功能損傷中ro-Ll的表達(dá)變化規(guī)律提供了技術(shù)平臺(tái)，從而進(jìn)一步豐富了豬瘟引起免疫功能 損傷的機(jī)理。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為瓊脂糖凝膠檢測豬ro-Ll基因擴(kuò)增結(jié)果；
圖2為豬ro-Ll實(shí)時(shí)熒光定量分析擴(kuò)增曲線；
圖3為豬ro-Ll實(shí)時(shí)熒光定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖4為豬ro-Ll實(shí)時(shí)熒光定量分析標(biāo)準(zhǔn)品溶解曲線；
圖5為豬ro- LI實(shí)時(shí)熒光定量產(chǎn)物特異性分析結(jié)果；
圖6為豬感染CSFV不同時(shí)期外周血單核細(xì)胞中PD-Ll基因的拷貝數(shù)；
圖7為豬感染CSFV不同時(shí)期血漿中CSFV病毒載量檢測結(jié)果；
圖8為豬感染CSFV不同時(shí)期IL-2基因的拷貝數(shù)；
圖9為豬感染CSFV不同時(shí)期IL-10基因的拷貝數(shù)。
【具體實(shí)施方式】
[0018]在本發(fā)明中，基因拷貝數(shù)、基因豐度代表同樣的概念；Real-time PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR表示同樣的概念；ddH20表示雙蒸水；CSF表示豬瘟；CSFV表示豬瘟病毒，羧基熒光素二醋酸鹽玻拍酸亞胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl amino ester, CFSE)為一種可以標(biāo)記活體細(xì)胞的熒光染料。[0019]實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和菌種:30日齡健康仔豬，隔離器中飼養(yǎng)；石門株CSFV由中國獸醫(yī)藥品檢查所提供，半數(shù)感染量為IO5XTCID5tl ;大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a，為本實(shí)驗(yàn)
室保存。
[0020]主要試劑和儀器:淋巴細(xì)胞分離液，購自天津?yàn)柹镏破房萍加邢薰?；PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；Taq DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD 18-T載體,均購自大連寶生物工程有限公司；SYBR Green I,購自Invitrogen公司。
[0021]實(shí)施例1豬ro-Ll實(shí)時(shí)熒光定量PCR陽性標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒的構(gòu)建
采集45日齡仔豬的外周血，參照淋巴細(xì)胞分離液的說明書分離外周血的淋巴細(xì)胞，參照Invitrogen公司TRIzol試劑盒說明書和相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行總RNA的提取。提取的總RNA參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-20°C備用，用于擴(kuò)增H)-L1目的基因片段的模板。
[0022]采用普通PCR方法擴(kuò)增H)-L1目的基因片段，將該目的基因片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收純化；然后將I3D-Ll目的基因純化片段與pMD 18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5ci中，提取重 組質(zhì)粒，經(jīng)克隆篩選后進(jìn)行測序分析，得到與目的基因片段相同序列的陽性標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒；
所述目的基因片段為序列SEQ ID N0.1:
AATGGCGAGGAAGACCTGAATGTTCAGCACAGTAGCTACAGCCAGAGGGCCCAGCTGTTGAAGGACCAGCTCT
TCTTGGGAAAGGCCTCACTTCAGATCACAGATGTGAAATTGCAAGATGCAGGGGTTTACTGCTGo
[0023]用以構(gòu)建ro-Ll實(shí)時(shí)熒光定量PCR陽性標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒的普通PCR反應(yīng)體系:
普通PCR反應(yīng)體系為25 μ L，反應(yīng)體系如下:2 μ L樣品DNA模板，陰性對(duì)照以無菌三蒸
水為模板，2.5μ L IOXPCR Buffer,2y L dNTP，正、反向引物各 0.5 μ L(20Mmol/L)，0.5 μ LTaqDNA聚合酶(大連寶生物工程公司)，其余體積以無菌三蒸水補(bǔ)足；將反應(yīng)體系輕柔混合，于普通PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
[0024]普通PCR 程序?yàn)?95°C熱啟動(dòng) Imin ;94°C變性 30s ;55°C退火 30s ;72°C延伸 30s，30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。
[0025]其中豬H)-L1實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物由某生物公司合成，引物序列如下:
正向引物 F 為:5' - AATGGCGAGGAAGACCTGAA -3'，
反向引物 R 為:5' - CAGCAGTAAACCCCTGCATCT -3'。
[0026]將普通PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖電泳分析，電壓100V，35min后在紫外燈下觀察產(chǎn)物，結(jié)果顯示擴(kuò)增出單一條帶，片段大小在137bp左右。
[0027]擴(kuò)增結(jié)果見附圖1，圖中M為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)，I為TO-Ll基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增條帶較清晰，無引物二聚體影響。擴(kuò)增序列經(jīng)克隆、測序后，在GenBank中進(jìn)行核酸同源性的比對(duì)，結(jié)果顯示，獲得的序列SEQ ID N0.1與GenBank中豬PD-Ll基因(ΝΜ_001025221.I)的序列同源性為100%，說明引物及擴(kuò)增產(chǎn)物都正確，可用于下一步實(shí)驗(yàn)研究。將特異性片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收后，進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化，將獲得的陽性克隆交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序分析。
[0028]實(shí)施例2:豬PD-Ll實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系的建立
(I)質(zhì)粒DNA模板的制備采用普通PCR擴(kuò)增方法擴(kuò)增ro-Ll目的基因片段，將目的基因片段經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收純化，與pMD 18-T載體(TaKaRa，大連)連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5a中，提取重組質(zhì)粒；經(jīng)克隆篩選后進(jìn)行測序分析，測序結(jié)果顯示與GenBank中豬TO-Ll基因的序列100%同源，說明所獲得序列正確，陽性質(zhì)粒可用于質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制作。使用微量核酸蛋白分光光度儀測定該標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒DNA濃度為300 μ g/mL,將初始標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒溶液進(jìn)行1:10倍的倍比稀釋。
[0029](2)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度計(jì)算和I3D-Ll標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
提取經(jīng)過測序驗(yàn)證的陽性克隆質(zhì)粒，將質(zhì)粒的DNA濃度換算成拷貝數(shù)。質(zhì)?？截悢?shù)的計(jì)算方法為:拷貝數(shù)(copies/μ L)=濃度(μ g/μ L) X 6.02 X IO23 (copies/μ L) / MW (g/mol )0
[0030]其中MW=(克隆載體長度+目的片段長度)(bp)) X660 g/mol/ bp。
[0031]已知:cDNA=300 μ g/mL，質(zhì)粒PMD18-T序列長度為2692bp，PD-Ll基因插入片段長度為137bp ;單個(gè)堿基的平均摩爾質(zhì)量為660 g/mol，計(jì)算公式為:
分子量(MW)= (2692+137) X660=1.87X IO6 g/mol。
[0032]質(zhì)?？截悵舛?6.02X IO23X (300Χ10-9)+ (1.87X IO6) =9.66X IO10 copies/μ L0
[0033]將上述已知拷貝濃度的質(zhì)粒溶液作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，在進(jìn)行Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制時(shí)按10倍梯度稀釋(濃度范圍為9.66X 1010-9.66Χ IO1Copies/μ L)0 [0034]將已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒進(jìn)行1:10倍梯度稀釋，獲得質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。
[0035]以稀釋好的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)采用Real-timePCR試劑盒SYBR PremixExTaqTM (Invitrogen公司)，反應(yīng)體系為20 μ L:2 μ L標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板，F(xiàn)、R 引物(20Mmol/L)各 0.2yL，SYBR Green I PreMix 10μL，三蒸水 7.6 μ L。每次Real-time PCR反應(yīng)中均設(shè)置陰性對(duì)照(模板為2 μ LddH2O), Real-time PCR程序?yàn)?95°C熱啟動(dòng)30s;94°C變性5s;60°C退火和延伸34s，60°C時(shí)收集熒光信號(hào)，40個(gè)循環(huán)。其中的F、R引物與實(shí)施例1相同。
[0036]標(biāo)準(zhǔn)曲線及所有待測樣品均設(shè)置3個(gè)平行反應(yīng)。反應(yīng)在ABI 7500定量PCR儀(美國Life Technologies)中進(jìn)行，利用ABI 7500軟件檢測和收集熒光信號(hào)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
[0037]ABI 7500軟件實(shí)時(shí)熒光定量分析軟件自行繪制出反應(yīng)的擴(kuò)增曲線(見附圖2)。擴(kuò)增曲線顯示從左至右6條曲線依次代表標(biāo)準(zhǔn)品107、106、105、104、IO3UO2的梯度稀釋液的擴(kuò)增曲線，6個(gè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線較光滑，呈現(xiàn)典型的S型，且各循環(huán)閾值(Ct值)間隔均勻。
[0038]根據(jù)擴(kuò)增曲線提供的標(biāo)準(zhǔn)品各濃度梯度及反應(yīng)的循環(huán)閾值(Ct值)，ABI 7500軟件自行繪制出反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見附圖3)。該標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2=0.998，斜率為-3.266，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=-3.266Χ + 22.794，其中Y為實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的Ct值，X為PD-Ll基因構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)數(shù)值。計(jì)算其擴(kuò)增效率Eff%=102.392%，符合ABI 7500熒光定量分析對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的要求。
[0039]測定各濃度稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)品在實(shí)時(shí)熒光定量PCR過程中的溶解溫度，并繪制溶解曲線(見附圖4)。標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的溶解曲線型峰單一，且標(biāo)準(zhǔn)品溶解溫度相同(83.5±0.5°C)，表明擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物溶解溫度均一，特異性好，且無引物二聚體。[0040]根據(jù)熒光信號(hào)的變化及標(biāo)準(zhǔn)曲線即可測出樣品DNA中H)-L1的基因豐度。
[0041]實(shí)施例3:豬I3D-Ll實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系的敏感性、特異性及重復(fù)性分析
采用實(shí)施例1所構(gòu)建的豬ro-Ll重組質(zhì)粒作為陽性重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒；采用實(shí)施例2所建立的豬ro-Ll實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測體系；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀采用Life Technologies公司(美國)生產(chǎn)的ABI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行。
[0042]用10倍系列稀釋的IO1~IO9 copies/μ L豬I3D-Ll陽性重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒做敏感性試驗(yàn)，結(jié)果表明，PD-Ll的檢測下限為10 copies/ μ L。
[0043]對(duì)豬ro-Ll分子Real-time -PCR溶解曲線(見附圖4)及產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳做特異性分析，結(jié)果表明，溶解曲線出現(xiàn)單一狹窄峰，能夠擴(kuò)增到與預(yù)期目的片段同樣大小的特異性片段，沒有生成非特異性產(chǎn)物和引物二聚體(見附圖5)。
[0044]用建立的方法分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性檢測，結(jié)果顯示，批內(nèi)和批間的變異系數(shù)小于3%，重復(fù)性良好(見表1 )。
[0045]表1豬ro-Ll實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法批內(nèi)與批間重復(fù)性評(píng)價(jià)結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.豬外周血單核淋巴細(xì)胞ro-Li實(shí)時(shí)熒光定量PCR陽性標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于:該方法包括以下步驟: 采集仔豬的外周血，分離出外周血單核淋巴細(xì)胞，提取外周血單核淋巴細(xì)胞的總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將cDNA保存于_20°C，采用普通PCR方法擴(kuò)增I3D-Ll目的基因片段； 采用普通PCR方法擴(kuò)增ro-Li目的基因片段，將該目的基因片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收純化；然后將I3D-Ll目的基因純化片段與pMD 18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5a中，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)克隆篩選后進(jìn)行測序分析，得到與目的基因片段相同序列的陽性標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒； 其中普通PCR擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)體系為25 μ L，反應(yīng)體系如下'2 μ L樣品cDNA模板，2.5 μ LIOXPCR Buffer,2y L dNTP，濃度均為20Mmol/L的正向引物和反向引物各0.5μ L，0.5μ L的TaqDNA聚合酶，其余為無菌三蒸水；普通PCR反應(yīng)程序:95°C熱啟動(dòng)Imin ;94°C變性30s ;55°C退火30s ;72°C延伸30s, 30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin ； 其中，正向引物 F 為:5' - AATGGCGAGGAAGACCTGAA -3'， 反向引物 R 為:5' - CAGCAGTAAACCCCTGCATCT -3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于:所述目的基因片段為SEQID N0.1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建方法，其特征在于:所述普通PCR擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)程序:95°C熱啟動(dòng)Imin ;94°C變性30s ;55°C退火30s ;72°C延伸30s，30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸 IOmin0
4.一種豬外周血單核淋巴細(xì)胞ro-Li基因的豐度實(shí)時(shí)檢測方法，其特征在于:該方法包括以下步驟: (1)將回收純化的H)-LI目的基因片段與pMD 18-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5a中，提取重組質(zhì)粒；經(jīng)克隆篩選后進(jìn)行測序分析，選取與H)- LI目的基因片段相同序列的陽性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，測定標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的DNA濃度，并換算成質(zhì)粒的拷貝濃度，按I: 10倍的濃度梯度稀釋陽性質(zhì)粒； (2)以稀釋的陽性質(zhì)粒為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測熒光信號(hào)，反應(yīng)結(jié)束后繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)熒光信號(hào)的變化及標(biāo)準(zhǔn)曲線測出樣品DNA中I3D-Ll的基因豐度； 其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20 μ L，包括2 μ L質(zhì)粒模板，濃度為20Mmol/L的正向引物F和反向引物R各0.2 μ L，SYBR Green I PreMix ΙΟμL，三蒸水7.6 μ L ； 其中，正向引物 F 為:5' - AATGGCGAGGAAGACCTGAA -3'， 反向引物 R 為:5' - CAGCAGTAAACCCCTGCATCT -3'。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的豐度實(shí)時(shí)檢測方法，其特征在于:所述目的基因片段為SEQID N0.1。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的豐度實(shí)時(shí)檢測方法，其特征在于:所述熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?95°C熱啟動(dòng)30s ;94°C變性5s ;60°C退火和延伸34s，60°C時(shí)收集熒光信號(hào)，再40個(gè)循環(huán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的豐度實(shí)時(shí)檢測方法，其特征在于:所述稀釋的陽性質(zhì)粒濃度范圍為濃度范圍為9.66 X 1010-9.66 X IO1Copies/ μ L ;所述標(biāo)準(zhǔn)曲線為Υ=-3.266Χ + 22.794。
8.權(quán)利要求4-7任一項(xiàng)所述的檢測方法在分析豬感染病毒性疾病后H)-L1基因的轉(zhuǎn)錄水平變化 規(guī)律中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK103966313SQ201410102234
【公開日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年3月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月19日
【發(fā)明者】王選年, 岳鋒, 朱艷平, 孫國鵬, 張艷芳, 李鵬, 張萬方, 楊媛, 王愛國, 李博文, 王軍 申請(qǐng)人:新鄉(xiāng)學(xué)院