一種利用不含透明帶的囊胚培養(yǎng)液檢測(cè)胚胎染色體異常的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種利用不含透明帶的囊胚培養(yǎng)液檢測(cè)胚胎染色體異常的方法，具體地，本發(fā)明提供了一種體外非治療性的利用囊胚培養(yǎng)液檢測(cè)胚胎染色體異常的方法，包括步驟：(a)提供一來(lái)自囊胚培養(yǎng)體系的培養(yǎng)液，其中，所述囊胚培養(yǎng)體系中的胚胎在培養(yǎng)前已去除透明帶，所述胚胎在所述囊胚培養(yǎng)體系中培養(yǎng)3?6天，較佳地，4天后，從所述培養(yǎng)體系中分離出所述培養(yǎng)液；(b)對(duì)所述培養(yǎng)液進(jìn)行基因檢測(cè)，從而鑒定所述胚胎染色體是否異常。本發(fā)明提供的方法可去除IVF和ICSI技術(shù)過(guò)程中多余精子和母源顆粒細(xì)胞污染干擾的風(fēng)險(xiǎn)，并可精確的鑒定胚胎染色體是否異常。
【專利說(shuō)明】
一種利用不含透明帶的囊胚培養(yǎng)液檢測(cè)胚胎染色體異常的 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)和分子細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及一種利用不含透明帶 的囊胚培養(yǎng)液檢測(cè)胚胎染色體異常的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 輔助生殖技術(shù)已經(jīng)成為治療不孕不育的重要手段，隨著技術(shù)水平的不斷提高，輔 助生殖的臨床妊娠率也不斷升高，但是胚胎種植率并沒(méi)有顯著性升高。胚胎的質(zhì)量是影響 胚胎種植的主要因素，目前優(yōu)質(zhì)胚胎的選擇主要通過(guò)胚胎發(fā)育形態(tài)學(xué)評(píng)分，主觀性較大并 不能從根本上區(qū)分胚胎質(zhì)量好壞。有研究表明即使是一些形態(tài)良好的優(yōu)質(zhì)囊胚是非整倍 體，或者染色體整倍體胚胎它的形態(tài)學(xué)評(píng)分并不高。因此僅僅依靠胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)并不能 保證移植的胚胎染色體是正常的。大量研究表明體外受精來(lái)源的胚胎有相當(dāng)部分是染色體 非整倍體，尤其是來(lái)自高齡不孕女性的胚胎。移植非整倍體胚胎導(dǎo)致移植后著床失敗或流 產(chǎn)，也是目前試管嬰兒成功低的主要原因。
[0003] 應(yīng)用胚胎植入前遺傳學(xué)篩查（Pre-implementation Genetic Screen，PGS)選擇染 色正常的胚胎，能夠有效提高試管嬰兒胚胎種植成功率，同時(shí)降低妊娠流產(chǎn)率。然而PGS檢 測(cè)需對(duì)胚胎進(jìn)行活檢，從胚胎中取出1至數(shù)個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，存在胚胎損傷風(fēng)險(xiǎn)。而目前的 利用囊胚培養(yǎng)液檢查胚胎染色體的方法也存在著IVF和ICSI技術(shù)過(guò)程中多余精子和母源顆 粒細(xì)胞污染干擾的風(fēng)險(xiǎn)。
[0004] 在IVF技術(shù)過(guò)程中，數(shù)億條精子與一個(gè)卵子在體外人工培養(yǎng)環(huán)境中混合。其結(jié)果是 有多條精子同時(shí)卵子結(jié)合，雖然只有一條精子與卵子完成正常受精，其他無(wú)法完成受精的 多余精子仍滯留在卵細(xì)胞外周的透明帶中。另外，此時(shí)也會(huì)有大量母體來(lái)源的顆粒細(xì)胞粘 附在卵子外周的透明帶上。這些滯留在透明帶中的多余精子和粘附在透明帶表面的顆粒細(xì) 胞在受精卵體外培養(yǎng)，發(fā)育成囊胚的過(guò)程中可能將DNA釋放到培養(yǎng)液中，因此囊胚培養(yǎng)液中 的DNA容易受到精子和顆粒細(xì)胞DNA的污染。
[0005] 在ICSI技術(shù)過(guò)程中，將單個(gè)精子注射入卵子的技術(shù)方法避免了多余精子對(duì)囊胚培 養(yǎng)液的污染。但卵子透明帶上粘附的母體來(lái)源的顆粒細(xì)胞仍然會(huì)對(duì)對(duì)囊胚培養(yǎng)造成污染并 對(duì)后續(xù)檢測(cè)形成干擾。
[0006] 因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)一種既可去除IVF和ICSI技術(shù)過(guò)程中多余精子和母源 顆粒細(xì)胞污染干擾的風(fēng)險(xiǎn)，又能精確的鑒定胚胎染色體是否異常的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種既可去除IVF和ICSI技術(shù)過(guò)程中多余精子和母源顆粒細(xì) 胞污染干擾的風(fēng)險(xiǎn)，又能精確的鑒定胚胎染色體是否異常的方法。
[0008] 本發(fā)明的第一方面提供了一種體外利用囊胚培養(yǎng)液檢測(cè)胚胎染色體異常的方法， 包括步驟：
[0009] (a)提供一來(lái)自囊胚培養(yǎng)體系的培養(yǎng)液，其中，所述囊胚培養(yǎng)體系中的胚胎在培養(yǎng) 前已去除透明帶，所述胚胎在所述囊胚培養(yǎng)體系中培養(yǎng)3-6天，較佳地，4天后，從所述培養(yǎng) 體系中分尚出所述培養(yǎng)液；
[0010] (b)對(duì)所述培養(yǎng)液進(jìn)行基因檢測(cè)，從而鑒定所述胚胎染色體是否異常。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述囊胚培養(yǎng)體系中僅含有一個(gè)胚胎。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述囊胚培養(yǎng)體系為單胚胎培養(yǎng)體系，并且在所述單胚胎培養(yǎng) 體系中沒(méi)有透明帶，含有10-100微升，較佳地，15-50微升，更佳地，20-35微升的培養(yǎng)液。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟(a)中分離出的培養(yǎng)液的體積為所述單胚胎培養(yǎng)體系 中培養(yǎng)液體積的30-100 %，較佳地，40-100 %，更佳地，50-100 %，最佳地，80-100 %。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟(b)中還包括步驟(c):
[0015] (i)將所述培養(yǎng)液與裂解液混合，從而獲得含有所述培養(yǎng)液與裂解液的第一混合 物；
[0016] (ii)將所述第一混合物與裂解酶混合，孵育，失活裂解酶，從而獲得裂解產(chǎn)物;和
[0017] (iii)對(duì)所述裂解產(chǎn)物進(jìn)行基因組分析，從而鑒定所述胚胎染色體是否異常。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述基因組分析的方法選自下組:二代測(cè)序、核酸芯片、免疫熒 光檢測(cè)、熒光PCR檢測(cè)、一代測(cè)序、三代測(cè)序、質(zhì)譜檢測(cè)、或其組合。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述裂解液選自下組:Tris緩沖液、螯合劑、鹽酸鹽、非離子型表 面活性劑、或其組合。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述Tris緩沖液包括Tris-Cl。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述Tri s緩沖液的濃度為10-60mM，較佳地，15-50mM，更佳地， 20-40mM〇
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述Tris緩沖液的pH為5-10，較佳地，6-9，更佳地，7-8。
[0023]在另一優(yōu)選例中，所述螯合劑包括EDTA。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述螯合劑的濃度為0.2-8mM，較佳地，0.5-6mM，更佳地，I -4mM。 [0025] 在另一優(yōu)選例中，所述鹽酸鹽選自下組:KCUNaCl、或其組合。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述鹽酸鹽的濃度為5-60mM，較佳地，8-40nM，更佳地，10-40mM。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述非離子型表面活性劑選自下組:Triton X-100、Triton X-114、吐溫20、陬40、303、或其組合。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述非離子型表面活性劑的濃度為0.02-10%，較佳地，0.05-5%，更佳地，0.1-3%，以所述裂解液的總重計(jì)。
[0029]在另一優(yōu)選例中，所述步驟⑴中，培養(yǎng)液與裂解液的體積比為1: 10 - 10:1，較佳 地，1:5 - 5:1，更佳地，1:2-2:1。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述裂解酶選自下組:蛋白酶K、Qiagen Protease、胃蛋白酶、木 瓜蛋白酶、胰蛋白酶、溶菌酶、或其組合。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述裂解酶的濃度為l_25μg/ml，較佳地，5-20μg/ml，更佳地， 10_15μg/ml〇
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述裂解酶的添加量為0.1-10μ1，較佳地，0.5_6μ1，更佳地， 0.8_3y-l 〇
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟(c)包括選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征：
[0034] (i)孵育溫度為20_70°C，較佳地，30_60°C ;
[0035] (ii)孵育時(shí)間為 Imin - 12h，較佳地，IOmin - 6h，更佳地，30min - 2h;
[0036] (iii)失活溫度為60_100°C，較佳地，75_95°C ;
[0037] (i v)失活時(shí)間為0 · 5_20min，較佳地，10-15min;
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)液用如下方法獲得：
[0039] (i)培養(yǎng)受精卵胚胎至3-6天(較佳地，4天)后，去除所述胚胎的透明帶，從而獲得 不含透明帶的胚胎；
[0040] (i i)將步驟（i)的不含透明帶的胚胎轉(zhuǎn)移到囊胚培養(yǎng)微滴中培養(yǎng)0.5-3天(較佳 地，1 一2天），從而獲得含有囊胚的培養(yǎng)液;和
[0041] (iii)分離步驟（ii)中獲得的培養(yǎng)液，即為用于鑒定所述胚胎染色體是否異常的 培養(yǎng)液。
[0042] 在另一優(yōu)選例中，所述囊胚培養(yǎng)微滴的體積為10-100微升，較佳地，15-50微升，更 佳地，20 - 35微升。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述方法為非治療和非診斷性的。
[0044] 本發(fā)明第二方面提供了一種制備基因檢測(cè)樣本或染色體檢測(cè)樣本的方法，包括步 驟：
[0045] (i)提供一培養(yǎng)體系，所述培養(yǎng)體系中含有去除透明帶的胚胎，培養(yǎng)3-6天，較佳 地，4天后，從所述培養(yǎng)體系中分離出液體，即為所述檢測(cè)樣本。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟（ii):對(duì)獲得的所述檢測(cè)樣本進(jìn)行基因檢 測(cè)，從而鑒定所述胚胎染色體是否異常。
[0047] 在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)體系中僅含有一個(gè)胚胎。
[0048] 在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)體系為單胚胎培養(yǎng)體系，含有10-100微升，較佳地，15-50微升，更佳地，20 - 35微升的培養(yǎng)液。
[0049] 在另一優(yōu)選例中，步驟（ii)中，所述檢測(cè)樣本的體積為所述培養(yǎng)體系中培養(yǎng)液體 積的 30-100 %，較佳地，40-100 %，更佳地，50-100 %，最佳地，80-100 %。
[0050] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（ii)中，對(duì)所述檢測(cè)樣本進(jìn)行離心，取上清液，進(jìn)行基因 檢測(cè)，從而鑒定所述胚胎染色體是否異常。
[0051 ]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說(shuō)明】
[0052]圖1顯示了在對(duì)常規(guī)的ICSI胚胎進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，因受到顆粒細(xì)胞污染的干擾，NICS檢 測(cè)結(jié)果(Ia)出現(xiàn)偏差，與常規(guī)PGS(胚胎有損活檢)檢測(cè)結(jié)果(Ib)不一致。
[0053]圖2顯示了在對(duì)常規(guī)的IVF胚胎進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，因受到多余精子污染的干擾，NICS檢 測(cè)(2a)結(jié)果出現(xiàn)偏差，與常規(guī)PGS(胚胎有損活檢)檢測(cè)結(jié)果(2b)不一致。
[0054]圖3顯示了使用本發(fā)明的技術(shù)方案對(duì)一個(gè)正常IVF胚胎進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，因排除了干 擾，NICS檢測(cè)(3a)結(jié)果準(zhǔn)確，與常規(guī)PGS(胚胎有損活檢)檢測(cè)結(jié)果(3b)-致。
[0055]圖4顯示了使用本發(fā)明的技術(shù)方案對(duì)一個(gè)異常IVF胚胎進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，因排除了干 擾，NICS檢測(cè)(4a)結(jié)果準(zhǔn)確，與常規(guī)PGS(胚胎有損活檢)檢測(cè)結(jié)果(4b)-致。
【具體實(shí)施方式】
[0056] 本發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期廣泛而深入的研究，通過(guò)大量篩選和測(cè)試，首次意外地發(fā)現(xiàn)，完 在去除透明帶后，采用單胚胎培養(yǎng)體系，在20-30微升的培養(yǎng)液中對(duì)胚胎進(jìn)行培養(yǎng)，取出少 量培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，所得到的染色體異常的檢測(cè)結(jié)果具有極高的精確性，可極大程 度的排除多余精子和母源顆粒細(xì)胞污染干擾的風(fēng)險(xiǎn)。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。
[0057] IVF 胚胎
[0058] IVF指in vitro fertilization(試管嬰兒、體外受精），具體指體外受精聯(lián)合胚胎 移植技術(shù)(IVF)，又稱試管嬰兒，是指分別將卵子與精子取出后，置于試管內(nèi)使其受精，再將 胚胎前體一受精卵移植回母體子宮內(nèi)發(fā)育成胎兒的技術(shù)。
[0059] ICSI
[0060] ICSI(Intracytoplasmic sperm injection)即卵胞衆(zhòng)內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)，也 就是第二代"試管嬰兒"，該技術(shù)是借助顯微操作系統(tǒng)將單一精子注射入卵子內(nèi)使其受精。 [0061 ] 透明帶
[0062]卵的外面具有外被(coat)，其成分主要是糖蛋白，是由卵細(xì)胞或其它細(xì)胞分泌的。 在哺乳動(dòng)物中這種外被叫做透明帶(zona pellucida)，其作用是保護(hù)卵子，阻止異種精子 進(jìn)入。
[0063]檢測(cè)方法
[0064] 本發(fā)明提供了一種對(duì)囊胚進(jìn)行培養(yǎng)后的乏培養(yǎng)液(depleted medium)(即從所述 培養(yǎng)體系中分離出的培養(yǎng)液)進(jìn)行基因檢測(cè)，從而鑒定胚胎染色體是否異常的方法。
[0065] 在本發(fā)明中，對(duì)囊胚進(jìn)行培養(yǎng)后的"乏"培養(yǎng)液（即從所述培養(yǎng)體系中分離出的培 養(yǎng)液)進(jìn)行基因檢測(cè)的方法不受特別的限制，可用常規(guī)方法進(jìn)行檢測(cè)，如二代測(cè)序、核酸芯 片、免疫熒光檢測(cè)、熒光PCR檢測(cè)、一代測(cè)序、三代測(cè)序、質(zhì)譜檢測(cè)、或其組合。
[0066] 在一種實(shí)施方式中，所述檢測(cè)方法包括如下步驟：
[0067] (a)提供一來(lái)自囊胚培養(yǎng)體系的培養(yǎng)液，其中，所述囊胚培養(yǎng)體系中的胚胎在培養(yǎng) 前已去除透明帶，所述胚胎在所述囊胚培養(yǎng)體系中培養(yǎng)3-6天，較佳地，4天后，從所述培養(yǎng) 體系中分尚出所述培養(yǎng)液；
[0068] (b)對(duì)所述培養(yǎng)液進(jìn)行基因檢測(cè)，從而鑒定所述胚胎染色體是否異常。
[0069] 在一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述步驟(b)中還包括步驟(C):
[0070] (i)將所述培養(yǎng)液與裂解液混合，從而獲得含有所述囊胚培養(yǎng)液與裂解液的第一 混合物；
[0071] (ii)將所述第一混合物與裂解酶混合，孵育，失活裂解酶，從而獲得裂解產(chǎn)物;和
[0072] (iii)對(duì)所述裂解產(chǎn)物進(jìn)行基因組分析，從而鑒定所述胚胎染色體是否異常。
[0073]樣本制備及其檢測(cè)
[0074] 本發(fā)明還提供了一種制備基因檢測(cè)樣本或染色體檢測(cè)樣本的方法，包括步驟：
[0075] (i)提供一培養(yǎng)體系，所述培養(yǎng)體系中含有去除透明帶的胚胎，培養(yǎng)3-6天，較佳 地，4天后，從所述培養(yǎng)體系中分離出液體，即為所述檢測(cè)樣本。
[0076] 在一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述方法還包括步驟(ii):對(duì)所述檢測(cè)樣本進(jìn)行基因檢測(cè)， 從而鑒定所述胚胎染色體是否異常。
[0077] 透明帶的去除
[0078] 去除透明帶的方法包括(但不限于）：機(jī)械剝除、激光去除、Tyrode液消化等方法。 具體去除透明帶的方法參見(jiàn)參考文獻(xiàn)1(A comparison of four different techniques of assisted hatching,2002)〇
[0079] 在本發(fā)明中，由于機(jī)械剝除方法去除透明帶的效果更好，并且所得到的胚胎更完 整，能夠排除各種物質(zhì)的干擾，因此，本發(fā)明選擇機(jī)械剝除方法去除透明帶，具體地，在本發(fā) 明中，用常規(guī)機(jī)械剝除方法和市售設(shè)備去除透明帶。
[0080] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括：
[0081 ] (1)在本發(fā)明中，完全去除透明帶后，將胚胎在20-30微升的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，并且對(duì) 少量的培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)，所得到的染色體異常的檢測(cè)結(jié)果居然具有極高的精確性，可極大 程度的排除多余精子和母源顆粒細(xì)胞污染干擾的風(fēng)險(xiǎn)。
[0082] (2)本發(fā)明采用單胚胎培養(yǎng)體系，即一個(gè)培養(yǎng)液微滴中只培養(yǎng)一個(gè)胚胎，該體系所 得到的染色體異常的檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。
[0083] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量 份數(shù)。
[0084] 本發(fā)明所用的材料如無(wú)特別說(shuō)明，均為市售產(chǎn)品。
[0085] Qiagen Protease:粗制蛋白酶，購(gòu)自凱杰公司。
[0086]通用方法
[0087]培養(yǎng)液的獲得
[0088] (1)受精卵（在志愿者夫婦中，從女性志愿者中獲取卵子，從男性志愿者中獲取精 子，體外受精，即得到受精卵)在體外培養(yǎng)至第3天到第6天，較佳地，第4天，即胚胎發(fā)育至桑 葚胚，卵裂球完全融合時(shí)，此時(shí)胚胎與透明帶之間產(chǎn)生較大空隙。
[0089] (2)利用機(jī)械剝除方法(如PIZO等機(jī)械方法)剝除胚胎周圍透明帶，用135微米剝卵 針輕柔吹吸胚胎，使透明帶與胚胎完全分離。
[0090] (3)將至少3個(gè)去除透明帶的胚胎分別依次轉(zhuǎn)移到至少3個(gè)30微升囊胚培養(yǎng)液微滴 (保證一個(gè)微滴中只有一個(gè)胚胎），每個(gè)微滴輕柔吹吸漂洗2-3次，之后再將胚胎轉(zhuǎn)移至37 °C，5 % CO2，5 % O2條件下，過(guò)夜平衡微滴(30微升）中繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚。
[0091] (4)將步驟(3)中獲取囊胚的培養(yǎng)液(即乏培養(yǎng)液）（體積約為24-30微升)轉(zhuǎn)移至30 微升裂解液(pH 7.8的30mM Tris-Cl，2mM EDTA，20mM KCl，0.2%Triton X-100)中，用記號(hào) 筆在采集管上標(biāo)記樣本名稱。微型離心機(jī)離心30秒。樣本可立即進(jìn)入下一步全基因組擴(kuò)增 步驟或放入_20°C或_80°C冷凍保存。
[0092]囊胚培養(yǎng)液中微量DNA的全基因組擴(kuò)增
[0093] (1)將囊胚培養(yǎng)液與裂解液的混合物于室溫下融解。
[0094] (2)向管中加入1微升裂解酶（12.5μg/ml Qiagen Protease)，上下吹打混勾。
[0095] (3)將管子置于50°C孵育90分鐘。
[0096] (4)將管子置于80°C 10分鐘以失活裂解酶。
[0097] (5)從管中取出10微升裂解產(chǎn)物加入一個(gè)PCR反應(yīng)管中.
[0098] (6)向PCR反應(yīng)管中加入60微升預(yù)擴(kuò)增混合液。
[0099] (7)將PCR反應(yīng)管置于PCR儀中進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，熱循環(huán)程序?yàn)椋?br>[0101] (8)向PCR反應(yīng)管中加入60微升擴(kuò)增混合液（所述擴(kuò)增混合液的成分為10-25mM Tris-HCl，5-25mM(NH4)2S〇4，5-30mM KCl，0 · 5-5mM MgS〇4，0 · 1 % -20 %DMSO和0 · 05-5 % Triton X-100。優(yōu)選地，所述擴(kuò)增混合液的成分為 15mM Tris-HCl，15mM(NH4)2S〇4,20mM KCl，lmMMgS〇4,5%DMS(^P2%TritonX-100)。
[0102] (9)將PCR反應(yīng)管置于PCR儀中進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增，熱循環(huán)程序?yàn)椋?br>[0104] NICS 方法
[0105] (1)將囊胚培養(yǎng)液與裂解液的混合物于室溫下融解。
[0106] (2)向管中加入1微升裂解酶（12.5μg/ml Qiagen Protease，上下吹打混勾。
[0107] (3)將管子置于50°C孵育90分鐘。
[0108] (4)將管子置于80 °C 10分鐘以失活裂解酶。
[0109 ] (5)從管中取出10微升裂解產(chǎn)物加入一個(gè)PCR反應(yīng)管中.
[0110] (6)向PCR反應(yīng)管中加入60微升預(yù)擴(kuò)增混合液。
[0111] (7)將PCR反應(yīng)管置于PCR儀中進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，熱循環(huán)程序?yàn)椋?br>[0114] (8)向PCR反應(yīng)管中加入60微升擴(kuò)增混合液（所述擴(kuò)增混合液的成分為10-25mM Tris-HCl，5-25mM(NH4)2S〇4，5-30mM KCl，0 · 5-5mM MgS〇4，0 · 1 % -20 %DMSO和0 · 05-5 % Triton X-100。優(yōu)選地，所述擴(kuò)增混合液的成分為 15mM Tris-HCl，15mM(NH4)2S〇4,20mM KCl，lmMMgS〇4,5%DMS(^P2%TritonX-100)。
[0115] (9)將PCR反應(yīng)管置于PCR儀中進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增，熱循環(huán)程序?yàn)椋?br>L0117」 （10)將擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物按常規(guī)方法進(jìn)行二代測(cè)序，以鑒定胚胎的染色體狀態(tài)是 否正常。
[0118] 樣品的處理與樣本的獲得
[0119] 樣品：從5對(duì)志愿者夫婦中，分別取5個(gè)受精卵（其中，從女性志愿者中取卵子，從男 性志愿者中取精子，體外受精，從而獲得受精卵）。
[0120]樣品處理及樣本獲得：
[0121 ] (1)將受精卵體外培養(yǎng)至第3天到第6天，較佳地，第4天，即胚胎發(fā)育至桑葚胚，卵 裂球完全融合時(shí)，此時(shí)胚胎與透明帶之間產(chǎn)生較大空隙。
[0122] (2)利用機(jī)械剝除方法(如PIZO等機(jī)械方法)剝除胚胎周圍透明帶，用135微米剝卵 針輕柔吹吸胚胎，使透明帶與胚胎完全分離。
[0123] (3)將至少3個(gè)去除透明帶的胚胎分別依次轉(zhuǎn)移到至少3個(gè)30微升囊胚培養(yǎng)液微滴 (保證一個(gè)微滴中只有一個(gè)胚胎），每個(gè)微滴輕柔吹吸漂洗2-3次，之后再將胚胎轉(zhuǎn)移至37 °C，5 % CO2，5 % O2條件下，過(guò)夜平衡微滴(30微升）中繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚。
[0124] (4)將取30微升(體積）（已補(bǔ)充）的培養(yǎng)液（即乏培養(yǎng)液）（體積約為24-30微升），并 將其轉(zhuǎn)移至30微升裂解液(pH 7.8的30mM Tris-Cl，2mM EDTA，20mM KCl，0.2%Triton X-100)中，即獲得去除透明帶的培養(yǎng)液樣本，微型離心機(jī)離心30秒，進(jìn)入下一步全基因組擴(kuò)增 步驟或放入-20°C或-80°C冷凍保存。
[0125] 實(shí)施例1
[0126] 利用本發(fā)明的檢測(cè)方法（即在桑葚胚期對(duì)胚胎透明帶進(jìn)行剝離，再換液培養(yǎng)），對(duì) 兩個(gè)IVF胚胎(樣本C和D)分別以囊胚細(xì)胞活檢檢測(cè)的方法和囊胚培養(yǎng)液檢測(cè)的方法評(píng)估其 染色體狀態(tài)。囊胚培養(yǎng)液檢測(cè)方法獲得了與囊胚細(xì)胞檢測(cè)方法相同的結(jié)果。
[0127] 二代測(cè)序數(shù)據(jù)的結(jié)果表明，在C樣本中，囊胚培養(yǎng)液檢測(cè)方法（圖3a)與囊胚細(xì)胞檢 測(cè)方法（圖3b)均檢出染色體正常。在D樣本中，囊胚培養(yǎng)液檢測(cè)方法（圖4a)與囊胚細(xì)胞檢測(cè) 方法(圖4b)均檢出2號(hào)染色體部分區(qū)段有缺失，4號(hào)染色體部分區(qū)段有擴(kuò)增。
[0128] 將C樣本的受精卵植入夫妻親本母親的子宮中，可得到染色體狀態(tài)正常，且能夠正 常發(fā)育的胚胎。
[0129] 對(duì)比例1
[0130] 利用常規(guī)NICS方法（即僅換液，不去透明帶培養(yǎng))對(duì)一個(gè)ICSI胚胎的囊胚培養(yǎng)液和 囊胚活檢細(xì)胞分別進(jìn)行檢測(cè)以評(píng)估其染色體狀態(tài)。以囊胚活檢細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)囊 胚培養(yǎng)液檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。
[0131] 二代測(cè)序的結(jié)果表明，與囊胚活檢細(xì)胞檢測(cè)方法（圖Ib)相比，囊胚培養(yǎng)液檢測(cè)方 法（圖la)檢測(cè)結(jié)果存在顆粒細(xì)胞污染，導(dǎo)致X染色體出現(xiàn)假陽(yáng)性擴(kuò)增，同時(shí)6號(hào)染色體和16 號(hào)染色體的擴(kuò)增變異不能檢出。
[0132] 對(duì)比例2
[0133] 利用常規(guī)NICS方法（即僅換液，不去透明帶培養(yǎng))對(duì)一個(gè)IVF胚胎的囊胚培養(yǎng)液和 囊胚活檢細(xì)胞分別進(jìn)行檢測(cè)以評(píng)估其染色體狀態(tài)。以囊胚活檢細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)囊 胚培養(yǎng)液檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。
[0134] 二代測(cè)序的結(jié)果表明，與囊胚活檢細(xì)胞檢測(cè)方法（圖2b)相比，囊胚培養(yǎng)液檢測(cè)方 法（圖2a)結(jié)果存在有精子污染，導(dǎo)致X染色體拷貝數(shù)假陽(yáng)性缺失，一號(hào)染色體缺失未能檢 出，兩種方法檢測(cè)結(jié)果不一致。
[0135] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種體外非治療性的利用囊胚培養(yǎng)液檢測(cè)胚胎染色體異常的方法，其特征在于，包 括步驟： (a) 提供一來(lái)自囊胚培養(yǎng)體系的培養(yǎng)液，其中，所述囊胚培養(yǎng)體系中的胚胎在培養(yǎng)前已 去除透明帶，所述胚胎在所述囊胚培養(yǎng)體系中培養(yǎng)3-6天，較佳地，4天后，從所述培養(yǎng)體系 中分尚出所述培養(yǎng)液； (b) 對(duì)所述培養(yǎng)液進(jìn)行基因檢測(cè)，從而鑒定所述胚胎染色體是否異常。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述囊胚培養(yǎng)體系為單胚胎培養(yǎng)體系，并且 在所述單胚胎培養(yǎng)體系中沒(méi)有透明帶，含有10-100微升，較佳地，15-50微升，更佳地，20-35 微升的培養(yǎng)液。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)中分離出的培養(yǎng)液的體積為所 述單胚胎培養(yǎng)體系中培養(yǎng)液體積的30-100%，較佳地，40-100%，更佳地，50-100%，最佳 地，80-100%。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(b)中還包括步驟(c): (i)將所述培養(yǎng)液與裂解液混合，從而獲得含有所述培養(yǎng)液與裂解液的第一混合物； (i i)將所述第一混合物與裂解酶混合，孵育，失活裂解酶，從而獲得裂解產(chǎn)物;和 (i i i)對(duì)所述裂解產(chǎn)物進(jìn)行基因組分析，從而鑒定所述胚胎染色體是否異常。5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述基因組分析的方法選自下組:二代測(cè)序、 核酸芯片、免疫熒光檢測(cè)、焚光PCR檢測(cè)、一代測(cè)序、三代測(cè)序、質(zhì)譜檢測(cè)、或其組合。6. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述裂解液選自下組:Tris緩沖液、螯合劑、 鹽酸鹽、非離子型表面活性劑、或其組合。7. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟(i)中，培養(yǎng)液與裂解液的體積比為 1:10 - 10:1，較佳地，1:5 - 5:1，更佳地，1:2-2:1。8. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述裂解酶的濃度為l-25μg/ml，較佳地，5-20μg/ml，更佳地，10_15μg/ml。9. 一種制備基因檢測(cè)樣本或染色體檢測(cè)樣本的方法，其特征在于，包括步驟： (i)提供一培養(yǎng)體系，所述培養(yǎng)體系中含有去除透明帶的胚胎，培養(yǎng)3-6天，較佳地，4天 后，從所述培養(yǎng)體系中分離出液體，即為所述檢測(cè)樣本。10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟(ii):對(duì)獲得的所述檢 測(cè)樣本進(jìn)行基因檢測(cè)，從而鑒定所述胚胎染色體是否異常。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK106086199SQ201610523133
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月5日
【發(fā)明人】陸思嘉, 蔡立義, 任軍, 馬婷, 方銳
【申請(qǐng)人】上海序康醫(yī)療科技有限公司