專利名稱：染色體異常的產(chǎn)前診斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及染色體異常的無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷方法。本發(fā)明的方法可以用來(lái)檢測(cè)染色體DNA缺失和重復(fù)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法用于診斷染色體非整倍性及相關(guān)疾病，例如唐氏綜合征(Down′s Syndrome)和特納綜合征(Turner′s Syndrome)。本發(fā)明還提供鑒定甲基多態(tài)性探針的方法，所述甲基多態(tài)性探針可用于檢測(cè)胎兒染色體異常。
背景技術(shù)：
染色體異常是造成大量先天缺陷(包括精神發(fā)育遲緩)的主要原因。異常一般表現(xiàn)為染色體DNA重復(fù)和缺失，以及染色體非整倍性，后者指的是完整的染色體的異常存在或缺失。當(dāng)生物體具有少于或多于正常二倍體的染色體數(shù)量時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生大量異常特征并引起多種綜合征。唐氏綜合征，亦稱21三體綜合征，是染色體非整倍性最常見(jiàn)的例子，包括一條額外的21號(hào)染色體。其它常見(jiàn)的染色體非整倍性有13三體綜合征、18三體綜合征、特納綜合征和克蘭費(fèi)爾特綜合征(Klinefelter′s Syndrome)。對(duì)于染色體異常產(chǎn)前檢測(cè)的選擇主要限于有創(chuàng)性方法，這些方法會(huì)有致使胎兒丟去的風(fēng)險(xiǎn)，雖小但的確有一些。最常用的檢測(cè)異常的方法是羊膜穿刺術(shù)。然而，由于羊膜穿刺術(shù)是有創(chuàng)性方法，因此通常只用于高齡產(chǎn)婦，因?yàn)楦啐g產(chǎn)婦的胎兒出現(xiàn)染色體異常的風(fēng)險(xiǎn)有所增加。因此，建立用于胎兒染色體異常診斷的無(wú)創(chuàng)性方法非常有益，這些方法可以使眾多的準(zhǔn)媽媽受益。美國(guó)專利號(hào)4,874,693中已經(jīng)描述了這樣一種無(wú)創(chuàng)性方法，該專利公開(kāi)了通過(guò)監(jiān)測(cè)母親的人絨毛膜促性腺激素(HCG)水平，檢測(cè)胎盤機(jī)能障礙以顯示染色體異常的方法。然而，雖然這種方法是無(wú)創(chuàng)性的并且能夠用來(lái)篩選所有年齡段的準(zhǔn)媽媽，但它不能作為具體染色體異常存在的診斷方法，也不能作為具體染色體異常存在的保證?，F(xiàn)有的產(chǎn)前診斷方法除了取樣步驟是有創(chuàng)性的，操作也耗時(shí)費(fèi)力。例如，吉姆薩(Geisma)染色法是最廣為使用的技術(shù)，這種方法要求實(shí)驗(yàn)時(shí)，細(xì)胞處于細(xì)胞分裂中期或者正在分裂。每對(duì)染色體要染上特征性的明帶譜或暗帶譜。采用這種方法，所有的染色體能夠被一一區(qū)分并容易展現(xiàn)任何結(jié)構(gòu)上的或數(shù)量上的異常性質(zhì)。吉姆薩染色法不是總能檢測(cè)出精細(xì)的染色體重排。如果懷疑染色體重排，但用這種方法檢測(cè)不到，進(jìn)一步的詳細(xì)分析可以使用熒光原位雜交(FISH)或圖譜核型分析(SKY)進(jìn)行。用吉姆薩染色法，測(cè)試結(jié)果需要一到兩周。SKY就是用不同探針(染料顏色)對(duì)每個(gè)中期染色體染色的技術(shù)。因?yàn)槊總€(gè)染色體特異性探針都會(huì)發(fā)射自身所特有的熒光波長(zhǎng)，因此能夠容易地觀察到結(jié)構(gòu)重排，并能夠容易地鑒定所涉及的染色體。由于SKY要求細(xì)胞是處于細(xì)胞分裂中期的細(xì)胞，因此結(jié)果需要一到兩周。FISH就是用熒光探針(染料)與特異性個(gè)別染色體或染色體的某些區(qū)結(jié)合或雜交的技術(shù)。受到影響的染色體或染色體區(qū)發(fā)熒光或是發(fā)出信號(hào)，可以通過(guò)熒光顯微鏡目測(cè)分析它們的存在或缺失。FISH通常用于鑒定具體的染色體重排或快速診斷出異常染色體存在的數(shù)量。對(duì)于異常染色體數(shù)量，F(xiàn)ISH是目前最快的診斷異常染色體數(shù)量的方法。速度較快是因?yàn)榉治鲇玫募?xì)胞不必是處于細(xì)胞分裂中期的細(xì)胞。因此，一般2到3天就可以知道測(cè)試結(jié)果。因此，本領(lǐng)域需要無(wú)創(chuàng)性的產(chǎn)前診斷方法，這些方法能夠快速而準(zhǔn)確地幫助確定染色體畸變的存在和類型。
發(fā)明概述
本發(fā)明描述了用于染色體異常例如染色體非整倍性的無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷方法，所述方法可以快速地做出準(zhǔn)確的結(jié)果。本發(fā)明方法使用的是得自孕婦的血漿樣本。已經(jīng)顯示出，除了母體血漿中有較小百分比的胎兒細(xì)胞外，母體樣本還含有較小百分比的胎兒DNA。常染色體具有一個(gè)母親遺傳的等位基因(A，如下表所示)和一個(gè)來(lái)自父親的等位基因(B，如下表所示)。有一種情況，其中胎兒DNA占母體血漿樣本中存在的總DNA的約2％，胎兒等位基因的存在狀況描述如下 因此，由于正常與三體之間的B％的差異僅僅是(2/200-2/202)即0.01％，因此這種差異太小了，即便采用現(xiàn)有最好的定量方法也難以發(fā)現(xiàn)。在檢測(cè)樣本中的等位基因之前，通過(guò)相對(duì)地富集母體血漿樣本中的胎兒DNA數(shù)量，本發(fā)明就解決了這個(gè)難題。本發(fā)明利用母體和胎兒之間DNA中的差異，例如，DNA甲基化狀態(tài)中的差異，富集母體血漿中的胎兒DNA以便準(zhǔn)確地檢測(cè)樣本中的胎兒等位基因。因此，可以將母體DNA大體上縮減、掩蔽或完全破壞，樣本余留的大部分DNA就是胎兒的了。可以用一種或多種酶選擇性破壞母體DNA，例如甲基化敏感酶，這類酶可以選擇性消化這個(gè)區(qū)域周圍的母體核酸，稍后用來(lái)檢測(cè)等位基因頻率。然后使用靠近所選擇的染色體區(qū)的多態(tài)性標(biāo)記，測(cè)定胎兒DNA的等位基因頻率。與對(duì)照樣本比較，等位基因頻率的差異表明存在染色體異常。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了檢測(cè)染色體異常的方法，該方法包括a)獲取孕婦血漿樣本，b)任選地從所述血漿樣本中分離DNA，c)用酶(例如甲基敏感酶)消化DNA，該甲基敏感酶選擇性消化母體DNA或胎兒DNA，d)利用選擇性消化以獲得富集了胎兒DNA或母體DNA的DNA樣本，e)用靠近所選胎兒DNA區(qū)的多態(tài)性標(biāo)記測(cè)定母源或父源等位基因頻率，f)將步驟e)的父源或母源等位基因頻率與對(duì)照DNA樣本進(jìn)行比較，其中等位基因頻率的差異表明存在染色體異常。優(yōu)選，考慮到多態(tài)性差異，應(yīng)當(dāng)用一組正常DNA和/或異常DNA與推定異常DNA進(jìn)行比較。因此，如果通過(guò)消化將母體DNA完全破壞，那么就能夠檢測(cè)到胎兒等位基因頻率，如下表所示 因?yàn)橄鄬?duì)富集了母體血漿樣本中的胎兒DNA，所以現(xiàn)在幾乎是采用任何核酸檢測(cè)方法都可以準(zhǔn)確地檢測(cè)出等位基因頻率。母體血漿樣本中的母源等位基因與父源等位基因之比因此僅僅反映出胎兒中的等位基因比率。因此，如果樣本中有兩個(gè)以上的母源等位基因，那么這個(gè)比率將明顯地不同于正常時(shí)的1/2?？梢岳锰篋NA和母體DNA之間的任何差異，例如利用Y染色體特異性DNA和端粒長(zhǎng)度。母體和胎兒之間DNA的差異可以用已知的方法來(lái)測(cè)定。在差異是差異甲基化的情況下，甲基敏感酶消化未甲基化的母體DNA，而胎兒里的DNA是甲基化的，反之亦然。例如，當(dāng)胎兒DNA區(qū)是甲基化的，那么將甲基敏感酶用來(lái)消化未甲基化的母體DNA。消化后只留下胎兒甲基化DNA片段，因此就富集了胎兒DNA。然后將靠近差異甲基化DNA區(qū)或在差異甲基化DNA區(qū)內(nèi)的多態(tài)性標(biāo)記用作檢測(cè)母體血漿樣本中的母源或父源DNA頻率的標(biāo)記。將母源DNA和父源DNA的等位基因頻率和得自無(wú)染色體異常健康個(gè)體的基因組DNA中通常觀察得到的等位基因頻率進(jìn)行比較。這樣，就可以檢測(cè)出任何染色體異常。因?yàn)槟軌蛲瑫r(shí)檢測(cè)出一個(gè)或多個(gè)等位基因，因此可從同一樣本中同時(shí)篩選出多種染色體異常?；蛘哒f(shuō)，只消化甲基化DNA的酶可以用來(lái)富集在胎兒中是未甲基化的而在母親中是甲基化的DNA。本發(fā)明的方法適于檢測(cè)染色體DNA重復(fù)或染色體DNA缺失，以及檢測(cè)染色體非整倍性。盡管優(yōu)選首先要大體上完全破壞母源等位基因時(shí)，但是這就沒(méi)有必要。本發(fā)明也提供一種方法，該方法中如果母體DNA沒(méi)有被完全破壞，就要一個(gè)或多個(gè)最好不是雙份的染色體作對(duì)照等位基因。情況如下 表中，等位基因B和等位基因D是胎兒DNA中的父性遺傳等位基因。或者，在首次消化后，胎兒DNA可以被進(jìn)一步擴(kuò)增。因此，本發(fā)明提供一種方法，該方法中在首次消化母體DNA后，采用選擇性地?cái)U(kuò)增胎兒DNA的擴(kuò)增方法擴(kuò)增樣本。或者說(shuō)，樣本中存有差異，例如母體DNA和胎兒DNA之間的甲基化差異。擴(kuò)增后的樣本因而被再次消化，并因此可以得到更大百分比的胎兒DNA。當(dāng)然，如果需要，可以進(jìn)行一次以上的消化/擴(kuò)增程序。擴(kuò)增步驟可以與對(duì)照等位基因的檢測(cè)一起進(jìn)行。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括擴(kuò)增程序以富集胎兒DNA。一方面，擴(kuò)增方法包括a)獲取孕婦血漿樣本并任選從所述樣本中分離DNA，b)用只消化未甲基化DNA的甲基敏感酶消化所分離的DNA，c)分離步驟b未消化的DNA，d)擴(kuò)增步驟c未消化的DNA，同時(shí)用DNA甲基化酶使新生的半甲基化DNA甲基化，e)使用只消化未甲基化DNA的酶消化步驟c已擴(kuò)增的DNA，f)使用例如靠近胎兒甲基化DNA區(qū)的多態(tài)性標(biāo)記，測(cè)定母源或父源等位基因頻率，g)將步驟f的父源或母源等位基因頻率與對(duì)照DNA樣本進(jìn)行比較，其中差異等位基因頻率表明有染色體異常。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了診斷21三體(唐氏綜合征)的方法。該方法包括a)獲取孕婦血漿樣本，b)任選地從所述血漿樣本中分離出DNA，c)用只消化母體DNA或胎兒DNA的酶例如甲基敏感酶消化DNA，d)使用靠近所選21號(hào)染色體的胎兒DNA區(qū)的多態(tài)性標(biāo)記測(cè)定父源等位基因頻率，e)將步驟d的父源等位基因頻率與對(duì)照DNA樣本進(jìn)行比較，其中如果父源等位基因頻率小于對(duì)照樣本的等位基因頻率，就表明有唐氏綜合征。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供檢測(cè)母體血漿樣本中的染色體非整倍性的試劑盒，其中所述試劑盒包括一種或多種酶以及引物，其中這類酶特異性消化孕婦血漿樣本中的母體DNA，而引物用來(lái)檢測(cè)已富集的胎兒DNA中的多態(tài)性標(biāo)記的父源和母源等位基因頻率，以便于檢測(cè)染色體缺失、染色體插入或染色體非整倍性。這種試劑盒也包括容器、酶(例如聚合酶)和緩沖液，以便于從母體血漿樣本中分離出核酸、擴(kuò)增標(biāo)記以檢測(cè)等位基因頻率。這種試劑盒也可以包括標(biāo)準(zhǔn)DNA或?qū)φ誅NA，例如從懷有健康胎兒的孕婦血漿中分離的DNA，和/或從懷有染色體異常例如21號(hào)、13號(hào)和/或18號(hào)染色體三體胎兒的孕婦血漿樣本中分離的DNA樣本。用于產(chǎn)前診斷染色體異常的試劑盒優(yōu)選包括至少一種甲基化敏感酶；至少一對(duì)核酸擴(kuò)增引物，該核酸擴(kuò)增引物能夠退火并因此擴(kuò)增位點(diǎn)側(cè)翼區(qū)，該位點(diǎn)包含至少一個(gè)位于母體血漿中存在的胎兒DNA和母體DNA的差異甲基化區(qū)內(nèi)的多態(tài)基因座；至少一種引物或探針，以便檢測(cè)至少一個(gè)多態(tài)基因座中的等位基因；和說(shuō)明書手冊(cè)，指導(dǎo)使用者進(jìn)行下述步驟獲取孕婦血漿樣本，用甲基化敏感酶選擇性消化所述血漿樣本中的核酸以富集樣本中的胎兒核酸，用擴(kuò)增引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增，檢測(cè)已富集了胎兒核酸樣本中的等位基因，解釋結(jié)果，如果基因座中兩個(gè)不同的等位基因的比率偏離了等位基因以等量存在的對(duì)照，就表明該胎兒患染色體異常。這種試劑盒還包括對(duì)照核酸組，其中對(duì)照核酸組包括從懷有已知的染色體異常胎兒的孕婦中分離的核酸和從懷有無(wú)染色體異常胎兒的孕婦中分離的核酸。這種試劑盒也還包括至少一對(duì)擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物或探針的內(nèi)部對(duì)照，其中所述引物和/或探針選自在母體血漿中存在的胎兒DNA和母體DNA中被差異甲基化的但存在于重復(fù)和缺失罕見(jiàn)的染色體上的核酸區(qū)，以便提供內(nèi)部對(duì)照。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供胎兒染色體異常的檢測(cè)方法。本文所用的術(shù)語(yǔ)“染色體異?！笔侵赣蠨NA缺失或重復(fù)的染色體以及染色體非整倍性。該術(shù)語(yǔ)也包括把染色體外序列易位到其它染色體上。本文所用的術(shù)語(yǔ)“染色體非整倍性”是指染色體的異常存在(超倍性)或異常不存在(亞倍性)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“多態(tài)性標(biāo)記”是指顯示個(gè)體間的DNA序列中可遺傳變異的基因組DNA區(qū)段。這類標(biāo)記包括但不限于單核苷酸多態(tài)性(SNP)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、短串聯(lián)重復(fù)(STR)例如二核苷酸重復(fù)、三核苷酸重復(fù)或四核苷酸重復(fù)等等。本發(fā)明的多態(tài)性標(biāo)記可特別用于把已富集的胎兒核酸樣本中的母源等位基因和父源等位基因區(qū)別開(kāi)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“甲基多態(tài)性標(biāo)記”是指靠近胎兒DNA和母體DNA的差異甲基化DNA區(qū)的多態(tài)性標(biāo)記。術(shù)語(yǔ)靠近是指標(biāo)記的位置距差異甲基化核苷酸1-3000堿基對(duì)，優(yōu)選1000堿基對(duì)，更優(yōu)選100堿基對(duì)，還更優(yōu)選50堿基對(duì)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“母源等位基因頻率”是指母源等位基因與總的等位基因(包括父源等位基因和母源等位基因)的比率，用百分比表示。術(shù)語(yǔ)“父源等位基因頻率”是指父源等位基因與總的等位基因(包括父源等位基因和母源等位基因)的比率，用百分比表示。本文所用的術(shù)語(yǔ)“對(duì)照DNA樣本”或“標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本”是指從沒(méi)有染色體異常的健康個(gè)體中獲得的基因組DNA。優(yōu)選，對(duì)照DNA樣本是從懷有無(wú)染色體異常健康胎兒的孕婦的血漿中獲得的。優(yōu)選使用一組對(duì)照樣本。在已知某些染色體異常的情況下，也可以有一些有特定疾病或病癥的標(biāo)準(zhǔn)物。因此，舉例來(lái)說(shuō)，為了篩選孕婦母體血漿中的三種不同染色體非整倍性，優(yōu)選使用一組對(duì)照DNA，該對(duì)照DNA是從已知懷有例如13號(hào)、18號(hào)或21號(hào)染色體三體胎兒的母親的血漿中分離的DNA以及從懷有無(wú)染色體異常胎兒的母親的血漿中分離的DNA。本發(fā)明描述了采用得自母體血漿中的胎兒DNA診斷染色體異常的無(wú)創(chuàng)性方法。妊娠早期或晚期的母體血漿中，胎兒DNA約占總DNA的2-6％。從理論上說(shuō)，在正常的胎兒中，一半的胎兒DNA來(lái)自父性遺傳組分。一俟懷孕就可以采用本發(fā)明的方法。優(yōu)選，在受孕后六周或更長(zhǎng)時(shí)間里獲取樣本。優(yōu)選受孕后6周和12周之間。分析母體血漿中的胎兒DNA所提出的技術(shù)特征在于，要能夠把胎兒DNA和共同存在的背景母體DNA區(qū)別開(kāi)。本發(fā)明的方法利用這種差異，例如從胎兒DNA和母體DNA之間觀察到的差異甲基化，來(lái)富集母體血漿DNA樣本中占相對(duì)較小百分比的胎兒DNA。所述方法的無(wú)創(chuàng)性特點(diǎn)與產(chǎn)前診斷的常規(guī)方法相比有較大的優(yōu)勢(shì)，常規(guī)方法例如羊膜穿刺術(shù)、絨毛膜絨毛取樣和臍帶穿刺術(shù)，這些方法都伴隨著雖小但的確有胎兒丟去的風(fēng)險(xiǎn)。同樣，由于所述方法不取決于處于任何特定細(xì)胞期的胎兒細(xì)胞，因此所述方法提供了測(cè)定染色體異常存在和染色體異常性質(zhì)的快速檢測(cè)方法?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法，從懷孕母親的血液、血漿或血清中分離DNA。標(biāo)準(zhǔn)DNA分離方法描述于例如(Sambrook等，Molecular BiologyA laboratory Approach，Cold SpringHarbor，N.Y.1989；Ausubel等，Current protocols in Molecular Biology，Greene Publishing，Y，1995)。分離血漿DNA的優(yōu)選方法描述于Chiu等2001，Clin.Chem.471607-1613，該文獻(xiàn)通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。其它合適的方法包括例如TRI REAGENTBD(Molecular ResearchCenter，Inc.，Cincinnati，OH)，這是從例如血漿中分離DNA的試劑。TRIREAGENT BD和一步法描述于例如美國(guó)專利第4,843,155號(hào)和第5,346,994號(hào)。按照本發(fā)明的方法，通過(guò)用一種或多種選擇性切割母體DNA部分的酶消化血漿DNA，就可以富集得自預(yù)期母親的血漿DNA樣本中的胎兒DNA。例如，用只在甲基化的DNA識(shí)別位點(diǎn)上切割的酶來(lái)消化血漿DNA，或者用只在未甲基化的DNA識(shí)別位點(diǎn)上切割的酶來(lái)消化血漿DNA。用只切割未甲基化DNA識(shí)別位點(diǎn)的酶消化，就可以富集胎兒DNA中甲基化的DNA序列而非母體DNA中未甲基化的DNA序列。或者，用只切割甲基化DNA識(shí)別位點(diǎn)的酶消化，就可以富集胎兒DNA中未甲基化的DNA序列而非母體DNA中甲基化的DNA序列。任何能夠選擇性切割母體DNA區(qū)而不能切割相應(yīng)的胎兒DNA區(qū)的酶都適用于本發(fā)明。例如，CG(或CpG)島是一段短序列，如果是這中間的DNA，那么CG序列頻率高于其它區(qū)域。在基因的啟動(dòng)子區(qū)中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)CpG島。當(dāng)基因是無(wú)活性基因時(shí)，多數(shù)CpG島甲基化程度較高，當(dāng)基因是活性基因即已翻譯的基因時(shí)，多數(shù)CpG島甲基化程度較低或未甲基化。因此，不同細(xì)胞類型的甲基化模式不同且隨著發(fā)育而改變。因?yàn)樘篋NA和母體DNA可能來(lái)自不同的細(xì)胞類型和不同的發(fā)育階段，因此就能容易地鑒定差異甲基化的區(qū)域并且用于富集母體血漿樣本中相對(duì)數(shù)量的胎兒DNA。本文所用的術(shù)語(yǔ)“甲基敏感”酶是DNA限制性內(nèi)切核酸酶，這種酶的活性取決于它們的DNA識(shí)別位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。例如，有些甲基敏感酶僅在未甲基化DNA識(shí)別序列上的位點(diǎn)切割。因此，未甲基化DNA樣本會(huì)被切成比甲基化DNA樣本更小的片段。同樣，過(guò)度甲基化DNA不會(huì)被切割。相反，有些甲基敏感酶僅在甲基化的DNA識(shí)別序列上切割。本文所用的術(shù)語(yǔ)“切割”、“切”和“消化”可互換使用。在本發(fā)明的方法中，適用的消化未甲基化DNA的甲基敏感酶包括但不限于HpaII、HhaI、MaeII、BstUI和AciI。優(yōu)選使用的酶是HpaII，它只切割未甲基化序列CCGG。也可以使用兩種或兩種以上只消化未甲基化DNA的甲基敏感酶的組合。合適的只消化甲基化DNA的酶包括但不限于DpnI，它在識(shí)別序列GATC上切割，還有McrBC，它屬于AAA+蛋白家族，切割含有修飾胞嘧啶的DNA并在識(shí)別位點(diǎn)5′…PumC(N40-3000)PumC…3′(New England BioLabs，Inc.，Beverly，MA)上切割。本領(lǐng)域技術(shù)人員通曉用所選限制酶切割特定位點(diǎn)上的DNA的切割方法和程序。例如很多限制酶的供應(yīng)商提供了用特異性限制酶切割的DNA序列的條件和類型的信息，他們包括New EnglandBioLabs、Pro-Mega Biochems、Boehringer-Mannheim等等。Sambrook等(參見(jiàn)Sambrook等，Molecular BiologyA laboratory Approach，ColdSpring Harbor，N.Y.1989)提供了有關(guān)限制酶和其它酶的使用方法的一般性描述。在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選酶的應(yīng)用條件是能夠切割母體DNA的效率約95％至100％，優(yōu)選效率約98％至100％。
檢測(cè)差異甲基化DNA區(qū)內(nèi)不同等位基因的甲基多態(tài)性探針和標(biāo)記的鑒定
本發(fā)明利用胎兒DNA和母體DNA中的差異來(lái)富集母體血漿樣本中的胎兒DNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明利用差異甲基化。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，甲基化在基因表達(dá)中起著重要的作用。例如，基因(通常是啟動(dòng)子和第一外顯子區(qū))在基因表達(dá)了的細(xì)胞里經(jīng)常是沒(méi)有甲基化的，而在基因沒(méi)有表達(dá)的細(xì)胞里是甲基化的。由于母體血漿樣本中的胎兒DNA和母體DNA常常來(lái)自不同的細(xì)胞類型和/或不同的發(fā)育階段，所以可鑒定出差異甲基化的區(qū)域。然后將代表差異甲基化區(qū)的DNA片段測(cè)序，篩選可以用作母源或父源的等位DNA“標(biāo)記”的多態(tài)性標(biāo)記。在公共數(shù)據(jù)庫(kù)例如NCBI中，或者通過(guò)對(duì)差異甲基化基因組區(qū)進(jìn)行測(cè)序，就可以發(fā)現(xiàn)位于特異基因組區(qū)的多態(tài)性標(biāo)記。然后通過(guò)評(píng)價(jià)母體血漿樣本中的母源或父源等位基因頻率，其中胎兒DNA已按照本發(fā)明的方法富集，可將已鑒定的甲基多態(tài)性標(biāo)記用作染色體異常的診斷標(biāo)記。如果母源等位基因或父源等位基因的比率不是約1/2，則說(shuō)明多態(tài)性標(biāo)記已定位的特定染色體區(qū)不是重復(fù)就是缺失?？梢杂萌魏伪绢I(lǐng)域已知的方法鑒定差異甲基化區(qū)，從而制備對(duì)應(yīng)于那些區(qū)的探針和/或引物。差異甲基化區(qū)的各種鑒定方法描述于例如美國(guó)專利號(hào)5,871,917、5,436,142及美國(guó)專利申請(qǐng)第US20020155451A1號(hào)、第US20030022215A1號(hào)和第US20030099997號(hào)，這些專利的內(nèi)容通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。為了鑒定不同胎兒細(xì)胞和不同胎兒發(fā)育階段中的差異甲基化區(qū)，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員通曉的核酸分離方法，從絨毛膜絨毛樣本、羊水樣本或流產(chǎn)胎兒獲取的樣本中分離出胎兒核酸。與母體DNA對(duì)比，如何鑒定胎兒DNA中差異甲基化區(qū)的實(shí)例如下。美國(guó)專利號(hào)5,871,917中描述了一種典型的方法。這種方法用不切割甲基化DNA的CNG特異性限制酶，在CpNpG序列切割試驗(yàn)DNA(例如胎兒DNA)和對(duì)照DNA(例如母體DNA)，檢測(cè)差異甲基化。這種方法用一次或多次DNA擴(kuò)增聯(lián)同扣除雜交法一起鑒定差異甲基化的DNA或突變的DNA的區(qū)段。因此，該方法可以選擇性地鑒定胎兒基因組甲基化不足或過(guò)度甲基化的區(qū)域。就是在那些區(qū)域里，可以容易地鑒定任何多態(tài)性，例如SNP、STR或RFLP，這些多態(tài)性可以用于檢測(cè)胎兒DNA已富集的母體血漿樣本中的母源等位基因和父源等位基因的等位基因頻率。具體地說(shuō)，分離母體DNA，并將其與從胎兒分離的DNA進(jìn)行比較。將母體DNA樣本和胎兒DNA樣本分別用只在沒(méi)有甲基化的CNG位點(diǎn)上切割的甲基敏感酶進(jìn)行切割。將樣本用第二種酶進(jìn)行進(jìn)一步切割，這種酶將DNA切割成適合DNA擴(kuò)增和扣除雜交的大小和復(fù)雜度。優(yōu)選，第二種酶切割DNA生成末端，這些末端與甲基敏感酶生成的粘端既不同源又不互補(bǔ)(complimentary)。切割后，將一組銜接頭連接到由不切割甲基化DNA的CNG特異性限制酶生成的粘端上。選擇銜接頭是為了把它們連接到由甲基敏感酶切割的DNA的CG豐富末端，而不是連接到由第二種酶切割的片段的末端。銜接頭不僅選來(lái)連接到由甲基敏感酶切割的DNA末端，同時(shí)也是用于DNA擴(kuò)增中的引物識(shí)別位點(diǎn)上的理想大小和DNA序列。只有那些有銜接頭因而可用甲基敏感酶切割的片段，方能用銜接頭序列引物在PCR反應(yīng)中進(jìn)行擴(kuò)增。將兩個(gè)樣本分別擴(kuò)增。擴(kuò)增后，通過(guò)用甲基敏感酶切割，將第一組銜接頭從已擴(kuò)增的片段的末端除去。這樣就保留了片段原來(lái)的末端。將第二組銜接頭連接到已擴(kuò)增的母體DNA上，而不是連接到已擴(kuò)增的胎兒DNA上。選擇與第一組銜接頭沒(méi)有相同序列的第二組銜接頭，以便它們只連接到由甲基敏感酶切割的DNA末端。第二組銜接頭也給用于擴(kuò)增的引物提供了理想的識(shí)別位點(diǎn)。在DNA擴(kuò)增后，用標(biāo)準(zhǔn)方法至少進(jìn)行一次扣除/雜交。結(jié)果是選擇了母體DNA中獨(dú)特的未甲基化的DNA片段，這個(gè)DNA片段可以用作探針來(lái)檢測(cè)胎兒基因組中的甲基化識(shí)別位點(diǎn)。具體地說(shuō)，如美國(guó)專利號(hào)5,871,917中描述，將母體DNA和過(guò)量的胎兒DNA混合。然后用與第二個(gè)銜接頭末端雜交的引物，通過(guò)體外DNA擴(kuò)增方法擴(kuò)增扣除雜交混合物。因此，只有帶第二個(gè)銜接頭末端的母體DNA片段會(huì)被擴(kuò)增。任何與胎兒DNA雜交了的母體DNA不會(huì)被擴(kuò)增。將過(guò)量的母體DNA用于促進(jìn)雜交體形成，所述雜交體通常在胎兒樣本和母體樣本中都能發(fā)現(xiàn)。結(jié)果是分離到未甲基化的母體DNA片段，這些片段是胎兒DNA中獨(dú)特甲基化的。這些片段用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行分離?？蛇M(jìn)行DNA印跡雜交來(lái)證實(shí)所分離的片段檢測(cè)差異甲基化區(qū)。母體和胎兒的基因組DNA可用甲基敏感酶進(jìn)行切割，特定位點(diǎn)的甲基化不足或過(guò)度甲基化，可以通過(guò)觀察樣本間用限制酶切割的DNA片段的大小或強(qiáng)度是否相同進(jìn)行檢測(cè)。這可以通過(guò)電泳分析或?qū)⑻结樑c母體DNA樣本和胎兒DNA樣本雜交并觀察兩個(gè)雜交復(fù)合物的大小和/或強(qiáng)度是否相同或不同來(lái)進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員通曉詳細(xì)的凝膠電泳和核酸雜交技術(shù)的方法學(xué)，例如在Sambrook等，Molecular BiologyA laboratory Approach，Cold Spring Harbor，N.Y.1989中可找到實(shí)驗(yàn)方案。然后用這些片段序列可篩選區(qū)分父源等位基因或母源等位基因的多態(tài)性標(biāo)記，如本文所述這些標(biāo)記可用作甲基多態(tài)性探針。用上述技術(shù)所分離的探針具有至少14個(gè)核苷酸至約200個(gè)核苷酸。以上方法中使用的合適的限制酶的實(shí)例包括但不限于BsiSI、Hin2I、MseI、Sau3A、RsaI、TspEI、MaeI、NiaIII、DpnI等等。優(yōu)選的甲基敏感酶是HpaII，該酶在非甲基化的CCGG序列上而不是在外胞嘧啶已被甲基化的CCGG序列上識(shí)別和切割。差異甲基化也可以用描述于美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?003009997中的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，該專利公開(kāi)了檢測(cè)方法，該方法利用不是使未甲基化DNA降解就是使甲基化DNA降解的酶，檢測(cè)兩種來(lái)源DNA間差異甲基化的存在。例如可以用只切割未甲基化DNA的甲基敏感酶的混合物例如HpaII、HhaI、MaeI、BstUI和AciI，處理基因組母體DNA以便使未甲基化DNA降解。然后用使甲基化DNA降解的酶例如McrBC(New England Biolabs，Inc.)，處理基因組胎兒DNA。然后通過(guò)扣除雜交法可以選擇性提取胎兒DNA和母體DNA間差異甲基化的序列?；蛘?，母體DNA和胎兒DNA間差異甲基化的評(píng)價(jià)可以通過(guò)二硫化物處理，隨后或是通過(guò)1)測(cè)序，或是通過(guò)2)堿基特異性裂解后進(jìn)行質(zhì)譜分析，描述于von Wintzingerode等，2002，PNAS，997039-44，該文獻(xiàn)通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。為了作為探針用，將已鑒定的甲基多態(tài)性標(biāo)記用本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行標(biāo)記，例如摻入與“報(bào)道分子”連接的核苷酸。本文所用的“報(bào)道分子”是提供分析鑒定信號(hào)的分子，所提供的信號(hào)可檢測(cè)雜交探針。檢測(cè)可以是定性檢測(cè)或是定量檢測(cè)。通常使用的報(bào)道分子包括熒光團(tuán)、酶、生物素、化學(xué)發(fā)光分子、生物發(fā)光分子、洋地黃毒苷、親和素、鏈霉親和素或放射性同位素。通常使用的酶包括辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、葡糖氧化酶和β-半乳糖苷酶等等?？梢詫⒚概c親和素或鏈霉親和素綴合以便和生物素化探針一起使用。同樣，也可將探針與親和素或鏈霉親和素綴合以便和生物素化酶一起使用。和這些酶一起使用的底物，通常選擇相應(yīng)的酶水解會(huì)產(chǎn)生可檢測(cè)到的顏色變化。例如對(duì)硝基苯磷酸適合和堿性磷酸酶報(bào)道分子一起使用；對(duì)于辣根過(guò)氧化物酶，通常使用1，2-苯二胺、5-氨基水楊酸或聯(lián)甲苯胺?？梢杂眉夹g(shù)人員已知的任何方法把報(bào)道分子摻入到DNA探針中，例如用切口平移、引物延伸、隨機(jī)寡核苷酸引發(fā)，通過(guò)3′或5′末端標(biāo)記或通過(guò)其它方法(參見(jiàn)例如Sambrook等，Molecular BiologyA laboratory Approach，Cold SpringHarbor，N.Y.1989)。或者，對(duì)已鑒定的甲基多態(tài)性標(biāo)記不必進(jìn)行標(biāo)記，就可以用來(lái)定量測(cè)定等位基因頻率，利用描述于Ding C.和Cantor C.R.，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100，3059-64中的質(zhì)譜分析技術(shù)，該文獻(xiàn)通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。
母源和父源等位基因頻率的比較
按照本發(fā)明的方法，使用母體血漿DNA來(lái)診斷染色體異常的存在，可首先用選擇性切割母體DNA的酶，例如用對(duì)DNA甲基化狀態(tài)敏感的酶，消化血漿DNA來(lái)富集胎兒DNA。多態(tài)性標(biāo)記，例如本文描述的靠近差異甲基化胎兒DNA區(qū)或在該區(qū)內(nèi)的甲基多態(tài)性標(biāo)記，可以用于測(cè)定父源等位基因或母源等位基因的等位基因頻率。將所測(cè)的等位基因頻率與對(duì)照DNA樣本(例如從無(wú)染色體異常的個(gè)體中獲取的基因組DNA)中存在的等位基因頻率進(jìn)行比較。優(yōu)選對(duì)照DNA是從懷有健康胎兒的孕婦的血漿中分離的。等位基因頻率的差異表明該胎兒DNA中存在染色體異常。因此，在正常的樣本中，其中幾乎全部的母體DNA已被消化，在任何已知的基因座中，母源等位基因和父源等位基因的比率約為1/2或者是母源等位基因和父源等位基因各占50％。如果由于存在了特異等位基因區(qū)的部分或完整的染色體重復(fù)或缺失，而使任何基因座重復(fù)或缺失，那么這個(gè)比率將不同于50％∶50％。染色體異?？赡苁荄NA缺失或重復(fù)，這包括了用多態(tài)性探針檢測(cè)到的DNA序列。缺失或重復(fù)會(huì)導(dǎo)致染色體非整倍性(有或沒(méi)有完整的染色體)，或者說(shuō)它會(huì)導(dǎo)致染色體內(nèi)的缺失或重復(fù)。可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法證實(shí)染色體非整倍性。證實(shí)染色體非整倍性的優(yōu)選方法是羊膜穿刺術(shù)，隨后用熒光原位雜交(FISH)，用吉姆薩染色法的傳統(tǒng)核型分析或用圖譜核型分析(SKY)，這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員通曉的方法。區(qū)域內(nèi)具有例如母體DNA和胎兒DNA間差異甲基化狀態(tài)的任何多態(tài)性標(biāo)記，或者任何其它優(yōu)選是母體DNA和胎兒DNA間的外遺傳基因信息差異，均可用來(lái)檢測(cè)母體血漿中的胎兒DNA的母源和父源的等位基因頻率。因此，差異甲基化區(qū)一經(jīng)確定，技術(shù)人員便可容易借助數(shù)據(jù)庫(kù)，從中挑選出位于差異甲基化DNA區(qū)內(nèi)的一個(gè)，優(yōu)選不止一個(gè)SNP或其它的多態(tài)性標(biāo)記?；蛘撸瑴y(cè)定一些個(gè)體該區(qū)的序列可揭示出新的有用的核酸多態(tài)性。本領(lǐng)域技術(shù)人員通曉測(cè)定等位基因頻率的方法。使用檢測(cè)差異DNA區(qū)的多態(tài)性探針，就可以通過(guò)任一這類方法測(cè)定等位基因頻率。例如，可以將定量標(biāo)記摻入甲基多態(tài)性探針中，該多態(tài)性探針能特異地檢測(cè)母源DNA或是父源DNA。然后將探針同DNA樣本雜交例如用DNA印跡法并定量。適合這種方法的優(yōu)選標(biāo)記是放射性同位素和可以通過(guò)光密度測(cè)定法定量的熒光標(biāo)記。在消化了血漿樣本中的母體核酸后，優(yōu)選用PCR擴(kuò)增存在于已富集的胎兒核酸樣本中的母源等位基因和父源等位基因。然后用下述各種不同的擴(kuò)增方法(包括不同的引物延伸方法)測(cè)定等位基因比率。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和用質(zhì)譜法檢測(cè)引物延伸產(chǎn)物后，優(yōu)選用引物延伸反應(yīng)進(jìn)行分析。本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的用質(zhì)譜分析技術(shù)測(cè)定等位基因頻率的方法描述于Ding C.和Cantor C.R.，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100，3059-64。質(zhì)量陣列系統(tǒng)基于引物延伸產(chǎn)物的襯質(zhì)輔助激光解吸與電離-飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜(MS)分析(Tang，K.等，Proc Natl Acad Sci USA 96，10016-10020(1999))。或者，可用諸如以下的方法進(jìn)行檢測(cè)電泳方法(包括毛細(xì)管電泳)、變性高效液相層析(D-HPLC)、侵入物分析(Third WaveTechnologies，Inc.，Madison，Wis.)、熱測(cè)序技術(shù)(Pyrosequencing，Inc.，Westborough，MA)或固相小量測(cè)序(美國(guó)專利號(hào)6,013,431，Suomalainen等，Mol.Biotechnol.Jun；15(2)123-31，2000)。等位基因頻率是以母源等位基因和父源等位基因分別占總等位基因(母源等位基因加上父源等位基因)的比例形式給出。因?yàn)榈任活l率是一種比率關(guān)系，因此可用不同或是相同的用于檢測(cè)胎兒DNA的等位基因頻率的探針，來(lái)測(cè)定對(duì)照DNA樣本的母源或父源等位基因頻率。優(yōu)選，在同一反應(yīng)中可以分析2、3、4、5-10或者甚至超過(guò)10個(gè)多態(tài)基因座。用幾種多態(tài)性標(biāo)記庫(kù)(pool)，可以在不知道父源等位基因的情況下進(jìn)行這種分析，還可以鑒定至少一種信息標(biāo)記，即基因座，其中胎兒樣本中兩個(gè)等位基因不同，即遺傳自父親的等位基因不同于自母親遺傳的等位基因。優(yōu)選，沿著所需的染色體例如21號(hào)、13號(hào)和18號(hào)染色體的不同部位選擇這些標(biāo)記?；蛘?，首先在母體DNA和胎兒DNA差異甲基化的染色體區(qū)中選擇多態(tài)性標(biāo)記，用這些標(biāo)記對(duì)母源和父源的基因座進(jìn)行基因型分型以確定信息基因座，并且只選擇等位基因有差別的那些標(biāo)記，用以測(cè)定胎兒DNA樣本中的等位基因頻率。在此，母源等位基因或父源等位基因的等位基因頻率差異是指至少3％的差異，優(yōu)選至少10％的差異，更優(yōu)選至少15％的差異。優(yōu)選，血漿DNA樣本中，其中母體DNA已經(jīng)基本上被完全消化，母源等位基因和父源等位基因的正常等位基因比率是50％的母源等位基因和50％的父源等位基因。如果任何已知基因座的這個(gè)等位基因比率有所改變，那么胎兒等位基因所在的染色體區(qū)就可能有重復(fù)或缺失。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，實(shí)施擴(kuò)增步驟進(jìn)一步富集母體血漿樣本中的胎兒DNA。擴(kuò)增是在通過(guò)酶促消化富集血漿DNA中的胎兒DNA之后及在檢測(cè)等位基因頻率/比率之前進(jìn)行。擴(kuò)增可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法(例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或滾環(huán)擴(kuò)增)，用退火至選擇的胎兒DNA區(qū)的引物進(jìn)行。選擇可以退火至待擴(kuò)增的序列的寡核苷酸引物。優(yōu)選，擴(kuò)增是用滾環(huán)方法進(jìn)行的，該方法可使擴(kuò)增反應(yīng)和酶促甲基化步驟結(jié)合，其中經(jīng)過(guò)擴(kuò)增后，胎兒和/或余留母體DNA的甲基化狀態(tài)仍然保存。優(yōu)選，擴(kuò)增步驟后，用另一個(gè)酶促消化步驟進(jìn)一步除去樣本中的任何余留母體DNA。本文描述的用于PCT、滾環(huán)擴(kuò)增和引物延伸反應(yīng)的寡核苷酸引物，可以用本領(lǐng)域眾所周知的方法進(jìn)行合成，包括例如磷酸三酯法(參見(jiàn)Narang，S.A.等，1979，Meth.Enzymol.，6890；和美國(guó)專利號(hào)4,356,270)、磷酸二酯法(Brown等，1979，Meth.Enzymol.，68109)和亞磷酰胺法(Beaucage，1993，Meth.Mol.Biol.，2033)。這些參考文獻(xiàn)中的每個(gè)文獻(xiàn)都通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中?；蛘?，可以掩蔽母體DNA和/或選擇性擴(kuò)增胎兒DNA以增加樣本中的胎兒DNA數(shù)量從而檢測(cè)胎兒DNA中的等位基因比率。一方面，本發(fā)明提供產(chǎn)前診斷胎兒染色體異常的方法。該方法包括下述步驟a)獲取孕婦血漿/血液/血清樣本，并從所述樣本中分離出DNA，b)用只消化未甲基化DNA的甲基敏感酶消化所分離的DNA，c)分離步驟b)中未消化的DNA，d)擴(kuò)增步驟c)中未消化的DNA，同時(shí)用DNA甲基化酶使新生半甲基化DNA甲基化，e)用只消化未甲基化DNA的甲基化敏感酶消化步驟d)擴(kuò)增的DNA，f)用靠近未甲基化胎兒DNA區(qū)的多態(tài)性標(biāo)記測(cè)定父源或母源等位基因頻率；g)將步驟f)的父源或母源等位基因頻率或比率與對(duì)照DNA樣本進(jìn)行比較，其中等位基因頻率的差異表明該胎兒患染色體異常。母體DNA樣本的第一次消化富集了甲基化的胎兒DNA。擴(kuò)增步驟通過(guò)擴(kuò)增再次富集了胎兒DNA，并進(jìn)一步保持了胎兒DNA的甲基化狀態(tài)。將擴(kuò)增步驟和DNA甲基化酶結(jié)合使用，所述DNA甲基化酶對(duì)于半甲基化DNA有特異性(例如Dnmtl)以使新生半甲基化DNA甲基化。由于在第一次消化時(shí)，都富集了甲基化的胎兒DNA，因此在擴(kuò)增過(guò)程中，甲基化酶僅會(huì)使胎兒DNA甲基化而不會(huì)使母體DNA甲基化。在擴(kuò)增過(guò)程中，產(chǎn)生了甲基化的胎兒DNA和任何背景未甲基化的母體DNA。因此，用只消化未甲基化DNA的甲基敏感酶再次消化擴(kuò)增后的DNA樣本。這樣的擴(kuò)增程序是胎兒DNA富集的第二階段。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用的是滾環(huán)擴(kuò)增(BCA)。滾環(huán)擴(kuò)增是一種產(chǎn)生多拷貝序列的等溫?cái)U(kuò)增方法。在體內(nèi)的滾環(huán)DNA復(fù)制中，DNA聚合酶在環(huán)狀模板上延伸引物(Komberg，A.和Baker，T.A.DNA Replication，W.H.Freeman，New York，1991)，所得產(chǎn)物由模板互補(bǔ)序列串聯(lián)連接的拷貝組成。RCA是一種適用于體外DNA擴(kuò)增的方法(Fire，A.和Si-Qun Xu，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，924641-4645；Lui，D.等，J.Am.Chem.Soc.，1996，1181587-1594；Lizardi，P.M.等，Nature Genetics，1998，19225-232；Kool的美國(guó)專利第5,714,320號(hào))。RCA技術(shù)包括線性RCA(LRCA)在本領(lǐng)域眾所周知。任何這類RCA技術(shù)都可用于本發(fā)明。本發(fā)明的方法適合診斷胎兒染色體異常，例如檢測(cè)染色體缺失、重復(fù)和/或非整倍性。本文所描述方法的優(yōu)勢(shì)在于，用得自母親的血漿/血液/血清DNA就可以檢測(cè)染色體異常，所述血漿/血液/血清中只含有較小百分比的胎兒細(xì)胞，因此也只含有較小百分比的胎兒DNA。本發(fā)明提供通過(guò)特異性消化母體DNA來(lái)富集胎兒DNA的方法，并提供一種容易的無(wú)創(chuàng)性方法來(lái)獲取胎兒DNA樣本，并用來(lái)篩選孕婦所懷胎兒的染色體異常。此外，因?yàn)樗龇椒ú蝗Q于染色體的目視檢查，所以就不必須培養(yǎng)胎兒細(xì)胞和/或使胎兒細(xì)胞的細(xì)胞周期同步，因此使對(duì)時(shí)間敏感的產(chǎn)前診斷的篩選迅速。所述方法尤其可用于但不限于診斷染色體非整倍性，例如唐氏綜合征、特納綜合征、13三體綜合征、18三體綜合征和克蘭費(fèi)爾特綜合征。唐氏綜合征的特征為存在3拷貝21號(hào)染色體而不是單拷貝21號(hào)染色體，通常稱之為21三體綜合征。所有21三體綜合征病例中的3-4％是由于羅伯遜易位(Robertsonia Translocation)而引起。在這種情況下，個(gè)別的染色體上發(fā)生兩處斷裂，通常是在第14號(hào)和第21號(hào)染色體。由于遺傳物質(zhì)的重排以致于一些第14號(hào)染色體被額外的第21號(hào)染色體取代。因此當(dāng)染色體的數(shù)量保持正常時(shí)，就會(huì)三份復(fù)制第21號(hào)染色體物質(zhì)。那么這些患兒中的一些也許只有三份重復(fù)的部分第21號(hào)染色體而不是一條完整的染色體，這種情況稱作部分21三體。額外的DNA產(chǎn)生了唐氏綜合征的身體特征和智力特征，包括頭型小而頭枕部扁平；斜眼；眼角處贅皮；小耳、小鼻和小嘴，身材矮小；小手和小腳；不同程度的智力殘疾。13三體和18三體分別是指一條額外的13號(hào)或18號(hào)染色體。13三體綜合征，亦稱巴多綜合征(Patua′s Syndrome)，其特征為出生時(shí)體重輕。在嬰兒早期會(huì)經(jīng)常出現(xiàn)呼吸中斷(窒息、呼吸暫停)，精神發(fā)育遲緩?fù)ǔ］^嚴(yán)重。很多受累患者出現(xiàn)耳聾。前額傾斜的中等小頭(腦過(guò)小、小頭畸形)，呈現(xiàn)出頭頂骨間較寬的接縫和空隙。常見(jiàn)的是大體解剖發(fā)現(xiàn)腦部組織有缺陷，特別是前腦沒(méi)有完全分裂(前腦無(wú)裂畸形)。在幾乎50％的病例中都會(huì)發(fā)現(xiàn)索狀組織突出及其脊膜通過(guò)椎管中的缺損(脊髓脊膜突出)。眼睛通常很小(小眼)、虹膜組織缺損(眼組織先天性缺損)、視網(wǎng)膜發(fā)育不完善(視網(wǎng)膜發(fā)育不良)較常見(jiàn)?？羯暇壓軠\，腭裂通常是斜的。多數(shù)病例都出現(xiàn)唇裂、腭裂，或者唇裂和腭裂同時(shí)出現(xiàn)。耳朵形狀異常，位置異常偏低。18三體綜合征，亦稱愛(ài)德華茲綜合征(Edward syndrome)導(dǎo)致嬰兒偏瘦，虛弱?；颊甙l(fā)育不良，進(jìn)食困難。18三體綜合征引起頭型小，頭后部(枕部)突出。耳位異常偏低。異常小嘴及小顎，胸骨較短。出生時(shí)，這些嬰兒即便是足月出生也顯得較小，哭聲低弱。對(duì)聲音反應(yīng)低下，懷孕史可發(fā)現(xiàn)胎動(dòng)較少。18三體嬰兒中大約90％都有心臟缺陷?；颊呶杖藙?shì)特殊，手指很難完全伸展。通常會(huì)出現(xiàn)關(guān)節(jié)攣縮，胳膊和腿彎曲不松馳。因腳的形狀可將其稱作“搖椅平底足(rocker bottom)”。18三體嬰兒也許會(huì)有脊對(duì)裂(占病例的6％)、眼疾(占病例的10％)、唇裂和腭裂(多數(shù)病例)和聽(tīng)力喪失(多數(shù)病例)。也常見(jiàn)進(jìn)食困難、生長(zhǎng)緩慢、癲癇發(fā)作(第一年里約占病例的30％)、高血壓、腎病和脊柱側(cè)凸(脊柱彎曲)。男嬰中，睪丸未下降到陰囊內(nèi)。特納綜合征(Turner syndrome)，亦稱X單體綜合征，通常是由于丟失一條X染色體所致。活產(chǎn)新生兒中的發(fā)病率為1/3000。這種綜合征的主要特征為身材矮小，頸蹼，無(wú)第二性征或第二性征發(fā)育不全，無(wú)月經(jīng)初潮，主動(dòng)脈縮窄(狹窄)，眼和骨異常。由于相關(guān)異常，通常該病在出生時(shí)就可診斷出，或者是當(dāng)青春期無(wú)月經(jīng)初潮或月經(jīng)初潮推遲及正常第二性征延遲發(fā)育時(shí)做出診斷。本文描述的方法能夠在出生前診斷出該病。克蘭費(fèi)爾特綜合征(Klinefelter syndrome)，是指多一條額外的性染色體的男性，XXY核型代替了通常的男性XY核型。該綜合征的特征為男性有女性型乳房，面部和身體毛發(fā)稀少，小睪丸，精子缺乏。雖然患者無(wú)智力障礙，但是多數(shù)XXY男性有一定程度的語(yǔ)言能力不足。本發(fā)明的方法提供診斷染色體異常和相關(guān)綜合征的無(wú)創(chuàng)性方法。下面將參考以下的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，以下實(shí)施例僅僅是說(shuō)明性的，在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)細(xì)節(jié)進(jìn)行修改。
實(shí)施例
下文是說(shuō)明用母體血漿DNA診斷唐氏綜合征的步驟的實(shí)例。這個(gè)方法適用于任何染色體非整倍性或染色體DNA重復(fù)。在唐氏綜合征中，胎兒有三個(gè)21號(hào)染色體。90％的21三體病例中，胎兒從母親那里獲得兩個(gè)21號(hào)染色體并從父親那里獲得一個(gè)21號(hào)染色體。如下檢測(cè)額外的21號(hào)染色體DNA。篩選21號(hào)染色體中有差異甲基化的DNA區(qū)，即胎兒DNA中甲基化的而母體DNA中沒(méi)有甲基化的DNA區(qū)(主要是外周血細(xì)胞)。已經(jīng)證實(shí)，緊靠差異甲基化DNA區(qū)的多態(tài)性標(biāo)記可以用作母源DNA和父源DNA的標(biāo)記。血漿樣本得自孕婦，而DNA自樣本中分離。用只切割未甲基化DNA序列CCGG的甲基化敏感酶(例如Hpa II)處理所分離的血漿DNA。將酶用來(lái)消化未甲基化的母體DNA，留下的僅是甲基化的胎兒DNA片段?；蛘?，也可以使用只切割甲基化DNA的酶(例如Dpn I，這種酶識(shí)別序列GATC)，隨后的步驟作相應(yīng)調(diào)整?？梢杂^察到21三體中的父源等位基因頻率和正常個(gè)體中的父源等位基因頻率之間的顯著性差異(見(jiàn)下表)。表中，等位基因A是母源特有的，而等位基因B是父源特有的。在下表中，如果父源等位基因頻率小于對(duì)照的，就表明有唐氏綜合征。 可以用本領(lǐng)域已知的方法例如羊膜穿刺術(shù)，證實(shí)染色體異常應(yīng)歸于由一條額外的21號(hào)染色體代表的染色體非整倍性。如果酶的消化效率低于100％，仍會(huì)觀察到等位基因頻率的差異，但不是16.7％的差異(如表中說(shuō)明)，觀察到的差異可能是在5-10％的范圍之間，因此優(yōu)選，將對(duì)照基因座(正常個(gè)體中的C/D等位基因或非-非整倍性基因座，見(jiàn)下表)用來(lái)提供對(duì)照。下表對(duì)此作了說(shuō)明 在沒(méi)有100％消化的情況下，為了進(jìn)一步富集胎兒DNA，上述方法也可以結(jié)合附加的擴(kuò)增方案。假定使用在胎兒DNA中是甲基化的而在母體DNA中是沒(méi)有甲基化的DNA區(qū)。多數(shù)母體DNA要用上述的甲基化敏感酶進(jìn)行消化。這是富集胎兒DNA的第一個(gè)步驟。然后通過(guò)等溫機(jī)理(例如滾環(huán)擴(kuò)增)擴(kuò)增母體DNA和胎兒DNA。同時(shí)，使用對(duì)半甲基化DNA有特異性的DNA甲基化酶(例如Dnmtl)使新生半甲基化DNA甲基化。由于最初只有胎兒DNA是甲基化的，因此甲基化酶將只能使擴(kuò)增過(guò)程中的胎兒DNA甲基化。結(jié)果，就產(chǎn)生了甲基化的胎兒DNA和未甲基化DNA。然后再用消化未甲基化母體DNA的甲基化敏感酶(例如HpaII)，消化經(jīng)擴(kuò)增的樣本。這是富集胎兒DNA的第二個(gè)步驟。這個(gè)步驟后，留下的絕大多數(shù)DNA就都是胎兒DNA了。在將來(lái)測(cè)定DNA數(shù)量時(shí)，這就等同于100％Hpa II消化。本文描述的所有參考文獻(xiàn)都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)定DNA區(qū)內(nèi)的染色體異常的產(chǎn)前診斷方法，所述方法包括下述步驟(a)獲取孕婦血漿樣本；(b)用酶消化所述血漿樣本中的DNA，所述酶選擇性和基本上完全消化母體DNA，從而獲得富集了胎兒DNA區(qū)的DNA樣本；和(c)用靠近步驟(b)樣本中的胎兒DNA區(qū)或在該區(qū)內(nèi)的多態(tài)性標(biāo)記，測(cè)定父源或母源等位基因頻率，其中與不包含染色體異常的正常對(duì)照相比，等位基因頻率與50％的父源等位基因和50％的母源等位基因之間有差異，就表明有染色體異常。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述DNA是從消化前的血漿樣本中分離的。
3.權(quán)利要求1的方法，其中將步驟(c)的父源或母源等位基因頻率與至少一個(gè)位于染色體上的內(nèi)部對(duì)照進(jìn)行比較，內(nèi)部對(duì)照的重復(fù)或缺失并不是診斷的目標(biāo)，其中母源等位基因和父源等位基因數(shù)量相同，其中比率偏離了內(nèi)部對(duì)照，就表明存在染色體異常。
4.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括在步驟(a)之后但在步驟(c)之前所進(jìn)行的DNA擴(kuò)增步驟。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟(b)的酶是甲基敏感酶。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述甲基敏感酶只在未甲基化的DNA識(shí)別位點(diǎn)上消化，并且其中用靠近胎兒甲基化DNA區(qū)或在該區(qū)內(nèi)的多態(tài)性標(biāo)記，測(cè)定母源或父源等位基因頻率。
7.權(quán)利要求3的方法，其中所述甲基敏感酶只在甲基化的DNA識(shí)別位點(diǎn)上消化，并且其中用靠近胎兒未甲基化DNA區(qū)或在該區(qū)內(nèi)的多態(tài)性標(biāo)記，測(cè)定母源或父源等位基因頻率。
8.一種染色體異常的產(chǎn)前診斷方法，所述方法包括下述步驟(a)獲取孕婦血漿樣本；(b)用只消化未甲基化DNA的甲基敏感酶消化所述血漿樣本中存在的核酸；(c)任選分離步驟(b)中未消化的核酸；(d)擴(kuò)增步驟(b)或步驟(c)中未消化的核酸，同時(shí)用核酸甲基化酶使新生半甲基化核酸甲基化；(e)用只消化未甲基化核酸的甲基敏感酶消化步驟(d)擴(kuò)增的核酸；和(f)用靠近胎兒未甲基化核酸區(qū)或在該區(qū)內(nèi)的多態(tài)性標(biāo)記，測(cè)定父源或母源等位基因頻率，其中等位基因頻率與50％的母源等位基因和50％的父源等位基因之間有差異，就表明有染色體異常。
9.權(quán)利要求8的方法，其中將步驟(f)的父源或母源等位基因頻率與對(duì)照核酸樣本進(jìn)行比較，其中與對(duì)照樣本中該比率有差異，就表明有染色體異常。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述核酸是DNA。
11.權(quán)利要求8的方法，其中所述核酸是從消化前的血漿樣本中分離的。
12.權(quán)利要求1或8的方法，其中所述染色體異常是DNA重復(fù)。
13.權(quán)利要求1或8的方法，其中所述染色體異常是DNA缺失。
14.權(quán)利要求1或8的方法，其中所述染色體異常是非整倍性。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述非整倍性選自21三體、18三體和13三體。
16.一種診斷胎兒染色體異常的方法，所述方法包括下述步驟(a)獲取孕婦血漿樣本；(b)選擇性處理所述血漿樣本以使樣本富集至少一個(gè)胎兒核酸區(qū)；(c)用靠近步驟(b)樣本中至少一個(gè)胎兒核酸區(qū)或在該區(qū)內(nèi)的至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記，測(cè)定父源或母源等位基因頻率；和(d)將步驟(c)的父源或母源等位基因頻率與對(duì)照DNA樣本進(jìn)行比較，其中等位基因頻率與50％的父源等位基因和50％的母源等位基因之間有差異，就表明有染色體異常。
17.一種診斷胎兒染色體異常的方法，所述方法包括下述步驟(a)獲取孕婦血漿樣本；(b)選擇性處理所述血漿樣本以使樣本富集至少一個(gè)胎兒核酸區(qū)；(c)用靠近步驟(b)樣本中至少一個(gè)胎兒核酸區(qū)或在該區(qū)內(nèi)的至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記，測(cè)定父源或母源等位基因頻率；(d)將步驟(c)的父源或母源等位基因頻率與其中母源和父源等位基因以預(yù)定量存在的對(duì)照DNA樣本進(jìn)行比較，其中與對(duì)照相比，等位基因頻率與50％的父源等位基因和50％的母源等位基因之間有差異，就表明有染色體異常。
18.一種用于產(chǎn)前診斷染色體異常的試劑盒，所述試劑盒包括甲基化敏感酶；至少一對(duì)核酸擴(kuò)增引物，該核酸擴(kuò)增引物能夠退火并因此擴(kuò)增位點(diǎn)側(cè)翼區(qū)，該位點(diǎn)包含至少一個(gè)多態(tài)基因座，該多態(tài)基因座在母體血漿中存在的胎兒DNA和母體DNA中差異甲基化區(qū)內(nèi)；至少一種引物或探針，以便檢測(cè)至少一個(gè)多態(tài)基因座中的等位基因；和說(shuō)明書手冊(cè)，指導(dǎo)使用者進(jìn)行下述步驟獲取孕婦血漿樣本，用甲基化敏感酶選擇性消化所述血漿樣本中存在的核酸以富集樣本中的胎兒核酸，用擴(kuò)增引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增，檢測(cè)已富集了胎兒核酸的樣本中存在的等位基因，解釋結(jié)果，如果基因座中兩個(gè)不同的等位基因的比率偏離了等位基因以等量存在的對(duì)照，就表明該胎兒患染色體異常。
19.權(quán)利要求18的試劑盒，所述試劑盒還包括一組對(duì)照核酸，其中所述對(duì)照包括從懷有攜帶了已知的染色體異常的胎兒的孕婦中分離的核酸和從懷有無(wú)染色體異常的胎兒的孕婦中分離的核酸。
20.權(quán)利要求19的試劑盒，所述試劑盒還包括至少一對(duì)擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物或探針的內(nèi)部對(duì)照，其中所述引物和/或探針選自在母體血漿中存在的胎兒DNA和母體DNA中被差異甲基化的但存在于重復(fù)和缺失罕見(jiàn)的染色體上的核酸區(qū)，以便提供內(nèi)部對(duì)照。
21.權(quán)利要求19的試劑盒，其中所述產(chǎn)前診斷是為了診斷13號(hào)、18號(hào)或21號(hào)染色體重復(fù)，而內(nèi)部對(duì)照位于任何其它的不是13號(hào)、18號(hào)或21號(hào)染色體的常染色體上。
全文摘要
染色體異常是造成大量出生缺陷(包括精神發(fā)育遲緩)的主要原因。本發(fā)明涉及基于對(duì)母親血樣的分析，無(wú)創(chuàng)性快速產(chǎn)前診斷染色體異常的方法。本發(fā)明利用母親和胎兒之間DNA的差異，例如其甲基化狀態(tài)的差異，作為富集母體血漿樣本中的胎兒DNA的方法。本發(fā)明所述方法可以用來(lái)檢測(cè)染色體DNA缺失和重復(fù)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法用于診斷染色體非整倍性及相關(guān)疾病，例如唐氏綜合征和特納綜合征。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1930303SQ200480036100
公開(kāi)日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2004年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月8日
發(fā)明者C·R·坎托爾, C·丁 申請(qǐng)人:波士頓大學(xué)信托人