本申請要求2014年4月1日遞交的美國臨時申請?zhí)?1/973,348和2014年4月4日遞交的美國臨時申請?zhí)?1/975,699的權(quán)益，這些申請通過引用并入本文。

背景技術(shù)：

對稀有細(xì)胞諸如循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的研究可以有助于疾病的檢測、診斷和預(yù)后以及有助于臨床護理和藥物發(fā)現(xiàn)。例如，循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離和分析可能對確定腫瘤的起源或理解腫瘤轉(zhuǎn)移的過程很重要。由于稀有細(xì)胞在血液樣品中相對低的豐度(abundance)，所以可能難于捕獲它們。稀有細(xì)胞，像循環(huán)腫瘤細(xì)胞，可能是脆弱的。用于分離稀有細(xì)胞的多種技術(shù)(諸如免疫磁分離、基于細(xì)胞大小的過濾、抗體功能化微流體裝置、纖維光學(xué)陣列掃描技術(shù)、介電泳、被動細(xì)胞分類、陰性選擇、總體決策整除排名(整體決策等份排序，ensemble-decision aliquot ranking))可能具有低的檢測限度和/或結(jié)果的再現(xiàn)性變化。因此，存在對用于以與檢測癌癥和其他疾病中的隨后的分子分析和臨床用途相容的形式分離稀有細(xì)胞諸如CTC的系統(tǒng)和方法的需要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本公開涉及用于分離感興趣的靶顆粒(諸如循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)、循環(huán)稀有細(xì)胞(CRC)、干細(xì)胞(例如腫瘤干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞)、胎兒細(xì)胞、細(xì)菌、病毒、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等)的方法、組合物以及系統(tǒng)。所分離的靶細(xì)胞可能是有活力的并且對體外和體內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)和生長、細(xì)胞保存、檢測、分子分析和臨床應(yīng)用有用。這些系統(tǒng)和方法可以有助于癌癥診斷、預(yù)后以及治療。

因此，在一方面，提供了一種方法。該方法包括：(a)使用微流體裝置，選擇性地使來自從受試者得來的異質(zhì)細(xì)胞樣品的稀有細(xì)胞富集，其中微流體裝置包括無污組合物(無結(jié)垢組合物，non-fouling composition)并且對稀有細(xì)胞具有至少40％的捕獲效率；以及(b)從微流體裝置釋放所捕獲的稀有細(xì)胞，同時維持至少40％的所釋放的稀有細(xì)胞有活力。

在一些實施方式中，該方法還包括對所釋放的稀有細(xì)胞進(jìn)行分析，從而對受試者的病癥的存在、缺乏、嚴(yán)重程度、轉(zhuǎn)移、起源組織進(jìn)行評估。在一些實施方式中，病癥為癌癥并且異質(zhì)細(xì)胞樣品為血液樣品。在一些實施方式中，病癥為良性疾病。在一些實施方式中，稀有細(xì)胞為CTC。在一些實施方式中，分析包括計數(shù)CTC、計數(shù)有活力的CTC或?qū)TC執(zhí)行分子分析試驗(測定)。在一些實施方式中，病癥為癌癥并且評估嚴(yán)重程度包括確定癌癥階段。在一些實施方式中，癌癥階段包括發(fā)育不良、階段I、階段II、階段III或階段IV癌癥。在一些實施方式中，該方法還包括在第二時間點重復(fù)步驟(a)和步驟(b)。在一些實施方式中，分析包括將所釋放的有活力CTC的數(shù)目與截止值(臨界值，截斷值，判定值，cutoff value)進(jìn)行比較。在一些實施方式中，截止值為3個稀有細(xì)胞，并且血液樣品具有等于或多達(dá)6mL的體積。在一些實施方式中，血液樣品具有等于或多達(dá)2mL的體積。在一些實施方式中，評估嚴(yán)重程度包括確定癌癥階段，并且其中，癌癥階段包括發(fā)育不良、階段I、階段II、階段III或階段IV癌癥。在一些實施方式中，該方法還包括基于癌癥階段為受試者選擇藥物療法。在一些實施方式中，評估確定了發(fā)育不良或階段I癌癥的存在或缺乏，并且發(fā)生在影像診斷之前。在一些實施方式中，影像診斷包括超聲(超聲波)、CT、MRI、PET或觸診分析。在一些實施方式中，病癥為結(jié)腸疾病、GI(胃腸道)疾病或卵巢/子宮內(nèi)膜疾病，并且其中，分析所釋放的稀有細(xì)胞包括利用DAPI、抗CK20以及抗CD45對所釋放的稀有細(xì)胞進(jìn)行染色。在一些實施方式中，病癥為乳腺疾病或前列腺疾病，并且其中對所釋放的稀有細(xì)胞的分析包括利用抗PSA和抗PSMA對所釋放的稀有細(xì)胞進(jìn)行染色。在一些實施方式中，病癥為乳腺疾病，并且其中分析所釋放的稀有細(xì)胞包括利用選自由抗CK7、抗HER2、抗ER及抗PR組成的組的一種或多種標(biāo)記物對所釋放的稀有細(xì)胞進(jìn)行染色。在一些實施方式中，病癥為肺部疾病，并且其中分析所釋放的稀有細(xì)胞包括利用選自由抗CK7、抗TTF1以及抗EGFR組成的組的一種或多種標(biāo)記物對所釋放的稀有細(xì)胞進(jìn)行染色。在一些實施方式中，病癥為癌癥，并且其中分析所釋放的稀有細(xì)胞包括利用抗pan-CK或抗CK18對稀有細(xì)胞進(jìn)行染色。在一些實施方式中，病癥為微轉(zhuǎn)移。

在另一方面，提供了一種對受試者的癌癥起源進(jìn)行評估的方法。該方法包括：使用微流體裝置，選擇性地使來自異質(zhì)細(xì)胞樣品的稀有細(xì)胞富集；利用抗體組對所富集的稀有細(xì)胞進(jìn)行染色，其中抗體組包括兩種或多種不同類型的抗體；以及基于染色結(jié)果，預(yù)測稀有細(xì)胞的癌癥起源。

在一些實施方式中，預(yù)測癌癥起源包括1)確定癌(carcinoma)細(xì)胞的存在以及2)如果癌細(xì)胞存在，則確定癌癥起源。在一些實施方式中，抗體組包括抗panCK、抗CK18、抗CK7、抗TTF-1、抗CK20、抗CDX-2、抗PSA或抗PSMA。在一些實施方式中，癌癥起源包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、前列腺癌或其他起源的癌癥。在一些實施方式中，異質(zhì)細(xì)胞樣品為具有等于或多達(dá)6mL體積的血液樣品。在一些實施方式中，血液樣品具有等于或多達(dá)2mL的體積。在一些實施方式中，該方法還包括基于癌癥的進(jìn)展為受試者選擇藥物療法。

在另一方面，提供了一種釋放在微流體表面上所捕獲的靶細(xì)胞的方法。該方法包括：使空氣泡沫流過微流體表面，其中微流體表面包括脂質(zhì)雙層并且在脂質(zhì)雙層的頂層上捕獲了靶細(xì)胞；以及使頂層脫離，從而釋放在頂層上所捕獲的靶細(xì)胞。

在一些實施方式中，所捕獲的靶細(xì)胞以至少40％的效率和40％的活力進(jìn)行釋放。在一些實施方式中，該方法還包括1)利用抗體組對該靶細(xì)胞進(jìn)行染色以及2)基于染色結(jié)果識別起源源頭(本源)。在一些實施方式中，抗體組包括抗panCK、抗CK18、抗CK7、抗TTF-1、混合有抗CDX-2的抗CK20、混合有抗PSMA的抗PSA中的至少兩種。在一些實施方式中，該方法還包括分析所釋放的靶細(xì)胞，從而對受試者的病癥的存在、缺乏、嚴(yán)重程度、轉(zhuǎn)移、起源組織進(jìn)行評估。

在另一方面，提供了一種釋放包括無污組合物的在微流體表面上所捕獲的靶細(xì)胞的方法。該方法包括：影響無污組合物的狀態(tài)；以及釋放靶細(xì)胞，其中靶細(xì)胞由于無污組合物的所受影響的狀態(tài)而被釋放。

在另一方面，提供了一種對受試者的病癥的存在、缺乏或嚴(yán)重程度進(jìn)行評估的方法。該方法包括：執(zhí)行診斷測試，其中診斷測試具有在0.75或更大的曲線之下面積(區(qū)域)的ROC曲線。

在一些實施方式中，該病癥為癌癥。在一些實施方式中，該病癥為階段I或階段I前癌癥。在一些實施方式中，該方法還包括基于ROC曲線將血液樣品中的CTC細(xì)胞計數(shù)與截止值進(jìn)行比較，從而評估該病癥的存在或缺乏。

在另一方面，提供了一種對受試者的病癥的存在、缺乏或嚴(yán)重程度進(jìn)行評估的方法。該方法包括：使用微流體裝置，選擇性地使來自具有等于或少于7mL體積的患者血液樣品的稀有細(xì)胞富集；以及分析稀有細(xì)胞，從而評估受試者的病癥的存在或嚴(yán)重程度。

在一些實施方式中，患者血液樣品具有等于或少于2mL的體積。在一些實施方式中，該病癥為發(fā)育不良或階段I癌癥。在一些實施方式中，分析稀有細(xì)胞包括將患者血液樣品中的稀有細(xì)胞數(shù)目和截止值進(jìn)行比較，其中截止值基于具有0.75或更多的ROC曲線下面積的測試而生成。在一些實施方式中，稀有細(xì)胞為CTC，并且其中該病癥為癌癥。

在另一方面，提供了一種確定受試者的發(fā)育不良或階段I癌癥的存在或缺乏的方法。該方法包括：使用微流體裝置，選擇性地使來自從受試者得來的異質(zhì)細(xì)胞樣品的稀有細(xì)胞富集；以及確定所富集的稀有細(xì)胞的數(shù)目并將該數(shù)目與截止值進(jìn)行比較，從而確定受試者的發(fā)育不良或階段I癌癥的存在或缺乏。

在一些實施方式中，稀有細(xì)胞為CTC。在一些實施方式中，確定存在或缺乏是在成像之前進(jìn)行的。在一些實施方式中，成像不能檢測或確定發(fā)育不良或階段I癌癥的存在或缺乏。

在另一方面，提供了一種評估受試者的病癥的存在或嚴(yán)重程度的方法。該方法包括：使用微流體裝置，以至少40％的捕獲效率選擇性地使來自從受試者得來的異質(zhì)細(xì)胞的稀有細(xì)胞富集；從微流體裝置釋放稀有細(xì)胞，同時維持至少40％的稀有細(xì)胞有活力；以及分析所釋放的稀有細(xì)胞，從而評估受試者的病癥的存在或嚴(yán)重程度。

在一些實施方式中，利用由ROC曲線下方面積所限定的敏感性和特異性對病癥的存在或嚴(yán)重程度進(jìn)行評估，其中，ROC曲線下方的面積為0.75或更大。在一些實施方式中，該病癥為癌癥。在一些實施方式中，該病癥為良性疾病。在一些實施方式中，稀有細(xì)胞為CTC。在一些實施方式中，分析所釋放的稀有細(xì)胞涉及計數(shù)CTC、計數(shù)有活力的CTC以及對CTC執(zhí)行分子分析試驗。在一些實施方式中，該病癥為癌癥，評估嚴(yán)重程度包括確定癌癥階段。在一些實施方式中，癌癥階段包括發(fā)育不良、階段I、階段II、階段III或階段IV癌癥。在一些實施方式中，該方法還包括1)基于曲線下方的面積生成了截止值以及2)基于該截止值確定該病癥的存在或嚴(yán)重程度。在一些實施方式中，確定該病癥的存在或嚴(yán)重程度包括將截止值與異質(zhì)細(xì)胞樣品內(nèi)的所釋放的稀有細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行比較。在一些實施方式中，截止值為3個或更多個稀有細(xì)胞，并且異質(zhì)細(xì)胞樣品為具有等于或少于2mL體積的患者血液樣品。在一些實施方式中，該病癥為癌癥或疾病。在一些實施方式中，評估嚴(yán)重程度包括確定癌癥階段，并且其中癌癥階段包括發(fā)育不良、階段I、階段II、階段III或階段IV癌癥。在一些實施方式中，異質(zhì)細(xì)胞樣品為具有等于或少于2mL體積的患者血液樣品。在一些實施方式中，該病癥為結(jié)腸疾病并且其中分析所釋放的稀有細(xì)胞包括利用DAPI、CK20以及CD45對稀有細(xì)胞進(jìn)行染色。在一些實施方式中，該病癥為乳腺或前列腺疾病，并且其中分析所釋放的稀有細(xì)胞包括利用抗PSA和/或抗PSMA對稀有細(xì)胞進(jìn)行染色。在一些實施方式中，該病癥為癌癥，并且其中分析所釋放的稀有細(xì)胞包括利用抗pan-CK或抗CK18對稀有細(xì)胞進(jìn)行染色。在一些實施方式中，該病癥為微轉(zhuǎn)移。在一些實施方式中，該病癥為癌癥，并且其中該病癥的存在在通過包括CT、PET、超聲或MRI的成像技術(shù)無法檢測的階段被確定。

在另一方面，提供了一種評估受試者的癌癥起源的方法。該方法包括：使用微流體裝置，選擇性地使來自從受試者得來的異質(zhì)細(xì)胞樣品的稀有細(xì)胞富集；從微流體裝置釋放稀有細(xì)胞；利用抗體組對稀有細(xì)胞進(jìn)行染色，其中抗體組包括兩種或更多種不同類型的抗體；以及基于染色結(jié)果預(yù)測稀有細(xì)胞的癌癥起源。

在一些實施方式中，預(yù)測癌癥起源包括1)確定癌細(xì)胞的存在以及2)如果存在癌細(xì)胞，則確定癌癥起源。在一些實施方式中，抗體組包括抗panCK、抗CK18、抗CK7、抗TTF-1、抗CK20、抗CDX-2、抗PSA或抗PSMA。在一些實施方式中，癌癥起源包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、前列腺癌或其他起源的癌癥。在一些實施方式中，從來自等于或少于2mL的量的患者的外周血收集稀有細(xì)胞。

在另一方面，提供了一種釋放在微流體表面上所捕獲的靶細(xì)胞的方法。該方法包括：使包括氣泡的流體流過微流體表面，其中微流體表面包括脂質(zhì)雙層和選擇性地結(jié)合靶細(xì)胞的結(jié)合部分，并且其中該結(jié)合部分偶聯(lián)至脂質(zhì)雙層的頂層；以及使脂質(zhì)雙層的頂層脫離，從而使偶聯(lián)至頂層的結(jié)合部分脫離，釋放了與結(jié)合部分結(jié)合的靶細(xì)胞。

在一些實施方式中，結(jié)合部分以至少40％的效率結(jié)合靶細(xì)胞。在一些實施方式中，釋放靶細(xì)胞以至少40％的效率釋放該細(xì)胞。在一些實施方式中，所釋放的靶細(xì)胞具有至少40％的活力。在一些實施方式中，該方法還包括確定靶細(xì)胞的起源源頭(本源)。在一些實施方式中，確定起源源頭包括1)利用抗體組對靶細(xì)胞進(jìn)行染色以及2)基于染色結(jié)果識別起源源頭。在一些實施方式中，抗體組包括抗panCK、抗CK18、抗CK7、抗TTF-1、混合有抗CDX-2的抗CK20、混合有抗PSMA的抗PSA中的至少兩種。在一些實施方式中，泡沫組合物包括氣泡，該氣泡的大部分具有小于微流體表面的寬度或微流體通道的高度的直徑。

在另一方面，本公開提供了一種具有大于1毫升的體積的泡沫組合物，其中該泡沫組合物包括氣泡，其中大于50％的氣泡包括從10微米到100微米的直徑，并且其中大于80％的體積的泡沫組合物為空氣。在一些實施方式中，大于60％的氣泡包括從10微米到100微米的直徑。在一些實施方式中，大于70％的氣泡包括從10微米到100微米的直徑。在一些實施方式中，大于80％的氣泡包括從10微米到100微米的直徑。在一些實施方式中，大于90％的氣泡包括從10微米到100微米的直徑。在一些實施方式中，泡沫組合物包括大于2毫升的體積。在一些實施方式中，泡沫組合物包括大于3毫升的體積。在一些實施方式中，泡沫組合物包括大于4毫升的體積。在一些實施方式中，泡沫組合物包括大于5毫升的體積。在一些實施方式中，泡沫組合物為等壓的(等滲的/等滲壓的，isotonic)。在一些實施方式中，泡沫組合物包括牛血清白蛋白(BSA)。在一些實施方式中，泡沫組合物包括細(xì)胞培養(yǎng)基。在一些實施方式中，泡沫組合物包括與細(xì)胞培養(yǎng)物相容的含有蛋白質(zhì)的溶液。在一些實施方式中，泡沫組合物中的液體與空氣的比率為至少1.5:1。在一些實施方式中，泡沫組合物中的液體與空氣的比率為至少2:1。在一些實施方式中，泡沫組合物中的液體與空氣的比率為至少3:1。在一些實施方式中，泡沫組合物中的液體與空氣的比率為至少4:1。在一些實施方式中，泡沫組合物中的液體與空氣的比率為至少5:1。在一些實施方式中，大于90％的體積的泡沫組合物為空氣。在一些實施方式中，大于95％的體積的泡沫組合物為空氣。

在一方面，本公開提供了一種從表面除去顆粒的方法，該方法包括：使泡沫組合物流過表面，并從表面除去顆粒，其中泡沫組合物包括氣泡，并且其中至少50％的氣泡包括從10微米到100微米的直徑。在一些實施方式中，流動包括至少2.5mm/s的線速度。在一些實施方式中，流動包括至多4mm/s的線速度。在一些實施方式中，流動包括從2.6mm/s至3.9mm/s的線速度。在一些實施方式中，流動包括至少0.5mm/s的線速度。在一些實施方式中，流動包括至多4mm/s的線速度。在一些實施方式中，流動包括從0.5mm/s至4mm/s的線速度。在一些實施方式中，流動除去了大于60％的無污組合物。在一些實施方式中，流動除去了大于70％的無污組合物。在一些實施方式中，流動除去了大于80％的無污組合物。在一些實施方式中，流動除去了大于90％的無污組合物。在一些實施方式中，表面包括一組微結(jié)構(gòu)。在一些實施方式中，表面包括無污組合物。在一些實施方式中，無污組合物包括聚合物和結(jié)合部分。在一些實施方式中，無污組合物包括脂質(zhì)層和結(jié)合部分。在一些實施方式中，結(jié)合部分非共價地偶聯(lián)至無污組合物。在一些實施方式中，結(jié)合部分共價地偶聯(lián)至無污組合物。在一些實施方式中，結(jié)合部分嵌入無污組合物中。在一些實施方式中，結(jié)合部分偶聯(lián)至表面。在一些實施方式中，脂質(zhì)層包括單層。在一些實施方式中，脂質(zhì)層包括雙層。在一些實施方式中，脂質(zhì)層包括脂質(zhì)體。在一些實施方式中，脂質(zhì)層包括脂質(zhì)單層、雙層或脂質(zhì)體中的兩種或更多種。在一些實施方式中，結(jié)合部分包括抗EpCAM抗體。在一些實施方式中，結(jié)合部分包括抗HER2抗體。在一些實施方式中，結(jié)合部分包括抗體。在一些實施方式中，表面包括結(jié)合細(xì)胞。在一些實施方式中，結(jié)合細(xì)胞通過泡沫組合物被除去。在一些實施方式中，結(jié)合細(xì)胞通過結(jié)合部分結(jié)合至表面。在一些實施方式中，細(xì)胞為稀有細(xì)胞。在一些實施方式中，細(xì)胞為循環(huán)腫瘤細(xì)胞。在一些實施方式中，無污組合物阻止了至少50％的非靶顆粒的結(jié)合。在一些實施方式中，無污組合物阻止了至少60％的非靶顆粒的結(jié)合。在一些實施方式中，無污組合物阻止了至少70％的非靶顆粒的結(jié)合。在一些實施方式中，無污組合物阻止了至少80％的非靶顆粒的結(jié)合。在一些實施方式中，無污組合物阻止了至少90％的非靶顆粒的結(jié)合。在一些實施方式中，通過用于生成泡沫組合物的方法來生成泡沫組合物，其包括：以至少1.5:1的比率組合液體溶液和空氣；以及渦旋(vortexing)液體溶液和空氣高達(dá)30秒，從而生成氣泡，其中，至少50％的氣泡包括從10微米到100微米的直徑。在一些實施方式中，通過用于生成泡沫組合物的方法來生成泡沫組合物，其包括：將溶液引入第一容器中，將溶液轉(zhuǎn)移到第二容器中，其中第二容器包括空氣，并且其中轉(zhuǎn)移通過孔發(fā)生，通過孔將溶液從第二容器轉(zhuǎn)移到第一容器中，以及生成泡沫，其中泡沫組合物包括氣泡，并且其中至少50％的氣泡包括從10微米到100微米的直徑。在一些實施方式中，通過用于生成泡沫組合物的方法來生成泡沫組合物，其包括：通過膜汲取溶液，其中溶液包括至少1:1.5空氣比液體的比率，其中汲取產(chǎn)生了氣泡，以及其中至少50％的氣泡包括從10微米到100微米的直徑。在一些實施方式中，表面包括微流體通道。

在一方面，本公開提供了一種用于生成泡沫組合物的方法，其包括：以至少1.5:1的比率組合液體溶液和空氣，渦旋液體溶液和空氣高達(dá)30秒，從而生成氣泡，其中至少50％的氣泡包括從10微米到100微米的直徑。在一些實施方式中，比率為至少2:1。在一些實施方式中，比率為至少3:1。在一些實施方式中，比率為至少4:1。在一些實施方式中，比率為至少5:1。在一些實施方式中，至少50％的氣泡包括從10微米到100微米的直徑。在一些實施方式中，至少60％的氣泡包括從10微米到100微米的直徑。在一些實施方式中，至少70％的氣泡包括從10微米到100微米的直徑。在一些實施方式中，至少80％的氣泡包括從10微米到100微米的直徑。在一些實施方式中，至少90％的氣泡包括從10微米到100微米的直徑。

在一方面，本公開提供了一種用于生成泡沫組合物的方法，其包括：將溶液引入第一容器中，將溶液轉(zhuǎn)移到第二容器中，其中第二容器包括空氣，并且其中轉(zhuǎn)移通過孔發(fā)生；通過孔將溶液從第二容器轉(zhuǎn)移到第一容器中；以及生成泡沫，其中泡沫包括氣泡，并且其中至少50％的氣泡包括從10微米到100微米的直徑。在一些實施方式中，重復(fù)該方法。在一些實施方式中，重復(fù)該方法至少5次。在一些實施方式中，重復(fù)該方法至少10次。在一些實施方式中，容器包括注射器。在一些實施方式中，孔包括2毫米的直徑。在一些實施方式中，孔包括至多100微米的直徑。在一些實施方式中，至少60％的氣泡包括從10微米到100微米的直徑。在一些實施方式中，至少70％的氣泡包括從10微米到100微米的直徑。在一些實施方式中，至少80％的氣泡包括從10微米到100微米的直徑。在一些實施方式中，至少90％的氣泡包括從10微米到100微米的直徑。在一些實施方式中，溶液與空氣的比率為至少1.5:1。在一些實施方式中，溶液與空氣的比率為至少2:1。在一些實施方式中，溶液與空氣的比率為至少3:1。在一些實施方式中，溶液與空氣的比率為至少4:1。在一些實施方式中，溶液與空氣的比率為至少5:1。

在一方面，本公開提供了一種用于生成泡沫組合物的方法，其包括：通過膜汲取溶液，其中溶液包括至少1:1.5的空氣與液體的比率，其中，汲取產(chǎn)生了氣泡，并且其中至少50％的氣泡包括從10微米到100微米的直徑。在一些實施方式中，膜包括細(xì)孔膜(微孔膜，fine pore membrane)。在一些實施方式中，膜包括多個孔。在一些實施方式中，該孔包括2毫米的直徑。在一些實施方式中，膜包括氣石(airstone)。在一些實施方式中，比率為至少2:1。在一些實施方式中，比率為至少3:1。在一些實施方式中，比率為至少4:1。在一些實施方式中，比率為至少5:1。在一些實施方式中，至少60％的氣泡包括從10微米到100微米的直徑。在一些實施方式中，至少70％的氣泡包括從10微米到100微米的直徑。在一些實施方式中，至少80％的氣泡包括從10微米到100微米的直徑。在一些實施方式中，至少90％的氣泡包括從10微米到100微米的直徑。

在一方面，本公開提供了一種用于生成泡沫組合物的方法，其包括：泵送包括含有蛋白質(zhì)溶液的溶液，其中所述泵送產(chǎn)生了氣泡，以及其中至少50％的所述氣泡包括從10微米到100微米的直徑。在一些實施方式中，泵送只發(fā)生一次。在一些實施方式中，泵送將所述含有蛋白質(zhì)的溶液與大氣混合。

本公開的另一方面的特征在于用于分離樣品中的靶細(xì)胞的細(xì)胞捕獲/釋放平臺。該平臺包括脂質(zhì)共軛體和結(jié)合劑，該脂質(zhì)共軛體包括潤滑組合物，該結(jié)合劑特異地結(jié)合靶細(xì)胞，并且其中脂質(zhì)共軛體和結(jié)合劑通過連接體(接頭，連接物)連接。在一些實施方式中，脂質(zhì)共軛體被固定到基底(基質(zhì))上。在一些實施方式中，該基底為平面裝置。在一些實施方式中，該基底為微流體裝置。

本公開的另一方面的特征在于用于分離樣品中的靶細(xì)胞的方法。該方法包括以下步驟：(a)利用包括潤滑組合物的脂質(zhì)共軛體和特異地結(jié)合靶細(xì)胞的結(jié)合劑來接觸樣品，以及其中潤滑共軛體和結(jié)合劑通過連接器連接；(b)洗掉未結(jié)合的細(xì)胞；以及(c)釋放結(jié)合細(xì)胞，從而分離靶細(xì)胞。

本文所描述的樣品可以為體液、體液的稀釋物、全血、尿液、淋巴液或腹水。在一些實施方式中，樣品的體積小于9mL、小于6ml、小于4mL或小于3mL、小于2mL或小于1mL。在一些實施方式中，樣品的體積為約8mL、約6mL、約4mL、約2mL或約1mL。

本文所描述的靶細(xì)胞包括但不限于腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞、病原體、T細(xì)胞、心肌細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循環(huán)上皮細(xì)胞以及循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞。

在一些實施方式中，該方法還包括使所分離的細(xì)胞富集。

該所分離的細(xì)胞保持為有活力。在一些實施方式中，該所分離的細(xì)胞具有大于95％、大于90％、大于80％、大于70％、大于60％、大于50％、大于40％或大于30％的細(xì)胞活力。在一些實施方式中，至少約90％、至少約80％、至少約70％、至少約60％、至少約50％、至少約40％或至少約30％的所分離細(xì)胞是有活力的。

本文所公開的結(jié)合劑特異地結(jié)合靶細(xì)胞表面。在一些實施方式中，靶細(xì)胞為上皮細(xì)胞，并且結(jié)合劑為抗上皮細(xì)胞粘附分子膜蛋白的抗體(抗EpCAM)。在優(yōu)選的實施方式中，結(jié)合劑為抗EpAb 4-1。

本文所公開的潤滑組合物為脂質(zhì)部分、脂質(zhì)混合物、脂質(zhì)單層、脂質(zhì)雙層、脂質(zhì)體、脂質(zhì)聚合物或聚乙二醇。在優(yōu)選的實施方式中，潤滑組合物為支撐的脂質(zhì)雙層(SLB)。

靶細(xì)胞在沒有破壞細(xì)胞的情況下被釋放，從而所分離的細(xì)胞保持完成并且有活力。在一些實施方式中，靶細(xì)胞通過破壞脂質(zhì)共軛體而被釋放。在一些實施方式中，靶細(xì)胞經(jīng)由破壞潤滑組合物(諸如SLB)而被釋放。

在一些實施方式中，步驟(b)中的洗滌通過向潤滑組合物施加剪切應(yīng)力來執(zhí)行。在一些實施方式中，剪切應(yīng)力為約0.5至約30達(dá)因/cm²。在一些實施方式中，剪切應(yīng)力為約0.5、約1、約2.5、約5、約7.5、約10、約12.5、約15、約20或約30達(dá)因/cm²。

在一些實施方式中，步驟(c)中的釋放通過施加溫和掃除力來執(zhí)行。溫和掃除力包括但不限于氣泡的剪切、空氣泡沫的剪切、乳化流體的剪切、超聲波振動或油相。溫和掃除力提供了與潤滑組合物的疏水性相互作用。

在一些實施方式中，該方法還包括使所分離的細(xì)胞富集。在一些實施方式中，富集所分離的細(xì)胞為至少200倍、至少400倍、至少600倍、至少800倍或至少1000倍。

在另一方面，本公開的特征在于體外或體內(nèi)培養(yǎng)所分離的細(xì)胞以及使其生長的方法。該方法包括步驟：(a)根據(jù)本文所公開的方法分離靶細(xì)胞以及(b)在體內(nèi)或體外有效地培養(yǎng)有活力的靶細(xì)胞以及使其生長的條件下維持所分離的細(xì)胞。

本公開的另一方面的特征在于保存有活力的靶細(xì)胞的方法。該方法包括步驟(a)根據(jù)本文所公開的方法分離靶細(xì)胞以及(b)在長期儲存的適合條件下保存所分離的細(xì)胞。

在另一方面，本公開的特征在于一種對所分離的細(xì)胞執(zhí)行分子分析的方法。該方法包括步驟(a)根據(jù)本文所公開的方法分離靶細(xì)胞，以及(b)執(zhí)行分子分析。

本公開的另一方面的特征在于一種檢測受試者的靶細(xì)胞的方法。該方法包括步驟(a)根據(jù)本文所公開的方法分離靶細(xì)胞；(b)通過染色檢測靶細(xì)胞。受試者具有或疑似具有疾病/癌癥。

本公開的另一方面的特征在于一種評估患有癌癥的患者的癌癥進(jìn)展的方法。該方法包括步驟(a)從患者分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)，以及(b)對CTC執(zhí)行一種或多種細(xì)胞或分子分析，以確定患者的癌癥進(jìn)展。

所分離的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)基本上是純的。在一些實施方式中，基本上純的CTC的群體包括不超過20％的非CTC細(xì)胞。在一些實施方式中，基本上純的CTC的群體包括不超過10％的非CTC細(xì)胞。在一些實施方式中，基本上純的CTC的繁殖包括不超過5％的非CTC細(xì)胞。

癌癥的實例包括但不限于肺癌、食道癌、膀胱癌、胃癌、結(jié)腸癌、皮膚癌、乳頭狀甲狀腺癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、盆腔癌以及睪丸癌。

在一些實施方式中，一種或多種細(xì)胞或分子分析包括形態(tài)分析、基因組分析、表觀基因組分析、轉(zhuǎn)錄組分析、蛋白組分析或它們的任何組合。

在一些實施方式中，一種或多種細(xì)胞或分子分析包括確定CTC中的一個或多個DNA突變。

在一些實施方式中，DNA突變包括插入、刪除、取代、轉(zhuǎn)移、基因擴增或它們的任何組合。

在一些實施方式中，DNA突變位于選自由KRAS、APC、TP53、BRAF、PTEN、EGFR、ERCCl、RRMl、ELM4、HER2以及ALK組成的組中的基因中。

在一些實施方式中，一種或多種細(xì)胞或分子分析包括確定CTC中的癌癥特異性基因的蛋白表達(dá)水平。在一些實施方式中，一種或多種細(xì)胞或分子分析包括確定CTC中癌癥特異性基因的RNA表達(dá)水平。

在一些實施方式中，該方法還包括通過染色來檢測CTC中一個或多個癌癥特異性標(biāo)記物的表達(dá)，以及計數(shù)所染色的細(xì)胞。患者的腫瘤的階段和/或預(yù)后可以基于分子分析和癌癥特異性CTC的計數(shù)的組合結(jié)果而確定。

本領(lǐng)域中已知多種癌癥特異性標(biāo)記物。在一些實施方式中，癌癥特異性標(biāo)記物為細(xì)胞角蛋白、CDX1、CDH17、前列腺特性異抗原(PSA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、粘蛋白-1(MUC-1)、人表皮生長因子受體2(HER2)、絨毛膜促性腺激素(hCG)、α-胎蛋白(AFP)、肝細(xì)胞癌(HCC)、N-鈣粘蛋白、表皮生長因子受體(EGFR)、ERCC1、雄激素受體(AR)、人平衡型核苷轉(zhuǎn)運蛋白1(hENTl)、RRMl或癌胚抗原(CEA)、CD44和p53、上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)、GD2、GM2、GM1、GD1a、GT1b、A2B5、Tf、Tn、GloboH、CD133、CD24、CD44、CD90、ER或PR。

此外，本公開的特征在于一種評估受試者的疾病的存在和/或嚴(yán)重程度的方法，該方法包括(a)從受試者分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)；(b)通過染色檢測CTC中一種或多種癌癥特異性標(biāo)記物的表達(dá)；(c)計數(shù)所染色的細(xì)胞；并且其中，所染色細(xì)胞的數(shù)目和/或與對照相比數(shù)目的變化是疾病的存在和/或嚴(yán)重程度的指示；從而評估疾病的存在和/或嚴(yán)重程度。

在一些實施方式中，該方法還包括對CTC執(zhí)行一種或多種細(xì)胞或分子分析，并且基于分子分析和疾病特異性CTC的計數(shù)的組合結(jié)果來確定疾病的存在和/或嚴(yán)重程度。

在一些實施方式中，疾病為癌癥。所染色的細(xì)胞的已增加的數(shù)目為癌癥不良預(yù)后或轉(zhuǎn)移的指示。

在一些實施方式中，疾病是癌前病癥。癌前病癥的實例包括光化性角化病、巴雷特食管、萎縮性胃炎、先天性角化不良、缺鐵性吞咽困難、扁平苔蘚、口腔黏膜下纖維化、日光性彈力組織變性以及宮頸發(fā)育不良。

本公開的特征還在于一種用于檢測受試者的結(jié)腸直腸癌或胃腸(GI)道疾病的方法。該方法包括以下步驟：(a)從受試者分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)；(b)通過染色檢測CTC中選自由DAPI、CK20、CD45、CDH17、CDX2、CK7、CEA、panCK、TCN、SΜLT2B1、ALDOB、COL11A1、PI3、CCL20、MTHFD11、IL-1b、SRPX2、SLC04A1、TESC以及IL-23a組成的組中的一種或多種標(biāo)記物的表達(dá)；(c)計數(shù)所染色的細(xì)胞；并且其中所染色的細(xì)胞的數(shù)目和/或與對照相比數(shù)目的變化是結(jié)腸直腸癌或胃腸(GI)道疾病的存在和/或嚴(yán)重程度的指示。

在一些實施方式中，標(biāo)記物包括CK20和選自由DAPI、CD45、CDH17、CDX2、CK7、CEA、panCK TCN、SΜLT2B1、ALDOB、COL11A1、PI3、CCL20、MTHFD11、IL-1b、SRPX2、SLC04A1、TESC和/或IL-23a組成的組中的一種或多種。

在一些實施方式中，標(biāo)記物選自由DAPI、CK20、CD45以及CEA組成的組。在一些實施方式中，標(biāo)記物選自由DAPI、CK20以及CD45組成的組。

在一些實施方式中，結(jié)腸直腸癌或胃腸(GI)道疾病的存在和/或嚴(yán)重程度由DAPI+/CK20+/CD45-的表達(dá)中的所染色細(xì)胞的數(shù)目或數(shù)目的變化來指示。

在一些實施方式中，受試者為具有或疑似具有胃腸(GI)道疾病的人類患者。胃腸道疾病包括但不限于巴雷特食管、胃潰瘍、胃炎、平滑肌瘤、息肉、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、胰腺炎、腺癌、粘液腺癌、類癌腫瘤、鱗狀細(xì)胞癌、淋巴瘤和肉瘤。

在一些實施方式中，受試者是具有結(jié)腸直腸癌(CRC)的人類患者。在某些實施方式中，結(jié)腸直腸癌患者遭受的結(jié)腸直腸癌為階段0、階段I、階段II、階段III和/或階段IV的結(jié)腸直腸癌。

在下面的描述中闡述了本發(fā)明的一個或多個實施方式的細(xì)節(jié)。本發(fā)明的其他特征或優(yōu)點將從下面的附圖和若干實施方式的詳細(xì)的描述以及還從所附權(quán)利要求中將更加明顯。

通過引用的并入

該說明書中所提及的所有公開、專利以及專利申請通過引用并入本文，其程度如同具體地和單獨地指示每個單獨的公開、專利或?qū)＠暾埻ㄟ^引用被并入。

附圖說明

利用所附權(quán)利要求的特性闡述了本發(fā)明的特征。通過引用下文中的詳細(xì)描述和所附的附圖將獲得對本發(fā)明的特征和優(yōu)點的更好的理解，下文中詳細(xì)的描述闡述了說明性實施方式，在這些說明性實施方式中利用了本發(fā)明的原理，并且在附圖中：

圖1示出了本公開的方法的示例性實施方式。

圖2示出了本公開的泡沫組合物和空氣液體界面的示例性實施方式。

圖3示出了毛細(xì)管微流體裝置。

圖4提供了CTC檢測的決策樹。

圖5提供了微流體裝置的分解視圖。

圖6示出了根據(jù)實施方式的在微流體通道中制備抗體-鏈的(tethered)SLB涂層所遵循的順序步驟。

圖7描繪了用于生成本公開的泡沫組合物的示例性裝置。

圖8描繪了用于生成本公開的泡沫組合物的示例性裝置。

圖9示出了6個不同的微流體通道設(shè)計(A到F)的幾何結(jié)構(gòu)和性能。

圖10示出了微流體通道設(shè)計A和B的構(gòu)造和尺寸。

圖11示出了微流體通道設(shè)計C和D的構(gòu)造和尺寸。

圖12示出了微流體通道設(shè)計E和F的構(gòu)造和尺寸。

圖13示出了經(jīng)由通過已增加的緩沖流動速率選擇性地增加流動通道中的剪切應(yīng)力的純化。

圖14提供了釋放過程的延時顯微照片。

圖15提供了將從芯片釋放的細(xì)胞與所附的抗體和空氣泡沫一起收集到Eppedorf試管中。

圖16示出了已洗脫的CTC的培養(yǎng)和遺傳突變分析。

圖17示出了在小基底上收集的細(xì)胞。

圖18示出了用于細(xì)胞識別的癌癥細(xì)胞覆蓋熒光圖像。

圖19示出了每2mL的CTC計數(shù)對CRC疾病TNM階段。

圖20示出了用戶、樣品、計算機以及輸出之間的相互作用。

圖21示出了從健康供體到具有從0/I、II、III至IV的TNM階段的結(jié)腸直腸癌癥患者的所有受試者的每2mL的外周血的CTC計數(shù)。

圖22示出了通過CTC的癌癥診斷的敏感性和特異性。

圖23示出了根據(jù)癌癥進(jìn)展的平均CTC數(shù)目。

圖24示出了系統(tǒng)的簡單工作流程。

具體實施方式

總體概述

本公開提供了用于從無污(非結(jié)垢，non-fouling)組合物捕獲并除去顆粒的組合物和方法。該顆?？梢允歉信d趣顆粒，諸如細(xì)胞，包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)、循環(huán)稀有細(xì)胞(CRC)、干細(xì)胞(例如腫瘤干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞)、胎兒細(xì)胞、細(xì)菌、病毒、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。感興趣的顆?？梢粤鬟^可以包括表面的通道。表面可以涂覆有結(jié)合部分，感興趣的顆?？梢愿街谠摻Y(jié)合部分。表面可以包括無污組合物。無污組合物可以是指減少非特異顆粒的結(jié)合的脂質(zhì)組合物。換言之，無污組合物可以通過降低非特異顆粒與該組合物的結(jié)合來富集感興趣的顆粒的純度。當(dāng)通過結(jié)合部分和無污組合物捕獲感興趣的顆粒時，它們可以通過溫和的掃除力或包括氣泡的泡沫組合物來除去。例如，溫和的掃除力可以是氣泡的剪切、空氣泡沫的剪切、乳化流體的剪切、超聲波振動或油相。泡沫組合物可以除去感興趣的顆粒、結(jié)合部分和/或無污組合物。

在圖1中圖解示出了該方法的示例性實施方式。表面120可以涂覆在無污組合物115中。無污組合物115可以附著至連接體110。連接體110可以共軛到結(jié)合部分105。結(jié)合部分105可以是抗體。表面120可以與包括感興趣的顆粒130的樣品接觸125。在一些情況下，感興趣的顆粒130是細(xì)胞。在一些情況下，感興趣的顆粒130是稀有細(xì)胞。感興趣的顆粒130可以結(jié)合至結(jié)合部分105。包括氣泡140的泡沫組合物可以在表面120上流動135。氣泡140可以從表面120除去無污組合物115及任何結(jié)合細(xì)胞130。當(dāng)圖1示出氣泡140除去單個的感興趣的顆粒時，應(yīng)當(dāng)理解氣泡可以除去多個感興趣的顆粒和/或無污組合物。

感興趣的顆粒(例如，CTC)可以被進(jìn)一步分析并在臨床應(yīng)用(諸如癌癥診斷、預(yù)后以及治療)中使用。前述系統(tǒng)和方法可以實現(xiàn)對有活力的CTC進(jìn)行捕獲和釋放，該有活力的CTC對確認(rèn)疾病的手段敏感并且相容(例如，與隨后的分子分析相容)。例如，本文所提供的系統(tǒng)和方法可允許對有活力的CTC進(jìn)行捕獲和釋放，從而允許對活的癌細(xì)胞在體外進(jìn)行研究或繁殖，以實現(xiàn)利用其他技術(shù)進(jìn)行分析，以便獲得可能會導(dǎo)致可操作的治療指導(dǎo)并可能對治療發(fā)展有益的結(jié)果。在一些情況下，其他技術(shù)可以包括用來研究突變或表觀遺傳變化的全基因組分子分析。在一些情況下，其他技術(shù)可以包括用于靶向癌癥干細(xì)胞的藥物干預(yù)的通路分析。雖然本文主要討論關(guān)于癌癥的應(yīng)用，但是應(yīng)當(dāng)理解的是，本文所描述的組合物和方法可以用于與非癌病癥相關(guān)的臨床應(yīng)用中。例如，臨床應(yīng)用可以涉及息肉、良性疾病(諸如炎性腸炎(IBD))、關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎等。例如，活躍時，CTC計數(shù)可能高，并且檢測率高。

表面

本文中對感興趣顆粒(諸如CTC)進(jìn)行選擇性的捕獲或有效的釋放有用的裝置可以包括一個或多個表面。這樣的表面可以是平的、彎曲的、平面的、圓形的、不規(guī)則形狀的和/或包括拓?fù)涮卣?例如，微結(jié)構(gòu)或納米結(jié)構(gòu)(諸如納米顆粒、納米線等))。表面可以是相同的。表面可以是不同的(例如，頂部表面可以包括微結(jié)構(gòu)，并且底部表面可以是平的)。

示例性表面可以包括但不限于，生物微機電表面(bioMEM)表面、微孔、載玻片、陪替氏培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)板、毛細(xì)管、管道、移液管尖端以及管。表面可以是固體、液體和/或半固體。無污組合物可被摻入細(xì)胞培養(yǎng)皿、微流體通道、微流體芯片、過濾過濾器、毛細(xì)管、管，珠、納米顆粒等。表面可具有任何幾何結(jié)構(gòu)(例如，表面可以是平面的、傾斜的、鋸齒的，具有拓?fù)?。

表面可以包括微流體表面。表面可以是微流體通道的一部分，或可以生成微流體通道。表面可以是載玻片的表面、孔板或任何其他腔的內(nèi)表面。

表面可以由固體材料制成。示例性的表面材料可以包括硅、玻璃、羥基化的聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、氧化鋁、塑料、金屬、氧化鈦(TiO₂)、Au、Ag、Pt等。

表面可以是通道的一部分或可以生成通道。通道可以包括被配置為捕獲感興趣顆粒(例如，細(xì)胞)的表面。通道可以被形成在微流體裝置內(nèi)，該微流體裝置被配置為從全血液樣品捕獲感興趣顆粒。捕獲可以通過感興趣顆粒(例如，細(xì)胞)的相互作用利用通道的表面上的結(jié)合部分來介導(dǎo)。例如，通道可以包括涂覆有結(jié)合部分的微結(jié)構(gòu)。微結(jié)構(gòu)可以被布置成從通道內(nèi)的全血液樣品來分離感興趣顆粒。這樣的通道可以用于從患者的血液樣品捕獲感興趣顆粒，并且能夠有助于癌癥生物研究和臨床癌癥管理兩者，包括癌癥的檢測、診斷以及監(jiān)測。

通道可以包括三個尺寸。通道的橫截面可以被定義為通道的體積的兩個尺寸(例如，高度和寬度)。在一些實施方式中，通道的寬度可以約等于或大于10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、120μm、150μm、200μm、250μm、300μm、500μm、1mm、2mm、5mm、10mm、20mm、50mm或100mm。在一些實施方式中，通道的高度可以約等于或大于20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、120μm、140μm、160μm、180μm、200μm、250μm、300μm、500μm、1mm、2mm、5mm、10mm、20mm、50mm或100mm。第三尺寸可以被稱之為通道的長度。

微流體通道可以包括微結(jié)構(gòu)。例如，微結(jié)構(gòu)可以被蝕刻成具有2.5cm×7.5cm的總尺寸的表面。在基底的周圍可以留有2mm的邊緣，用于結(jié)合底部表面以創(chuàng)建封閉的室。例如，雕刻的矩形微結(jié)構(gòu)可以具有從250μm的寬度到1000μm的長度，并且具有可變的高度(例如，50、80以及100μm)。微結(jié)構(gòu)可以被布置成Z字圖案或交錯圖案，其中第1至5行中的特征的數(shù)目為a、2、3、2以及1，在這些行之間具有250μm的間距。相鄰特征可以間距200μm。該交錯的圖案可以在通道的整個長度上重復(fù)，并且這些特征的更多行中的1至4行可以在通道腔的整個長度上平行地延伸。微結(jié)構(gòu)的高度、寬度或長度可以為至少5、10、25、50、75、100、250、500微米或更多。微結(jié)構(gòu)的高度、寬度或長度可以為至多100、500、250、100、75、50、25或10或更少微米。微結(jié)構(gòu)之間的間距可以為至少10、25、50、75、100、250、500或750或更多微米。微結(jié)構(gòu)之間的間距可以為至多1000、750、500、250、100、75、50或25或更少微米。

微結(jié)構(gòu)可以被定向成人字形圖案。人字形圖案可以通過形成人字形柱來創(chuàng)建，該人字形柱中每個微結(jié)構(gòu)被定位成與另一微結(jié)構(gòu)相鄰。柱中所有微結(jié)構(gòu)可以面向相同方向。在一些實施方式中，每個微結(jié)構(gòu)之間的距離為50微米。微結(jié)構(gòu)可以被定位成彼此相距任何距離。柱可以包括任何數(shù)目的微結(jié)構(gòu)。例如，柱可以包括至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多個微結(jié)構(gòu)。柱可以包括至多約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多個微結(jié)構(gòu)。人字形圖案還可以包括從入口到出口串聯(lián)地形成的微結(jié)構(gòu)的多個柱。在一些實施方式中，微結(jié)構(gòu)的兩個相鄰柱可以分開100微米。換言之，第二柱的第一微結(jié)構(gòu)可以被定位成離第一柱的最后微結(jié)構(gòu)100微米。從通道的入口到出口可以重復(fù)該圖案。

(例如，微流體通道的)表面可以創(chuàng)建體積或為體積的一部分。本文的表面可以生成在其上樣品流動的體積。這樣的體積可以為至少約1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200或更多微升?？商鎿Q地或另外，表面的體積可以為至多約1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200或更多微升。

由于在平表面的中心形成停滯區(qū)，樣品內(nèi)的感興趣顆粒至表面的粘附可以沿著每個微結(jié)構(gòu)的平表面增加，從而提供增加停留時間和/或增加與結(jié)合表面的化學(xué)相互作用的效率的停滯流動條件。在一些實施方式中，表面可以為通道內(nèi)的微結(jié)構(gòu)的外表面或被定向成基本上垂直于微流體通道內(nèi)的生物樣品的流體流動的方向的表面的部分。微結(jié)構(gòu)可以完全地或部分地延伸傳過微流體通道。

微流體裝置可以包括在入口和出口之間提供流體連通的流體流動通道。通道可以包括被配置成結(jié)合感興趣顆粒(例如，用結(jié)合部分功能化)的至少一個表面。表面可以形成在被配置成捕獲樣品中的感興趣顆粒的通道內(nèi)的一個或多個微結(jié)構(gòu)上?？梢砸耘c其他組件組合的方式包括通道，以提供用于從樣品分離分析物或感興趣顆粒(例如，細(xì)胞)的系統(tǒng)。具有結(jié)合部分的通道或區(qū)域的體積可以根據(jù)被采用的樣品的體積進(jìn)行選擇。通道的體積可以大于樣品的尺寸。

(例如，微流體通道的)一個或多個表面可以被配置成引導(dǎo)流體流動和/或流體內(nèi)的感興趣顆粒通過微流體通道。例如，通道的表面可以是粗糙的或光滑的。通道可以包括粗糙的表面。通道可以包括其大小可以比得上所需的分析物或感興趣顆粒(例如，細(xì)胞)的周期性振幅和/或頻率。在一些情況下，通道可以由被定位成與微流體通道內(nèi)的一個或多個微結(jié)構(gòu)的基底相對的波狀或“鋸齒”形狀的壁來限定。鋸齒形狀的表面可以具有約為約1-100微米的高度和頻率。鋸齒形狀的表面可以被定位成直接與僅部分地延伸穿過表面的一個或多個微結(jié)構(gòu)相對?？梢赃x擇通道的尺寸，以提供將感興趣顆粒結(jié)合至微流體通道的表面的所需的速率。

可以選擇流體流動(例如，針對樣品流動、緩沖液清理等)的速率和壓力來提供結(jié)合至表面的所需的速率。還可以選擇流體流動速度來提供對所結(jié)合至表面的感興趣顆粒所需的剪切應(yīng)力?？梢圆倏v至少兩個變量，以控制施加至通道的剪切應(yīng)力：室的橫截面面積和施加至室的流體壓力?？梢圆倏v其他因素以控制允許結(jié)合所需的感興趣顆粒和防止不需要的顆粒的結(jié)合(例如，所采用的結(jié)合部分和通道中的結(jié)合部分的密度)所需的剪切應(yīng)力的量。產(chǎn)生適合的剪切應(yīng)力的與微流體通道結(jié)合的泵可以產(chǎn)生單向剪切應(yīng)力(即，基本上不存在流動方向的逆轉(zhuǎn)和/或基本上是恒定的剪切應(yīng)力)。在樣品通過通道的時間段期間，可以維持單向的或基本上恒定的剪應(yīng)力。

可以配置表面(例如，微流體通道)以最大化感興趣顆粒與通道內(nèi)一個或多個表面的結(jié)合，同時允許通過通道的流體流動的所需的速率。增加微結(jié)構(gòu)的表面積可以增加感興趣顆粒結(jié)合的面積，同時增加從入口至出口通過通道的樣品流體流動的阻抗(阻力)。

如本文所提及的微流體裝置可以有效地分離感興趣顆粒(例如，稀有細(xì)胞、CTC、干細(xì)胞等)。稀有細(xì)胞的釋放和恢復(fù)可能是分離稀有細(xì)胞的重要因素。例如，當(dāng)使用梯度洗脫方法時，可能存在對細(xì)胞膜的破壞、表面標(biāo)記物的退化以及CTC的表型和功能化信息變化的可能性，這可能限制了細(xì)胞的下游分析。例如，當(dāng)使用流動誘導(dǎo)的細(xì)胞脫離時，破壞抗體細(xì)胞表面抗原結(jié)合所需的剪切應(yīng)力(例如50至200達(dá)因/cm2)可能改變了基因表達(dá)，并且可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

功能化表面

表面(例如，微流體通道)可以涂覆有無污組合物。無污組合物可以是防止結(jié)垢(例如，防止非特異性顆粒(諸如血清蛋白)的結(jié)合，同時保留結(jié)合感興趣顆粒的能力)的組合物。無污組合物可以充當(dāng)潤滑表面，使得僅低流動剪切應(yīng)力或低流動速率可以用于本公開的方法。對于無污組合物，可能僅需要低流動剪切應(yīng)力以從無污層(無結(jié)垢層)除去非特異性細(xì)胞或不需要的成分。在一些情況下，無污行為可能與無污表面的表面水合、柔韌性以及流動性有關(guān)。無污組合物可以包括如本文所進(jìn)一步描述的結(jié)合部分和/或連接體。

無污組合物可以包括脂質(zhì)層或脂質(zhì)共軛體。脂質(zhì)層可以包括脂質(zhì)單層、脂質(zhì)雙層、支持的脂質(zhì)雙層(SLB)或脂質(zhì)多層、脂質(zhì)體、多肽、聚電解質(zhì)多層(PEM)、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)、水凝膠聚合物、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、碳水化合物、聚合物刷、兩性離子物質(zhì)、聚(羧基甜菜堿)(pCB)、聚(磺基甜菜堿)(pSB)、pDMAEMA以及小的有機化合物，或者它們的任何組合?？梢杂糜跓o污物的示例性脂質(zhì)可以包括但不限于1,2-二油?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(帽生物素基)(鈉鹽)(b-PE)、1-棕櫚酰-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(POPC)、二酰基甘油、磷脂、糖脂、甾酮、卵磷脂(PtdCho)、磷脂酰乙醇胺(PtdEtn)、磷脂酰肌醇(PtdIns)、磷脂酰絲氨酸(PtdSer)以及磷酸鞘脂。

脂質(zhì)層可以具有橫向移動性。脂質(zhì)層可以是生物惰性的。脂質(zhì)層可以有效地抵抗非特異性蛋白質(zhì)吸收和細(xì)胞粘附(例如，由于橫向移動性和生物惰性)。橫向移動性可以允許脂質(zhì)和蛋白質(zhì)重組它們在表面上的分布。橫向移動性可以允許蛋白質(zhì)的組裝并增加靶細(xì)胞(感興趣顆粒)的結(jié)合親和力和特異性。

脂質(zhì)分子在脂質(zhì)固體界面上的移動性可以使它們連續(xù)地彼此交換位置。由于脂質(zhì)分子的移動性，一旦感興趣顆粒接近抗體修飾的脂質(zhì)層，下面的流體脂質(zhì)層可以允許抗體分子朝向感興趣顆粒遷移(例如，由于活性招募或擴散)。由此，感興趣顆?？梢愿臃€(wěn)固地粘附在表面上。相反，當(dāng)抗體功能化的脂質(zhì)集中在感興趣顆粒下方時，遠(yuǎn)離靶細(xì)胞的非功能化的脂質(zhì)的集中可以增加，從而導(dǎo)致對非特異性結(jié)合的更大的抵抗。通過蛋白質(zhì)和血液細(xì)胞而降低的非特異性結(jié)合可以降低由非特異性結(jié)合事件在受限的結(jié)合空間中所產(chǎn)生的位阻現(xiàn)象(空間位阻)。

無污組合物可以通過施加較小的力來幫助除去非特異性顆粒。從無污組合物除去非特異性顆粒所需的剪切應(yīng)力可以比從常規(guī)的抗體涂覆的表面除去非特異性顆粒所需的剪切應(yīng)力小得多，并且可以遠(yuǎn)低于通過在生理狀態(tài)下的細(xì)胞(諸如在人體血液中觀察到的)所通常經(jīng)歷的剪切應(yīng)力(例如，～15達(dá)因/cm2)。

在一些實施方式中，無污組合物可以是支持的脂質(zhì)雙層(SLB)。SLB可以包括脂質(zhì)(諸如，1,2-二油?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(帽生物素基)(鈉鹽)(b-PE)和1-棕櫚酰-2-油?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(POPC))。SLB可以是蛋白質(zhì)抗性的。例如，由于在寬pH范圍中存在中性和兩性離子磷脂酰膽堿頭基，因此SLB可以是蛋白質(zhì)抗性的。例如，由于在親水性脂質(zhì)頭基和本體溶液之間所形成的水性薄膜，因此SLB可以是蛋白質(zhì)抗性的。

無污組合物可以包括聚乙二醇(PEG)。PEG可以包括至少約50、100、200、500、700、1000、5000、10000、15000、50000、75000、100000、150000、200000或250000或更多道爾頓的分子量。PEG可以包括至多約50、100、200、500、700、1000、5000、10000、15000、50000、75000、100000、150000、200000或250000或更多道爾頓的分子量。PEG可以包括從100至100,000道爾頓的分子量。

無污組合物可以包括聚電解質(zhì)多層(PEM)。PEM可指包括電解質(zhì)的聚合物。示例性的PEM可以包括但不限于聚L-賴氨酸/聚-L-谷氨酸(PLL/PLGA)、聚L-賴氨酸/聚L天冬氨酸、聚(苯乙烯磺酸鈉)(PSS)、聚丙烯酸(PAA)、聚(乙基丙烯酸)(PEA)或它們的任何組合。

無污組合物可以包括聚合物刷。聚合物刷可指可在一端附著至表面的聚合物。示例性的聚合物刷可以包括([2-(丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化銨，TMA)/(2-羧基乙基丙烯酸酯，CAA)共聚物。

無污組合物可以包括脂質(zhì)、PEG、聚電解質(zhì)多層或聚合物刷或它們的任何組合。

無污組合物可以包括一厚度。無污組合物的厚度可以為至少約0.5、1、10、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、5000、10000、25000、50000、100000、200000、300000、500000、750000、1000000或更多納米。無污組合物的厚度可以為至多約0.5、1、10、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、5000、10000、25000、50000、100000、200000、300000、500000、750000、1000000或更多納米。

無污組合物可以包括官能團。官能團能夠直接共價和/或非供價地連接至結(jié)合部分中存在的官能團或直接連接至作為連接組合物的一部分的官能團。示例性的官能團可以包括但不限于羥基、胺基、羧酸或酯基、硫酯基、醛基、環(huán)氧基或環(huán)氧乙烷基、酰肼(hyrdrazine)基和硫醇基、生物素、抗生物素蛋白、鏈霉親和素、DNA、RNA、配體、受體、抗原、抗體以及正-負(fù)電荷。官能團可以附著至無污組合物的脂質(zhì)。官能團可以選擇為與在連接體或結(jié)合部分中存在的官能團進(jìn)行反應(yīng)?？梢赃x擇官能團以結(jié)合在連接體或結(jié)合部分中存在的結(jié)合對的第二成員。在一些實施方式中，無污組合物可以是支持的脂質(zhì)雙層(SLB)，該SLB內(nèi)在地產(chǎn)生了排斥非特異性血液組分的潤滑層并且?guī)椭Y(jié)合部分的移動以形成細(xì)胞捕獲平臺。

無污組合物可以共價地附著至表面。無污組合物可以非共價地附著至表面。無污組合物可以通過氫鍵、靜電相互作用、親水-親水相互作用、極性-極性相互作用、互補DNA結(jié)合、磁力、范德華相互作用、離子相互作用等而與表面相互作用。

無污組合物可以結(jié)合感興趣顆粒同時降低其他非特異性顆粒的結(jié)合。無污組合物可以結(jié)合少于1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％或更多的非特異性顆粒。

表面可以包括結(jié)垢組合物(污染組合物，fouling composition)。結(jié)垢組合物可以包括誘導(dǎo)非特異性感興趣顆粒的積聚和/或沉淀的組合物。

表面可以為功能化表面。表面可以利用例如染料，有機感光體，抗原，抗體，聚合物，聚D賴氨酸，在HfO₂、TiO₂、Ta₂O₅、ZrO₂以及它們的混合物之中所選擇的氧化物，有機化合物以及功能化的納米層來進(jìn)行功能化。表面可以利用非特異性結(jié)合部分(諸如細(xì)胞外基質(zhì))以及薄膜涂層來進(jìn)行功能化。表面可以通過例如軟光刻、UV輻射以及噴墨印刷來進(jìn)行功能化。

在一些實施方式中，無污組合物可以包括硅烷功能化的PEG，并且表面可以選自由硅、玻璃、羥基化的聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、氧化鋁、TiO2等組成的組。在一些實施方式中，無污組合物可以包括硫醇功能化的化合物，并且表面可以選自由Au、Ag、Pt等組成的組。

結(jié)合部分

表面可以涂覆有被選擇成結(jié)合感興趣顆粒的結(jié)合部分。結(jié)合部分可以共軛至表面。結(jié)合部分可以共軛至無污組合物(例如，無污組合物中的脂質(zhì))。

結(jié)合部分可以包括可以特異地結(jié)合感興趣顆粒的部分。例如，結(jié)合部分可以選擇性地結(jié)合至一種或多種細(xì)胞諸如與下述疾病相關(guān)聯(lián)的上皮細(xì)胞或腫瘤(贅生性，neoplastic)細(xì)胞：急性淋巴細(xì)胞白血病、急性或慢性淋巴細(xì)胞或粒瘤、急性髓細(xì)胞白血病、急性早幼粒白血病、腺癌、腺瘤、腎上腺癌、基底細(xì)胞癌、骨癌、腦癌、乳腺癌、支氣管癌、宮頸發(fā)育不良、慢性髓細(xì)胞性白血病、結(jié)腸癌、表皮樣癌、尤因氏肉瘤、膽囊癌、膽結(jié)石瘤、巨細(xì)胞瘤、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、毛細(xì)胞瘤、頭癌、增生、增生性角膜神經(jīng)瘤、原位癌、腸神經(jīng)節(jié)瘤、胰島細(xì)胞瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、喉癌、平滑肌瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、惡性類癌瘤、惡性高鈣血癥、惡性黑色素瘤、馬方綜合征習(xí)性腫瘤、髓樣癌、轉(zhuǎn)移性皮膚癌、粘膜神經(jīng)瘤、蕈樣肉芽腫病、骨髓發(fā)育不良綜合征、骨髓瘤、頸癌、神經(jīng)組織癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、骨原性肉瘤、骨肉瘤、卵巢腫瘤、胰臟癌、副甲狀腺癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、真性紅細(xì)胞增多癥、原發(fā)性腦瘤、前列腺癌、直腸癌、腎細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、精原細(xì)胞瘤、皮膚癌、小細(xì)胞肺腫瘤、軟組織肉瘤、鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、甲狀腺癌、局部皮膚損傷、網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤或腎胚細(xì)胞瘤(威耳姆氏瘤)。示例性的結(jié)合部分可以包括肽、多肽、合成聚合物、分子印跡聚合物、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、結(jié)合受體、抗體、DNA、RNA、抗原、適體、或?qū)ι镂镔|(zhì)呈現(xiàn)高親和力的任何其他表面標(biāo)記物。

結(jié)合部分可以通過例如分子識別、化學(xué)親和力和/或幾何/形狀識別來結(jié)合至感興趣顆粒。

結(jié)合部分可以包括抗體。該抗體可以包括抗各種上皮標(biāo)記物、表面粘附分子以及生長因子受體的抗體?？贵w可以是抗-EpCAM膜蛋白抗體?？笶pCAM膜蛋白抗體可以是EpAb4-1抗體，包括表1中所示出的具有SEQ ID NO：1的重鏈序列和具有SEQ ID NO：2的輕鏈序列。在一些情況下，抗體可以是抗EGFR、抗MUC-1、抗C-MET、抗HER-2、抗EphB4、抗CEA或抗ErbB2。如本文所使用的抗體可以結(jié)合特異性細(xì)胞標(biāo)記物或細(xì)胞表面抗原。標(biāo)記物可以包括EpCAM、EGFR、MUC-1、C-MET、HER-2、EphB4、CEA或ErbB2。在一些情況下，兩種或更多種不同類型的抗體可共軛至表面和/或無污組合物。例如，該表面可涂覆有抗EpCAM和抗HER2兩者。

表1.EpAb4-1抗體的VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。

示出了用于VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域兩者的互補性決定區(qū)1-3(CDR1-3)、框架區(qū)1-4(FW1-4)。

結(jié)合部分可以包括官能團。該官能團可用于將結(jié)合部分附著到無污組合物和/或表面。該官能團可用于結(jié)合部分的共價或非共價附著。示例性的官能團可以包括但不限于：羥基、胺基、羧酸或酯基、硫酯基、醛基、環(huán)氧基或環(huán)氧乙烷基、肼基(聯(lián)氨基)、硫醇基、生物素、抗生物素蛋白、鏈霉親和素、DNA、RNA、配體、受體、抗原-抗體和正-負(fù)電荷。

在一些實施方式中，官能團包括生物素和鏈霉親和素或它們的衍生物。在一些實施方式中，官能團包括1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基(磺基-NHS)。在一些實施方式中，官能團包括磺基琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)。

在一些實施方式中，微流體表面包括無污組合物，該無污組合物包括非共價結(jié)合到表面的脂質(zhì)，并且無污組合物通過連接體附著至結(jié)合部分。

在一些實施方式中，針對上皮細(xì)胞粘附分子的抗體(抗EpCAM)(即克隆EpAb4-1)層可共軛至SLB以選擇性地結(jié)合感興趣顆粒(諸如CTC)。SLB的橫向流動性可以使蛋白質(zhì)聚類并增強對感興趣顆粒(例如，CTC)的結(jié)合親和力和特異性。此外，在SLB中脂質(zhì)分子的兩性離子性質(zhì)可以最小化非特異性蛋白質(zhì)和/或細(xì)胞吸附，從而通過外周血液降低表面的結(jié)垢。

連接體

連接體可加入無污組合物和結(jié)合部分。連接體可以將結(jié)合部分加入至表面。連接體可以將無污組合物加入至表面。連接體可共價地和/或非共價地加入無污組合物和結(jié)合部分。在兩個組合物之間的連接可以通過包括靜電相互作用、親水-親水相互作用、極性-極性相互作用、互補DNA結(jié)合、磁力或它們的組合的相互作用而形成。

示例性的連接體可以包括但不限于：金屬、塑料、玻璃、硅、晶片、羥基化聚(3甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、羥基、胺基、羧酸或酯基、硫酯基、醛基、環(huán)氧基或環(huán)氧乙烷基、肼基、硫醇基、生物素、抗生物素蛋白、鏈霉親和素、DNA、RNA、配體、受體、抗原、抗體以及正-負(fù)電荷或它們的任何組合。例如，連接體可以包括硅烷、氨基丙基三乙氧基硅烷、氨基丙基三甲氧基硅烷、硅烷-PEG-NH2、硅烷-PEG-N3(PEG分子量為約1,000至約30,000道爾頓)和硅烷-PEG生物素。在一些實施方式中，互補DNA片段可用于結(jié)合無污組合物和結(jié)合部分。該片段附著至每種組合物，并且可以在它們的長度上部分地或完全地互補。DNA的合適的長度一般將是至少15個、20個、25個、35個、50個、100個或更多個堿基的長度。本發(fā)明中所使用的DNA的實例是DNA鑷。

連接體可以包括可分裂的連接體。示例性的可分裂連接體可以包括但不限于：通過紫外線照射可分裂的光敏官能團、通過電脈沖機制可分裂的電敏感官能團、通過缺乏磁力可分裂的鐵或磁性材料、通過破壞靜電相互作用可分裂的聚電解質(zhì)材料、通過雜交可分裂的DNA、熱解離性基團等。例如，在釋放之前，照射、加熱、磁力、電力等可應(yīng)用于含有可分裂的連接體的表面。隨后，感興趣顆?？梢?例如，使用空氣泡沫的剪切)被洗脫。

感興趣顆粒、樣品以及受試者

本公開提供了捕獲感興趣顆粒。感興趣顆?？梢允羌?xì)胞。細(xì)胞可指真核細(xì)胞。真核細(xì)胞可以來源于大鼠、牛、豬、狗、貓、小鼠、人、靈長類、豚鼠或倉鼠(例如，CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、NSO細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、HEK細(xì)胞)。細(xì)胞可以是來自組織的細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、酵母細(xì)胞、病毒(例如，流感、冠狀病毒)和/或昆蟲細(xì)胞。細(xì)胞可以是來源于轉(zhuǎn)基因動物或所培養(yǎng)的組織的細(xì)胞。細(xì)胞可以是原核細(xì)胞。原核細(xì)胞可以是細(xì)菌、真菌、后生動物或古菌。細(xì)胞可指本文所提及的多個細(xì)胞或任何細(xì)胞。

感興趣顆粒可指細(xì)胞的一部分。例如，細(xì)胞可指細(xì)胞器(例如，高爾基復(fù)合物、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核)、細(xì)胞碎片(例如，細(xì)胞壁、肽聚糖層)和/或細(xì)胞的內(nèi)容物(例如，核酸內(nèi)容物、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物)。

感興趣顆粒可以是稀有細(xì)胞。示例性的細(xì)胞可以包括但不限于：稀有癌癥細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循環(huán)腫瘤微栓子、血液細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)胚層來源的細(xì)胞、外胚層來源的細(xì)胞以及中胚層來源的細(xì)胞或它們的任何組合。

感興趣顆粒可以是樣品的一部分。樣品可以包括多個顆粒，僅其中一些是感興趣顆粒。顆?？芍讣?xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、組織、器官、細(xì)胞分解產(chǎn)物等。顆?？梢允墙Y(jié)垢顆粒。顆?？梢圆唤Y(jié)合至無污組合物。樣品可以包括至少約0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％或更多的感興趣顆粒。樣品可以包括至多約0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％或更多的感興趣顆粒。

樣品可以從受試者獲得。受試者可以是人類。受試者可以是非人類。受試者可以是例如，哺乳動物(例如，狗、貓、牛、馬、靈長類、小鼠、大鼠、綿羊)。受試者可以是脊椎動物或無脊椎動物。受試者可具有癌癥疾病。受試者可具稀有細(xì)胞的疾病。受試者可具有稀有細(xì)胞或癌癥的疾病，并且沒有顯示出疾病的癥狀。受試者可能不知道他們具有癌癥或稀有細(xì)胞的疾病。

樣品可以包括體液。示例性的體液可以包括但不限于血液、血清、血漿、鼻拭子或鼻咽洗液、唾液、尿液、胃液、脊髓液、淚液、糞便、粘液、汗、耳垢、油、腺體分泌、大腦脊髓液、組織、精液、陰道液、間質(zhì)液(包括來源于腫瘤組織的間質(zhì)液)、眼液、腦脊液、咽拭子、呼吸、毛發(fā)、指甲、皮膚、活組織檢查、胎盤液、羊水、臍帶血、顯著流體(emphatic fluid)、腔液、痰液、膿液、微生物叢、胎糞、母乳和/或其他排泄物。

泡沫組合物

表面上的無污層可以向本文中的裝置提供其他優(yōu)點。例如，該無污層可以允許所捕獲的顆粒(諸如細(xì)胞)的溫和釋放，而基本上不影響它們的活力。具體地，本公開考慮了使用溫和的液體溶液或泡沫組合物(諸如空氣形式的組合物)來釋放在本文所描述的表面上所捕獲的細(xì)胞。

泡沫組合物可以通過表面張力來釋放所捕獲的顆粒。例如，當(dāng)氣泡(例如，在泡沫組合物內(nèi))接觸所捕獲的顆粒時，該顆粒表面上的空氣-液體界面可以形成，從而產(chǎn)生垂直于表面的凈力并將所捕獲的顆粒向上拉動，導(dǎo)致釋放。對于在無污組合物(例如，脂質(zhì)層)上所捕獲的感興趣顆粒，可替換地或除了表面張力，力而非表面張力可以有助于感興趣顆粒的釋放。例如，有助于感興趣顆粒的釋放的力可以是疏水性-親水性的、疏水性-疏水性的和/或親水性-親水性的相互作用。例如，對于脂質(zhì)層，與氣泡接觸可以將脂質(zhì)層的疏水頭拉進(jìn)氣泡的空氣相，同時可以將脂質(zhì)層的親水尾部拉進(jìn)液相并且所捕獲的顆?？梢赃B同沿著氣泡所拉動的脂質(zhì)層一起被釋放。除了或可替換的表面張力，力可以是較少數(shù)量的或不同質(zhì)量的，使得所釋放的細(xì)胞的活力更高。

本公開的泡沫組合物可以包括液體和空氣。液體和空氣可被結(jié)合以形成氣泡，從而制造泡沫。泡沫組合物可以是具有氣囊的液體。泡沫組合物可以是具有氣囊的液體的連續(xù)流。例如，泡沫組合物可以包括由液體包圍的氣泡。泡沫組合物可以是氣泡的連續(xù)序列。在一些情況下，泡沫組合物可以不指液體之后的氣泡。在圖2中描繪了本公開的泡沫組合物的示例性實施方式。在一些實施方式中，如在201中所描繪的，泡沫組合物可以處于通道205內(nèi)，該通道可以包括表面。泡沫組合物可以包括可散布有氣泡215的連續(xù)的液體界面210。泡沫組合物可以不同于如在202中所描繪的空氣-液體界面?？諝?液體界面226可以在通道220中的液體225阻擋空氣230的區(qū)段(部分)(例如，其中液體完全消耗空氣的區(qū)段之間的體積)時發(fā)生。在一些情況下，空氣-液體界面226的空氣230在流過通道220時可能無法壓縮并且可能被截留在通道220中(例如，當(dāng)該體積沿通道減小或在通道內(nèi)存在障礙時)。在一些情況下，201的泡沫組合物的空氣215具有可能不會被截留在通道205中的大小。在一些情況下，201的泡沫組合物的氣泡215的直徑小于通道(例如，微流體通道205)的橫截面尺寸。在一些情況下，空氣-液體界面226的氣泡230的直徑可以是約與通道的橫截面尺寸具有相同的大小(例如，通道的橫截面尺寸)。

泡沫組合物的空氣可以包括任何氣體。例如，空氣可指氧氣、氮氣、二氧化碳、氫氣、氬氣以及氦氣?？諝饪梢允羌訅嚎諝狻?/p>

泡沫組合物的液體可以是等壓的。泡沫組合物的液體可以不是等壓的。泡沫組合物的液體可以包括蛋白質(zhì)。泡沫組合物的液體可以包括任何等壓的含有蛋白質(zhì)的液體。泡沫組合物的液體可以是與細(xì)胞培養(yǎng)物(例如，細(xì)胞培養(yǎng)基、杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、洛斯維帕克紀(jì)念研究所(RPMI)、MEM、CMRL、布瑞士特氏(Brinster’s)BMOC-3、格拉斯哥、Leibovitz’s L-15)相容的液體。液體可以包括牛血清白蛋白(BSA)。蛋白質(zhì)的非限制性實例可以包括胎牛血清(FBS)、新生牛血清(NCS)、氨基酸(例如，L-谷氨酰胺)、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖連蛋白、抑肽酶、酪蛋白以及胎球蛋白，或它們的任何組合。在一些情況下，蛋白質(zhì)和/或血清可以涂覆泡沫組合物的氣泡的表面。在一些情況下，蛋白質(zhì)和/或血清可以抵消表面張力的影響并通過防止空氣向外擴散(例如，通過涂覆氣泡的表面)來穩(wěn)定氣泡。例如，液體可以是補充有10％的FBS的DMEM和補充有10％的FBS的RPMI。例如，液體可以是含有FBS(例如，5％)的PBS的溶液。

液體可以包括具有濃度為至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％或40％濃度的蛋白質(zhì)。該液體可以包括具有濃度為至多1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％或40％濃度的蛋白質(zhì)。液體可以包括5％濃度的蛋白質(zhì)。液體可以包括在磷酸鹽濃度緩沖液鹽水中5％濃度的BSA。

液體可以包括蛋白質(zhì)和緩沖液。示例性的緩沖液可以包括磷酸鹽緩沖液鹽水(PBS)、硫酸銨、N-二(羥乙基)甘氨酸、咪唑緩沖液、4-羥乙基哌嗪乙硫磺酸、3-嗎啉丙磺酸(mops)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(mes)、檸檬酸鉀、甲酸鉀、三磷酸氫二鈉以及磷酸二氫鈉。在一些情況下，液體包括磷酸鹽緩沖液鹽水。

液體中所使用的蛋白質(zhì)可以是疏水性蛋白質(zhì)。液體的溫度可以升高以幫助溶解液體溶液中的疏水蛋白質(zhì)。液體的溫度可以升高至4℃、25℃或37℃或更高。

液體可以包括兩親聚合物。兩親聚合物可指具有疏水區(qū)和親水區(qū)兩者的生物分子(例如，氨基酸聚合物)。兩親分子的疏水區(qū)和親水區(qū)可涉及靜電、極性-極性以及極性-非極性相互作用。當(dāng)利用空氣攪動兩親聚合物時，聚合物可以重新定向成水相中的膠束樣結(jié)構(gòu)。兩親聚合物的重新定向可指重新定向兩親聚合物，使得大多數(shù)聚合物都面向相同的方向(例如，疏水區(qū)面向膠束的內(nèi)芯，而親水區(qū)面向水溶液)。例如，膠束樣結(jié)構(gòu)可以包括內(nèi)芯和外芯，該內(nèi)芯包括氣泡，該外芯包括兩親聚合物。示例性的兩親分子可以包括但不限于磷脂、膽固醇、糖脂、脂肪酸、膽汁酸、皂苷、表面活性劑、洗滌劑、聚乙二醇、甘油以及兩性離子。

液體可以包括碳水化合物(例如，淀粉)。示例性的碳水化合物可以包括單糖、二糖、多糖、葡萄糖、甘露糖、蔗糖、纖維素、甘油醛、核酸、DNA、RNA、乳糖以及半乳糖。

液體可以包括乳狀液。乳狀液可指兩種不相溶的液體的混合物。示例性的乳狀液可以包括油包水乳狀液、水包油乳狀液、水包水乳狀液、微乳狀液以及納米乳狀液。乳狀液可以包括乳化劑。示例性的乳化劑可以包括洗滌劑(例如，吐溫-20、Triton-X)、表面活性劑(例如，SDS)以及卵磷脂。在一些實施方式中，泡沫組合物的液體可以包括蛋白質(zhì)、碳水化合物、乳狀液或聚合物的任何組合。

液體可以是粘性的。液體的粘度可以比水的粘度大至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。液體的粘度可以比水的粘度大至多20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。液體的粘度可以比水的粘度小至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。液體的粘度可以比水的粘度小至多20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。液體的粘度可以是這樣的，使得它保持泡沫組合物至少1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或60分鐘。

在一些實施方式中，泡沫組合物包括平衡泡沫的強度和弱度的分子。例如，泡沫組合物可以能夠具有足夠的延展性以移動通過通道，使得泡沫氣泡的形狀可以暫時變形(例如，微流體通道，例如，包括微結(jié)構(gòu))，但足夠強以攜帶所釋放的細(xì)胞，使得泡沫氣泡不會過早地破裂。

待用于生成本公開的泡沫組合物的液體的體積可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多毫升。待用于生成本公開的泡沫組合物的液體的體積可以是至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多毫升。在一些情況下，待用于生成本公開的泡沫組合物的液體的體積為4毫升。在一些情況下，泡沫組合物的液體包括在PBS中的4毫升的5％的BSA。

待用于生成本公開的泡沫組合物的空氣的體積可以為至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多毫升。待用于生成本公開的泡沫組合物的空氣的體積可以為至多約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多毫升。在一些情況下，待用于生成本公開的泡沫組合物的空氣的體積可以為2毫升。

液體和空氣可以以不同的量進(jìn)行組合。例如，液體與空氣的比率可以是至少0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、3:1、4:1或5:1或更多。液體與空氣的比率可以是至多0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、3:1、4:1或5:1或更多。在一些情況下，液體與空氣的比率為2:1。液體的量可以是至少50％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％或400％或更多的空氣的量。液體的量可以是至多50％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％或400％或更多的空氣的量。在一些情況下，泡沫組合物包括在PBS中的4毫升的5％的BSA和2mL的空氣的混合物。

泡沫組合物可以包括氣泡。泡沫組合物的氣泡的直徑可以是至少1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800或900微米或更多。泡沫組合物的氣泡的直徑可以是至多1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800或900微米或更多。在一些情況下，泡沫組合物的氣泡包括從20微米至500微米的直徑。在一些情況下，泡沫組合物的氣泡包括60微米的直徑。在一些情況下，泡沫組合物包括在PBS中的4毫升的5％的BSA和2mL的空氣的混合物，并且包括從約10至100微米的氣泡。

泡沫組合物的氣泡可以具有比微流體通道的橫截面尺寸小的尺寸。泡沫組合物的氣泡可以具有比微流體通道的橫截面尺寸大的尺寸。例如，泡沫組合物的氣泡可以在微流體通道內(nèi)壓縮并通過。泡沫組合物的氣泡可以具有比無污組合物的高度大的尺寸。氣泡的直徑與微流體通道的橫截面長度(例如，對角線長度、寬度或高度)的比率可以是約1/100、1/50、1/25、1/18、1/16、1/12、1/8、1/5、1/4、1/2、2/3、1、1.2、1.5、2、3、4、5或10。氣泡的直徑和微流體通道的橫截面長度可以如本文先前所描述的。在一些實施方式中，泡沫組合物可以包括其直徑比微流體通道的橫截面長度(例如，對角線長度、寬度或高度)小的氣泡。在一些實施方式中，泡沫組合物可以包括至少一些其直徑比微流體通道的橫截面長度(例如，對角線長度、寬度或高度)小的氣泡。在一些實施方式中，泡沫組合物可以包括這樣的氣泡，其中大部分具有比微流體通道的橫截面長度(例如，對角線長度、寬度或高度)小的直徑。如本文所使用的，大部分可指至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。如本文中所使用的，微流體通道的寬度可指表面(例如，微流體表面)的寬度。例如，泡沫組合物可以包括具有0到200μm之間的直徑的氣泡，而微流體通道的寬度大于200μm。例如，泡沫組合物可以包括至少50％的具有1微米到200微米之間的直徑的氣泡而微流體通道的寬度大于200μm。

包括從1微米至200的直徑的氣泡的百分比可以是至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。包括從1微米至100微米的直徑的氣泡的百分比可以是至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。包括從1微米至200微米的直徑的氣泡的百分比可以是至多20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。包括從1微米至100微米的直徑的氣泡的百分比可以是至多20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。包括從10微米至100微米的直徑的氣泡的百分比可以是至少50％、60％、70％、80％、90％或100％。包括從10微米至100微米的直徑的氣泡的百分比可以是至多50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些情況下，泡沫組合物包括4毫升的在BSA中的5％的PBS和2mL的空氣的混合物，和/或泡沫組合物的至少50％的氣泡具有從約10至100微米的直徑。

泡沫組合物的體積可以是泡沫組合物將流過的通道的體積的至少1倍、2倍、3倍、4倍或5倍或更多倍。泡沫組合物的體積可以比泡沫組合物將流過的通道的體積多至少50％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％或1000％或更多。泡沫組合物的體積與泡沫組合物將流過的通道的體積的比率可以是至少1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1或更多。在一些情況下，泡沫組合物包括4毫升的在PBS中的5％的BSA和2mL的空氣的混合物，泡沫組合物的至少50％的氣泡具有從約10至100微米的直徑，和/或泡沫組合物的體積比泡沫組合物將流過的通道的體積多至少5倍。

作為液體的泡沫組合物的體積可變化。例如，泡沫組合物的體積可以包括至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的液體。泡沫組合物的體積可以包括至多30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的液體。

泡沫組合物的體積可以包括不同量的液體和空氣。例如，泡沫組合物的體積可以包括比空氣多至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多倍的液體。泡沫組合物的體積可以包括比空氣多至多2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多倍的液體。泡沫組合物的體積可以包括比液體多至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多倍的空氣。泡沫組合物的體積可以包括比液體多至多2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多倍的空氣。

泡沫組合物的體積可以是至少0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多毫升。泡沫組合物的體積可以是至多0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多毫升。在一些情況下，泡沫體積為2毫升。在一些情況下，待在本公開的方法中使用的泡沫體積為1.5毫升。在一些情況下，泡沫組合物包括4毫升的在PBS中的5％的BSA和2mL的空氣的混合物，泡沫組合物的至少50％的氣泡具有從約10至100微米的直徑，和/或泡沫組合物的體積為至少1.5毫升。

泡沫組合物的體積(例如，量)可以基本上等于泡沫將在其上流動的通道的體積。泡沫組合物的體積可以是泡沫將在其上流動的通道的體積的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70倍或更多倍。泡沫組合物的體積可以是泡沫將在其上流動的通道的體積的至多5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70倍或更多倍。在一些情況下，泡沫組合物的體積為比泡沫將在其上流動的通道的體積多35倍。在一些情況下，待流動的泡沫組合物的體積是1.5毫升，并且通道的體積為55微升。

泡沫組合物在制造泡沫之后可是活性的以用于本公開的方法中至少1、5、10、15、20、25、30、35或40分鐘。泡沫組合物在制造泡沫之后可是活性的以用于本公開的方法中至多1、5、10、15、20、25、30、35或40分鐘。泡沫組合物在制造泡沫后可是活性的以使用15分鐘。在一些情況下，氣泡可能隨著時間合并、破裂或尺寸減小，從而降低泡沫組合物的有效性。在一些情況下，泡沫組合物包括4毫升的在PBS中的5％的BSA和2mL的空氣的混合物，泡沫組合物的至少50％的氣泡具有從約10至100微米的直徑，泡沫組合物的體積為至少1.5毫升，和/或泡沫組合物可是活性的持續(xù)15分鐘。

泡沫組合物可以是可重復(fù)使用的。泡沫組合物可以重復(fù)使用至少1、2、3、4或5次。泡沫組合物可重復(fù)使用至多1、2、3、4或5次。泡沫組合物可以不是可重復(fù)使用的。泡沫組合物可以為了每次使用而重新制備。

本公開的泡沫組合物的密度可以比用于制造泡沫組合物的液體的密度小。泡沫組合物的密度可以比用于制造泡沫組合物的液體的密度小10％、20％、30％、40％或50％或更多。泡沫組合物可以包括與液體不同的材料相。例如，泡沫組合物可以包括氣相(例如，氣泡)。泡沫組合物與用于制造泡沫組合物的液體相比可以為50％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％或更多的氣態(tài)的。

泡沫組合物可以是粘性的。泡沫組合物的粘度可以比水的粘度大至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。泡沫組合物的粘度可以比水的粘度大至多20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。泡沫組合物的粘度可比水的粘度小至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。泡沫組合物的粘度可比水的粘度小至多20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

制備泡沫組合物的方法

本公開的泡沫組合物可以使用例如，任何一種或多種本文所述的方法來制備。在一些情況下，泡沫是在低于至少0、4、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30攝氏度下制造的。本公開的泡沫組合物可以在高于0、4、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30攝氏度下制備。泡沫組合物可在從0-4攝氏度、0-18攝氏度、0-37攝氏度、4-18攝氏度、4-18攝氏度、15-25攝氏度、18-22攝氏度、18-25攝氏度、18-37攝氏度的溫度下制備。在一些情況下，本公開的泡沫組合物在從18-22攝氏度的溫度下制備。

在一些情況下，泡沫組合物包括4毫升的在PBS中的5％的BSA和2mL的空氣的混合物，泡沫組合物的至少50％的氣泡具有從約10到100微米的直徑，泡沫組合物的體積是至少1.5毫升，和/或泡沫組合物在溫度從18-22度下制備。

渦旋

本公開提供了用于制造本公開的泡沫組合物的方法。一種用于制造泡沫組合物的方法可以包括將本公開的液體和空氣組合以及混合樣品。

混合可通過例如渦旋、攪動、搖擺、攪拌、磁力攪拌以及搖晃來執(zhí)行?；旌?例如，渦旋)可以執(zhí)行至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60或更多秒?；旌?例如，渦旋)可以執(zhí)行至多5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60或更多秒。

在一些情況下，制造泡沫組合物的方法可以包括使包括4毫升的在PBS中的5％的BSA和2mL的空氣的混合物渦旋30秒，其中泡沫組合物在從18-22度的溫度下制備。

注射器

本公開的泡沫組合物可通過中間閥在容器之間轉(zhuǎn)移本公開的液體和空氣來制造。示例性的容器可以包括但不限于注射器、管、瓶、玻璃以及桶。在一些情況下，容器是注射器。

將液體和空氣從一個容器轉(zhuǎn)移(例如，注射器)轉(zhuǎn)移到另一容器(例如，注射器)可以包括通過中間閥中的孔來轉(zhuǎn)移液體和空氣?？卓捎糜谏膳菽M合物的氣泡?？椎闹睆娇梢允侵辽?.01、0.05、0.1、0.5、1或更多毫米。孔的直徑可以是至多0.01、0.1、0.5、1、1.5、2或更多毫米?？卓梢詾?.2毫米?？卓梢跃哂猩芍睆皆?到200微米之間的氣泡的尺寸。在一些情況下，制造泡沫組合物的方法可以包括通過包括0.2微米的直徑的孔轉(zhuǎn)移4毫升的在PBS中的5％的BSA和2mL的空氣的混合物，并且其中泡沫組合物的至少50％的氣泡具有從約10至100微米的直徑。

在一些情況下，孔的開口越小，則轉(zhuǎn)移期間剪切壓力就越高，從而導(dǎo)致較小的氣泡。在一些情況下，孔的開口越小，可能需要越多的進(jìn)行轉(zhuǎn)移的外部壓力。在一些情況下，孔越大，氣泡的尺寸的變化就越大。

容器之間的轉(zhuǎn)移可以進(jìn)行至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多次。容器之間的轉(zhuǎn)移可以進(jìn)行至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多次。

容器之間的轉(zhuǎn)移可以進(jìn)行至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多秒。容器之間的轉(zhuǎn)移可以進(jìn)行至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多秒。在一些情況下，制造泡沫組合物的方法可以包括通過包括2微米的直徑的孔轉(zhuǎn)移4毫升的在PBS中的5％的BSA和2mL的空氣的混合物至少10次，并且其中泡沫組合物的至少50％的氣泡具有從約10至100微米的直徑。

在一些情況下，用于轉(zhuǎn)移液體和空氣的容器是注射器。注射器可以具有相同的尺寸。注射器可以具有不同的尺寸。注射器能夠保持至少1、5、10、20、25或50或更多毫升。注射器能夠保持至多1、5、10、20、25、或50或更多毫升。注射器可以包括連接端口。連接端口可以包括魯爾鎖(luer lock)。連接端口可以包括滑動尖端。

注射器可以通過閥連接至另一注射器。閥可以是三通閥。閥可以連接到注射器的魯爾鎖。

第一注射器可以包括液體和空氣兩者。在一些情況下，第一注射器和第二注射器均包括液體和空氣。在一些情況下，第一注射器包括液體而第二注射器包括空氣。

在一些情況下，第一注射器包括液體和空氣兩者，而第二注射器是空的。來自第一注射器的內(nèi)容物可以通過按壓第一注射器的活塞被轉(zhuǎn)移至第二注射器。來自第一注射器的內(nèi)容物可以通過拉動第二注射器的活塞而被轉(zhuǎn)移至第二注射器，從而從第一注射器汲取液體。

轉(zhuǎn)移可以在適于生成本公開的泡沫組合物的壓力下執(zhí)行。例如，壓力可以是成年人的拇指摁在注射器的管和/或活塞的壓力。轉(zhuǎn)移中所使用的壓力可以為至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10或更多兆帕斯卡(MPa)。轉(zhuǎn)移中所使用的壓力可以為至多0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10或更多兆帕斯卡(MPa)。

膜

本公開的泡沫組合物可以利用膜制造。包括本公開的液體和空氣的樣品可通過膜汲取。示例性的膜可以包括但不限于空氣石、細(xì)孔膜、橡膠膜擴散器、空氣盤以及空氣管?？梢杂勺⑸淦魍ㄟ^膜來汲取液體和空氣。

膜可以包括孔?？椎闹睆娇梢允侵辽?、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100或更多微米?？椎闹睆娇梢允侵炼?、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100或更多微米?？卓梢跃哂猩砂◤?至200微米的直徑的氣泡的尺寸?？卓梢跃哂猩砂◤?0至100微米的直徑的氣泡的尺寸。在一些情況下，制造泡沫組合物的方法可以包括通過包括直徑為至少5微米的氣孔的膜汲取4毫升的在PBS中的5％的BSA和2mL的空氣的混合物，并且其中泡沫組合物的至少50％的氣泡具有從約10至100微米的直徑。

用于通過膜拉動液體和空氣的混合物的壓力可以為至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1或更多kg/cm²。用于通過膜拉動液體和空氣的混合物的壓力可以為至多0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、或1或更多kg/cm²。

泵送

在一些情況下，可通過泵送機構(gòu)來生成泡沫組合物?？梢詢H執(zhí)行泵送機構(gòu)一次，以生成本公開的泡沫。該方法可以包括泵送液體溶液，其中在泵送期間，溶液與空氣混合。液體和空氣的混合溶液可通過噴嘴被泵送。噴嘴可以包括至多0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5或1或更多毫米的直徑。

毛細(xì)管微流體

在一些情況下，可通過毛細(xì)管微流體裝置來生成泡沫組合物。圖3示出了根據(jù)實施方式的毛細(xì)管微流體裝置。例如，圓形玻璃毛細(xì)管301可以被加熱和拉動以在一個端部孔口中形成錐形幾何結(jié)構(gòu)?？諝饬骺梢酝ㄟ^錐形孔口流入液體303(例如，培養(yǎng)基)的罐中，以形成氣泡305和泡沫組合物。氣泡的體積可通過調(diào)節(jié)空氣流的流動速率來控制。例如，當(dāng)空氣流的流動速率低時，可以產(chǎn)生單分散的空氣下降。例如，當(dāng)空氣流的流動速率超過一定閾值時，可以形成空氣噴射并可以在下游形成空氣下降。

方法

本公開提供了一種用于捕獲和釋放感興趣顆粒(例如，循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循環(huán)稀有細(xì)胞(CRC)、循環(huán)干細(xì)胞(例如腫瘤干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞)、胎兒細(xì)胞、細(xì)菌、病毒、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等)的方法。感興趣顆?？梢员徊东@在表面上。表面可以在無污組合物中被涂覆。無污組合物可以包括特異性地結(jié)合至感興趣顆粒的結(jié)合部分。

捕獲

為了捕獲感興趣顆粒，可以使包括感興趣顆粒的樣品在表面上流動。在涂覆有無污層的表面上的樣品的流動速率可以包括至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、8、9、10或更多mm/s的線速度。流動速率可以包括至多0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、8、9、10或更多mm/s的線速度。流動速率可以包括從0.5至4mm/s的線速度。流動速率可以包括從2.5到4mm/s的線速度。流動速率可以為其中至少50％、60％、70％、80％、90％或100％的感興趣顆粒結(jié)合到結(jié)合部分的速率。流動速率可以是其中至多50、60、70、80、90或100％的感興趣顆粒結(jié)合到結(jié)合部分的速率。流動速率可以是不損壞感興趣顆粒的速率。

表面可以從樣品捕獲至少50％、60％、70％、80％、90％或100％的感興趣顆粒。表面可以從樣品捕獲至多50％、60％、70％、80％、90％或100％的感興趣顆粒。表面可以每毫升的樣品捕獲至少5、10、25、50、100、200、300、400、500、1000、1500、2000或2500個感興趣顆粒。表面可以每毫升的樣品捕獲至多5、10、25、50、100、200、300、400、500、1000、1500、2000或2500個感興趣顆粒?？傮w上，本文的微流體裝置和表面對感興趣顆粒(例如，稀有細(xì)胞、CTC等)可以具有至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的捕獲效率。感興趣細(xì)胞的捕獲效率可以通過定義為(捕獲的確認(rèn)的稀有細(xì)胞的數(shù)目)/(流過裝置或鄰近該表面的實際稀有細(xì)胞的數(shù)目)×100％來定義。

通過洗滌純化

表面可以通過除去樣品的非特異性感興趣顆粒和/或其他組分來進(jìn)一步純化。感興趣顆?？赏ㄟ^除去無污組合物的表面上的非特異性顆粒(例如，細(xì)胞)和其他不想要的組分來進(jìn)行純化。無污組合物可對非特異性顆粒和其他不想要的組分具有低親和力。例如，利用約0.8達(dá)因/cm²至約50達(dá)因/cm²的低流動緩沖液溶液沖洗脂質(zhì)共軛體可能足以除去無污組合物上的非特異性顆粒和其他不需要的組分。

純化可通過使洗滌緩沖液在表面上流動來執(zhí)行。洗滌緩沖液的流動速率可以包括至少為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、8、9、10或更多mm/s的線速度。洗滌緩沖液的流動速率可以包括至多為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、8、9、10或更多mm/s的線速度。洗滌緩沖液的流動速率可以包括從0.5至4mm/s的線速度。洗滌緩沖液的流動速率可以包括從2.5到4mm/s的線速度。洗滌緩沖液的流動速率可以為其中至少50％、60％、70％、80％、90％或100％的感興趣顆粒保持結(jié)合到結(jié)合部分的速率。洗滌緩沖液的流動速率可以為其中至多50％、60％、70％、80％、90％或100％的感興趣顆粒保持結(jié)合到結(jié)合部分的速率。洗滌緩沖液的流動速率可以為不損壞感興趣顆粒的速率。損壞可指感興趣顆粒的形態(tài)變化、感興趣顆粒的退化、感興趣顆粒的活力的變化、感興趣顆粒的裂解和/或感興趣顆粒的基因表達(dá)(例如，代謝)的變化。

洗滌緩沖液的流動(即，漂洗)可除去至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的非特異性顆粒。洗滌緩沖液的流動(即，漂洗)可除去至多40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的非特異性顆粒。洗滌緩沖液的流動可以從表面的無污組合物汲取至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或15％或更多的感興趣顆粒。洗滌緩沖液的流動可以從表面的無污組合物汲取至多1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或15％或更多的感興趣顆粒。

釋放

本公開的方法提供了一種用于收集感興趣顆粒的釋放方法，其中所釋放的感興趣顆粒是有活力的。感興趣顆粒的釋放可以通過使本公開的泡沫組合物在表面(例如，包括無污層、連接體和/或結(jié)合部分的表面)上流動來執(zhí)行。感興趣顆粒的釋放可以通過溫和掃除力。如本文中所使用的溫和掃除力可指氣泡的剪切、空氣泡沫的剪切、乳劑流體的剪切、超聲波振動或油相。在一些情況下，泡沫組合物可以在表面上以從0.5-4mm/s的流動速率進(jìn)行流動以釋放感興趣顆粒，該泡沫組合物包括4毫升的在PBS中的5％的BSA和2mL的空氣的混合物，其中泡沫組合物的至少50％的氣泡具有從10至100微米的直徑。

泡沫組合物的流動速率可以包括至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、8、9、10或更多mm/s的線速度。泡沫組合物的流動速率可以包括至多0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、8、9、10或更多mm/s的線速度。泡沫組合物的流動速率可以包括從0.5至4mm/s的線速度。泡沫組合物的流動速率可以包括線速度從2.5到4mm/s的線速度。泡沫組合物的流動速率可以是其中至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、30％、40％或50％的感興趣顆粒保持結(jié)合至結(jié)合部分的速率。洗滌緩沖液的流動速率可以是其中至多1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、30％、40％或50％的感興趣顆粒保持結(jié)合至結(jié)合部分的速率。泡沫組合物的流動速率可以是不損壞感興趣顆粒的速率。損壞可指感興趣顆粒的形態(tài)變化、感興趣顆粒的退化、感興趣顆粒的活力的變化、感興趣顆粒的裂解和/或感興趣顆粒的基因表達(dá)(例如，代謝)的變化。泡沫組合物可以在表面上流動大約或多于1分鐘、2分鐘、3分鐘、5分鐘、8分鐘、10分鐘、12分鐘、14分鐘、16分鐘、18分鐘、20分鐘、25分鐘或30分鐘。

泡沫組合物(例如，泡沫組合物的氣泡)可導(dǎo)致從表面除去無污組合物和/或結(jié)合部分。泡沫組合物可導(dǎo)致從表面除去至少50％、60％、70％、80％、90％或100％的無污組合物和/或結(jié)合部分。泡沫組合物可導(dǎo)致從表面除去至多50％、60％、70％、80％、90％或100％的無污組合物和/或結(jié)合部分。在一些情況下，泡沫組合物除去至少70％的無污組合物和/或結(jié)合部分。在一些情況下，泡沫組合物以從0.5-4mm/s的流動速率在表面上流動可導(dǎo)致從表面除去至少50％的無污組合物、結(jié)合部分、連接體和/或感興趣顆粒，該泡沫組合物包括4毫升的在PBS中的5％的BSA和2mL的空氣的混合物，其中泡沫組合物的至少50％的氣泡具有從10至100微米的直徑。

由本公開的泡沫組合物所釋放的感興趣顆?？梢员皇占谑占b置中。在一些實施方式中，收集裝置可充當(dāng)使感興趣顆粒濃縮的濃縮裝置。在一些實施方式中，收集裝置可以包括膜。在一些實施方式中，膜可以包括具有約或少于0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm或5μm的直徑的孔?；谀さ目壮叽?，可以將感興趣顆粒收集在收集裝置(例如，膜)內(nèi)的區(qū)域中。例如，尺寸比膜的孔尺寸大的感興趣顆?？梢曰陬w粒離析(size separation)被收集在膜上。例如，對于具有2μm的孔尺寸的膜，包括癌細(xì)胞和WBC的所有細(xì)胞可以被收集在膜上。負(fù)壓力可以被提供在收集裝置(例如，膜)的與感興趣顆粒的一側(cè)相反的一側(cè)上。負(fù)壓力可以確保非特異性顆?；驓馀?例如，泡沫)穿過在膜上的孔，而不會引起膜堵塞或不期望的碎片。負(fù)壓力可以是不影響細(xì)胞的活力的量。在一些實施方式中，細(xì)胞可以被收集在約或大于10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200或更多mm²的區(qū)域中。在收集之后，該膜可以被除去，并安裝在顯微鏡載玻片上。在收集后，膜可進(jìn)行成像(例如，在顯微鏡下熒光成像)。通過將感興趣顆粒收集到收集裝置(例如，膜)的小區(qū)域中，可以有效地評價本文的方法和系統(tǒng)的性能。通過將感興趣顆粒收集到收集裝置(例如，膜)的小區(qū)域，可以限制離焦的圖像。

由本公開的泡沫組合物所釋放的感興趣顆粒可以是有活力的。由本公開的泡沫組合物所釋放的感興趣顆粒可以不具有活力。由泡沫組合物所釋放的至少50％、60％、70％、80％、90％或100％的感興趣顆?？梢允怯谢盍Φ?。由泡沫組合物所釋放的至多50％、60％、70％、80％、90％或100％的感興趣顆?？梢允怯谢盍Φ摹；盍梢酝ㄟ^形態(tài)學(xué)變化(例如，裂解)、基因表達(dá)(例如，半胱天冬酶活性)、基因活性(某些細(xì)胞路徑的關(guān)閉)以及細(xì)胞功能(例如，缺乏移動)來確定。在一些情況下，所釋放的細(xì)胞可用于下游過程(諸如ELISA、免疫試驗、培養(yǎng)以及核酸測序)。如果所釋放的細(xì)胞未能在下游試驗中表現(xiàn)良好，則該細(xì)胞可以被稱為沒有活力。在一些情況下，泡沫組合物可以在表面(例如，包含無污組合物和結(jié)合部分)上以從0.5-4mm/s的流動速率進(jìn)行流動以釋放感興趣顆粒，從而釋放結(jié)合至表面的細(xì)胞，該泡沫組合物包括4毫升的在PBS中的5％的BSA和2mL的空氣的混合物，其中泡沫組合物的至少50％的氣泡具有從10至100微米的直徑，其中至少50％的所釋放的細(xì)胞是有活力的。

所釋放的感興趣顆粒可以是至少50％、60％、70％、80％、90％或100％無非特異性感興趣顆粒。所釋放的感興趣顆?？梢允侵炼?0％、60％、70％、80％、90％或100％無非特異感興趣顆粒。非特異性感興趣顆?？梢允欠歉信d趣顆粒的任何細(xì)胞顆粒。例如，非特異性感興趣顆粒可以包括，白血細(xì)胞、紅血細(xì)胞、血清蛋白、血清核酸以及循環(huán)上皮細(xì)胞。非特異性感興趣顆粒可指無法特異性地結(jié)合至本公開的微流體芯片中所使用的結(jié)合部分的顆粒。換言之，非特異性感興趣顆?？芍覆槐磉_(dá)對結(jié)合部分具有特異性的抗原/受體的細(xì)胞。在一些情況下，泡沫組合物在表面上以從0.5-4mm/s的流動速率進(jìn)行流動可導(dǎo)致從表面除去至少50％的無污組合物和/或?qū)е滤尫诺母信d趣顆粒為至少50％無非特異感興趣顆粒，該泡沫組合物包括4毫升的在PBS中的5％的BSA和2mL的空氣的混合物，其中泡沫組合物的至少50％的氣泡具有從10至100微米的直徑。

在一些情況下，細(xì)胞群可以從(例如，微流體通道的，例如，無污組合物的)表面釋放。細(xì)胞群可以包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、100、1000、10000、100000或1000000個或更多個細(xì)胞。細(xì)胞群可以包括至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、100、1000、10000、100000或1000000個或更多個細(xì)胞。細(xì)胞群可以以至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％效率的效率從表面釋放。細(xì)胞群可以以至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％效率的效率從表面釋放。換言之，細(xì)胞群中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的細(xì)胞可以通過本公開的泡沫組合物而被釋放。細(xì)胞群中至多50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的細(xì)胞可以通過本公開的泡沫組合物而被釋放。

細(xì)胞群的細(xì)胞可以是有活力的。細(xì)胞群中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的細(xì)胞可以是有活力的。細(xì)胞群中至多50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的細(xì)胞可以是有活力的。

細(xì)胞群可以包括多個感興趣顆粒。細(xì)胞群可以包括至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的感興趣顆粒。細(xì)胞群可以包括至多20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的感興趣顆粒。細(xì)胞群可以包括多個非感興趣顆粒。細(xì)胞群可以包括至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的非感興趣顆粒。細(xì)胞群可以包括至多20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的非感興趣顆粒。

本公開的泡沫組合物的氣泡可以通過與無污組合物相互作用來除去無污組合物。氣泡的空氣-液體相互作用可以是疏水的。它可以與無污組合物的疏水部分相互作用。當(dāng)無污組合物的疏水部分包括脂質(zhì)雙層的疏水尾部時，氣泡可以與脂質(zhì)雙層的疏水尾部相互作用并破壞雙層，從而從表面移出無污組合物。

在一些情況下，當(dāng)氣泡與脂質(zhì)雙層相互作用時，它可以生成固體-液體-空氣接觸線(例如，空氣、液體和細(xì)胞之間的接觸)。細(xì)胞上的氣泡的接觸角和氣泡的液體-空氣界面的表面張力的組合可以是用于將細(xì)胞拉離表面的驅(qū)動力。如果對細(xì)胞的氣泡的空氣-液體界面的張力過強，則它可能會損壞細(xì)胞。如果表面張力太弱，則細(xì)胞可能不會從表面上被除去。表面張力可以通過泡沫組合物的組分來控制。

泡沫組合物與表面(例如，細(xì)胞)的相互作用可導(dǎo)致表面和/或無污組合物的重組(例如，分子變化)。例如，包括包含脂質(zhì)雙層的無污組合物的表面在通過與無污組合物的氣泡相互作用之后可以被破壞成單層和/或單個的脂質(zhì)分子。

所分離的細(xì)胞(諸如循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTC)可以是基本上純的。如本文所使用的，術(shù)語“基本上純的CTC群”可指其中至少約40％、50％、60％、70％、80％或90％的細(xì)胞是CTC的細(xì)胞群。在一些實施方式中，基本上純的CTC群可以包含不超過約30％、不超過約25％、不超過約20％、不超過約15％、不超過約10％、不超過多約5％、不超過約4％、不超過約3％、不超過約2％、不超過約1％、不超過約0.5％的非CTC。在一些實施方式中，基本上純的CTC群中至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％或至少約99％的細(xì)胞可以是CTC。

在一些實施方式中，脂質(zhì)層可以是抗EpCAM-SLB，并且脂質(zhì)層可以摻入具有被設(shè)計成提高混沌混合的蝕刻圖案的微流體芯片。通過控制流體流動參數(shù)，諸如CTC的靶細(xì)胞可以被捕獲。緩沖液的流動速率可以隨后增加，使得任何非特異性吸附的血液細(xì)胞被除去，而不置換任何結(jié)合的CTC。純化的CTC可以經(jīng)由SLB組件的破壞(但不是細(xì)胞膜或蛋白質(zhì)結(jié)合位點)通過空氣泡沫的溫和掃除而從裝置洗脫。CTC可以溫和地被釋放，以保持有活力并適合下游分子分析或培養(yǎng)。

組合物

本公開的組合物可以包括已釋放的感興趣顆粒(例如，已釋放的稀有細(xì)胞)。已釋放的感興趣顆粒可以指通過本公開的方法(例如，泡沫和氣泡在包括無污層的表面上流動)所釋放的細(xì)胞。在一些情況下，在釋放步驟期間，無污組合物、結(jié)合部分、連接體以及感興趣顆?；蛩鼈兊娜魏谓M合被一起釋放。在一些情況下，在釋放步驟期間，無污組合物和感興趣顆粒被一起釋放。

本公開的組合物可以包括已釋放的細(xì)胞、無污層以及來自泡沫組合物的氣泡。氣泡可以包括已釋放的細(xì)胞和無污層。換言之，氣泡可以部分地包圍無污層的脂質(zhì)。

細(xì)胞培養(yǎng)

已釋放的細(xì)胞可經(jīng)歷細(xì)胞培養(yǎng)。如本文所使用的細(xì)胞培養(yǎng)可以意指細(xì)胞的生長、維持、轉(zhuǎn)染或繁殖。細(xì)胞培養(yǎng)可在培養(yǎng)基中。如本文所使用的培養(yǎng)基可以意指用于提供維持活細(xì)胞(或組織中的活細(xì)胞)并支持它們的生長的營養(yǎng)物(例如，維生素、氨基酸、必需營養(yǎng)素、鹽等)和性質(zhì)(例如，相似性、緩沖)的液體溶液。

細(xì)胞保存

所釋放或培養(yǎng)的細(xì)胞可經(jīng)歷細(xì)胞保存。細(xì)胞的高活力存儲可能在臨床醫(yī)學(xué)和生物制藥發(fā)展方面是重要的。低溫保存可以通常用于細(xì)胞的可靠長期穩(wěn)定。在低溫保存下可以存儲存已分離的細(xì)胞，以便長期儲存。

分析

可以通過任何方式諸如光學(xué)(例如，目視檢查)、自動計數(shù)、基于顯微鏡的檢測、FACS以及電檢測(例如，庫爾特計數(shù)器)來對所收集的細(xì)胞進(jìn)行檢測和計數(shù)。對使用本公開的方法所分離的細(xì)胞或其他感興趣顆粒的計數(shù)可以用于診斷疾病、監(jiān)測疾病的進(jìn)展以及監(jiān)測或確定治療的功效。對感興趣顆粒(例如，細(xì)胞)的計數(shù)可以用于非醫(yī)學(xué)應(yīng)用中。例如對感興趣顆粒的計數(shù)可以用于確定環(huán)境樣品(例如，水、空氣和土壤)、藥物、食品或化妝品中污染物的量、存在或類型。

可以測量由本公開的方法所收集的細(xì)胞和/或感興趣顆?；蛩鼈兊牟糠值囊环N或多種性質(zhì)?？梢詼y量的生物性質(zhì)的實例可以包括mRNA表達(dá)、蛋白質(zhì)表達(dá)以及DNA定量?？蓪τ杀竟_的方法所分離的感興趣顆粒進(jìn)行測序。測序可以用于確定某些序列特征(例如，多態(tài)性和染色體異常)。

裂解可以用來分析感興趣顆粒(例如，細(xì)胞)。裂解可以在感興趣顆粒結(jié)合到無污組合物時發(fā)生。在非特異性保留的顆粒存在下可以對感興趣顆粒進(jìn)行分析。

可以從由無污組合物的結(jié)合部分所捕獲的感興趣顆粒(例如，細(xì)胞)獲得遺傳信息。這樣的遺傳信息可以包括特定基因組DNA、cDNA或mRNA序列的識別或計數(shù)；細(xì)胞表面標(biāo)記物的識別或計數(shù)；以及蛋白質(zhì)或其他細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物的識別或計數(shù)，這指示了特定腫瘤的類型或存在。可以分析細(xì)胞以確定起源組織、疾病的階段或嚴(yán)重程度或?qū)μ囟ㄖ委煹囊赘行浴?/p>

為了指示癌癥干細(xì)胞的標(biāo)記物的存在可對由本公開的方法所收集的感興趣顆粒進(jìn)行試驗。這樣的標(biāo)記物的實例可以包括C-MET、EpCAM、MUC-1、EGFR、CD133、CD44、CD24、上皮特異性抗原(ESA)、Nanog(同源域蛋白)、BMI1、DAPI、CK20、CD45、CDH17、CDX2、CK7、CK8、CK18、CK19、TTF-1、CDX2、PSA、PSMA、CEA、panCK、TCN、SΜLT2B1、ALDOB、COL11A1、PI3、CCL20、MTHFD11、IL-1b、SRPX2、SLC04A1、TESC、IL-23、CD45等。

可以使用識別細(xì)胞群內(nèi)的特異性細(xì)胞類型的抗體(例如，單克隆抗體)來進(jìn)行細(xì)胞染色?？贵w可直接用熒光化合物進(jìn)行標(biāo)記或使用例如識別第一抗體的熒光標(biāo)記的第二抗體間接地標(biāo)記?？贵w組可用于分析多標(biāo)記物成像方法中的細(xì)胞群。例如，不同的抗體可以用不同的顏色進(jìn)行標(biāo)記，并且隨后在流式細(xì)胞儀中成像和/或分析。在一些情況下，多標(biāo)記物成像方法可以增加CTC的檢測靈敏度并有助于識別表達(dá)特定的治療目標(biāo)的CTC亞群。抗體組可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20或更多種不同類型的抗體。例如，抗體組可以包括對應(yīng)于標(biāo)記物panCK、CK18、CK7、TTF-1、CK20、CDX2、PSA以及PSMA的抗體。例如，抗體組可以包括抗panCK、抗CK18、抗CK7、抗TTF-1、混合有抗CDX-2的抗CK20、混合有抗PSMA的抗PSA。

利用抗體組對細(xì)胞群進(jìn)行染色可以涉及多個操縱步驟。例如，1)可以制備來自群的一系列樣品；2)來自組的一種抗體可與每個樣品結(jié)合，并且得到的混合物可被孵育，使得抗體可結(jié)合至其中該抗體識別的樣品中的細(xì)胞；3)可以執(zhí)行細(xì)胞的一次或多次洗滌以除去任何未結(jié)合的抗體。在一些情況下，如果第一抗體沒有直接用熒光化合物標(biāo)記，則可能需要利用其他抗體或試劑的額外的孵育和額外的洗滌，以對結(jié)合至細(xì)胞的未共軛的一級抗體(一抗)進(jìn)行標(biāo)記。

細(xì)胞染色之后接著可以是進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，以確定相對于群中細(xì)胞的總數(shù)的已染色的細(xì)胞的數(shù)目。市售設(shè)備(例如由諸如CoμLter Electronics、Hialeah、Fla.以及Becton-Dickinson、Mountain View、Calif.這樣的公司制造的設(shè)備)可用于執(zhí)行細(xì)胞分類和分析的計數(shù)步驟。

臨床應(yīng)用

CTC的特征可以為治療患者和有助于個體化治療策略提供有價值的信息。例如，可檢測的CTC的數(shù)目和/或數(shù)目的變化可被用于預(yù)測患者結(jié)果和對治療的反應(yīng)。例如，CTC可用于識別在腫瘤細(xì)胞中影響治療決策的遺傳改變。在一些情況下，檢測、定量或評估患者的血流內(nèi)CTC的分子特征的能力可允許細(xì)胞特征的遺傳操縱和/或使細(xì)胞行為變化，同時CTC在至轉(zhuǎn)移位點的途中，并從而改變患者結(jié)果。例如，通過基因組學(xué)、表觀基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和/或蛋白質(zhì)組學(xué)方法對CTC的進(jìn)一步分析可幫助臨床醫(yī)生實時了解腫瘤生物學(xué)。在一些情況下，CTC可用于研究癌細(xì)胞對治療壓力的反應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)針對癌癥的新型生物標(biāo)記物和藥物靶。

本文所描述的系統(tǒng)和方法可以用于評價有利或不利的存活，并且在預(yù)后有利時，有助于防止可能導(dǎo)致有害的副作用的不必要治療。因此，本發(fā)明可以用于任何的多種癌癥的預(yù)后，該癌癥包括但不限于包括突顯癌癥的實體腫瘤和白血?。喊非绑w攝取與脫羧細(xì)胞瘤、迷芽瘤、鰓原瘤、惡性類癌綜合征、類癌心臟疾病、癌(即，沃克癌、基底細(xì)胞癌、基底鱗狀細(xì)胞、布朗-皮爾斯、導(dǎo)管癌、艾氏癌、克雷布斯2癌、梅克爾細(xì)胞癌、粘液癌、非小細(xì)胞肺癌、燕麥細(xì)胞癌、乳頭狀癌、硬癌、細(xì)支氣管癌、支氣管癌、鱗狀細(xì)胞癌以及移行細(xì)胞癌)、組織細(xì)胞病癥、白血病(即B細(xì)胞白血病、混合細(xì)胞白血病、空細(xì)胞白血病、T細(xì)胞白血病、T細(xì)胞慢性白血病、HTLV-Ⅱ相關(guān)白血病、淋巴細(xì)胞急性白血病、淋巴細(xì)胞慢性白血病、肥大細(xì)胞白血病以及骨髓性白血病)、惡性組織細(xì)胞增多癥、霍奇金病、免疫增殖小腸疾病、非霍奇金淋巴瘤、漿細(xì)胞瘤、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖、黑色素瘤、軟骨母細(xì)胞瘤、軟骨瘤、軟骨肉瘤、纖維瘤、纖維肉瘤、巨細(xì)胞瘤、組織細(xì)胞瘤、脂肪瘤、脂肪肉瘤、間皮瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、骨瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、滑膜瘤、腺纖維瘤、腺淋巴瘤、癌肉瘤、脊索瘤、顱咽管瘤、無性細(xì)胞瘤、錯構(gòu)瘤、間質(zhì)瘤、中腎瘤、肌肉瘤、成釉細(xì)胞瘤、牙骨質(zhì)瘤、牙瘤、畸胎瘤、胸腺瘤、滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤、腺癌、腺瘤、膽管癌、膽脂瘤、圓柱瘤、囊腺癌、囊腺瘤、粒狀細(xì)胞瘤、兩性胚胎細(xì)胞瘤、肝癌、汗腺瘤、胰島細(xì)胞瘤、萊氏細(xì)胞瘤、乳頭狀瘤、支持細(xì)胞瘤、卵泡膜細(xì)胞瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、成肌細(xì)胞瘤、肌瘤、肌肉瘤、橫紋肌瘤、橫紋肌肉瘤、室管膜瘤、神經(jīng)節(jié)瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、髓母細(xì)胞瘤、腦膜瘤、神經(jīng)鞘瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)上皮瘤、神經(jīng)纖維瘤、神經(jīng)瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤、非嗜鉻副神經(jīng)節(jié)瘤、血管角化瘤、嗜伊紅血球過多血管淋巴樣增生、硬化性血管瘤、血管瘤病、血管球瘤、血管內(nèi)皮細(xì)胞瘤、血管瘤、血管外皮細(xì)胞瘤、血管肉瘤、淋巴管瘤、淋巴管肌瘤、淋巴管肉瘤、松果體瘤、癌肉瘤、軟骨肉瘤、囊性肉瘤、葉狀瘤、纖維肉瘤、血管肉瘤、平滑肌肉瘤、白色肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、肌肉瘤、粘液肉瘤、卵巢癌、橫紋肌肉瘤、肉瘤(即尤因氏實驗肉瘤、卡波西氏肉瘤以及肥大細(xì)胞肉瘤)、腫瘤(即骨腫瘤、乳腺腫瘤、消化系統(tǒng)腫瘤、結(jié)腸直腸腫瘤、肝腫瘤、胰腺腫瘤、垂體腫瘤、睪丸腫瘤、眼眶腫瘤、頭頸腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、聽神經(jīng)腫瘤、盆腔腫瘤、呼吸道腫瘤和泌尿生殖腫瘤)、神經(jīng)纖維瘤以及宮頸發(fā)育不良。

使用本文所描述的系統(tǒng)和方法分析所需的血液的體積可以等于約或小于25μL、50μL、75μL、100μL、0.2mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL、5mL、5.5mL、6mL、6.5mL、7mL、7.5mL或8mL、9mL、10mL、11mL、12mL、13mL、14mL、15mL或16mL。使用本文描述的系統(tǒng)和方法分析所需的血液的體積可以等于或至多達(dá)25μL、50μL、75μL、100μL、0.2mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL、5mL、5.5mL、6mL、6.5mL、7mL、7.5mL或8mL、9mL、10mL、11mL、12mL、13mL、14mL、15mL或16mL。

用于識別CTC源或癌癥的起源組織的方法

感興趣顆粒(例如，CTC)上的某些標(biāo)記物的存在可以指示CTC的源或起源或癌癥的起源組織。標(biāo)記物可以通過利用特定的(例如，特異性的)抗體對感興趣顆粒進(jìn)行染色并隨后成像(例如，熒光成像)來進(jìn)行識別。例如，CK18可以在簡單上皮、導(dǎo)管上皮以及假復(fù)層上皮中大量表達(dá)，這可以是對腫瘤有用的標(biāo)記物。例如，CK18可用作基于在乳腺癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌、前列腺癌以及胰腺癌中的表達(dá)的癌檢測標(biāo)記物。例如，感興趣顆粒諸如CTC可以利用抗CK18進(jìn)行染色并且可以對CK18標(biāo)記物的存在進(jìn)行評估。例如，CK7的存在可被用作起源于乳腺、肺或胰腺的CTC的代表。例如，CK7可用作識別起源于乳腺癌、肺癌或胰腺癌的CTC的代表。例如，可以利用抗CK7對感興趣顆粒諸如CTC進(jìn)行染色，并且可以對CK7標(biāo)記物的存在進(jìn)行評估。例如，TTF-1的存在可以用作起源于肺、甲狀腺或間腦的CTC的代表。例如，TTF-1的存在可以用作起源于肺癌、甲狀腺癌或間腦綜合征的CTC的代表。例如，感興趣顆粒諸如CTC可以利用抗TTF-1進(jìn)行染色，并且可以對TTF-1標(biāo)記物的存在進(jìn)行評估。例如，混合有抗CDX-2的抗CK20可以用于檢測起源于結(jié)腸的CTC。例如，混合有抗CDX-2的抗CK20可用于檢測起源于結(jié)腸直腸癌的CTC。例如，混合有抗PSMA的抗PSA可用于檢測起源于前列腺的CTC。例如，混合有抗PSMA的抗PSA混合可用于檢測起源于前列腺癌的CTC。在一些情況下，組合CK20和CK8/18/19可以顯著地增加CTC檢測率。

用于CTC檢測的多標(biāo)記物分析可用于臨床應(yīng)用。例如，抗體組可用于在多標(biāo)記物成像方法中分析細(xì)胞群。抗體組可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20種或更多種不同類型的抗體。例如，抗體組可以包括對應(yīng)于標(biāo)記物panCK、CK18、CK7、TTF-1、CK20、CDX2、PSA以及PSMA的抗體。例如，抗體組可以包括抗panCK、抗CK18、抗CK7、抗TTF-1、混合有抗CDX-2的抗CK20、混合有抗PSMA的抗PSA?？筙，其中X是如本文所提及的任何標(biāo)記物，可指對應(yīng)于標(biāo)記物X或?qū)?biāo)記物X特異性的抗體。利用多標(biāo)記物的CTC檢測試驗不僅可以適用于不同類型的癌癥，以建立臨床相關(guān)性，而且還可以使CTC作為健康個體癌癥篩查或早期癌癥患者、甚至與癌癥未知的主要源的個體的早期檢測工具。

圖4提供了根據(jù)實施方式的用于CTC檢測的決策樹。例如，抗體組可以包括抗panCK、抗CK18、抗CK7、抗TTF-1、混合有抗CDX-2的抗CK20、混合有抗PSMA的抗PSA?？筽anCK和/或抗CK18可用于分析CTC作為第一步驟401(例如，識別癌細(xì)胞)。在第二步驟403中，抗CK7、抗TTF-1、混合有抗CDX-2的抗CK20以及混合有抗PSMA的抗PSA可用于分析CTC。例如，對CK7陽性的CTC可指示起源于乳腺、肺或胰腺的CTC。例如，對CK7陽性的CTC可指示乳腺癌、肺癌或胰腺癌。例如，對TTF-1陽性的CTC可指示起源于肺、甲狀腺或間腦的CTC。例如，對TTF-1陽性的CTC可以指示肺癌、甲狀腺癌或間腦綜合征。例如，對混合有抗CDX-2的抗CK20陽性的CTC可指示起源于結(jié)腸的CTC。例如，對混合有抗CDX-2的抗CK20陽性的CTC可以指示結(jié)腸直腸癌。例如，對混合有抗PSMA的抗PSA陽性的CTC可以指示起源于前列腺的CTC。例如，對混合有抗PSMA的抗PSA陽性的CTC可以指示前列腺癌?？梢灶A(yù)測癌癥率或癌癥的可能性。例如，通過使用抗體組，如果對不同抗體存在陽性的染色的細(xì)胞，則可以預(yù)測細(xì)胞起源或癌癥起源的可能性。例如，預(yù)測率可以被計算為每個標(biāo)記物的染色效率*癌癥流行程度*100％。在一些實施方式中，乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、前列腺癌和/或肺癌的幾率可以被預(yù)測為等于約或大于1％、5％、15％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。

用于評估疾病的存在、不存在、進(jìn)展和/或嚴(yán)重程度的分子分析

本文所描述的靶細(xì)胞可以是循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTC。本公開對用于基于對CTC的分子分析提供了對患有癌癥的患者疾病進(jìn)展(例如，癌癥進(jìn)展)進(jìn)行評估的系統(tǒng)和方法。例如，對患者的癌癥進(jìn)展進(jìn)行評估的方法可以包括：1)根據(jù)本文所描述的方法從患者分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)；以及2)對CTC執(zhí)行一種或多種細(xì)胞或分子分析，以確定患者的癌癥進(jìn)展。

在一些實施方式中，癌癥選自由肺癌、食管癌、膀胱癌、胃癌、結(jié)腸癌、皮膚癌、乳頭狀甲狀腺癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、骨盆癌以及睪丸癌組成的組。

在一些實施方式中，一種或多種細(xì)胞或分子分析包括形態(tài)分析、基因組分析、表觀基因組分析、轉(zhuǎn)錄組分析、蛋白組分析或它們的任何組合。

在一些實施方式中，一種或多種細(xì)胞或分子分析可以包括確定CTC中的一個或多個DNA突變。在某些實施方式中，DNA突變可以包括插入、缺失、取代、轉(zhuǎn)移、基因擴增或它們的任何組合。在某些實施方式中，DNA突變位于選自由KRAS、APC、TP53、BRAF、PTEN、EGFR、ERCCL、RRMl、ELM4、HER2以及ALK組成的組的基因中。

在一些實施方式中，一種或多種細(xì)胞或分子分析可以包括確定CTC中癌癥特異性基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。在一些實施方式中，一種或多種細(xì)胞或分子分析可以包括確定CTC中癌癥特異性基因的RNA表達(dá)水平。

在一些實施方式中，癌癥特異性基因是細(xì)胞角蛋白、前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、粘蛋白-1(MUC-1)、人表皮生長因子受體2(HER2)、絨毛膜促性腺激素(hCG)、α-甲胎蛋白(AFP)、肝細(xì)胞癌(HCC)、N-鈣粘蛋白、上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)、表皮生長因子受體(EGFR)、ERCC1、雄激素受體(AR)、人平衡型核苷轉(zhuǎn)運蛋白1(hENTl)、RRMl或癌胚抗原(CEA)。

在一些實施方式中，用于對患者的癌癥進(jìn)展進(jìn)行評估的方法還可以包括通過染色檢測CTC中的一種或多種癌癥特異性標(biāo)記物的表達(dá)，以及計數(shù)已染色的細(xì)胞?；颊叩哪[瘤的階段和/或預(yù)后可以基于癌癥特異性CTC的分子分析和計數(shù)的組合結(jié)果來確定。

可以使用癌癥特異性標(biāo)記物。這樣的標(biāo)記物可以包括：(1)在疾病中升高的標(biāo)記物，諸如在睪丸癌和滋養(yǎng)細(xì)胞疾病中升高的人類絨毛膜促性腺激素(hCG)，以及在肝細(xì)胞癌(HCC)中升高的α-甲胎蛋白(AFP)；(2)疾病中定性地改變的mRNA或蛋白質(zhì)標(biāo)記物，諸如膀胱癌中CD44的mRNA的剪接變體以及肺癌和結(jié)腸直腸癌中的p53蛋白的突變；(3)在特定組織、器官、或者器官系統(tǒng)中正常表達(dá)但是在不恰當(dāng)?shù)纳眢w隔室中出現(xiàn)的蛋白質(zhì)標(biāo)記物。實例包括前列腺特異性抗原(PSA)和癌胚抗原(CEA)。CEA濃度在診斷患有包括炎性腸疾病和結(jié)腸的腺癌的結(jié)腸疾病的許多患者的血液、血漿或血清中顯著升高，并且被用作結(jié)腸疾病的指標(biāo)。在一些情況下，標(biāo)記物可以包括DAPI、細(xì)胞角蛋白(例如，CK7、CK 18、CK19、CK20等)、CD45、CDH17、CDX2、TTF-1、CDX2、PSA、PSMA、CEA、panCK、TCN、SΜLT2B1、ALDOB、COL11A1、PI3、CCL20、HER2等。在一些情況下，癌癥特異性標(biāo)記物可以是細(xì)胞角蛋白、CDX1、CDH17、前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、粘蛋白-1(MUC-1)、人表皮生長因子受體2(HER2)、絨毛膜促性腺激素(hCG)、α-甲胎蛋白(AFP)、肝細(xì)胞癌(HCC)、N-鈣粘蛋白、表皮生長因子受體(EGFR)、ERCC1、雄激素受體(AR)、人平衡型核苷轉(zhuǎn)運蛋白1(hENTl)、RRMl或癌胚抗原(CEA)、CD44和p53、上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)、GD2、GM2、GM1、GD1a、GT1b、A2B5、Tf、Tn、Globo H、CD133、CD24、CD44、CD90、ER或PR。

在一些情況下，特定的癌癥可以表達(dá)特定的標(biāo)記物。例如，乳腺疾病的存在、不存在、進(jìn)展和/或嚴(yán)重程度可以通過利用抗CK7、抗HER2、抗ER以及抗PR對稀有細(xì)胞(例如CTC)進(jìn)行染色并分析結(jié)果來進(jìn)行評估。在一些情況下，乳腺疾病的存在、不存在、進(jìn)展和/或嚴(yán)重程度可以通過利用選自由抗CK7、抗HER2、抗ER以及抗PR組成的組中的一種或多種抗體對稀有細(xì)胞(例如CTC)進(jìn)行染色并分析結(jié)果來進(jìn)行評估。在一些情況下，可使用所有四種抗體對稀有細(xì)胞進(jìn)行染色。例如，結(jié)腸疾病、GI疾病和/或卵巢疾病/子宮內(nèi)膜疾病的存在、不存在、進(jìn)展和/或嚴(yán)重程度可以通過利用DAPI、抗CK20以及抗CD45對稀有細(xì)胞(例如，CTC)進(jìn)行染色并分析結(jié)果來進(jìn)行評估。例如，乳腺疾病或前列腺疾病的存在、不存在、進(jìn)展和/或嚴(yán)重程度可以通過利用抗PSA和抗PSMA對稀有細(xì)胞(例如，CTC)進(jìn)行染色并分析結(jié)果來進(jìn)行評估。例如，肺部疾病的存在、不存在、進(jìn)展和/或嚴(yán)重程度可以通過利用抗CK7、抗TTF1以及抗EGFR對稀有細(xì)胞(例如，CTC)進(jìn)行染色并分析結(jié)果來進(jìn)行評估。在一些情況下，肺部疾病的存在、不存在、進(jìn)展和/或嚴(yán)重程度可通過利用選自由抗CK7、抗TTF1以及抗EGFR組成的組中的一種或多種抗體對稀有細(xì)胞(例如，CTC)進(jìn)行染色并分析結(jié)果來進(jìn)行評估。在一些情況下，可以使用所有三種抗體對稀有細(xì)胞進(jìn)行染色。

在一些實施方式中，患者的癌癥存在、癌癥進(jìn)展或腫瘤生長可以與CTC負(fù)荷(例如，CTC計數(shù)、CTC量等)相關(guān)聯(lián)。例如在個體內(nèi)，當(dāng)腫瘤體積大于預(yù)定量時，CTC負(fù)荷和腫瘤生長可以相關(guān)聯(lián)。腫瘤體積的預(yù)定量可以是約或大于10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500mm³。

在一些實施方式中，癌癥的存在或進(jìn)展可基于樣品中所發(fā)現(xiàn)的CTC數(shù)目的CTC截止值來進(jìn)行預(yù)測。如本文所使用的癌癥的存在或進(jìn)展可以包括發(fā)育不良、階段I、階段II、階段III或階段IV癌癥、轉(zhuǎn)移、微轉(zhuǎn)移、息肉等。用于檢測癌癥的存在或進(jìn)展所需的血液的體積可以等于約或小于25μL、50μL、75μL、100μL、0.2mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL、5mL、5.5mL、6mL、6.5mL、7mL、7.5mL或8mL、9mL、10mL、11mL、12mL、13mL、14mL、15mL或16mL。檢測癌癥的存在或進(jìn)展所需的血液的體積可以等于或至多達(dá)25μL、50μL、75μL、100μL、0.2mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL、5mL、5.5mL、6mL、6.5mL、7mL、7.5mL或8mL、9mL、10mL、11mL、12mL、13mL、14mL、15mL或16mL。樣品中的CTC截止值可以為約或大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、80、100、120、140、160、180、200、250或300個CTC。例如，在2mL外周血的樣品中檢測3個或更多個CTC可以預(yù)測具有圖22中所示的臨床可接受的特異性和敏感性的結(jié)腸直腸(CRC)癌癥。例如，在多達(dá)6mL血液的樣品中檢測3個或更多個CTC可預(yù)測具有臨床可接受的特異性和敏感性的癌癥。在一些實施方式中，癌癥進(jìn)展可以由不同的階段來限定。例如，階段可以包括正常/增生性息肉、腺瘤/發(fā)育不良性息肉、階段0/1、2、3或4。癌癥進(jìn)展的每個不同階段可基于具有臨床上可接受的敏感性和特異性的特定的CTC截止值來預(yù)測。在一些情況下，疾病的存在可以在成像診斷之前進(jìn)行評估或確定。例如，使用本文所提及的方法和系統(tǒng)，癌癥的診斷或預(yù)后可在由成像技術(shù)無法檢測或無法確定的階段發(fā)生。癌癥的診斷可基于具有臨床上可接受的敏感性和特異性的特定的CTC截止值來預(yù)測。敏感性可以為約或大于50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。特異性可以為約或大于50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。敏感性和特異性可以通過接受者操作特性(ROC)曲線下的面積來限定。ROC曲線下的面積可以為約或大于0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9或0.95。癌癥的陽性檢測率(對應(yīng)于不同的階段)可以為約或大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些實施方式中，癌癥可以是腦癌、肺癌、乳腺癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽管癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌以及前列腺癌。

在一些實施方式中，血源播散轉(zhuǎn)移可基于CTC截止值或在樣品中所檢測的CTC來進(jìn)行預(yù)測。檢測樣品中的CTC所需的血液的體積可以等于約或小于25μL、50μL、75μL、100μL、0.2mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL、5mL、5.5mL、6mL、6.5mL、7mL、7.5mL或8mL、9mL、10mL、11mL、12mL、13mL、14mL、15mL或16mL。檢測樣品中的CTC所需的血液的體積可以等于或至多達(dá)25μL、50μL、75μL、100μL、0.2mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL、5mL、5.5mL、6mL、6.5mL、7mL、7.5mL或8mL、9mL、10mL、11mL、12mL、13mL、14mL、15mL或16mL。樣品中的CTC截止值可以為約或大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、80、100、120、140、160、180、200、250或300個CTC。例如，在5ml外周血的樣品中檢測6個或更多個CTC可預(yù)測具有臨床上可接受的特異性和敏感性的血源播散轉(zhuǎn)移(例如，肝臟轉(zhuǎn)移)。例如，患有壺腹周圍惡性腫瘤的患者的門靜脈血液中的高CTC計數(shù)可能是手術(shù)后1年內(nèi)肝臟轉(zhuǎn)移的重要預(yù)測因子。敏感性可以為約或大于50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。特異性可以為約或大于50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。敏感性和特異性可以通過接受者操作特性(ROC)曲線下的面積來限定。ROC曲線下的面積可以為約或大于0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9或0.95。血源播散轉(zhuǎn)移的陽性檢測率可以為約或大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。

在一些實施方式中，良性疾病可以基于CTC截止值或在樣品中檢測到的CTC進(jìn)行預(yù)測。檢測樣品中的CTC所需的血液的體積可以等于約或小于25μL、50μL、75μL、100μL、0.2mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL、5mL、5.5mL、6mL、6.5mL、7mL、7.5mL或8mL、9mL、10mL、11mL、12mL、13mL、14mL、15mL或16mL。樣品中的CTC截止值可以為約或大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、80、100、120、140、160、180、200、250或300個CTC。例如，2mL的外周血的樣品中3個或更多個CTC檢測可以預(yù)測具有臨床可接受的特異性和敏感性的良性結(jié)腸疾病。例如，2mL的外周血的樣品中3個或更多個CTC檢測可以預(yù)測具有臨床可接受的特異性和敏感性的息肉。敏感性可以為約或大于50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。特異性可以為約或大于50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。敏感性和特異性可以通過接受者操作特性(ROC)曲線下的面積來限定。ROC曲線下的面積可以為約或大于0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9或0.95。良性疾病的陽性檢測率可以為約或大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。

CTC檢測可能受到臨床狀況的影響。例如，CTC檢測在患有腸梗阻、先前息肉切除的患者、失血、梗阻和/或穿孔的患者中可能升高或降低?？煽紤]因素，以便增加本文所提到的疾病或轉(zhuǎn)移的特異性、敏感性和/或陽性檢測率。這樣的因素可以包括但不限于年齡、性別、腫瘤部位、CEA升高、腫瘤腸梗阻、腫瘤大小、大體類型(例如，息肉樣、潰瘍性、浸潤性)、T分級、N類、組織分化(良好、中度)等?；诩膊?例如，癌癥)的存在、不存在、進(jìn)展和/或嚴(yán)重程度，可以選擇藥物治療或治療方案。

用于對疾病的存在、不存在和/或嚴(yán)重程度進(jìn)行評估的方法

本公開還可以提供用于對受試者的疾病的存在和/或嚴(yán)重程度進(jìn)行評估的方法。例如，用于對受試者的疾病的存在和/或嚴(yán)重程度進(jìn)行評估的方法可以包括：1)根據(jù)本文所描述的方法從患者分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)；2)通過染色檢測CTC中的一種或多種疾病特異性標(biāo)記物的表達(dá)；3)計數(shù)所染色的細(xì)胞；并且其中已染色的細(xì)胞的數(shù)目與對照相比的變化是疾病的存在和/或嚴(yán)重程度的特征；由此，對疾病的存在和/或嚴(yán)重程度進(jìn)行評估。

在一些實施方式中，疾病的存在和/或嚴(yán)重程度可基于疾病特異性CTC的分子分析和計數(shù)的組合結(jié)果進(jìn)行確定。

在一些實施方式中，疾病的存在和/或嚴(yán)重程度可基于一種或多種因素的組合進(jìn)行確定，其中這些因素均分別加權(quán)，以提供該疾病的存在和/或嚴(yán)重程度的單個矩陣值?？梢钥紤]因素以便增加疾病的存在、不存在和/或嚴(yán)重程度的特異性、敏感性和/或陽性檢測率。如果在確定中使用了兩種或更多種因素(例如，疾病的存在、不存在和/或嚴(yán)重程度)，則每種因素的水平可被加權(quán)并組合。因此，可以通過(a)對每種因素的確定的水平利用預(yù)定系數(shù)進(jìn)行加權(quán)以及(b)組合已加權(quán)的水平以提供值。組合步驟可以是通過直接相加或進(jìn)行平均(例如，等同地進(jìn)行加權(quán))或者通過不同的預(yù)定系數(shù)。因素可以包括：CTC的數(shù)目、CTC的分子特征(某些突變的存在或不存在、基因表達(dá)、拷貝數(shù)變異等)、受試者的年齡、受試者的性別、疾病的遺傳、位置、家族史、既往病史、在先治療或其缺乏。在得出存在和/或嚴(yán)重程度的可能性的最終顯示/結(jié)果時對上述各因素進(jìn)行評估和加權(quán)。

關(guān)于一種或多種因素、它們的權(quán)重或值(例如，通過組合步驟確定的)的信息可以以計算機可讀的形式進(jìn)行存儲。最終顯示/結(jié)果可以通過計算機可讀介質(zhì)和/或計算機系統(tǒng)。這樣的計算機系統(tǒng)通常包括主要子系統(tǒng)，諸如中央處理器、系統(tǒng)存儲器(通常為RAM)、輸入/輸出(I/O)控制器、外部裝置(諸如經(jīng)由顯示適配器的顯示屏幕、串行端口、鍵盤、經(jīng)由存儲接口的固定磁盤驅(qū)動器和可操作以接收軟盤的軟盤驅(qū)動器以及可操作以接收CD-ROM的CD-ROM(或DVD-ROM)裝置)?？梢赃B接許多其他裝置，例如經(jīng)由串行端口連接的網(wǎng)絡(luò)接口。

計算機系統(tǒng)還可以鏈接到網(wǎng)絡(luò)，包括多個經(jīng)由數(shù)據(jù)鏈路鏈接的計算裝置，諸如以太網(wǎng)電纜(同軸電纜或的10BaseT)、電話線路、ISDN線路、無線網(wǎng)絡(luò)、光纖或其他適合的信號傳輸介質(zhì)，由此至少一個網(wǎng)絡(luò)裝置(例如，計算機、磁盤陣列等)包括構(gòu)成對從本發(fā)明的試驗獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行編碼的位模式(位組合格式，bit pattern)的磁域(例如，磁盤)和/或電荷域(例如，DRAM單元陣列)的模式。

計算機系統(tǒng)可以包括用于對評價疾病的存在、不存在和/或嚴(yán)重程度的研究結(jié)果進(jìn)行解釋的代碼。因此，在示例性的實施方式中，將該結(jié)果提供給計算機，其中中央處理器執(zhí)行用于確定具有結(jié)腸直腸癌的患者的可能性的計算機程序。圖20示出了用戶、樣品、計算機以及輸出之間的相互作用。例如，用戶可以是患者。樣品可以是患者血液樣品。患者血液樣品可以包括稀有細(xì)胞(例如，CTC細(xì)胞)，其可使用本文所提到的方法進(jìn)行分析。該分析還可以包括利用對研究結(jié)果進(jìn)行解釋的代碼。研究結(jié)果的分析、代碼或解釋可以(例如，通過計算機到計算機終端、經(jīng)由計算機終端上的數(shù)據(jù)、通過連接至因特網(wǎng)的調(diào)制解調(diào)器等)發(fā)送至和/或輸出至接收方。

本發(fā)明還提供了計算機系統(tǒng)的使用，諸如上面所描述的計算機系統(tǒng)，其包括：(1)計算機；(2)對通過本發(fā)明的方法所獲得的測試結(jié)果進(jìn)行編碼的存儲位模式，其可以存儲在計算機中；(3)以及，可選地，(4a)用于選擇具有疾病的患者的藥物治療的程序，或(4b)用于對患有癌癥的患者的陽性預(yù)后的可能性進(jìn)行預(yù)測的程序。

在一些實施方式中，疾病可以是癌癥。已染色的細(xì)胞的增加數(shù)目可以是癌癥或轉(zhuǎn)移的指示。癌癥的實例包括但不限于腦癌、肺癌、乳腺癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽管癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌癌以及前列腺癌。

在一些實施方式中，疾病是癌前病癥。癌前病癥的實例包括光化性角化病、巴雷特食管、萎縮性胃炎、先天性角化不良、缺鐵性吞咽困難、扁平苔蘚、口腔黏膜下纖維化、日光性彈力組織變性以及宮頸發(fā)育不良。

疾病的存在(例如，癌癥或腫瘤的診斷)和/或嚴(yán)重程度可以通過如本文所公開的稀有細(xì)胞(例如，CTC細(xì)胞)進(jìn)行評估。在一些情況下，CTC細(xì)胞可被用作疾病或疾病的嚴(yán)重程度的標(biāo)記物。在一些情況下，CTC細(xì)胞可以被用作在任何成像技術(shù)(例如CT掃描、超聲波、PET、MRI等)能夠檢測疾病(例如，癌癥或腫瘤)的存在之前的疾病的標(biāo)記物。例如，來自血液樣品(例如，外周血液樣品)的CTC計數(shù)可以(例如，通過與截止值進(jìn)行比較)用作疾病的存在和/或疾病的嚴(yán)重程度的標(biāo)記物。

用于檢測結(jié)腸直腸癌或胃腸(GI)道消化疾病的方法

本公開可以提供了用于檢測人類患者的結(jié)腸直腸癌或胃腸(GI)道疾病的方法。例如，用于檢測人類患者的結(jié)腸直腸癌或胃腸(GI)道疾病的方法可以包括：1)從受試者分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)；2)通過染色檢測CTC中選自由DAPI、CK20、CD45、CDH17、CDX2、CK7、CEA、panCK、TCN、SΜLT2B1、ALDOB、COL11A1、PI3、CCL20、MTHFD11、IL-1b、SRPX2、SLC04A1、TESC以及IL-23a組成的組中的一種或多種標(biāo)記物的表達(dá)；3)計數(shù)所染色的細(xì)胞；以及其中，所染色的細(xì)胞的數(shù)目和/或與對照相比數(shù)目的變化是結(jié)腸直腸癌或胃腸(GI)道疾病的存在和/或嚴(yán)重程度的指示。例如，用于檢測人類患者的結(jié)腸直腸癌或胃腸(GI)道疾病的方法可以包括：1)從受試者分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)；2)通過染色檢測CTC中的一種或多種標(biāo)記物的表達(dá)，該標(biāo)記物包括DAPI、CK20、CD45、CDH17、CDX2、CK7、CK8、CK18、CK19、TTF-1、CDX2、PSA、PSMA、CEA、panCK、TCN、SΜLT2B1、ALDOB、COL11A1、PI3、CCL20、MTHFD11、IL-1b、SRPX2、SLC04A1、TESC以及IL-23a；3)計數(shù)所染色的細(xì)胞；以及其中，所染色的細(xì)胞的數(shù)目和/或與對照相比數(shù)目的變化是結(jié)腸直腸癌或胃腸(GI)道疾病的存在和/或嚴(yán)重程度的指示。

在一些實施方式中，患者中結(jié)腸直腸癌或胃腸(GI)道疾病的存在和/或嚴(yán)重程度可基于所染色的CTC的分子分析和計數(shù)的組合結(jié)果來確定。樣品中所染色的細(xì)胞的數(shù)目被確定，并且與對照(例如，來自已知具有癌癥(陽性對照)的個體或個體組的樣品或來自已知不具有癌癥(正常、無疾病或陰性對照)的個體或個體組的樣品)進(jìn)行比較。

在一些實施方式中，檢測可以基于CTC中的DAPI+/CK20+/CD45-的表達(dá)。例如，假定對照是針對已知不具有結(jié)腸直腸癌或胃腸(GI)道疾病的個體組(正常、非疾病或陰性對照)所建立的DAPI+/CK20+/CD45-表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)范圍，高于DAPI+/CK20+/CD45-表達(dá)細(xì)胞的正常百分比可以指示結(jié)腸直腸癌或胃腸(GI)道疾病的存在和/或嚴(yán)重程度。

在一些實施方式中，人類患者可以患有或疑似患有結(jié)腸直腸癌。在一些實施方式中，結(jié)腸直腸癌患者是患有是階段0、階段I、階段II、階段III和/或階段IV結(jié)腸直腸癌的結(jié)腸直腸癌。

在一些實施方式中，人類患者患有或疑似患有胃腸(GI)道疾病。在某些實施方式中，胃腸道疾病是巴雷特食管、胃潰瘍、胃炎、平滑肌瘤、息肉、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、胰腺炎、腺癌、粘液腺癌、類癌腫瘤、鱗狀細(xì)胞癌、淋巴瘤和肉瘤。

用于監(jiān)測治療方案的功效的方法

本公開可以提供用于監(jiān)測治療方案的功效的方法。例如，用于監(jiān)測治療方案的功效的方法可以包括：1)根據(jù)本文所描述的方法從患者分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)；2)通過染色檢測CTC中的一種或多種疾病特異性標(biāo)記物的表達(dá)；3)計數(shù)所染色的細(xì)胞；且其中治療方案的功效基于所染色的細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行確定。

如本文所使用的，術(shù)語“樣品”可以包括任何化學(xué)樣品或生物樣品。化學(xué)樣品可指任何化學(xué)混合物或化學(xué)化合物。生物樣品可以包括但不限于細(xì)胞培養(yǎng)物或其提取物；從動物(例如，哺乳動物)或其提取物獲得的活組織檢查材料；以及血液、唾液、尿液、糞便、精液、淚液或其他體液或其提取物。例如，術(shù)語“生物樣品”可指從任何活體獲得的、通過任何活體排出或分泌的任何固體或流體樣品，包括單細(xì)胞微生物(諸如細(xì)菌和酵母)和多細(xì)胞有機體(諸如植物和動物，例如脊椎動物或哺乳動物，特別是健康的或表面健康的人類受試者或受待診斷或研究的病癥或疾病影響的人類患者)。生物樣品可以是任何形式，包括固體材料，諸如組織、細(xì)胞、細(xì)胞沉淀、細(xì)胞提取物、細(xì)胞勻漿或細(xì)胞部分；或活組織檢查或生物流體。生物流體可從任何位點獲得(例如血液、唾液(或含口腔細(xì)胞的漱口劑)、淚液、血漿、血清、尿液、膽汁、腦脊髓液、羊水、腹膜液和胸膜液或來自其的細(xì)胞、眼房水或玻璃體液或任何身體分泌物)、漏出液、滲出液(例如從膿腫或感染或炎癥的任何其他位點所獲得的流體)或從關(guān)節(jié)獲得的流體(例如正常關(guān)節(jié)或受諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)或膿毒性關(guān)節(jié)炎的疾病的影響的關(guān)節(jié))。生物樣品可從任何器官或組織(包括活組織檢查或尸體解剖標(biāo)本)獲得，或者可以包括細(xì)胞(無論是原代細(xì)胞或培養(yǎng)的細(xì)胞)或由任何細(xì)胞、組織或器官調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基。生物樣品還可以包括組織切片，諸如為了組織學(xué)的目的而取得的冷凍切片。生物樣品還包括生物分子的混合物，包括由部分或全部細(xì)胞或組織勻漿物分餾所生成的蛋白、脂質(zhì)、碳水化合物以及核酸。雖然樣品優(yōu)選地從人類受試者中取得，但是生物樣品可以是來自任何動物、植物、細(xì)菌、病毒、酵母等。如本文所使用的動物可指在任何發(fā)育階段的人類以及非人類動物，包括例如哺乳動物、鳥類、爬行動物、兩棲動物、魚類、蠕蟲和單細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)物和活組織樣品可以被認(rèn)為是多種動物。在一些實施方式中，非人類動物為哺乳動物(例如，嚙齒動物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、貓、綿羊、牛、靈長類動物或豬)。動物可以是轉(zhuǎn)基因動物或人克隆。如果需要，則生物樣品可以經(jīng)受初步處理，包括初步分離技術(shù)。

如本文所使用，術(shù)語“受試者”可指哺乳動物。哺乳動物可以是人類、非人靈長類動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬或者牛，但是并不限于這些實例。除人之外的哺乳動物可以被有利地用作代表疾病、預(yù)疾病或疾病前病癥的動物模型的受試者。受試者可以是雄性或雌性。受試者可以是先前已經(jīng)被診斷或鑒定為具有健康狀況(例如疾病、疾病前或疾病前病癥)的受試者，并且可選地已經(jīng)經(jīng)歷或正在經(jīng)歷對健康狀況的治療性干預(yù)?？商鎿Q地，受試者也可以是先前尚未診斷為患有給定的健康狀態(tài)的受試者。例如，受試者可以是表現(xiàn)出疾病、預(yù)疾病或疾病前病癥的一個或多個風(fēng)險因素的受試者，或未表現(xiàn)出疾病風(fēng)險因素的受試者，或?qū)膊?、預(yù)疾病或疾病前病癥無癥狀的受試者。受試者也可以是患有或具有發(fā)生疾病、預(yù)疾病或疾病前狀病癥的風(fēng)險的受試者。

如本文所使用的，術(shù)語“病癥(condition)”，“疾病”以及“障礙(紊亂，病癥，disorder)”可以互換使用。病癥可以是血液病癥、炎性病癥、缺血性病癥、腫瘤性病癥、感染、外傷、子宮內(nèi)膜異位或腎衰竭。腫瘤性病癥可以選自由以下組成的組：急性淋巴細(xì)胞白血病、急性或慢性淋巴細(xì)胞或粒細(xì)胞瘤、急性骨髓性白血病、急性早幼粒細(xì)胞白血病、腺癌、腺瘤、腎上腺癌、基底細(xì)胞癌、骨癌、腦癌、乳腺癌、支氣管癌、宮頸發(fā)育不良、慢性髓細(xì)胞性白血病、結(jié)腸癌、表皮樣癌、尤因氏肉瘤、膽囊癌、膽結(jié)石瘤、巨細(xì)胞瘤、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、毛細(xì)胞瘤、頭癌、增生、增生性角膜神經(jīng)瘤、原位癌、腸神經(jīng)節(jié)瘤、胰島細(xì)胞瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、喉癌、平滑肌瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、惡性類癌瘤、惡性高鈣血癥、惡性黑色素瘤、馬方綜合征習(xí)性腫瘤、髓樣癌、轉(zhuǎn)移性皮膚癌、粘膜神經(jīng)瘤、蕈樣真菌病、骨髓增生異常綜合征、骨髓瘤、頸癌、神經(jīng)組織癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、骨原性肉瘤、骨肉瘤、卵巢腫瘤、胰臟癌、甲狀旁腺癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、真性紅細(xì)胞增多癥、原發(fā)性腦瘤、前列腺癌、直腸癌、腎細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、精原細(xì)胞瘤、皮膚癌、小細(xì)胞肺腫瘤、軟組織肉瘤、鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、甲狀腺癌、局部皮膚損傷、網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤或胚胎性癌肉瘤。

如本文所使用的，術(shù)語“約”可指在隨后所提到的值的+/-1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％內(nèi)的量。例如，11mL的血液樣品還可以稱為等于約10mL的血液的樣品。

在提供值的范圍的情況下，應(yīng)當(dāng)理解，還具體公開了該范圍的上限和下限之間的每個中間值，除非上下文另有明確指示，否則到下限的單位的十分之一。在所述范圍中的任何陳述的值或中間值與該陳述范圍中的任何其他陳述值或中間值之間的每個較小范圍被涵蓋在本發(fā)明內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可獨立地包括或排除在該范圍內(nèi)。并且，其中在較小范圍中包括了任一限制、無限制或兩個限制的每個范圍也被涵蓋在本發(fā)明內(nèi)，受限于所陳述的范圍內(nèi)的任何特別排除的限制。在所陳述的范圍包括一個限制或兩個限制的情況下，在本發(fā)明中也包括排除這些所包括的限制中的一個或兩個的范圍。

提供了下面的實施例以便更充分地說明了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。然而，它們不應(yīng)以任何方式被解釋為限制本發(fā)明的寬范圍。

實施例

實施例1：微通道制造和表面修飾

使用激光微加工技術(shù)將微流體裝置制造成具有通過U形微通道連接的一個入口和出口。圖5提供了根據(jù)實施方式的微流體裝置500的分解視圖。微流體裝置可以包括連接器502、頂板504、間隔件506以及基底載玻片508。該裝置的構(gòu)造開始于具有兩個鉆孔、入口以及出口的PMMA頂板的制造。U形被雕刻到間隔件中，其在一側(cè)待結(jié)合至PMMA頂板和在另一側(cè)待結(jié)合至標(biāo)準(zhǔn)蓋玻片的兩側(cè)上雙涂覆有丙烯酸粘著劑，以形成微流體通道。PMMA連接器結(jié)合至PMMA頂板。微通道是約110mm長、5.5mm寬以及0.06mm高。為了破壞流線然后破壞在基于微流體的裝置中主導(dǎo)流動條件的層流的細(xì)胞，以及為了增加細(xì)胞表面相互作用的數(shù)目，利用線槽對微通道的上表面進(jìn)行圖案化，該線槽的平均高度為約0.05mm、平均寬度為約0.25mm以及平均長度為約1mm。

圖6示出了根據(jù)實施方式的在微流體通道中制備抗體-鏈的SLB涂層所遵循的順序步驟。在步驟602中，由POPC/b-PE(95/5、90/10、85/15以及80/20mol/mol)組成的0.2mg/ml的脂質(zhì)囊泡被填充在微流體通道中并孵育1小時以形成完整脂質(zhì)雙層涂層，隨后用具有150mM的NaCl、pH值7.2的10mM的磷酸鹽緩沖液鹽水(PBS)沖洗，以除去過量的囊泡和未結(jié)合的脂質(zhì)。在步驟604中，0.1mg/ml的親和素(NA)溶液流到SLB-bPE涂覆的微通道上并孵育1小時，隨后用PBS緩沖液沖洗以除去過量的NA。在步驟606中，引入0.05mg/ml的b-抗EpCAM溶液，以與SA-SLB-bPE固定表面共軛1小時，隨后用PBS緩沖液沖洗以除去過量的b-抗EpCAM。

實施例2：使用注射器生成泡沫組合物

通過使5mL的第一注射器(參見圖7)連接至空的第二注射器來制造泡沫組合物，其中第一注射器含有4mL的含有5％的BSA的磷酸鹽緩沖液鹽水與2mL的空氣的2:1的混合物。兩個注射器由三通閥連接。未使用的閥的第三孔口被阻塞，以生成兩個注射器之間的連續(xù)流動路徑。包括混合物的第一注射器的活塞被按壓，使得第一注射器的內(nèi)容物被迫進(jìn)入第二注射器中。然后第二注射器的活塞被按壓以迫使內(nèi)容物返回到第一注射器中。該過程重復(fù)10次，其中每次按壓少于五秒鐘。該過程生成至少1.5毫升的其中至少50％的氣泡包括從10至100微米的直徑(參見圖8)的泡沫組合物。

實施例3：使用膜生成泡沫組合物

細(xì)孔膜被置于包括4mL的含有5％的BSA的磷酸緩沖液鹽水與2mL的空氣的2:1的混合物的容器上方。該膜包括直徑為10微米的孔。容器被上下顛倒，使得容器中的液體不會流出并且不會通過細(xì)孔膜滴落。5ml的注射器的尖端被放置在膜上。注射器的活塞被拉動，從而生成通過膜從容器拉動液體的力。然后通過膜將注射器中的液體轉(zhuǎn)移回容器中，通過利用壓力按壓注射器的活塞使得液體穿過膜。該過程重復(fù)5次。該膜從容器的開口除去，并且收集泡沫組合物。

實施例4：通過渦旋生成泡沫組合物

將4mL的含有5％的BSA的磷酸緩沖液鹽水與空氣的2:1的混合物添加至10mL的錐形管中。錐形管在渦旋器上以最高速度設(shè)定渦旋20秒。將泡沫從錐形管中除去，并且注入微流體芯片中，該微流體芯片已與包括稀有循環(huán)腫瘤細(xì)胞的樣品接觸，其中稀有循環(huán)細(xì)胞已結(jié)合至芯片上的結(jié)合部分。泡沫組合物以3mm/s流入芯片中。使稀有循環(huán)腫瘤細(xì)胞從微流體芯片釋放，并與泡沫一起收集。對來自稀有循環(huán)腫瘤細(xì)胞的核酸進(jìn)行測序。

實施例5：使用泡沫組合物從無污組合物釋放細(xì)胞

使包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞的樣品與表面接觸。該表面包括無污組合物。無污組合物包括脂質(zhì)雙層和結(jié)合部分。無污組合物的脂質(zhì)非共價地附著至微流體通道的表面(例如，通過范德華相互作用)。脂質(zhì)的端部包括生物素部分。結(jié)合部分包括鏈霉親和素部分。生物素部分和鏈霉親和素部分結(jié)合在一起，從而將脂質(zhì)連接至結(jié)合部分。結(jié)合部分是抗EpCAM抗體。樣品以0.5至4mm/s的流動速率在表面上流動。樣品的循環(huán)腫瘤細(xì)胞結(jié)合至結(jié)合部分。通過使包括磷酸鹽緩沖液鹽水的洗滌緩沖液流過無污組合物來純化無污組合物的表面。洗滌緩沖液除去非特異性結(jié)合細(xì)胞，但不破壞循環(huán)腫瘤細(xì)胞的結(jié)合。將1.5毫升的包括磷酸緩沖液鹽水中5％的BSA和氣泡的泡沫組合物(其中至少50％的氣泡包括從10至100微米的直徑)流過無污組合物。泡沫組合物的氣泡與無污組合物的脂質(zhì)相互作用以從表面除去脂質(zhì)。通過剪切應(yīng)力與來自氣泡和無污組合物之間的空氣-液體界面的泡沫組合物的兩親性一起除去脂質(zhì)。剪切應(yīng)力將脂質(zhì)雙層內(nèi)外翻轉(zhuǎn)，從而松開脂質(zhì)，使得它們?nèi)菀酌撾x。附著至無污組合物的結(jié)合部分的循環(huán)腫瘤細(xì)胞也與脂質(zhì)一起被除去。剪切應(yīng)力足夠強以除去循環(huán)腫瘤細(xì)胞，但不破壞細(xì)胞。所釋放的細(xì)胞是有活力的。以這種方式，使用通過泡沫組合物釋放的方法收集循環(huán)腫瘤細(xì)胞。

實施例6：細(xì)胞捕獲和純化

在37℃、5％的CO2氣氛下，在加濕培養(yǎng)箱中，在補充有10％的胎牛血清(FBS)和1％的抗生素/抗真菌劑(100U/ml青霉素鈉、100lg/ml鏈霉素以及0.25lg/ml兩性霉素B；Gibco-RBL life Technologies，佩斯利，英國)的杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)(Gibco-RBL life Technologies，佩斯利，英國)中維持和生長人類結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系HCT 116。在約90％融合時，細(xì)胞利用CellTracker Green CMFDA或CellTracker Red CMTPX(Invitrogen，加拿大，美國)預(yù)染色1小時，然后使用具有0.1％的乙二胺四乙酸(EDTA)的0.2％的胰蛋白酶(Sigma Aldrich，圣路易，美國)在相同培養(yǎng)基中重懸浮細(xì)胞，用于隨后的實驗。

將用CellTracker Green預(yù)染色的300至2000個HCT116細(xì)胞摻入EDTA管中的從健康個體收集的1mL全血液中。在充分混合后，使細(xì)胞-血液混合物流過功能化微通道。然后，用0.5mL的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、隨后用0.3mL的Hoechst溶液(PBS中的1μg/mL)洗滌微通道以染色細(xì)胞核中的DNA。通道被熒光地拍攝顯微照片以計數(shù)被結(jié)合至通道表面的細(xì)胞的總數(shù)。對于CellTracker和Hoechst染料呈雙陽性的細(xì)胞被識別為HCT116細(xì)胞，并且單陽性DAPI單細(xì)胞被識別為非特異性結(jié)合細(xì)胞，諸如白血細(xì)胞(白細(xì)胞)(WBC)。圖9示出了根據(jù)實施方式的6種不同微流體通道設(shè)計(A至F)的幾何結(jié)構(gòu)901和性能902。圖10示出了根據(jù)實施方式的微流體通道設(shè)計A和B的構(gòu)造和尺寸。圖11示出了根據(jù)實施方式的微流體通道設(shè)計C和D的構(gòu)造和尺寸。圖12示出了根據(jù)實施方式的微流體通道設(shè)計E和F的構(gòu)造和尺寸。在相同的線速度下具有簡單圖案的直通道中，捕獲性能(被定義為芯片上結(jié)合的HCT116細(xì)胞數(shù)目與發(fā)送到芯片的細(xì)胞數(shù)目的比率)由于受限的保留時間和非混合流動模式而非常低。A型芯片捕獲性能＝1.2±0.6％，并且B型芯片性能＝4.5±2.2％。當(dāng)微圖案的數(shù)目增加以產(chǎn)生有效混合時，捕獲效率顯著地增加了：C型芯片＝17.9±3.0％，且D型芯片＝33.5±6.6％。另外的倍增通道長度僅略微增加效率至37.0±10.5％(E型)，而4個平行通道增加效率至93.7±8.9％(F型)。除非另有說明，否則F型芯片用于其余實驗。

所捕獲的細(xì)胞的純化通過增加PBS緩沖液沖洗的流動速率來實現(xiàn)。隨著PBS的流動速率增加，所保留的WBC的百分比顯著減少。除去80～100％的WBC同時保留95％+HCT116的所誘導(dǎo)的剪切應(yīng)力s只需要～4-8達(dá)因/cm2(對應(yīng)于～5-10mL/h的流動速率，圖13)。圖13示出了經(jīng)由通過已增加的緩沖液流動速率選擇性地增加流動通道中的剪切應(yīng)力的純化。保留靶HCT116細(xì)胞，同時剪切應(yīng)力正好大到足以沖掉非靶WBC。圖表中顯示的是細(xì)胞脫離率(％，Y-軸)對流動速率(或線性速度)(下部X-軸)以及相對應(yīng)的剪切應(yīng)力(上部X-軸)。流動速率一般保持在灰色區(qū)域之下，以避免所捕獲的CTC的任何潛在損失。*：P<0.05；**：P<0.01

純化靶細(xì)胞所需的剪切應(yīng)力顯著低于基于常規(guī)抗體硅烷化的表面的先前細(xì)胞脫離研究中所報道的剪應(yīng)力，并且被認(rèn)為足夠低以對細(xì)胞活力或蛋白質(zhì)表達(dá)具有最小影響或沒有影響。相反，存在～80％的HCT116即使在50mL/h下仍由于強的抗體-抗原結(jié)合而保持結(jié)合。對于臨床樣品，可以選擇甚至4mL/h的更小的流動速率以避免CTC的任何潛在損失。

實施例7：所捕獲的有活力的細(xì)胞的釋放

從微流體芯片釋放有活力的CTC是實現(xiàn)方便的細(xì)胞保存、下游分子分析以及細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵步驟。使用酶裂解、化學(xué)力或機械力來使細(xì)胞脫離的先前嘗試已經(jīng)示出了歸咎于抗體-抗原連接的破壞或膜破裂的部分釋放或不可避免的細(xì)胞死亡。SLB是在水-固體界面的脂質(zhì)分子組裝，該分子組裝通過脂質(zhì)分子的長烴鏈的向內(nèi)疏水-疏水相互作用和與水或親水性氧化硅表面(即玻璃)相互作用的向外親水性頭部基來進(jìn)行穩(wěn)定。SLB組件可以通過如氣泡一樣簡單地引入疏水性組分來進(jìn)行分解。我們提供了通過注入連續(xù)空氣泡沫至微流體來溫和地釋放粘附的CTC而不破壞抗體-抗原結(jié)合的策略。泡沫溶液由空氣和細(xì)胞培養(yǎng)基的混合物(1:2體積比)并溫和地渦旋1分鐘以產(chǎn)生泡沫來產(chǎn)生。延時實驗的顯微照片顯示了，所捕獲的HCT116細(xì)胞在空氣泡沫在它們上進(jìn)行掃除時在數(shù)秒內(nèi)被釋放(圖14，基于芯片E)。圖14提供了釋放過程的延時顯微照片。在t＝10.500分鐘時，在表面上捕獲了預(yù)染色的HCT116細(xì)胞(用數(shù)字標(biāo)記的綠點)。3個箭頭指向現(xiàn)有的小氣泡。在t＝10.504分鐘時，當(dāng)進(jìn)入的氣泡流過該區(qū)域時將這些細(xì)胞覆蓋在進(jìn)入的氣泡的空氣相內(nèi)。該箭頭指向該大的引入氣泡的邊界。在t＝10.550分鐘時，細(xì)胞從附著位點釋放，并通過流出的氣泡掃除。箭頭指向從微小截留空氣和所引入的較大的氣泡的界面邊界反射的熒光。使用250μL的泡沫溶液在三次重復(fù)中的平均釋放效率為99.7％，如表2中所示。

表2.細(xì)胞釋放效率

圖15示出了所洗脫細(xì)胞由脂質(zhì)包裹，指示了通過用空氣剝離SLB的細(xì)胞釋放。將從芯片釋放的細(xì)胞與所附著的抗體和空氣泡沫一起收集到埃彭道夫(Eppendorf)管中。可替換地，為了熒光免疫檢驗染色和計數(shù)，可以將所洗脫的細(xì)胞收集到平面多孔膜(示出10mm的直徑)上。在細(xì)胞洗脫之后立即執(zhí)行活/死試驗(Life Technologies)；與來自常規(guī)涂覆的抗EpCAM硅烷化芯片的0％的活力相比，結(jié)果顯示出86％的洗脫CTC保持有活力。

實施例8：有活力細(xì)胞的培養(yǎng)和維持

為了確定所分離的細(xì)胞是否可在體外培養(yǎng)，來自臨床樣品的CTC所釋放的空氣泡沫被收集并接種在96孔組織培養(yǎng)板上，在5％的CO2下在37℃下孵育。如圖16中所示，從階段III患者所分離的癌癥細(xì)胞在第7天聚集并附著至板的底部，并在第9天變得更加擴散。免疫熒光染色示出了DAPI(藍(lán)色)和CK20(紅色)陽性。為了證明這些細(xì)胞具有重新附著的傾向，在第9天將它們用0.1％的胰蛋白酶處理并重新接種在96孔板上。1天后，這些細(xì)胞(第10天)以～25μm的表觀細(xì)胞大小而牢固地重新附著到基底上。觀察到了CTC活力的維持。

實施例9：分子分析

為了檢測遺傳突變，從所洗脫的細(xì)胞中直接提取DNA以執(zhí)行P53、腺瘤性息肉病(APC)以及K-ras突變中的7個高頻癌癥熱點的castPCR，如表3中所示。

表3：突變試驗

3個健康供體的結(jié)果全部為陰性(ΔCt>9.96)；在10個隨機選擇的CRC患者中，2個樣品對于TP53R248Q為陽性(ΔCt<9.96)，并且3個樣品對于APC1556fs*3為陽性。

實施例10：臨床樣品的高吞吐量分析

容易從微流體裝置釋放細(xì)胞的重要優(yōu)點是細(xì)胞可以在小的平面基底上收集和染色。替代在3維復(fù)雜的微流體通道內(nèi)進(jìn)行芯片內(nèi)檢查，對小得多的區(qū)域上(～10mm直徑)的CTC進(jìn)行成像能夠?qū)崿F(xiàn)對興趣細(xì)胞的容易的重新定位，并且顯著地將成像和檢查時間從6h減少到<0.5h(圖17)。因此，臨床樣品分析的高吞吐量變得可行。

實施例11：在結(jié)腸直腸癌的所有階段中的CTC分析

CTC在血液中相當(dāng)稀有。這時用于檢測和分離CTC的唯一FDA批準(zhǔn)試驗是來自Veridex的試驗。在大多數(shù)患者中，試驗發(fā)現(xiàn)每7.5ml的血液少于5個CTC。雖然CellSearch試驗結(jié)果證明了在患者樣品中計數(shù)CTC作為預(yù)后標(biāo)記物的臨床效用，但是這種效用只適用于晚期癌癥，不適用于癌癥檢測的所有階段。

本文所公開的裝置可用于檢測癌癥的所有階段。通過檢測來自所有階段的結(jié)腸直腸癌患者的CTC來說明實例。在雙盲、前瞻性研究中包括了110個具有階段0/I(n＝20)、階段II(n＝29)、階段III(n＝46)以及階段IV(n＝15)且沒有先前癌癥治療的CRC患者和無結(jié)腸疾病的供體陰性對照(通過結(jié)腸鏡檢查確認(rèn)，n＝28)。

從CRC患者獲得外周人類血液。在CTC捕獲和純化后，使用空氣泡沫掃除來將所捕獲的CTC釋放到小膜(～2μm孔大小以排出過量的染色溶液)上，其中執(zhí)行免疫熒光染色以識別和計數(shù)所釋放的細(xì)胞(圖18)。我們選擇針對細(xì)胞角蛋白20(CK20)的單克隆抗體作為陽性染色標(biāo)記物，這是因為它比pan-CK更具結(jié)腸直腸特異性。如圖19中所示，被定義為DAPI+/CK20+/CD45-細(xì)胞的患者CTC，隨著患者疾病階段的進(jìn)展而增加。在28個健康供體中，DAPI+/CK20+/CD45-細(xì)胞的范圍為0至3。健康、階段0/I、階段II、階段III以及階段IV中的DAPI+/CK20+/CD45-細(xì)胞的中位數(shù)分別為0、2、4、7以及36。階段IV的CTC計數(shù)廣泛分布，其中最高的細(xì)胞計數(shù)超過1000；在圖19中示出了每個臨床階段的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。如圖23中所示，繪制了每個臨床階段的平均值。

實施例12：CTC數(shù)量與結(jié)腸直腸癌和胃腸(GI)道疾病的相關(guān)性

為了評價CTC數(shù)量與結(jié)腸直腸癌(CRC)和胃腸(GI)道疾病的相關(guān)性，檢查了術(shù)前從120個具有原發(fā)性CRC的病例所獲得的外周血中的CTC。我們隨機選擇了沒有先前癌癥病史的60個病例，以在結(jié)腸鏡檢查前執(zhí)行CTC作為對照。為了進(jìn)一步分析，在120個癌癥患者中，排除了10個在CTC檢查前已經(jīng)接收了術(shù)前同步化療和放療、單獨的化療或放療的患者(4個病例為階段IV，且6個病例為階段I至III)。

對照組的分類基本上根據(jù)結(jié)腸鏡檢查結(jié)果。在正常結(jié)腸分類時，將在CTC檢查之后接受手術(shù)的三個消化疾病患者和一個子宮內(nèi)膜息肉患者(在CTC檢查前3年前還經(jīng)歷了針對腮腺卡索曼疾病的手術(shù)的歷史)分類到名稱為“具有其他位點粘膜病變”的子分類中。根據(jù)息肉的存在或不存在，對患有結(jié)腸疾病的兩個子分類進(jìn)行分類。然而，患有息肉和潰瘍性結(jié)腸炎的兩個病例被分類為潰瘍組?；加许也〉囊粋€病例還患有原位宮頸癌并在CTC檢查之后接受了手術(shù)性切除。患有盲腸局灶性嚴(yán)重發(fā)育不良腺瘤的一個病例還患有卵巢透明細(xì)胞癌(病理階段T2N0)并在CTC檢查后接受了兩種腫瘤的手術(shù)性切除。為了更準(zhǔn)確地評估循環(huán)腫瘤細(xì)胞的存在與結(jié)腸腫瘤進(jìn)展的相關(guān)性，我們排除了屬于具有其他位點粘膜病變的正常結(jié)腸和具有其他粘膜病變的患病結(jié)腸的子分類的患者，用于進(jìn)一步分析?？傊?，161個病例(110癌癥和51個對照病例)被納入結(jié)腸直腸腫瘤的CTC和進(jìn)展之間的關(guān)系的分析中。TNM階段的病理分類是根據(jù)AJCC第7版的。六個階段IV癌癥病例不接受手術(shù)干預(yù)。一個階段0(Tis)的病例僅接受內(nèi)窺鏡粘膜切除。所有其他病例接受治愈性或預(yù)計治愈性腫瘤切除。根據(jù)圖表記錄對患者的所有臨床病理參數(shù)進(jìn)行分類。

使用Windows的SPSS(版本12.0，SPSS Inc，Chicago，IL)來執(zhí)行統(tǒng)計分析。使用兩個獨立樣品T測試來比較每個組的平均值。Anova(方差)分析用于比較相同參數(shù)的子組之間的平均值和線性。線性回歸測試用于測試組之間的線性關(guān)聯(lián)。Pearson(皮爾森)卡方測試用于分析組之間超過截止水平的陽性率的發(fā)生率的差異。所有P-值是雙面的(雙邊的，two-sided)；小于0.05的P-值指示統(tǒng)計學(xué)顯著性。

1)每個分類中的CTC數(shù)目的分布

對照組的平均年齡為50.6±13.5歲(從25到76歲的范圍)，且比癌癥組的62.0±11.5歲(從34到87歲的范圍)顯著年輕(P<0.001)。對照組和癌癥組的雌性/雄性的比率分別為28/25和62/48，并且兩組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。

如表4中所概述的，癌癥組和患病結(jié)腸組的CTC數(shù)目的平均值顯著高于正常組的CTC數(shù)目的平均值(P<0.01)。癌癥組中的CTC的平均值也顯著高于患病組的CTC的平均值(P＝0.01)。在癌癥組中，在CTC檢查之前已經(jīng)接受治療的患者中檢測到的CTC數(shù)目低于那些沒有接受治療的患者中檢測到的CTC數(shù)目。

表4在對照和癌癥病例中所檢測的CTC的數(shù)目

*：當(dāng)將平均值相互比較時P＜0.05。

2)CTC數(shù)目與臨床病理特征之間的關(guān)系

總之，在該分析中涉及在CTC測試之前沒有治療的110個CRC病例。從腫瘤的T1到T4分類逐漸增加的平均CTC數(shù)目(Anova分析，P＝0.022)，特別是T4的平均CTC數(shù)目顯著高于其他T分類(t測試，P<0.01)。平均CTC數(shù)目也隨著腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的進(jìn)展而逐漸增加(Anova試驗，P<0.05)。N2的平均CTC值顯著高于N0或N1分類的平均CTC值(t測試，P<0.01)。腫瘤大小超過5cm的平均CTC值也顯著高于腫瘤大小小于5cm的平均CTC值(t測試，P<0.01)。M1的平均CTC值顯著高于M0分類的平均CTC值(t測試，P<0.01)。這些結(jié)果揭示了血液中CTC數(shù)目的增加與名稱為TNM階段的腫瘤進(jìn)展和腫瘤大小密切相關(guān)。CEA升高的平均CTC值(>5)高于無CEA升高的平均CTC值，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義(t測試，P＝0.076)。在分化差的腫瘤中平均CTC值顯著高于在良好或中度分化腫瘤中的CTC值(t測試，P<0.01)。在良好和中等分化組之間沒有CTC值的差異。CTC存在在不同的性別、年齡以及腫瘤位置的組之間沒有差異。

表5沒有先前治療的各個癌癥組中的CTC分布

*P＜0.05，t測試

3)階段IV癌癥各種類型的轉(zhuǎn)移中的CTC的存在

在19個階段IV病例中，4個病例在CTC測試前已接受治療。雖然所檢測的CTC數(shù)目在已經(jīng)治療的患者中低于未治療的患者的CTC數(shù)目，但是在兩個組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。在CTC測試前未治療的15個病例中，所檢測的肝和肺轉(zhuǎn)移的CTC數(shù)目高于腹膜侵入和中央淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CTC數(shù)量(t測試，P＝0.076)，如表6中所概述。這意味著CTC的存在在血源擴散轉(zhuǎn)移比腹膜接種或淋巴感染轉(zhuǎn)移中具有變得更多的傾向。存在兩個無先前治療的病例在他們的原發(fā)性腫瘤中具有K-ras突變。一個具有肝和肺轉(zhuǎn)移的病例不能檢測到CTC的存在。另一個具有中央淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例具有2個CTC。其他在CTC測試前未治療的患者具有野生型K-ras。因此，值得懷疑的是CTC檢測是否與K-ras突變有關(guān)。

表6在階段IV癌癥中各種類型的轉(zhuǎn)移中的CTC分布

可以觀察到，血源性擴散轉(zhuǎn)移比腹膜或LN轉(zhuǎn)移具有更多的CTC數(shù)目。具有肝和肺轉(zhuǎn)移的一個病例具有腹腔內(nèi)侵入的宮頸癌并具有K-ras突變和差的腫瘤分化。肝轉(zhuǎn)移組中的一個病例(D-結(jié)腸癌)具有3個CTC，正好等于截止水平并且CEA＝1.1。在具有階段IV的19個病例中，13個病例進(jìn)行了原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤的姑息性切除。

表7對照和具有結(jié)腸直腸癌的患者的特征

表8 CK20+/CD45-和CK20+/CD45+細(xì)胞的數(shù)據(jù)

*：當(dāng)彼此比較時P＜0.05

**：當(dāng)彼此比較時P＜0.05

表9沒有先前治療的各個癌癥組中的CTC分布

*P＜0.05曼-惠特尼測試

N2中CTC顯著高于N0和N1組中的CTC。

表10短期放療或長期CCRT患者中的CTC分布

作為比較，廣泛使用的Veridex CellSearch CTC計數(shù)系統(tǒng)證明了在50個階段IV CRC患者的僅25％的每7.5mL的血液≥3個CTC(定義為DAPI+/panCK+/CD45-)的檢測敏感性。我們的平臺顯示了使用每2mL血液≥3個CTC(DAPI+/CK20+/CD45-)作為截止值，80％、67％、66％以及30％的CRC階段IV、III、II以及I/0是陽性的，相反，28個健康供體中僅一個(4％)具有3個CTC(其余的具有0～2個CTC)。在敏感性和特異性的這種水平下，顯示可以在早期階段檢測到CTC并且數(shù)量與疾病進(jìn)展相關(guān)。

典型的1mL血液樣品含有～6.6×106個有核的WBC，并且SLB涂覆的微流體系統(tǒng)平均消除99.9962％。目前由于以4mL/h的流動速率下溫和洗滌而存在用CTC洗脫的～500-2000個WBC，以及在流體裝置和管道中的死體積。然而，CTC的這種純度水平足以促進(jìn)用于致癌基因識別(用于castPCR的0.1％純度)的分子分析，并可以提供使用適當(dāng)選擇的治療的早期干預(yù)的益處。如圖24中所示，我們的系統(tǒng)的簡單工作流程以連續(xù)平行的過程經(jīng)濟地執(zhí)行捕獲、純化以及釋放。均分成4等份的8mL血液樣品平行地供給到4個芯片中。所有芯片通過細(xì)胞捕獲、純化，且然后將細(xì)胞釋放用于許多下游應(yīng)用中的一種，包括IF染色、細(xì)胞計數(shù)、PCR熱點分析、細(xì)胞培養(yǎng)和/或低溫存儲(cyrobanking)。該平臺同時提供了完整的CTC的解決方案，以用于成像、分子分析、細(xì)胞培養(yǎng)以及保存，僅需要總共8mL的血液。這創(chuàng)造了CTC在癌癥篩選、監(jiān)測、分子性能分析以及藥物選擇中的常規(guī)臨床應(yīng)用的機會。

實施例13：在手術(shù)后預(yù)測早期肝轉(zhuǎn)移

從2012年7月4日至2012年11月1日，在長庚紀(jì)念醫(yī)院林口校區(qū)(Chang Gung Memorial Hospital,Linkou Campus)招募隨機選擇的110個患有原發(fā)性CRC的患者和根據(jù)結(jié)腸鏡檢查沒有先前已知的癌癥病史的50個健康供體。在血液抽取和CTC計數(shù)時前瞻性研究是雙盲的。全部110個癌癥患者在血液抽取時沒有接受任何在先治療。非轉(zhuǎn)移性CRC患者的臨床狀態(tài)被跟蹤直到2014年11月，包括每3個月的一系列血清CEA測量、每12個月或按照臨床癥狀或CEA升高疑似轉(zhuǎn)移時的腹部超聲或CT掃描、胸部X線以及結(jié)腸鏡檢查。

對照組的分類基于結(jié)腸鏡檢查結(jié)果和圖表記錄。TNM階段的病理分類基于AJCC第7版。除一個無手術(shù)切除的病例之外，所有其他非轉(zhuǎn)移性病例均已接受治愈性或預(yù)期治愈性腫瘤切除?；颊叩乃信R床病理參數(shù)根據(jù)圖表記錄分類。IRB批準(zhǔn)的(長庚紀(jì)念醫(yī)院倫理委員會(Ethic Committee of Chang Gung Memorial Hospital)的編號100-4274B和中國科學(xué)院(Academia Sinica)的AS-IRB01-11056)知情同意書已在檢查之前從所有病例獲得。

CMx平臺用于CTC分離和富集。該方法的程序簡要描述如下。首先，約7～9mL的外周血液樣品被從供體抽取并收集到含有抗凝血劑EDTA(BDBiosciences)的10ml的Vacutainer管中，然后將2mL的血液以1.5mL/h的流動速率注入涂覆有抗-EpCAM-SLB的芯片中。在完成血液注入后，用PBS緩沖液洗滌掉松散結(jié)合的細(xì)胞；隨后，空氣泡沫被注入芯片以分解SLB，從而洗脫所捕獲的細(xì)胞。所釋放的細(xì)胞利用DAPI、CK20以及CD45進(jìn)行染色。具有細(xì)胞形態(tài)并且直徑在7～25μm內(nèi)，同時在細(xì)胞質(zhì)中呈CK20陽性、在核中呈DAPI陽性以及CD45陰性染色的圓形顆粒被定義為CTC，并且在Leica DMIRE2(自動反轉(zhuǎn)顯微鏡和活細(xì)胞系統(tǒng))和Leica AF 6000(高級熒光成像像系統(tǒng))的顯微鏡下進(jìn)行計數(shù)。至少兩個經(jīng)訓(xùn)練的操作員獨立地評估細(xì)胞圖像，并基于共識對CTC進(jìn)行計數(shù)。

使用Windows的SPSS(版本12.0，SPSS Inc，Chicago，IL)執(zhí)行統(tǒng)計分析。使用兩個獨立樣品T測試和Anova分析對不同組之間的平均值和線性進(jìn)行比較。使用線性回歸測試來測試組之間的線性關(guān)聯(lián)。使用皮爾森卡方測試來分析組間陽性率的發(fā)生率差異。通過Kaplan-Meier法和Log-rank測試執(zhí)行存活分析。Cox回歸模型用于預(yù)后因子的多變量分析。所有P值都是雙面的；小于0.05的P值指示了統(tǒng)計學(xué)顯著性。

實施例14：微流體芯片制備

定制微流體芯片的制造描述如下：市售CO2激光劃線機(Helix 24，Epilog，美國)用于在聚(甲基甲基丙烯酸酯)(PMMA)載玻片(大小＝標(biāo)準(zhǔn)載玻片，厚度＝1.5mm)上產(chǎn)生微圖案。激光還用于雕刻63μm厚的粘合的雙面膠帶(8018PT，3M公司)，以雕刻出圍繞PMMA上微流體圖案的邊界。PMMA載玻片上的微溝槽圖案和微結(jié)構(gòu)使用CorelDraw(Corel，Ottawa，Canada)繪制，然后轉(zhuǎn)移到激光劃線機，用于在基底上進(jìn)行直接加工。在這項研究中，制備了六種類型的芯片。通過將雕刻出的3M膠帶放置(夾)在頂部(PMMA載玻片)和底部上玻璃載玻片之間，以形成密封通道，來使雕刻出的芯片經(jīng)等離子處理的玻璃載玻片進(jìn)行結(jié)合。脂質(zhì)囊泡的制備、EpCAM抗體的生物素化、EpAb4-1、涂覆在微流體芯片中的EpCAM支持脂質(zhì)雙層的順序制備在前面已經(jīng)描述，但是在此簡要描述。

利用由摩爾比為95/5的1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(POPC)和1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-帽-生物素(b-PE)組成的脂質(zhì)囊泡來處理微流體通道的內(nèi)壁。在除去過量的脂質(zhì)后，通過NA-生物素識別將Neutravidin^TM(NA)共軛至SLB中的b-PE，然后將生物素化的EpAb4-1(b-EpAb4-1)共軛至NA以完成表面形成。圖9示出了具有不同流動路徑、尺寸以及具有該表面修飾的微結(jié)構(gòu)的一系列微流體裝置。

實施例15：結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系捕獲效率研究

使用HCT116表征結(jié)腸直腸癌細(xì)胞捕獲效率。將用CellTracker Green預(yù)染色的300至2000個HCT116細(xì)胞摻入玻璃底孔(直徑：6mm，高度：5mm)并等待10分鐘使細(xì)胞沉降。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到通過熒光顯微法(Leica AF 6000Advanced熒光成像系統(tǒng))從健康個體收集的全血液之前和之后對底部進(jìn)行成像，以確保準(zhǔn)確的計數(shù)。所摻入的細(xì)胞的實際數(shù)目被定義為(轉(zhuǎn)移前孔中的細(xì)胞數(shù)目)減去(轉(zhuǎn)移后孔中剩余的細(xì)胞數(shù)目)。在適當(dāng)溫和混合后，使細(xì)胞-血液混合物流過功能化微通道。然后，用0.5mL的PBS洗滌微通道并引入0.3mL的Hoechst溶液(PBS中1μg/mL)對細(xì)胞核進(jìn)行染色。對通道進(jìn)行熒光顯微照相以計數(shù)通道中所捕獲的細(xì)胞的總數(shù)目。結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系捕獲效率被定義為(確認(rèn)的所捕獲細(xì)胞數(shù)目)/(實際摻入的細(xì)胞數(shù)目)×100％。

實施例16：臨床樣品選擇和使用castPCR技術(shù)對用于臨床樣品和基因型分型的CTC進(jìn)行免疫熒光染色

分別從110個患有階段0～I(xiàn)V的結(jié)腸直腸癌患者和28個健康供體(62個雌性和76個雄性)獲得一管各自的外周血。在本研究中接受沒有先前癌癥治療的結(jié)腸直腸癌患者，在同一天或前一天在手術(shù)前接受血液抽取。健康供體通過結(jié)腸鏡檢查確認(rèn)沒有結(jié)腸疾病，并在該程序之前接受血液抽取?；颊吆徒】倒w的平均年齡為62歲和44歲。研究方案由中央研究院機構(gòu)審查委員會(the Institutional Review Boards of Academia Sinica)(AS·IRBOI-12040)和長庚紀(jì)念醫(yī)院(Chang Gung Memorial Hospital)(100-1023B)批準(zhǔn)。

將從芯片釋放到濾膜上的所捕獲的細(xì)胞用4％的多聚甲醛(PFA)固定，用在1x PBS中的0.1％的triton X-100透化，并用BSA封閉。隨后，在4℃下用兔抗人細(xì)胞角蛋白20(CK20)(Abcam，Cambridge，UK)和大鼠抗人CD45(Abcam Cambridge，英國)對細(xì)胞染色過夜，然后進(jìn)行PBS洗滌。在PBS洗滌后，利用FITC共軛的山羊抗大鼠IgG抗體(Abcam Cambridge，英國)和Alexa568抗兔IgG抗體(Life Technologies，CA，美國)在室溫下對細(xì)胞孵育1小時，然后進(jìn)行PBS洗滌以除去過量的二級抗體。在圖21中概述了CTC計數(shù)。

通過市場上可以買得到的突變檢測試驗(Life Technologies，Carlsbad，CA)檢測KRAS、TP53以及APC突變狀態(tài)。這些試驗使用競爭性等位基因特異性TaqMan PCR(castPCR技術(shù))。每個野生型或突變等位基因試驗由修飾或未修飾的等位基因特異性正向引物、基因座特異性探針、基因座特異性反向引物以及等位基因特異性MGB阻斷劑組成。每個測試樣品用一個或多個突變等位基因試驗和相應(yīng)的基因參照試驗進(jìn)行。使用Seq Detection System版本2.3分析結(jié)果以生成CT_靶和CT_參考的值。檢測ΔCT截止值用于確定樣品中突變等位基因試驗可檢測的百分比突變的限制。％與ΔCT之間的轉(zhuǎn)換公式為2-(ΔCT)×100％。突變等位基因試驗敏感性為0.1％。因此，ΔCT<9.96的值為陽性，且ΔCT>9.96的值為陰性。

應(yīng)當(dāng)理解，在實踐本發(fā)明時可以采用本文所述的本發(fā)明的實施方式的各種替代方案。意圖是以下權(quán)利要求書限定本發(fā)明的范圍，并且本發(fā)明由此涵蓋這些權(quán)利要求及其等同物的范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)。