一種荔枝炭疽菌lamp引物及其快速檢測方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)作物病害防治及植物檢疫領(lǐng)域，特別涉及一種荔枝炭疽菌LAMP引 物及其快速檢測方法和在荔枝炭疽菌的早期診斷、病菌的監(jiān)測和鑒定中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蒸枝（Litchii chinensis Sonn.)是原產(chǎn)于我國南部和越南北部著名的熱帶亞熱 帶特產(chǎn)水果，我國主要分布于廣東、廣西、福建、海南、臺灣、四川、云南、貴州、浙江等省和自 治區(qū)。我國荔枝的種植面積和產(chǎn)量為世界之首，且大量出口。荔枝因其經(jīng)濟價值高，是我國 在國際市場上最有競爭力的果品之一。隨著荔枝連作和種植面積的擴大，荔枝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展 主要由真菌病害的發(fā)生和危害所影響，而導(dǎo)致荔枝果實腐爛變質(zhì)的主要原因之一是荔枝炭 疽（Colletotrichum gloeosporioides (Penz. ) Sacc.)，病菌主要危害蒸枝枝梢、葉片及果 實，引起嫩梢、嫩葉回枯和果實腐爛，也可導(dǎo)致采后果實大量的腐爛。該病菌具有潛伏侵染 的特性，早期不易發(fā)現(xiàn)，當在高溫高濕的季節(jié)出現(xiàn)明顯癥狀，鮮果腐爛損耗高達20~40%， 且具有很強的傳染性，嚴重威脅了荔枝的產(chǎn)量與品質(zhì)。并常與其他荔枝病害混合發(fā)生，給病 害的診斷造成困難，而生產(chǎn)上則常因不明發(fā)病原因，難以有針對性的防治措施，故造成更為 嚴重的危害。因此建立荔枝炭疽菌快速檢測體系，早期對發(fā)病植株進行荔枝炭疽菌的快速 準確檢測，對預(yù)測病害發(fā)生情況、及時采取有效的防治措施、控制病原菌的傳播和流行、減 少經(jīng)濟損失都具有重要的理論和實際意義。
[0003]目前對荔枝炭疽菌的檢測大多仍沿用傳統(tǒng)的組織分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)鑒定方法，但 是，這種鑒定方法耗時長，對分離操作人員專業(yè)知識儲備和分離操作能力、經(jīng)驗的要求高。 若是多種病原菌復(fù)合侵染，所分離的病害樣本不新鮮，則更難確診病原菌，難以滿足對荔枝 炭疽菌診斷的實際需要，這對病原菌的檢測控制十分不利。
[0004]環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，簡稱LAMP)是 2000年由日本榮研株式會社Notomi等人開發(fā)的一種新型循環(huán)恒溫核酸擴增技術(shù)。LAMP反 應(yīng)針對靶基因的6個位點設(shè)計出4條引物，利用一種鏈式置換活性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase)，在恒溫條件下（60~65°C )保溫30~90分鐘，即可完成擴增反應(yīng)。由于LAMP 反應(yīng)的高效性和等溫快速擴增的特點，在90分鐘內(nèi)可擴增109~10 1(]倍產(chǎn)物。LAMP擴增產(chǎn) 物的檢測一般采用熒光染料目測觀察、瓊脂糖凝膠電泳和濁度觀察等方法。由于LAMP反應(yīng) 簡單、快速、高效、經(jīng)濟等特征，因而具有極為廣泛的應(yīng)用前景。目前LAMP檢測主要應(yīng)用于 人畜病原物、食品安全和環(huán)境衛(wèi)生的檢測，在植物病原菌檢測中報道較少，荔枝炭疽菌的檢 測國內(nèi)外均未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中荔枝炭疽菌的生物學(xué)檢測方法所需周期長、檢測 方法特異性差，靈敏度低的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種荔枝炭疽菌 (Colletotrichum gloeosporioides)LAMP弓|物。
[0006] 本發(fā)明另一目的在于提供一種基于上述荔枝炭疽菌LAMP引物的快速檢測方法。 該檢測方法結(jié)果可靠、易于操作、特異性強、靈敏度高。
[0007] 本發(fā)明再一目的在于提供上述快速檢測方法在荔枝炭疽菌的早期診斷、病菌的監(jiān) 測和鑒定中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的目的通過下述方案實現(xiàn)：
[0009] 一種蒸枝炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides) LAMP 引物，包括內(nèi)引物對 F3和B3,以及外引物對FIP和BIP，序列如下所示：
[0010] F3 :5, -GCTGGGCTTCTGGTTATTGC-3,；
[0011] B3 :5 ' -GCCAACCGGCAAAAAGGATG-3 ' ；
[0012] FIP :5' -ATCAGCCAGGTGGGGTGGG-GCTGCTGGCTGACAGGA-3' ；
[0013] BIP :5' -GCCTCCAGCTGCAGGGTTCAA-GCGGACAAAGACGCCTCTA-3'。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種基于上述荔枝炭疽菌LAMP引物的快速檢測方法，包括以下 步驟：
[0015] 以待檢測樣本的DNA為模板，利用上述引物進行LAMP反應(yīng)擴增，再通過熒光染料 目測觀察法或瓊脂糖凝膠電泳法進行檢測。
[0016] 所述LAMP反應(yīng)體系優(yōu)選為：25 y L，其中F3與B3各0. 2 y M，F(xiàn)IP與BIP各1. 6 y M， 20mM Tris-HCl，10mM(NH4)2S04,10mM KC1，2 ~4mM MgS04,0. 1 % Tween-20,0 ~1. 2M Betaine，lmM dNTPs，8 U Bst DNA聚合酶大片段，10~50ng DNA模板，不足部分用無菌雙 蒸水補足；LAMP反應(yīng)條件為在60~65°C溫育30~90min，80°C保溫5~10min。
[0017] 所述LAMP反應(yīng)體系優(yōu)選為：25yL，其中F3與B3各0.2yM，F(xiàn)IP與BIP各1. 6yM， 20mM Tris-HCl, 10mM(NH4)2S04,10mM KCl,4mM MgS04,0. 1 % Tween-20,0. 2M Betaine, ImM dNTPs，8 U Bst DNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用無菌雙蒸水補足；LAMP反應(yīng) 條件為在64°C溫育80min，80°C保溫10min。
[0018] 所述熒光染料目測觀察法：在LAMP反應(yīng)的最終擴增產(chǎn)物中加入1 y L顯色劑，所述 顯色劑為SYBR Green I，觀察結(jié)果進行判斷。顯色結(jié)果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色 判斷為陰性。
[0019] 所述瓊脂糖凝膠電泳法：取6 y L LAMP反應(yīng)的最終擴增產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電 泳檢測，觀察結(jié)果。如果出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現(xiàn)擴增條帶判斷為 陰性。
[0020] 所述待檢測樣本的DNA優(yōu)選通過DNA抽提試劑盒法提取。
[0021] 當所述的待檢測樣本為菌體時，優(yōu)選使用真菌DNA抽提試劑盒法提取。
[0022] 當所述的待檢測樣本為植物組織時，優(yōu)選使用植物組織DNA抽提試劑盒法提取。
[0023] 本發(fā)明檢測方法結(jié)果可靠、易于操作、特異性強、靈敏度高，適用于發(fā)病組織中荔 枝炭疽菌的快速可靠的檢測和鑒定，可直接用于帶菌的植株高靈敏度快速檢測，可用于荔 枝炭疽菌的早期診斷、病菌的監(jiān)測和鑒定中。本發(fā)明建立了荔枝炭疽菌快速、簡便、特異性 強、靈敏度高的監(jiān)測技術(shù)體系，對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中荔枝炭疽菌引起病害顯癥之前的早期監(jiān)測， 確定病害防治最佳時期具有十分重要的意義。
[0024] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及有益效果：
[0025] 1、結(jié)果可靠：本發(fā)明的LAMP引物及LAMP反應(yīng)體系，已經(jīng)對荔枝炭疽菌和帶荔枝炭 疽菌的植物組織進行了多次重復(fù)驗證，結(jié)果可靠。
[0026] 2、特異性強：本發(fā)明的LAMP引物是針對荔枝炭疽菌GS基因序列中6個不同區(qū)域 設(shè)計出4條特異性引物，6個區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進行核酸擴增，故特異性 尚。
[0027] 3、靈敏度高：本發(fā)明的LAMP檢測方法對荔枝炭疽菌的檢測靈敏度在DNA水平上可 達到l〇〇fg，比常規(guī)PCR檢測高10000倍。
[0028] 4、操作簡便快速：應(yīng)用本發(fā)明方法，對帶荔枝炭疽菌的組織進行檢測可在1小時 內(nèi)完成，且LAMP核酸擴增是在等溫條件下進行，只需一個水浴鍋即可，不需要復(fù)雜的儀器 設(shè)備和昂貴的分子試劑，結(jié)果肉眼直接可見。
【附圖說明】
[0029]圖1為荔枝炭疽菌的特異LAMP瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖。其中：泳道M為DL 2000 DNA marker，泳道1~8分別為荔枝炭疽菌、荔枝霜疫霉菌、桂圓擬莖點霉、擬盤多毛 孢、鏈格孢花腐病菌、瓜果疫霉、瓜果腐霉、荔枝酸腐病菌，第9泳道為陰性對照，第10泳道 為空白對照。
[0030]圖2為荔枝炭疽菌的LAMP靈敏性瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖。其中：泳道M為 DL2000 DNA marker，泳道1 ~9模板濃度分別為100ng，10ng，lng，100pg，10pg，lpg，100fg， 10fg，lfg，第10泳道為陰性對照。
[0031] 圖3為對接種發(fā)病葉片的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖。其中，泳道M為DL 2000 DNA marker，第1泳道為陽性對照，泳道2~3為荔枝炭疽菌的發(fā)病葉片，第4~5泳道為 荔枝霜疫霉和荔枝炭疽菌復(fù)合發(fā)病的葉片，第6泳道為陰性對照，第7泳道為空白對照。
【具體實施方式】
[0032] 下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[0033] 下列實施例所用試劑：Bst DNA聚合酶大片段購自英國NEB公司；DNA marker和 dNTPs試劑購自寶生物工程大連有限公司；甜菜堿（Betaine)和SYBR Green I試劑購自北 京鼎國昌盛有限公司。
[0034] 實施例1 :蒸枝炭疽菌LAMP引物設(shè)計
[0035] 從GenBank中下載荔枝炭疽菌的GS基因（登錄號：JX010086)序列，根據(jù)荔枝炭疽 菌GS基因序列，采用PrimerExplorer V4軟件設(shè)計出一套LAMP檢測引物，包括外引物（F3 和B3)和內(nèi)引物（FIP和BIP)，引物序列分別為：
[0036] F3:5,-GCTGGGCTTCTGGTTATTGC-3,；
[0037] B3 :5' -GCCAACCGGCAAAAAGGATG-3'；
[0038] FIP :5,-ATCAGCCAGGTGGGGTGGG-GCTGCTGGCTGACAGGA-3,；
[0039] BIP:5'-GCCTCCAGCTGCAGGGTTCAA-GCGGACAAAGACGCCTCTA-3'。
[0040] 實施例2 :LAMP快速檢測體系的建立及荔枝炭疽菌LAMP引物的特異性檢測
[0041] 為了驗證蒸枝炭疽菌的特異引物序列，以黃瓜疫霉菌（Phytophthora melonis)、 黃瓜腐霉菌（Pythium aphanidermatum)、桂圓擬莖點霉（Phomopsis guiyuan)、擬盤多 毛孢（Pestalotiopsis sp.)、鏈格孢花腐病菌（Alternaria alternata)、蒸枝酸腐病菌 (Geotrichum candidum)、蒸枝霜疫霉（Peronophythora litchii)(均可購買于中國科學(xué)院 微生物研究所的微生物資源中心），為對比材料。
[0042] 當所述的待檢測樣本為菌體時，使用真菌DNA抽提試劑盒法提取，所用真菌DNA抽 提試劑盒為Omega公司的Fungal DNA kit，貨號為D3390,具體方法如下：
[0043] (1)取凍干菌絲約100mg放入研缽中研磨至粉狀，立即加入800 y L Buffer FG1， 充分混勻后加入2mL離心管中，65°C水浴10min，水浴期間顛倒混勻樣品兩次。
[0044] (2)加入 140 y L Buffer FG2,漩渦混勻，lOOOOrpm 下離心 10min。
[0045] (3)小心地取上清液至一新的1. 5mL離心管中，加0?7倍體積的異丙醇沉淀DNA， lOOOOrpm 下離心 10min。
[0046] (4)小心地倒出上清液，然后把離心管倒置在幾層干凈的濾紙或吸水紙上倒扣 lmin，以吸干殘余的水份。
[0047] (5)加入300 y L無菌水（預(yù)熱65°C )使DNA懸浮，加4 y L RNase (終濃度20 y g/ mL)并混勻，RNA酶處理時不需溫育。
[0048] (6)加入150 y L Buffer FG3和300 y L無水乙醇，混勻，得到一均勻的混合液。
[0049] (7)把收集到的DNA樣品純化柱置于2mL收集管中，lOOOOr