一種抗魚類淋巴囊腫病毒的單鏈抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗魚類淋巴囊腫病毒的單鏈抗體，以及編碼該單鏈抗體的基因、含有該基因的載體和宿主細(xì)胞等。該抗魚類淋巴囊腫病毒的單鏈抗體，是由抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過接頭肽連接而成，并可通過原核表達(dá)系統(tǒng)進行高效表達(dá)。單鏈抗體ScFv?ALV的分子量約為28kD，能夠特異識別魚類淋巴囊腫病毒，阻斷病毒與天然血清的結(jié)合，可進一步用于該病毒的診斷、治療制劑的開發(fā)。
【專利說明】
一種抗魚類淋巴囊腫病毒的單鏈抗體
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種抗魚類淋巴囊腫病毒的單鏈抗體及其制 備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 淋巴囊腫?。↙ymphocys ti s disease， LCD)是Lowe在1874年首先在河鰈 Pleuronectes f Iesus)中發(fā)現(xiàn)，由虹彩病毒科的淋巴囊腫病毒(IXDV)引起，是最早發(fā)現(xiàn)的 魚類病毒病。淋巴囊腫病毒過去主要流行于歐洲和美洲，日本1972年首先發(fā)現(xiàn)LCDV對牙鲆 的感染，1988年，韓國在網(wǎng)箱養(yǎng)殖的石斑魚中檢測到了淋巴囊腫病毒。1997年，我國威海地 區(qū)幾家公司從韓國引進牙鲆魚苗、魚卵和親魚，導(dǎo)致淋巴囊腫病在我國的初次大規(guī)模爆發(fā)， 涉病牙鲆魚達(dá)百余萬尾，發(fā)病率在60 %以上，個別養(yǎng)殖場發(fā)病率在90 %以上。目前，我國的 淋巴囊腫病毒受害魚達(dá)10余種，有云紋石斑魚、真鯛、鱸魚、紫紅笛鯛、牙鲆等。特別是近年 來該病一直在養(yǎng)殖魚類中流行，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟損失高達(dá)數(shù)百億元之巨。
[0003] 自單克隆抗體技術(shù)實現(xiàn)以來，其在檢測試劑和治療制劑方面得到了廣泛應(yīng)用。但 單克隆抗體也存在其自身的缺陷，如雜交瘤細(xì)胞的抗體基因容易丟失、制備工作量大、不利 于抗體蛋白改造等。隨著對免疫球蛋白基因結(jié)構(gòu)的解析和各種基因工程技術(shù)的涌現(xiàn)，人們 開始采用基因工程的方法制備抗體。噬菌體抗體庫是其中一種重要的抗體制備方法，其原 理是將抗體可變區(qū)基因與絲狀噬菌體衣殼蛋白基因連接，并表達(dá)在噬菌體表面。通過抗原 對抗體庫進行多輪親和吸附，從中淘篩出所需的特異性抗體。噬菌體抗體庫技術(shù)的產(chǎn)生取 決于3項實驗技術(shù)的發(fā)展:PCR技術(shù)、噬菌體表面展示技術(shù)、大腸桿菌重組表達(dá)技術(shù)。PCR技術(shù) 使人們可以用一組引物克隆出全套免疫球蛋白可變區(qū)基因，噬菌體表面展示技術(shù)可以將重 組的免疫球蛋白可變區(qū)展示在噬菌體的表面，大腸桿菌重組表達(dá)技術(shù)可以將獲得的特異性 抗體進行重組、表達(dá)和大規(guī)模制備。噬菌體抗體庫技術(shù)避開了常規(guī)單抗制備的細(xì)胞融合、亞 克隆等繁瑣過程，可短期內(nèi)開發(fā)出大量基因工程抗體，因此得到廣泛應(yīng)用。同時，噬菌體抗 體庫技術(shù)開發(fā)的單鏈抗體ScFv是具有完全抗體結(jié)合位點的最小抗體片段，為完整抗體的1/ 6。其具有常規(guī)抗體的特異性，同時又因為分子量小而減少了抗體的免疫原性。同時由于知 道了特異性抗體的基因序列，可以通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)設(shè)計獲得更優(yōu)的改造抗體。再者，特異 性抗體通過基因工程技術(shù)易于大量的生產(chǎn)，如在大腸桿菌、酵母菌、昆蟲、哺乳動物細(xì)胞等 表達(dá)系統(tǒng)大量生產(chǎn)。
[0004] 本發(fā)明采用噬菌體抗體庫技術(shù)篩選了一種抗魚類淋巴囊腫病毒的單鏈抗體，并進 一步對其進行了抗體結(jié)構(gòu)改造，為LCDV病毒診斷試劑開發(fā)、新型藥物研究和抗原表位鑒定 等提供了基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種抗魚類淋巴囊腫病毒的單鏈抗體，從而彌補現(xiàn)有技術(shù)的 不足。通過構(gòu)建噬菌體展示單鏈抗體庫，"富集-洗脫-富集"的循環(huán)操作，從中篩選得到一種 抗魚類淋巴囊腫病毒的單鏈抗體ScFv-LV，并經(jīng)進一步改造獲得優(yōu)化的單鏈抗體ScFv-ALV， 構(gòu)建了表達(dá)單鏈抗體的基因工程菌，從而為采用生物工程的方法大量制備該單鏈抗體提供 了基礎(chǔ)。
[0006] 本發(fā)明首先提供一種抗魚類淋巴囊腫病毒的單鏈抗體ScFv-LV，其編碼蛋白的氨 基酸序列為SEQ ID NO: 1;
[0007] 編碼上述蛋白的一種基因，其一種核苷酸序列為SEQ ID N0:2;
[0008] 改造的單鏈抗體ScFv-ALV的氨基酸序列為SEQ ID NO:3;
[0009]編碼上述改造蛋白的一種基因，其一種核苷酸序列為SEQ ID N0:4;
[0010] 本發(fā)明還提供一種抗魚類淋巴囊腫病毒的單鏈抗體的制備方法，其制備步驟如 下：
[0011] 1)將抗魚類淋巴囊腫病毒的單鏈抗體基因連入表達(dá)載體中，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì) 粒；
[0012] 2)將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，構(gòu)建重組基因工程菌，并進行單鏈抗體的 重組表達(dá)；
[0013] 3)對重組表達(dá)的單鏈抗體進行純化，并開發(fā)魚類淋巴囊腫病毒的診斷、治療制劑。 [0014]本發(fā)明構(gòu)建了表達(dá)抗魚類淋巴囊腫病毒的單鏈抗體的重組菌株，經(jīng)SDS-PAGE分 析，表達(dá)出了28kD左右的重組目的蛋白。將重組蛋白純化后可用于魚類淋巴囊腫病毒的診 斷、預(yù)防和治療。
【具體實施方式】
[0015] 下面結(jié)合【具體實施方式】來進一步描述本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是， 在不偏離本發(fā)明的技術(shù)方案的情況下可以對本發(fā)明的技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進行修改或 替換，這些修改和替換均落入本發(fā)明保護范圍內(nèi)。
[0016] 實施例1抗魚類淋巴囊腫病毒的噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建
[0017] 1、將超速離心獲得的淋巴囊腫病毒與弗氏完全佐劑1:1乳化后免疫BALB/c小鼠， 加強免疫2次至抗體效價達(dá)1:100000以上。取小鼠脾臟，液氮研磨，按50-100mg脾臟加入1ml Trizo 1試劑，室溫靜置5min，加入0.2ml氯仿，反復(fù)劇烈振蕩15s，室溫靜置2-3min。4°C， 12000g/min離心15min，吸取水相于另一干凈1.5ml的離心管中，加入0.5ml異丙醇顛倒混 勾，于-20°C沉淀30_60min，12000g/min離心10min。保留沉淀，70%的乙醇洗滌1遍，空氣中 晾干，DEPC處理水溶解沉淀RNA。
[0018] 2、基因組DNA的去除和反轉(zhuǎn)錄合成CDNA(采用天根公司的FastQuant CDNA第一條 鏈合成試劑盒）：
[0019] 2.1基因組DNA的去除：按下述體系配制基因組DNA去除體系，徹底混勻。簡短離心， 并置于42°C，孵育3min，然后置于冰上放置。
[0020] 5 XgDNA Buffer 2μ1
[0021 ] RNA 模板 Iyg
[0022] RNase-Free ddH2〇 補足到 10μ1
[0023] 2.2cDNA的合成:按下述體系配制混合液，充分混勻。 IOX Fast RT Buffer 2 μ1 RT Enzyme Mix I μ I
[0024] ' FQ-RT Primer Mix 2 μ I RNase-Free ddH2〇 補足到 IOwl
[0025] 將上述基因組DNA的去除體系和反轉(zhuǎn)錄體系混合，充分混勻，42 °C孵育15min。95 °C 孵育3min后放于冰上，得到的cDNA可用于后繼試驗。
[0026] 3、設(shè)計和合成的小鼠抗體輕、重鏈可變區(qū)擴增引物：
[0027]擴增單鏈抗體重鏈VH的引物：
[0028] VH上：5-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCSAGGTSMARCTGCAGSAGTC-3;
[0029] VH下：5-GCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT-3。
[0030]擴增單鏈抗體輕鏈VL的引物：
[0031 ] VL上：5-TCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATYGAGCTCACYCAGTCTCC-3
[0032] VL下：5-GAGTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTBAKYTCCARCTTKGTSCC-3。
[0033] 備注:b = T、C、G;K = T、G;M=A、C;R=A、G;S=G、C;W=A、T;Y = C、T。
[0034] 用上述引物分別擴增上述cDNA模板，膠回收獲得其輕、重鏈可變區(qū)基因片段。
[0035] 4、將上述擴增到的VH和VL基因片斷分別用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行分離、回收， 然后將VH和VL等量混合作為模板進行重疊延伸PCR(SOE-PCR)以裝配ScFv片斷，條件為94°C Imin變性、55°C Imin退火、72°C Imin延伸，共30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物即為單鏈抗體基因片斷，VH 和VL基因之間是15個氨基酸的linker序列:GGGGSGGGGSGGGGS。
[0036] 5、將膠回收的ScFv基因和pCANTAB5E載體分別雙酶切（Sfi I和Not I)后連接，將 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到1〇〇μ1 TGl感受態(tài)細(xì)胞，然后加入900μ1 37°C預(yù)熱的2\￥1'培養(yǎng)基，37°(：振 蕩培養(yǎng)lh。取上步轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)的菌液100μΙ，用2 X YT培養(yǎng)液做梯度倍比稀釋，涂布SOB-AG平 板，30Γ培養(yǎng)過夜。計數(shù)平板上的單菌落數(shù)，推算抗體庫庫容量為IX 108。剩余的轉(zhuǎn)化后培 養(yǎng)的菌液，加入10ml 2 X YT(含葡萄糖:2%，Amp: 100μg/ml)，37°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入2 \101()噬菌體姐31(07,37°(：培養(yǎng)111，400(^/111丨11離心10111丨11，重懸沉淀于2001111 2\￥1'(含厶1^: 100μg/ml，卡那霉素：50μg/ml)，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。4000g/min離心10min后，加入1/5體積 量的 PEG/NaCl (20 % 的 PEG8000，2 · 5mol/L的 NaCl)于4°C 沉淀噬菌體30min，9000g/min離心 20min，將沉淀菌體重懸于2ml含10g/L BSA的PBS中，12000g/min離心5min，上清經(jīng)0·45μηι 濾膜過濾，即獲得噬菌體單鏈抗體庫。
[0037]實施例2單鏈抗體多樣性的分析
[0038]隨機挑取10個克隆，搖菌擴增后提取質(zhì)粒，用Sfi I和Not I雙酶切，初步鑒定陽性 克隆。以SI (SI: 5-CAACGTGAAAAAATTATTATT-3)、S6(S6:5-GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3)為 引物進行測序分析，結(jié)果10個克隆的測序結(jié)果表明序列均與小鼠免疫球蛋白可變區(qū)序列一 致，符合小鼠輕重鏈可變區(qū)基因結(jié)構(gòu)，排列方式為VH-Linker-VL。其中VH部分為357-367bp 左右，VL為320-330bp左右，重鏈和輕鏈之間的I inker堿基序列全部正確。序列比對表明其 同源性達(dá)80%以上。
[0039]實施例3抗魚類淋巴囊腫病毒單鏈抗體庫的富集
[0040] 1、將魚類淋巴囊腫病毒液按1:5(體積比）稀釋，用碳酸鹽包被緩沖液包被到免疫 管，2ml/管，4°C過夜。
[00411 2、包被完畢，用I3BS洗管3次，拍干；用封閉（2%脫脂乳roS，MPBS)封閉免疫管，37 °C封閉2小時。
[0042] 3、傾去封閉液，用PBS洗管3次，拍干；
[0043] 4、將上述已獲得的初級噬菌體單鏈抗體庫上清，按照MPBS:上清=2:3的體積比將 MPBS和噬菌體上清進行混勻，在室溫下進行去干擾化處理20min。
[0044] 5、將4中處理好液體加入封閉好的免疫管，2ml/管，輕搖溫育30min后，再靜置溫育 1.5小時。
[0045] 6、棄免疫管內(nèi)噬菌體上清，用PBST洗滌3次，再用PBS洗滌3次，拍干。
[0046] 7、加入甘氨酸-鹽酸(pH2.2)洗脫液，2ml/管，37°C作用6min后，迅速加入Tris緩沖 液（2moI/L pH 7.4)，200μ 1 /管中和洗脫下來的噬菌體溶液，再加入2ml新鮮的TG1菌液 (OD6qq值約為0.5 )，37 °C作用Ih。完成了第一輪淘篩，獲得了 一級抗體庫。
[0047] 8、取部分菌液做10倍梯度稀釋后，涂布SOB-AG板計算輸出的噬菌體淘篩量，剩余 菌液加入終濃度為l〇〇μg/ml Amp和2 %葡萄糖，同時加入約4 X 101()M13K07噬菌體，靜置溫育 30min后，再250rpm振蕩培養(yǎng)30min; 1000 g離心10min，去上清，用100ml 2 X YT-AK輕懸細(xì)胞， 37°C，250rpm，培養(yǎng)過夜，開始下一輪淘篩。
[0048] 9、最終經(jīng)過3輪淘篩，取獲得的菌液，用2 X YT培養(yǎng)基做梯度倍比稀釋，取稀釋液 100μ 1涂布SOB-AG平板，30 °C培養(yǎng)過夜；
[0049] 選取大約有100-200個左右菌落的平板，計算菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得相應(yīng) 庫容。經(jīng)過3輪特異性富集淘篩，獲得了滴度約為2.3 X 106pf u/ml的噬菌體重組抗體庫。剩 余菌液加入無菌甘油至終濃度20%，混勻后，-70°C凍存，標(biāo)記為三級抗體庫。
[0050] 實施例5單鏈抗體的檢測及強陽性株的篩選
[00511取72個1.5ml的離心管置培養(yǎng)架上作為培養(yǎng)板，每孔加入2 X YT-AG培養(yǎng)基400μ1; 挑取上述中的SOB-AG平板上長出的單個菌落，接種至上面各孔中，此板標(biāo)記為Master Plate;將Master Plate置于搖床，30°C，250rpm/min，振蕩培養(yǎng)過夜；次日，另取72孔培養(yǎng) 板，取400μ1含有2.5 X 101Qpfu/ml M13K07的2 X YT-AG至每孔，此板標(biāo)為PlPlate;從過夜培 養(yǎng)的Master Plate上每孔取40μ1培養(yǎng)液至PlPlate;將PlPlate置于搖床，37°C，150rpm/ min，振蕩培養(yǎng)2小時，1500g離心20min，小心去上清；向PlPlate每孔加入400 μL 2 X YT-AK 培養(yǎng)液，37°C，250rpm/min，振蕩培養(yǎng)過夜；1500g離心20min，小心取上清待用。
[0052]將超速離心獲得的魚類淋巴囊腫病毒4°C包被酶標(biāo)板過夜，MPBS封閉，洗滌后，以 上面獲得噬菌體液為一抗，37 °C孵育2h，HRP標(biāo)記的抗M13單抗為二抗，37 °C反應(yīng)Ih，洗滌后 加入TMB顯色液，37 °C反應(yīng)30min，加入2M硫酸終止顯色，酶標(biāo)儀450nm波長下測OD值，設(shè) Ml 3K07包被對照孔（陽性對照）和空白包被對照孔，找出陽性克隆(0D值彡0.3且OD值/OD空 白孔多3可以確定為陽性克?。〢LISA測定各孔上清與淋巴囊腫病毒的結(jié)合情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 15株克隆與抗原有陽性反應(yīng)，初步確定這15株重組克隆為陽性，其中一株噬菌體抗體為強 陽性，命名為ScFv-LV株。
[0053]提取ScFv-LV株克隆的重組質(zhì)粒，以S1、S6為引物做PCR鑒定，目的片段用膠回收試 劑盒回收后送公司測序，測序結(jié)果表明目的ScFv序列排列方式為VH-Linker-VL，序列比對 發(fā)現(xiàn)符合小鼠輕重鏈可變區(qū)基因結(jié)構(gòu)。在Genebank中進行Blast同源性比較，發(fā)現(xiàn)最大同源 性只為94%，表明發(fā)生了氨基酸的變化，是一個新的鼠單鏈抗體ScFv，其編碼蛋白的氨基酸 序列為SEQ ID NO: 1，核苷酸序列為SEQ ID N0:2。根據(jù)生物軟件的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測信息，將 ScFv-LV株的33位絲氨酸(S)變成天冬酰胺(N)、56位絲氨酸(S)變成異亮氨酸（I)、105位天 冬氨酸(D)變成絲氨酸(S)、190位賴氨酸(L)變成精氨酸(R)和225位谷氨酰胺(Q)變成脯氨 酸(P)，并命名為單鏈抗體ScFv-ALV，其編碼蛋白的氨基酸序列為SEQ ID N0:3,核苷酸序列 為SEQ ID NO:4。
[0054] 實施例6改造后的單鏈抗體ScFv-ALV與原始單鏈抗體ScFv-LV的原核表達(dá)
[0055] 1、單鏈抗體ScFv-LV基因片段的擴增及改造前后重組質(zhì)粒的鑒定
[0056] 根據(jù)ScFv-LV的基因序列設(shè)計一對引物，兩端分別加上BamHI和Hind III內(nèi)切酶：
[0057] LV-Pl：5-CCAGGATCCATGGCCCAGGTGAAG-3
[0058] LV-P2：5-CCGAAGCTTTTACTTCAGTTCGAG-3 [0059]加入下列試劑進行擴增： IOXPCRbuffer 5 μ 1
[0060] dNTP (2.5mM) 4 μ L LV-Pl I Hl LV-P2 1 μ I
[0061 ] 模板（LV基因片段） UiL Taq(5U/ μ L) 0.5 μ I 無菌水 37.5 μ I
[0062]純化PCR產(chǎn)物，與蛋白表達(dá)載體pET-28a分別酶切后連接，并轉(zhuǎn)入Τ0Ρ10菌株接種到 含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C震蕩過夜，提取重組質(zhì)粒酶切鑒定。
[0063] 將改造后的ScFv-ALV全基因合成，兩端分別加上BamHI和Hind III內(nèi)切酶，與蛋白 表達(dá)載體pET-28a分別酶切后連接，并轉(zhuǎn)入T0P10菌株接種到含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 °(：震蕩過夜，提取重組質(zhì)粒酶切鑒定。
[0064] 將鑒定好的pET28a-ScFv-LV、pET28a-ScFv-ALV送公司測序，結(jié)果正確無誤。
[0065] 2、單鏈抗體ScFv-LV、ScFv-ALV的原核表達(dá)及純化
[0066] 將鑒定好的重組質(zhì)粒pET28a-ScFv-LV、pET28a-ScFv-ALV分別轉(zhuǎn)入BL21(DE3)大腸 桿菌中，在37°C培養(yǎng)至菌液吸光度約0.6時，加 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，25°C誘導(dǎo)6h，以未加 IPTG菌液作對照，進行SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)情況。目的蛋白主要以可溶形式表達(dá)，采用鎳 柱純化，具體步驟如下：
[0067] (1)誘導(dǎo)表達(dá)后菌液產(chǎn)物經(jīng)4°C，8000g/min離心15min，去除上清。
[0068] (2)用0.1 倍培養(yǎng)基體積的Wash Buffer(20mM Tris，pH7.5，10mM EDTA)重懸沉淀， 充分混勻。
[0069] (3)冰上操作，超聲裂解細(xì)菌。
[0070] (4)10000g/min離心10min，收集超聲破碎上清。
[0071] (5)鎳柱純化，咪唑洗脫。將收集的重組蛋白洗脫液放入透析袋，PBS液作為透析外 液，透析脫鹽后即得單鏈抗體ScFv-LV、ScFv-ALV。
[0072] (6)考馬斯亮藍(lán)法分別測定蛋白濃度，用PBS液調(diào)整為lmg/ml，-20 °C保存。
[0073] 實施例7間接ELISA檢測重組單鏈抗體的活性
[0074] 按照最佳包被條件，將純化的魚類淋巴囊腫病毒4°C包被酶標(biāo)板過夜；棄包被液， 用I3BST洗滌2次，拍干酶標(biāo)板;加入MPBS至滿孔，37°C封閉1.5h;棄封閉液，用I 3BST洗滌3次， 拍干酶標(biāo)板;分別加上不同稀釋度的重組單鏈抗體ScFv-LV、SCFv-ALV，同時設(shè)立PBS液作為 陰性對照，37 °C反應(yīng)Ih;棄重組抗體液，用PBST洗滌3次，拍干酶標(biāo)板;將HRP標(biāo)記抗His的抗 體用PBS做1:4000稀釋，100μΙ/孔，37 °C孵育反應(yīng)Ih;棄酶標(biāo)抗體液，用PBST洗滌3次，拍干酶 標(biāo)板；顯色：加入1〇〇μ1/孔TMB顯色液，37 °C孵育顯色15min;終止：用100μΙ/孔終止液，終止 顯色，在450nm處讀值。結(jié)果見下表。間接ELISA結(jié)果表明，原核表達(dá)的原始單鏈抗體ScFv-LV 與改造后的單鏈抗體ScFv-ALV均與淋巴囊腫病毒具有較強的結(jié)合能力，改造后的單鏈抗體 ScFv-ALV與LCDV病毒的結(jié)合能力更強(表1)。
[0075]表1:間接ELISA檢測改造前后重組單鏈抗體的活性
[0077] 實施例8阻斷ELISA檢測重組單鏈抗體ScFv-ALV的活性
[0078]按照最佳包被條件，將純化的淋巴囊腫病毒(IXDV)包被96孔板，4°C包被過夜后用 MPBS封閉。將LCDV病毒液按8倍、4倍、2倍、1倍包被濃度設(shè)置4個梯度，每一梯度設(shè)立阻斷孔 和非阻斷孔，各為三重復(fù)。IXDV病毒液與重組單鏈抗體ScFv-AL V液各50μ1在孔外室溫反應(yīng) 30min，移至阻斷孔，PBS液與重組單鏈抗體ScFv-ALV液同樣反應(yīng)后移至非阻斷孔，37°C反應(yīng) Ih;棄反應(yīng)液，用PBST洗滌3次，拍干酶標(biāo)板;將HRP標(biāo)記抗His的抗體用PBS做1:4000稀釋， 100μΙ/孔，37 °C孵育反應(yīng)Ih;棄酶標(biāo)抗體液，用I3BST洗滌3次，拍干酶標(biāo)板;顯色:加入100μΙ/ 孔TMB顯色液，37 °C孵育顯色15min;終止:用100μΙ/孔終止液，終止顯色，在450nm處讀值。結(jié) 果顯示用來阻斷的病毒濃度越高，剩下能夠與已包被在ELISA板上的病毒反應(yīng)的單鏈抗體 量越少，ELISA的0D45Q值越小，結(jié)果見下表，說明重組單鏈抗體ScFv-ALV與IXDV病毒結(jié)合反 應(yīng)的特異性較好，有阻斷作用。
[0079] 表2:阻斷ELISA檢測重組單鏈抗體ScFv-ALV的活性
[0082] 實施例9基于單鏈抗體ScFv-ALV的雙抗夾心ELISA法檢測LCDV
[0083] 病毒
[0084] 將重組單鏈抗體ScFv-ALV包被96孔板，同時設(shè)立空白包被孔作為陰性對照，4 °C包 被過夜。MPBS封閉，洗滌后加入純化的IXDV病毒，各做三個重復(fù)，37°C反應(yīng)Ih，洗滌后加入抗 IXDV病毒的兔血清（1:5000稀釋），37 °C反應(yīng)Ih，洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體，37 °C反 應(yīng)Ih，同上顯色及測定OD值。結(jié)果表明建立的雙抗夾心ELISA法可以用于檢測LCDV病毒抗 原。
[0085] 衷3:雙賽心RLTSA法檢測LCDV病毒抗原
[0087] 實施例10重組單鏈抗體ScFv-ALV的特異性試驗
[0088] 將純化的淋巴囊腫病毒(IXDV)、傳染性造血器官壞死病毒（IHNV)、病毒性出血性 敗血癥病毒(VHSV)、鯉春血癥病毒(SVCV)包被96孔板，4°C包被過夜。MPBS封閉，洗滌后加入 重組單鏈抗體ScFv-ALV作為一抗，37°C反應(yīng)Ih，洗滌。將HRP標(biāo)記抗His的抗體用PBS做1: 4000稀釋，100μΙ/孔，37 °C孵育反應(yīng)Ih;棄酶標(biāo)抗體液，用I3BST洗滌3次，拍干酶標(biāo)板;顯色： 加入100μΙ/孔TMB顯色液，37°C孵育顯色15min;終止：用100μΙ/孔終止液，終止顯色，在 450nm處讀值。結(jié)果見下表，說明所篩選的重組單鏈抗體ScFv-ALV僅能夠與魚類淋巴囊腫病 毒發(fā)生反應(yīng)，而與其他魚類病毒反應(yīng)無信號，證明其具有病毒識別特異性。
[0089] 表4:重組單鏈抗體ScFv-ALV的特異性
【主權(quán)項】
1. 一種抗魚類淋巴囊腫病毒的單鏈抗體，其特征在于，所述的單鏈抗體的氨基酸序列 為SEQ ID N0:1。2. -種核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段編碼權(quán)利要求1所述的單鏈抗體。3. 如權(quán)利要求2所述的核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段的序列為SEQ ID N0:2〇4. 一種抗魚類淋巴囊腫病毒的單鏈抗體，其特征在于，所述的單鏈抗體的氨基酸序列 為SEQ ID N0:3。5. -種核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段編碼權(quán)利要求4所述的單鏈抗體。6. 如權(quán)利要求5所述的核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段的序列為SEQ ID N0:4〇7. 權(quán)利要求1或4所述的單鏈抗體的制備方法，其特征在于，所述的制備方法包括有如 下的步驟： 1) 將單鏈抗體基因連入原核表達(dá)載體中，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒； 2) 將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，構(gòu)建能表達(dá)單鏈抗體的重組基因工程菌，用該 重組基因工程菌表達(dá)出單鏈抗體。8. 權(quán)利要求1或4所述的單鏈抗體在制備魚類淋巴囊腫病毒診斷、治療制劑和抗原表位 研究中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK105859879SQ201610393432
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月3日
【發(fā)明人】侯竹美
【申請人】青島農(nóng)業(yè)大學(xué)