專利名稱：：伊維菌素的單鏈抗體hsIVM8及其制備方法、其在免疫學(xué)檢測的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抗體，具體涉及一種伊維菌素的單鏈抗體hsIVM8及其制備方法、在免疫學(xué)檢測的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：伊維菌素(IVM)是大環(huán)內(nèi)酯類廣譜抗寄生蟲藥物，它通過與無脊柱動(dòng)物神經(jīng)細(xì)胞與肌肉細(xì)胞中谷氨酸為閥門的氯離子通道的高親和力結(jié)合，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜對氯離子通透性的增加，引起神經(jīng)細(xì)胞或肌肉細(xì)胞超極化，使寄生蟲麻痹或死亡。因其對多數(shù)線蟲和節(jié)肢動(dòng)物殺滅作用較強(qiáng)[l]，且不易使寄生蟲產(chǎn)生耐藥性，已被世界各國廣泛用于水產(chǎn)業(yè)，農(nóng)業(yè)，畜牧業(yè)及人類熱帶雨林病[2]等的治療。然而不規(guī)范用藥會引起伊維菌素在環(huán)境，食品和動(dòng)物體內(nèi)的高殘留，作為高毒性化合物，對人和自然界產(chǎn)生了潛在危害[3-5]，使人類更加關(guān)注對IVM的檢測，其中伊維菌素抗體在樣品免疫檢測中是關(guān)鍵。目前對伊維菌素殘留檢測的研究有液質(zhì)、質(zhì)譜[6，7]及依賴于單抗或多抗的ELISA法[8]。但是伊維菌素的單鏈抗體制備以及免疫分析法的建立，國內(nèi)外均沒有文獻(xiàn)報(bào)道。參考文獻(xiàn)[l]LYWen，XLYan，F(xiàn)HSun，etal.Arandomized,double-blind，multicenterclinicaltrialontheefficacyofivermectinagainstintestinalnematodeinfectionsinChina[J].ActaTropica.2008，106:190—194.[2]Z.Tadesse，A.Hailemariam，J.H.Kolaczinski.PotentialforintegratedcontrolofneglectedtropicaldiseasesinEthiopia[J].TransactionsoftheRoyalSocietyofTropicalMedicineandHygiene.2008，102:213—214.[3]B.A.Halley，T.A.Jacob,A.Y.H丄u，Theenvironmentalimpactoftheuseofivermectin-environmentaleffectsandfate，Chemosphere.18(1989)1543-1563.[4]D.R.Hennesy，M.R.Alvinerie，Pharmacokineticsofthemacrocycliclactones-Conventionalwisdomandnewparadigms,Macrocycliclactonesinantiparasitetherapy.NewYork:CABIPublishing;2002.97-124.[5]R.A.Wall，L.Strong,Environmentalconsequencesoftreatingcattlewiththeantiparasiticdrugivermectin,Nature.327(1987)418-421.[6]J.Raich-Montiu，K.A.Krogh，M.Granados，J.A.Jonsson，B.Hailing-S0rensen,Determinationofivermectinandtransformationproductsinenvironmentalwatersusinghoilowfibre—supportedliquidmembraneextractionandliquidchromatography-massspectrometry/massspectrometry，J.Chromatogr.A.1187(2008)275-280.[7]K.A.Krogh，E.Bjorklund，D.Loeffler，G.Fink，B.Hailing—S0rensen,3T.A.Ternes，Developmentofananalyticalmethodtodetermineivermectinsinwater,sedimentsandsoilsusingliquidchromatogr即hy—tandemmassspectrometry,J.Chromatogr.A.1211(2008)60-69.[8]D.J.Schmidt,C.E.Clarkson，T.A.Swanson，M.L.Egger，R.E.Carlson,J.M.VanEmon，A.E.Karu，Monoclonalantibodiesforimmunoassayofavermectins，J.Agric.FoodChem.38(1990)1763-1770.
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明目的目前伊維菌素殘留檢測方法依賴于昂貴的儀器，或是獲得過程費(fèi)時(shí)的多克隆抗體及實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求苛刻的單克隆抗體。而廉價(jià)、快速、易于大批量獲得的伊維菌素的單鏈抗體尚未見報(bào)道。本發(fā)明提供了一種廉價(jià)、簡便、快捷的制備伊維菌素單鏈抗體的方法，并建立了依賴于單鏈抗體的適合大量樣品快速篩查的伊維菌素免疫學(xué)檢測方法。技術(shù)方案本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的—種伊維菌素的單鏈抗體hsIVM8核酸序列為SeqNO.1?！N伊維菌素的單鏈抗體hsIVM8，其氨基酸序列為SeqNO.2?！N伊維菌素的單鏈抗體hsIVM8的制備，其特征在于以伊維菌素-牛血清白蛋白結(jié)合物為包被抗原包被免疫管，通過固相抗原篩選法從人源噬菌體抗體庫TomlinsonJ中篩選展示伊維菌素單鏈抗體的噬菌體，用單克隆ELISA法篩選陽性噬菌體，將陽性噬菌體感染大腸桿菌HB2151進(jìn)行可溶性抗體的表達(dá)，對單鏈抗體進(jìn)行純化，獲得伊維菌素的單鏈抗體hsIVM8。—種單鏈抗體hsIVM8在伊維菌素間接競爭ELISA檢測方法的應(yīng)用，其特征在于如下步驟A、間接非競爭ELISA法測定單鏈抗體hsIVM8的工作濃度及效價(jià)選擇0D值為1.0時(shí)的抗原抗體稀釋濃度作為包被抗原、抗體工作濃度，以Ara45。/APJ!45。>2.1的最大稀釋倍數(shù)作為抗體的最終效價(jià)；B、將伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品與兩倍工作濃度的單鏈抗體hsIVM8等體積混合過夜，所述的伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為0.01，0.1，2，5，lOiig/mL;C、將工作濃度的伊維菌素包被抗原加入酶標(biāo)板，洗去未吸附抗原，再加入封閉液封閉酶標(biāo)板剩余的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，洗去多余的封閉物；將所述的伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品與單鏈抗體hsIVM8的混合液和所述的待測樣品與單鏈抗體hsIVM8的混合液分別加入酶標(biāo)板，使伊維菌素包被抗原與混合液中的標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品對單鏈抗體hsIVM8進(jìn)行競爭免疫結(jié)合反應(yīng)，在酶標(biāo)板的微孔底部形成伊維菌素包被抗原-抗體復(fù)合物，洗去游離的抗原和抗體；然后加入辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記的anti-His抗體，使在酶標(biāo)板上形成包被抗原_抗體_二抗-HRP復(fù)合物，洗去未結(jié)合的酶標(biāo)二抗；再加入酶的底物，在酶的催化作用下，底物發(fā)生降解反應(yīng)，產(chǎn)生有色產(chǎn)物；最后加入50iiL/孔的2MH2S04，終止反應(yīng)；D、用酶標(biāo)儀測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔及待測樣品孔的吸光值，計(jì)算抑制率，繪制伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品濃度對抑制率的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對線性范圍進(jìn)行回歸分析，建立伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)抑4制曲線的回歸方程I=23.986LogC+35.267，R2=0.9294，伊維菌素對單鏈抗體hsIVM8的抑制中濃度IC5。為4.11g/mL，伊維菌素最低檢測限IC1Q為0.088yg/mL，線性檢測范圍在0.1-5.OPg/mL，根據(jù)待測樣品的吸光度計(jì)算待測樣品的濃度；所述的I為伊維菌素對單鏈抗體hsIVM8的抑制率，C為伊維菌素濃度。所述的伊維菌素_牛血清白蛋白(IVM-BSA)的制備方法參照文獻(xiàn)D.J.Schmidt,C.E.Clarkson，T.A.Swanson，M.L.Egger，R.E.Carlson,J.M.VanEmon，A.E.Karu，Monoclonalantibodiesforimmunoassayofavermectins，J.Agric.FoodChem.38(1990)1763-1770。所述的伊維菌素的單鏈抗體命名為hsIVM8。所述的HRP標(biāo)記的anti-His抗體及大腸桿菌HB2151均購自北京GE公司，Pharmacia生產(chǎn)。本發(fā)明中所述的固相抗原篩選法具體為將4mL，100ug/mL牛血清白蛋白(BSA)和伊維菌素-牛血清白蛋白(IVM-BSA)分別包被免疫管，4t:過夜，次日用8mL含2X脫脂牛奶的PBS(PBSM)室溫封閉2h，用含0.5%Tween-20的PBS(PBST)洗滌3次。加入1012pfu/mL的人源噬菌體抗體庫TomlinsonJ于4mLPBSM中，與固相化抗原BSA室溫反應(yīng)lh后置于搖床中緩慢振蕩lh。取出上清加入包被有IVM-BSA的免疫管中，室溫反應(yīng)lh后置于搖床中緩慢震蕩lh。用500iiLTrypsin-PBS(50iiL的10mg/mLtrypsin溶液加入450iiLPBS)室溫震蕩洗脫10min。取250L洗脫的噬菌體感染1.75mL處于對數(shù)生長期的大腸桿菌TGl，37t:靜置30min，取10yL鋪板計(jì)算噬菌體滴度。按上述方法繼續(xù)進(jìn)行3次篩選，并計(jì)算每輪篩選的產(chǎn)出率(產(chǎn)出滴度/投入滴度)。1-4輪篩選包被的IVM-BSA濃度依次為100，75，50，20ug/mL。所述的大腸桿菌TGI購自北京GE公司，Pharmacia生產(chǎn)。所述的單克隆ELISA法篩選陽性噬菌體富集的重組噬菌體感染處于對數(shù)期的TGl，37t:靜置30min，37t:搖床培養(yǎng)lh后涂布在含100yg/mL氨芐青霉素和1%葡萄糖的TYE(TYE-AG)固體培養(yǎng)基上，37。C培養(yǎng)過夜。隨機(jī)挑選96個(gè)單菌落，分別接種于200uL2XTY-AG培養(yǎng)基中，37t:培養(yǎng)2h，加入25uL2XYT_AGM13K07(109pfu/mL)后繼續(xù)培養(yǎng)lh，再1800g離心10min，倒掉上清，菌體沉淀用含100yg/mL氨芐青霉素和50yg/mL卡那霉素的2XTY(2XTY-AK)懸浮，3(TC培養(yǎng)過夜。次日，離心取上清單克隆ELISA鑒定每孔各取lOOuL加入到包被有IVM-BSA并已經(jīng)用PBSM封閉2h的96孔板中室溫反應(yīng)lh，以包被載體蛋白BSA的孔作為陰性對照。PBST洗滌6次，加入1:5000HRP-羊抗M13抗體，37。C孵育lh，同上洗滌后，加HRP底物顯色液顯色15min，以2MH2S04終止反應(yīng)，于波長450nm測定OD值，高于陰性值2.1倍的視為陽性。經(jīng)ELISA鑒定的陽性值最高的克隆菌株表達(dá)的單鏈抗體為hsIVM8(圖1)。所述的HRP標(biāo)記的羊抗M13抗體購自北京GE公司，Pharmacia生產(chǎn)。所述的陽性噬菌體感染大腸桿菌HB2151進(jìn)行可溶性抗體的表達(dá)取出20uL表達(dá)hsIVM8的過夜培養(yǎng)菌液加入到2mL2XTY-AG中，37。C搖床1.5h，3，300g離心10min，去上清后沉淀以2mL2XTY-AK重懸，37。C搖床培養(yǎng)過夜。3，300g離心10min后將上清加入含20%聚乙二醇6000和2.5MNaCl(PEG/NaCl)的溶液中，混勻后置冰上lh，3，300g離心30min盡可能的吸除管內(nèi)的液體。以2XTY重懸重組噬菌體，加入lmL處于對數(shù)期的大腸桿菌HB2151，37t:水浴30min，鋪TYE-AG平板，37。C過夜培養(yǎng)。挑過夜培養(yǎng)hsIVM8的單克隆菌落于3mL2XTY-AG中，37。C過夜培養(yǎng)。次日，取2mL到200mL含100ug/mL氨芐青霉素和0.1%葡萄糖的2XTY中，37。C搖床培養(yǎng)3h，加25mL含100ug/mL氨芐青霉素和9mM異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，25t:培養(yǎng)18h。單鏈抗體純化經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的菌液于3，300g，4t:離心15min，棄上清，菌體沉淀加入10mL上樣緩沖液(20mMTris-Cl;500mMNaCl;10mM咪唑；pH7.4)重懸后置于冰上用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，條件設(shè)為400W，工作5s，間隔8s，50次循環(huán)。12，000g，4°C離心10min取上清，過0.22iim膜過濾。鎳親和柱依次用雙蒸水，上樣緩沖液沖洗至平衡，過濾溶液上樣，再分別用上樣和洗滌緩沖液(20mMTris-Cl;500mMNaCl;20-60mM咪唑；pH7.4)洗滌至平衡。最后用洗脫緩沖液(20mMTris-Cl;500mMNaCl;500mM咪唑;pH7.4)洗脫目的蛋白。流速均控制在lmL/min。洗脫液立即用PBS透析過夜，換液3_4次。用12%SDS-PAGE膠檢測其純度(圖2)。獲得伊維菌素的單鏈抗體hsIVM8:ELISA鑒定的陽性值最高的克隆菌株表達(dá)的hsIVM8核酸序列送上海英俊公司測序，以確定其含有全長序列，hsIVM8的核酸序列為SeqNo.1;并利用PrimerPremier5.0推導(dǎo)氨基酸序列，以確定其能正確翻譯成氨基酸，hsIVM8的氨基酸序列為SeqNo.2。本發(fā)明中所述的間接非競爭ELISA法測定抗體的工作濃度及效價(jià)，具體方法為用方陣滴定法確定抗體及包被抗原的工作濃度。選擇OD值為1.0時(shí)的抗原、抗體稀釋濃度作為抗原、抗體工作濃度。并用工作濃度的包被抗原包被96孔微孔板，將單鏈抗體hsIVM8進(jìn)行倍比稀釋，以PBS溶液作為空白對照，用間接非競爭ELISA法測定抗體效價(jià)，以Ara45。/A陰4s。>2.1的最大稀釋倍數(shù)作為單鏈抗體hsIVM8的最終效價(jià)。建立單鏈抗體hsIVM8在伊維菌素間接競爭ELISA檢測方法中的應(yīng)用將O.Ol，0.1，2，5，10iig/mL伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品分別與兩倍工作濃度的單鏈抗體hsIVM8等體積混合過夜；工作濃度的伊維菌素包被抗原加入酶標(biāo)板，洗去未吸附抗原，再加入封閉液封閉酶標(biāo)板剩余的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，洗去多余的封閉物；將所述的0.01，0.1，2，5，10iig/mL伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品與單鏈抗體hsIVM8的混合液加入酶標(biāo)板，使包被抗原與混合液中的標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品對單鏈抗體hsIVM8進(jìn)行競爭免疫結(jié)合反應(yīng)，在酶標(biāo)板的微孔底部形成包被抗原-抗體復(fù)合物，洗去游離的抗原和抗體；然后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的anti-His抗體，使在酶標(biāo)板上形成包被抗原_抗體_二抗-HRP復(fù)合物，洗去未結(jié)合的酶標(biāo)二抗；再加入酶的底物，在酶的催化作用下，底物發(fā)生降解反應(yīng)，產(chǎn)生有色產(chǎn)物；最后加入50iiL/孔的2MH2S04，終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔及待測樣品孔的吸光值，計(jì)算抑制率，繪制伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品濃度對抑制率的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對線性范圍進(jìn)行回歸分析，建立伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線的回歸方程I=23.986LogC+35.267(R2=0.9294)，伊維菌素對單鏈抗體hsIVM的抑制中濃度(15。)為4.11i!g/mL，伊維菌素最低檢測限I^為0.088iig/mL，線性檢測范圍在0.1_5.0yg/mL，根據(jù)待測樣品的吸光度計(jì)算待測樣品的濃度(圖4)。有益效果1、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于國內(nèi)外首次報(bào)道了伊維菌素的單鏈抗體hsIVM8制備與免疫學(xué)檢測方法，與現(xiàn)有的抗體獲得途徑相比，該制備方法具有簡單、快速、檢測成本低等優(yōu)點(diǎn)。2、本發(fā)明的抗體易于基因操作和基因工程大量生產(chǎn)，可用于構(gòu)建多種雙功能抗體分子，有助于標(biāo)記和偶聯(lián)其他分子。3、本發(fā)明的抗體含有(His)e標(biāo)簽蛋白，易于檢測和純化。4、本發(fā)明中伊維菌素對抗體的抑制中濃度(IC5。)為4.11i！g/mL，伊維菌素最低檢測限IQ。為0.088iig/mL，抗體對伊維菌素的線性檢測范圍為0.1-5.0yg/mL，適用于環(huán)境及農(nóng)產(chǎn)品中伊維菌素殘留檢測。圖1篩選的11株陽性克隆的單克隆ELISA圖2過鎳親和柱純化后的SDS-PAGE電泳圖圖3間接競爭ELISA法建立的伊維菌素檢測標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。固相篩選法對噬菌體的富集用固相抗原篩選法從人源抗體庫中篩選伊維菌素的單鏈抗體hsIVM8:將4mL，100ug/mL牛血清白蛋白(BSA)和伊維菌素-牛血清白蛋白(IVM-BSA)分別包被免疫管，4t:過夜，次日用8mL含2X脫脂牛奶的PBS(PBSM)室溫封閉2h，用含0.5%Tween-20的PBS(PBST)洗滌3次。加入1012pfu/mL的噬菌體抗體庫于4mLPBSM中，與固相化抗原BSA室溫反應(yīng)lh后置于搖床中緩慢振蕩lh。取出上清加入包被有IVM-BSA的免疫管中，室溫反應(yīng)lh后置于搖床中緩慢震蕩lh。用500iiLTrypsin-PBS(50yL的10mg/mLtrypsin溶液加入450iiLPBS)室溫震蕩洗脫10min。取250yL洗脫的噬菌體感染1.75mL處于對數(shù)生長期的大腸桿菌TGl，37t:靜置30min，取10yL鋪板計(jì)算噬菌體滴度。按上述方法繼續(xù)進(jìn)行3次篩選，并計(jì)算每輪篩選的產(chǎn)出率。1-4輪篩選包被的IVM-BSA依次為100，75，50，20ug/mL。如表1所示，顯示的是每輪富集后，特異性噬菌體在逐輪增加。為提高多樣性，在首輪篩選是采用高濃度的包被原包被免疫管；為提高特異性，每輪包被原的量逐漸減少并增加洗滌強(qiáng)度。經(jīng)過4輪篩選，產(chǎn)出/投入比趨于穩(wěn)定。表1是固相篩選法對噬菌體的富集<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>陽性克隆的單克隆ELISA將富集的重組噬菌體感染處于對數(shù)期的TGl，37t:靜置30min，37t:搖床培養(yǎng)lh后涂在含100g/mL氨芐青霉素和1%葡萄糖的TYE(TYE-AG)固體培養(yǎng)基上37。C培養(yǎng)過夜，隨機(jī)挑選96個(gè)單菌落，分別接種于200uL2XTY-AG培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)2h后，加入25uL2XYT-AG-M13K07(109pfu/mL)，37。C搖床250rpm培養(yǎng)lh，再1800g離心10min，倒掉上清，菌體沉淀用含100iig/mL氨芐青霉素和50iig/mL卡那霉素的2XTY(2XTY-AK)懸浮，3(TC培養(yǎng)過夜。次日，離心取上清單克隆ELISA鑒定每孔各取100uL加入到包被有IVM-BSA并已經(jīng)用PBSM封閉2h的96孔板中室溫反應(yīng)lh，以包被載體蛋白BSA的孔作為陰性對照。PBST洗滌6次，加入1:5000HRP-羊抗M13抗體，37t:孵育lh，同上洗滌后，加HRP底物顯色液顯色15min，以2MH2S04終止反應(yīng)，于波長450nm測定OD值。如圖1所示，顯示的是11個(gè)陽性克隆的單克隆ELISA值，將其中0D值最高的克隆展示的抗體命名為hsIVM8。hsIVM8的核酸序列測定將表達(dá)hsIVM8的單克隆菌液送上海英俊測序。序列顯示，hsIVM8的核酸含有完整的重輕鏈可變區(qū)，序列完整，具體見SeqNO.1。hsIVM8的氨基酸序列推導(dǎo)利用PrimerPremier5.0推導(dǎo)hsIVM8氨基酸序列，序列顯示，氨基酸序列含有特征性的(HiS)6標(biāo)簽及15個(gè)彈性短肽，具體見SeqNO.2。鎳親和柱純化hsIVM8的SDS-PAGE電泳圖挑過夜培養(yǎng)的表達(dá)hsIVM8的單克隆菌落于3mL2XTY-AG中，37"過夜培養(yǎng)。次日，取2mL到200mL含100ug/mL氨節(jié)青霉素和0.1%葡萄糖的2XTY中，37。C搖床培養(yǎng)3h，加25mL含100ug/mL氨芐青霉素和9mM異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，25。C培養(yǎng)18h。菌液于3，300g，4。C離心15min，棄上清，菌體沉淀加入10mL上樣緩沖液(20mMTris-Cl;500mMNaCl;10mM咪唑；pH7.4)重懸后置于冰上用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，條件設(shè)為400W，工作5s，間隔8s，50次循環(huán)。12，OOOg，4。C離心10min取上清，過0.22ym膜過濾。鎳親和柱依次用雙蒸水，上樣緩沖液沖洗至平衡，過濾溶液上樣，再分別用上樣和洗滌緩沖液(20mMTris-Cl;500mMNaCl;20-60mM咪唑；pH7.4)洗滌至平衡。最后用洗脫緩沖液(20mMTris-Cl;500mMNaCl;500mM咪唑；pH7.4)洗脫目的蛋白。流速均控制在lmL/min。洗脫液立即用PBS透析過夜，換液3-4次。用12%SDS-PAGE膠檢測其純度。如圖2所示，泳道1是蛋白Marker,2是純化前菌液上清，3是經(jīng)過鎳親和柱純化，500慮咪唑洗脫下來的目標(biāo)蛋白，純度較高達(dá)95%以上。說明重組單鏈抗體hsIVM8已成功純化。間接非競爭ELISA法測定抗體的工作濃度及效價(jià)(1)工作濃度的確定用方陣滴定法確定抗體及包被抗原的工作濃度。選擇OD值為1.0時(shí)的抗原抗體稀釋濃度作為包被抗原、抗體工作濃度，最終選擇的包被抗原稀釋倍數(shù)為1/1000(以蛋白計(jì)，包被抗原實(shí)際濃度為2iig/mL)，抗體的工作濃度為1/32。具體操作步驟如下①包被CBS包被緩沖液將包被原倍比稀釋100X5n(n=0.5，1，2，4)，分別加于96孔酶標(biāo)微孔板的AB、CD、EF、GH八行中，100iiL/孔，4。C過夜。②封閉每孔加3%BSA封閉液200iiL，37。C孵育lh。③加樣將倍比稀釋2n(n=8，16，32，64，128，256)的抗體分別加于酶標(biāo)板的12、34、56、78、910、1112十二列孔中，100yL/孔，以PBS溶液為空白，25。C孵育2.5h。④加酶標(biāo)二抗用含3%BSA的PBS溶液稀釋酶標(biāo)二抗到工作濃度，100yL/孔加入酶標(biāo)板，25t:孵育1.5h。(以上每一步結(jié)束都用PBST洗滌液洗3次)⑤顯色將底物溶液加到酶標(biāo)板上，100iiL/孔，25t:顯色15min。⑥終止反應(yīng)將2MH2S(V決速加到96孔中，50iiL/孔，450nm讀取光吸收值。用方陣滴定法確定的包被原工作濃度包被96孔酶標(biāo)微孔板，將單鏈抗體hsIVM8進(jìn)行倍比稀釋，以PBS溶液作為空白對照，用間接非競爭ELISA法測定抗體效價(jià)，具體步驟按照以下步驟進(jìn)行。以A^5。/A,5。〉2.l的最大稀釋倍數(shù)作為抗體的最終效價(jià)。計(jì)算獲得的抗體最終效價(jià)為1/256。具體操作步驟如下①包被將2iig/mL包被原加入96孔酶標(biāo)微孔板中，100iiL/孔孔，4。C過夜。②封閉每孔加3%BSA封閉液200iiL，37。C孵育lh。③加樣:將倍比稀釋2n(n=4，8，16，32，64，128)的抗體分別加于酶標(biāo)板的12、34、56、78、910、1112十二列孔中，100yL/孔，以PBS溶液為空白，25"C孵育2.5h。④加酶標(biāo)二抗用含3%BSA的PBS溶液稀釋酶標(biāo)二抗到工作濃度，100yL/孔加入酶標(biāo)板，25t:孵育1.5h。(以上每一步結(jié)束都用PBST洗滌液洗3次)⑤顯色將底物溶液加到酶標(biāo)板上，100iiL/孔，25t:顯色15min。⑥終止反應(yīng)將2MH2S(V決速加到96孔中，50iiL/孔，450nm讀取光吸收值。間接競爭ELISA法建立伊維菌素的單鏈抗體免疫檢測方法間接競爭ELISA(IC-ELISA)的建立，具體步驟如下(1)單鏈抗體hsIVM8與0.Ol，O.1，2，5，10iig/mL伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品預(yù)混用PBS將抗體稀釋16倍(兩倍工作濃度)，再與等體積的伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品室溫預(yù)混進(jìn)行前抑制，對照用PBS與抗體等體積預(yù)混，過夜。(2)包被將2ug/mL包被抗原加入酶標(biāo)板，100iiL/孔，4。C過夜。(3)封閉每孔加3%BSA封閉液200ii1，37。C溫浴lh。(4)加樣品將預(yù)混液加入酶標(biāo)板，100iiL/孔，以PBS為空白對照，25t:溫浴2.5h。(5)加酶標(biāo)二抗用含3%BSA的PBS將酶標(biāo)二抗稀釋到工作濃度加入酶標(biāo)板，100iiL/孑L25t:溫浴1.5h。(以上每一步結(jié)束都用洗滌液PBST洗3次)(6)顯色將底物溶液加到酶標(biāo)板上，100iiL/孔，25t:顯色15min。(7)終止反應(yīng)50iiL/孔2MH2S04快速加到96孔酶標(biāo)板中，于450nm讀取光吸收值。將0.01，0.1，2，5，10iig/mL伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的吸光值(OD)，按照公式抑制率(工)=100[(0D對照-0D標(biāo)樣)/0D對照]，計(jì)算抑制率(I)。以抑制率為縱坐標(biāo)，標(biāo)樣濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。建立伊維菌素的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，并對線性范圍進(jìn)行回歸9分析。最后計(jì)算得到，伊維菌素線性回歸方程為I=23.986LogC+35.267(R2=0.9294)，伊維菌素對抗體的抑制中濃度(IC5。)為4.11g/mL，伊維菌素最低檢測限IC1Q為0.088yg/mL，線性檢測范圍在O.1-5.0iig/mL，如圖3所示。序列表SEQUENCELISTING〈110〉江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院〈120〉伊維菌素的單鏈抗體hsIVM8及其制備方法、其在免疫學(xué)檢測的應(yīng)用〈130>[1]LYWen，XLYan，F(xiàn)HS皿，etal.Arandomized,double-blind,multicenterclinicaltrialontheefficacyofivermectinagainstintestinalnematodeinfectionsinChina[J].ActaTropica.2008,106:190-194.〈160>2〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>798〈212>DNA〈213>人工序列〈400〉1gaggtgcagctcctgtgcagccagggaagggcagactccgctgcaaatgacatacgtttgtcaggcggagtcctccctgtattagcagcttatccggcatacagatttcacaacagcggggcggccgcacgatctgaatg〈210>2〈211>266〈212>PRT〈213>人工序列〈400>2GluValGinLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly15101510tgttggagtctggggg郷cttggtecagcctggggggtccctgagactc60cctctggattcacctttegcagctetgccatgagctgggtccgccaggct120ggctggagtgggtctcatcgatttgtcatgagggteagccgacatettec180tg皿gggraggttcaccatccacgctgtet2403C3gCCtg3g3gCCg3gg3Cacggccgtetattectgtgc300actectggggccaggg皿ccctggtcaccgtctcgagcggtgg郷cggt360gtggragcggcggtggcgggtcgacggacatccagatgacccagtctcca420ctgcatctgtgtcaccatcacttgccgggc皿gtcagagc■gtetc3gcag皿3CC3ggg3aagccccteagctcctgatc540cccctttgca皿gtggggtcccatcaaggttggatctggg600ctctcaccatcagcagtctgc皿cctg皿gattttgcaacttectectgt660cgagggcgcctecgacgttcggc咖gggacc皿ggtgga720atcatcatcaccatcacggggccgcag皿cctcag^gag780gggccgca798SetLeuArgLeuSetCysAlaAlaSetGlyPhe／hrPheSetSet／yr202530AlaMetSet／rioValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGlu／rioVal]SetSetIleCysHiSGluGlyLysPro／hr／yr／yrAlaAspSetVal505560LysGlyArgPhe／hrIleSetArgAspAShSetLysASh／hrLeu／yr65707580LeuGlnMetAShSetLeuArgAlaGluAsp／hrAlaVal／yr／yrCys859095AlaLysSetAspHiS／hrPheAsp／yr／rioGlyGlnGly／hrLeuVal100105110／hrValSetSetGlyGlyGlyGlySetGlyGlyGlyGlySetGlyGly]GlyGlySet／hrAspIleGlnMet／hrGlnSetProSetSetLeuSet130135140AlaSetValGlyAspArgVal／hrIle／hrCysArgAlaSetGlnSet145150155160IleSetSet／yrLeuASh／rio／yrGlnGlnLysProGlyLysAlaPro165170175LysLeuLeuIle／yrProAlaSetProLeuGlnSetGlyValProSet180185190ArgPheSetGlySetGlySetGly／hrAspPhe／hrLeu／hrIleSet]SetLeuGlnProGluAspPheAla／hr／yr／yrCysGlnGlnArgAla2lo215220ArgAlaPro／hr／hrPheGlyGlnGly／hrLysValGluIleLysArg225230235240AlaAlaAlaHiSHiSHiSHiSHiSHiSGlyAlaAlaGluGlnLysLeu245250255IleSetGluGluAspLeuAShGlyAlaAla26026權(quán)利要求一種伊維菌素的單鏈抗體hsIVM8，其核酸序列為SeqNO.1。2.—種伊維菌素的單鏈抗體hsIVM8，其氨基酸序列為SeqNO.2。3.—種伊維菌素的單鏈抗體hsIVM8的制備，其特征在于以伊維菌素-牛血清白蛋白結(jié)合物為包被抗原包被免疫管，通過固相抗原篩選法從人源噬菌體抗體庫TomlinsonJ中篩選展示伊維菌素單鏈抗體的噬菌體，用單克隆ELISA法篩選陽性噬菌體，將陽性噬菌體感染大腸桿菌HB2151進(jìn)行可溶性抗體的表達(dá)，對單鏈抗體進(jìn)行純化，獲得伊維菌素的單鏈抗體hsIVM8。4.一種單鏈抗體hsIVM8在伊維菌素間接競爭ELISA檢測方法的應(yīng)用，其特征在于如下步驟A、間接非競爭ELISA法測定單鏈抗體hsIVM8的工作濃度及效價(jià)選擇0D值為1.0時(shí)的抗原抗體稀釋濃度作為包被抗原、抗體工作濃度，以Ara45。/APJ!45。>2.1的最大稀釋倍數(shù)作為抗體的最終效價(jià)；B、將伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品分別與兩倍工作濃度的單鏈抗體hsIVM8等體積混合過夜，所述的伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為0.01，0.l，2，5，10iig/mL;C、將工作濃度的伊維菌素包被抗原加入酶標(biāo)板，洗去未吸附抗原，再加入封閉液封閉酶標(biāo)板剩余的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，洗去多余的封閉物；將所述的伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品與單鏈抗體hsIVM8的混合液和所述的待測樣品與單鏈抗體hsIVM8的混合液分別加入酶標(biāo)板，使伊維菌素包被抗原與混合液中的標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品對單鏈抗體hsIVM8進(jìn)行競爭免疫結(jié)合反應(yīng)，在酶標(biāo)板的微孔底部形成伊維菌素包被抗原_抗體復(fù)合物，洗去游離的抗原和抗體；然后加入辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記的anti-His抗體，使在酶標(biāo)板上形成包被抗原_抗體_二抗-HRP復(fù)合物，洗去未結(jié)合的酶標(biāo)二抗；再加入酶的底物，在酶的催化作用下，底物發(fā)生降解反應(yīng)，產(chǎn)生有色產(chǎn)物；最后加入50iiL/孔的2MH2S04，終止反應(yīng)；D、用酶標(biāo)儀測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔及待測樣品孔的吸光值，計(jì)算抑制率，繪制伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品濃度對抑制率的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對線性范圍進(jìn)行回歸分析，建立伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線的回歸方程I=23.986LogC+35.267，R2=0.9294，伊維菌素對單鏈抗體hsIVM8的抑制中濃度IC5。為4.11iig/mL，伊維菌素最低檢測限IC1Q為0.088yg/mL，線性檢測范圍在0.1-5.0i!g/mL，根據(jù)待測樣品的吸光度計(jì)算待測樣品的濃度；所述的I為伊維菌素對單鏈抗體hsIVM8的抑制率，C為伊維菌素濃度。全文摘要本發(fā)明涉及抗體，具體涉及一種伊維菌素的單鏈抗體hsIVM8及其制備方法、在免疫學(xué)檢測的應(yīng)用；本發(fā)明為以伊維菌素-牛血清白蛋白結(jié)合物為包被抗原包被免疫管，通過固相抗原篩選法從人源噬菌體抗體庫TomlinsonJ中篩選展示伊維菌素單鏈抗體的噬菌體，用單克隆ELISA法篩選陽性噬菌體，將陽性噬菌體感染大腸桿菌HB2151進(jìn)行可溶性抗體的表達(dá)，對單鏈抗體hsIVM8進(jìn)行純化，獲得伊維菌素的單鏈抗體hsIVM8。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于國內(nèi)外首次報(bào)道了伊維菌素的單鏈抗體hsIVM8制備與免疫學(xué)檢測方法，與現(xiàn)有的獲得抗體的途徑相比，該制備方法具有簡單、快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號G01N33/53GK101717448SQ200910223819公開日2010年6月2日申請日期2009年11月23日優(yōu)先權(quán)日2009年11月23日發(fā)明者劉媛,劉賢進(jìn),張曉,溫爽申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院