專利名稱：一種魚類病毒的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及淋巴囊腫病病毒(Lymphocystic Disease Virus China，LCDV-cn)的一種核酸探針斑點(diǎn)雜交試劑盒及其檢測(cè)技術(shù)，具體說是一種魚類病毒的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
LCDV-cn病毒是一種可以感染多種魚類的DNA型病毒，我國山東、河北、廣東等省的養(yǎng)殖海水魚都遭受其害。據(jù)報(bào)道，該病最早在歐洲被發(fā)現(xiàn)，至今已有上百年的歷史。其感染癥狀是在魚的體表、口唇、鰓和鰭條等處，出現(xiàn)若干形似菜花的腫瘤，病魚外觀丑陋，死亡率上升，商業(yè)價(jià)值大大下降，造成的經(jīng)濟(jì)損失非常嚴(yán)重。而且該病毒具有隱性感染的特點(diǎn)，侵入魚體內(nèi)可潛伏兩個(gè)月以上，并不表現(xiàn)出肉眼可見的癥狀。而一旦出現(xiàn)癥狀，則病情加重，加之還沒有理想的藥物，所以造成的后果是嚴(yán)重的。因此，通過對(duì)親魚和魚苗的早期檢測(cè)，去除攜帶病毒的魚，就可以做到切斷傳染、減少流行，保障魚類的健康養(yǎng)殖。但是迄今為止，盡日本北海道大學(xué)吉水守教授建立了淋巴囊腫病毒的ELISA檢測(cè)方法，該方法可以定性、定量病毒，但作為早期、微量檢出，其靈敏度則遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足。核酸探針-斑點(diǎn)雜交技術(shù)是一種快捷的基因診斷技術(shù)。根據(jù)雜交膜上點(diǎn)狀斑點(diǎn)的有無和強(qiáng)弱，可以判斷樣品是否染毒、還可以半定量病原。國內(nèi)，點(diǎn)雜交技術(shù)在對(duì)蝦疾病診斷中的應(yīng)用較多。Lo等(1999)、史成銀等(1999)和徐洪濤等(2000)，利用此方法檢測(cè)對(duì)蝦白斑綜合癥(WSSV)。中國水產(chǎn)科學(xué)院黃海水產(chǎn)研究所病害室研制出了“對(duì)蝦爆發(fā)性流行病原核酸探針-點(diǎn)雜交診斷試劑盒”，但點(diǎn)雜交應(yīng)用于養(yǎng)殖魚類病毒病的檢測(cè)尚未有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種魚類病毒的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，以便早期和更方便地檢測(cè)出LCDV-cn感染的魚，尤其是對(duì)魚苗和親魚的早期檢測(cè)，以避免該病毒感染造成的損失。
本發(fā)明采用核酸探針-斑點(diǎn)雜交技術(shù)，它是在核酸水平上的一種檢測(cè)技術(shù)，具有準(zhǔn)確性好、靈敏度高的特點(diǎn)。其原理是利用LCDV-cn的DNA是一種雙鏈結(jié)構(gòu)核酸和熱變性及復(fù)性的特點(diǎn)(即在加熱的條件下，DNA可由雙鏈變成單鏈；而在適當(dāng)條件下，也可由單鏈變成雙鏈)，只要其堿基序列相同，變性后不同來源的兩條DNA單鏈都可以相互雜交。根據(jù)這一DNA雜交的原理，采用國家海洋局第一海洋研究研制的地高辛標(biāo)記特異性核酸探針液，進(jìn)行斑點(diǎn)雜交就可以檢測(cè)出LCDV-cn。
本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒為底面有延伸舌(部)的方形盒體，盒體內(nèi)上設(shè)有插入內(nèi)盛溶液的、多種瓶體的圓孔，并置放于外包裝盒中。瓶體內(nèi)的溶液包括洗液、緩沖液各3種；對(duì)照液、顯色液各2種以及封閉液、抗體液、探針液、研磨液各1種，并注入在內(nèi)盒體的14只容器(瓶)中。盒體底面延伸舌上可放置備用的附件，如雜交膜、雜交袋、薄壁管和研磨棒。
本發(fā)明的檢測(cè)方法是先取待測(cè)魚組織(為了盡量少傷害魚類，建議剪取0.05-0.1克鰭條)，在研磨液C中充分研磨；然后取其上清液，待變性后點(diǎn)樣于一張雜交膜上；該膜在交聯(lián)和預(yù)雜交后，與變性后的探針液K雜交；然后分別用洗液D、洗液B清洗，再與抗體液L進(jìn)行免疫反應(yīng)；再經(jīng)洗液A洗凈后，與顯色液NBT/BCIP進(jìn)行顯色反應(yīng)，最后檢查并記錄雜交膜上的顯色結(jié)果。點(diǎn)樣處出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)的相對(duì)應(yīng)的魚組織，視為被LCDV-CN病毒感染；否則，其對(duì)應(yīng)的魚組織未被LCDV-CN病毒感染。


圖1為本發(fā)明的總體結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為本發(fā)明的盒體俯視圖。
其中1、盒體；2、瓶；3、雜交袋；4、雜交膜；5、研磨棒；6、離心(薄壁)管；7、圓孔。
具體實(shí)施例方式如圖1、圖2所示，本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒為底面有延伸舌(部)的方形盒體(1)，盒體(1)上面布設(shè)著內(nèi)盛溶液的多種瓶體(2)的圓孔。盒體(1)底面延伸舌上可置放備用的附件，如雜交膜(4)、雜交袋(3)、薄壁管(6)和研磨棒(5)。其瓶體內(nèi)的溶液包括洗液，緩沖液各3種，對(duì)照液、顯色液各2種以及封閉液、抗體液、探針液、研磨液各1種，并置放在內(nèi)盒體的相應(yīng)14只容器(瓶)中。本發(fā)明的盒體內(nèi)裝有以下物品A瓶(洗液A，25ml)；B瓶(洗液B，20ml)；C瓶(樣品研磨液C，5ml)；D瓶(洗液D，5ml)；E瓶(緩沖液E，5ml)；F瓶(緩沖液F，5ml)；G瓶(緩沖液G，3ml)；H瓶(封閉液H，1ml)；I瓶(陽性對(duì)照液I，10ul)；J瓶(陰性對(duì)照液J，10ul)；K瓶(探針液K，10ul)；L瓶(抗體液L，10ul)；M瓶(顯色液M，3ul)；N瓶(顯色液N，4ul)。另外還有北京鼎國生物有限公司等生物公司制的多個(gè)附件，包括多張雜交膜，多個(gè)雜交袋和多根研磨棒，以及若干支0.5ml薄壁管。
按盒內(nèi)字母順序標(biāo)識(shí)的溶液及成份如下表

具體操作步驟如下
1、處理樣品用消毒刀片(手術(shù)刀片，刮胡刀片等均可)切取待測(cè)魚組織50-100mg，放入備用的薄壁管中，加入100-200ul樣品研磨液C，用研磨棒將其研碎，靜置約2分鐘，使沉淀下沉；2、取上述研磨液中的上清液各10微升注入薄壁管中，再加入陽性對(duì)照液I和陰性對(duì)照液J，在100℃沸水中水浴5-10分鐘，迅速置于冰水浴中充分冷卻，使魚組織內(nèi)的病毒釋放出來，并利用熱變性再驟冷的方式，使病毒的DNA結(jié)構(gòu)由雙鏈變?yōu)閱捂湥?、點(diǎn)樣取1ul(2、的)上清液，點(diǎn)樣於雜交膜上的小格中，自然晾干(注意點(diǎn)樣量不要過大，以防相鄰的樣品間相互滲透)；4、交聯(lián)將點(diǎn)樣后的雜交膜夾在兩層濾紙之間，在120℃烘箱中烘烤半小時(shí)，將變性后的單鏈DNA固定到雜交膜上；5、預(yù)雜交再將雜交膜置于預(yù)雜交袋中，加入1-2ml緩沖液G，用封口機(jī)封口，62-70℃水浴中孵育半小時(shí)；6、探針液變性將探針液K(連同容器一起)，100℃沸水浴5分鐘，迅速置于冰水浴中使其充分冷卻，以將探針液變性，使探針液中的DNA結(jié)構(gòu)由雙鏈變?yōu)閱捂湥?、雜交剪開第5步的預(yù)雜交袋，加入第6步處理后的溶液K，水浴中雜交6-16小時(shí)以保證上述讓單鏈探針與固定在雜交膜上的單鏈樣品進(jìn)行雜交；8、洗膜將雜交膜取出、放入新的雜交袋中，用2ml洗液D清洗一次以上洗；將雜交膜再取出、放入新的雜交袋中，在62-70℃條件下，用10ml洗液B，再清洗一次以上，以將膜上未雜交的探針液洗掉；9、免疫反應(yīng)將上述雜交膜取出放入一新的雜交袋中，加入2ml緩沖液E，加入200ul封閉液H，放置三十分鐘；剪開上述雜交袋一角，加入1/50體積的抗體液L，密封，放置30分鐘使抗體液與探針液里的地高辛發(fā)生免疫反應(yīng)；10、洗膜將雜交膜取出、放入一新的雜交袋中，用10ml洗液A洗1次以上；再用2ml緩沖液F浸洗1-2分鐘，以將未結(jié)合的抗體洗掉；11、顯色將雜交膜取出、放入一個(gè)新的雜交袋中。加入1ml緩沖液F，再加入3ul顯色液M和4ul顯色液N，於暗室中放置2-12小時(shí)(中間不要攪動(dòng))。顯色的時(shí)間，以雜交膜上未點(diǎn)樣的空白處不出現(xiàn)變色為準(zhǔn)，空白處一旦出現(xiàn)變色、應(yīng)采取下一步以立即中止反應(yīng)；12、中止反應(yīng)用大量水沖洗上述雜交膜5-15分鐘，中止顯色反應(yīng)；13、記錄結(jié)果如果待測(cè)樣品中有LCDV-cn病毒，則雜交膜上的點(diǎn)樣處會(huì)出現(xiàn)或深或淺的藍(lán)色斑點(diǎn)，陽性對(duì)照液I點(diǎn)樣處，應(yīng)出現(xiàn)藍(lán)色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照液J點(diǎn)樣處，不會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)。在所測(cè)樣品中，沒有顯色的樣品為正常魚，而出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)的樣品是已被LCDV-cn感染的魚，其藍(lán)色越深、說明感染的程度越大。若要保存雜交膜，則可將膜夾在濾紙中令其干燥后再保存。
權(quán)利要求
1.一種魚類病毒的檢測(cè)方法，其特征是先取待測(cè)魚組織，在研磨液C中充分研磨；然后取其上清液，待變性后點(diǎn)樣于一張雜交膜上；該膜在交聯(lián)和預(yù)雜交后，與變性后的探針液K進(jìn)行雜交反應(yīng)；然后分別用洗液D，洗液B清洗，再與抗體液L進(jìn)行免疫反應(yīng)；再經(jīng)洗液A清洗后，與顯色液NBT/BCIP進(jìn)行顯色反應(yīng)，最后檢查并記錄雜交膜上的顯色結(jié)果。點(diǎn)樣處出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)的相應(yīng)魚組織，則已被LCDV-CN病毒感染，否則，其對(duì)應(yīng)的魚組織未被LCDV-CN病毒感染。
2.一種魚類病毒的具體操作步驟是(1)處理樣品用消毒刀片切取待測(cè)魚組織50-100mg，放入備用的薄壁管中，加入100-200ul樣品研磨液C，用研磨棒將其研碎，靜置約2分鐘，使沉淀沉下；(2)取上述研磨液中的上清液各10微升注入薄壁管中，再加入陽性對(duì)照液I和陰性對(duì)照液J，在100℃沸水浴5-10分鐘，迅速置于冰水浴中充分冷卻；(3)點(diǎn)樣取1ul上清液，點(diǎn)樣于雜交膜上的小格中，自然晾干；(4)交聯(lián)將點(diǎn)樣后的雜交膜夾在兩層濾紙之間，在120℃烘箱中烘烤半小時(shí)；(5)預(yù)雜交再將雜交膜置于預(yù)雜交袋中，加入1-2ml緩沖液G，用封口機(jī)封口，62-70℃水浴中孵育半小時(shí)；(6)探針液變性將探針液K(連同容器一起)，100℃沸水浴5分鐘，迅速置于冰水浴中使其充分冷卻；(7)雜交剪開第5步的預(yù)雜交袋，加入第6步處理后的溶液K，水浴中雜交6-16小時(shí)；(8)洗膜將雜交膜取出、放入新的雜交袋中，用2ml洗液D清洗一次以上洗；將雜交膜再取出、放入新的雜交袋中，在62-70℃條件下，用10ml洗液B，再清洗一次以上，以將膜上未雜交的探針液洗掉；(9)免疫反應(yīng)將上述雜交膜取出放入一新的雜交袋中，加入2ml緩沖液E，加入200ul封閉液H，放置三十分鐘。剪開上述雜交袋一角，加入1/50體積的抗體液L，密封、放置30分鐘；(10)洗膜將雜交膜取出、放入一新的雜交袋中，用10ml洗液A洗一次以上；再用2ml緩沖液F浸洗1-2分鐘；(11)顯色將雜交膜取出、放入一個(gè)新的雜交袋中，加入1ml緩沖液F，再加入3ul顯色液M和4ul顯色液N，於暗室中放置2-12小時(shí)；(12)中止反應(yīng)用大量水沖洗上述雜交膜5-15分鐘，中止顯色反應(yīng)并記錄結(jié)果。
3.一種魚類病毒的檢測(cè)試劑盒，其特征是檢測(cè)試劑盒為底面有延伸舌的方形盒體(1)，盒體(1)上面有布設(shè)內(nèi)盛溶液的多種瓶(2)體的圓孔，盒體(1)底面延伸舌上可置放備用的附件，如雜交膜(4)、雜交袋(3)、薄壁管(6)和研磨棒(5)，其瓶體內(nèi)的溶液包括洗液，緩沖液各3種，對(duì)照液、顯色液各2種以及封閉液、抗體液、探針液、研磨液各一種，并置放在內(nèi)盒體(1)的相應(yīng)的14只瓶(2)中。
4.如權(quán)利要求3所述的一種魚類病毒的檢測(cè)試劑盒，其特征是上述探針液含地高辛標(biāo)記的LCDV-cn特異性核酸探針。
全文摘要
一種魚類病毒的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，盒體上面有布設(shè)內(nèi)盛溶液的、多種瓶體的圓孔，盒體底面延伸舌上可置放備用的附件，如雜交膜、袋等，14只瓶?jī)?nèi)有洗液，緩沖液各3種，對(duì)照液、顯色液各2種以及封閉液、抗體液、探針液、研磨液各一種。方法是先取待測(cè)魚組織，在研磨液C中充分研磨；然后取其上清液，待變性后點(diǎn)樣于一張雜交膜上；該膜在交聯(lián)和預(yù)雜交后，與變性后的探針液K進(jìn)行雜交反應(yīng)；然后分別用洗液D和B清洗，再與抗體液L進(jìn)行免疫反應(yīng)；再經(jīng)洗液A洗后，與顯色液NBT/BCIP進(jìn)行顯色反應(yīng)，最后檢查并記錄雜交膜上的顯色結(jié)果。點(diǎn)樣處出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)的相對(duì)應(yīng)的魚組織，則已被病毒感染。可早期方便地檢測(cè)出病毒感染的精、卵、親魚、魚苗及成魚，以免造成重大損失。
文檔編號(hào)G01N1/28GK1556410SQ20031011469
公開日2004年12月22日 申請(qǐng)日期2003年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月31日
發(fā)明者孫修勤, 李繼業(yè), 張進(jìn)興, 洪旭光, 吳謖琦, 曲凌云 申請(qǐng)人:國家海洋局第一海洋研究所