專利名稱：抗淋巴囊腫病毒27.8kDa受體蛋白的單克隆抗體及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種單克隆抗體及其制備方法，具體涉及一種抗淋巴囊腫病毒 (lymphocystis disease virus，LCDV)27. 8kDa受體蛋白的單克隆抗體及其制備方法，屬于分子免疫學和病毒學交叉技術領域。
背景技術：
LCDV是一種具有囊膜的雙鏈DNA病毒，屬于虹彩病毒科(Iridoviridae)。該病毒在世界范圍內(nèi)可感染至少42科140種以上的海水、咸水和半咸水魚類，造成野生、養(yǎng)殖及觀賞魚類的淋巴囊腫病。國內(nèi)外已有的研究涉及LCDV的流行病學、病理學、分子生物學等方面，探明LCDV感染的分子機理、尋找預防和控制LCDV感染的有效方法和措施是目前研究的熱點。病毒囊膜蛋白與宿主特異性細胞受體相結合，繼而侵入并感染細胞是病毒感染宿主的主要途徑，因此，研究IXDV宿主細胞上的病毒特異性受體蛋白，對研究IXDV感染的機理和尋找阻斷IXDV感染的途徑具有重要意義。我們之前的研究表明牙鲆鰓細胞(flounder gill,FG)表面分子量為27. SkDa蛋白是IXDV的受體蛋白之一，但該受體蛋白在IXDV感染中的作用與功能以及能否利用受體單抗阻斷LCDV入侵尚未見報道。因此，制備LCDV受體蛋白的單克隆抗體，可以為弄清LCDV與宿主細胞相互作用關系及其感染機理提供重要工具， 為尋找阻斷LCDV感染的途徑提供技術手段，對養(yǎng)殖魚類淋巴囊腫病毒病的防治具有重要的理論與實踐意義，也為制備LCDV亞單位疫苗及基因工程疫苗提供理論依據(jù)和技術基礎。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種由雜交瘤細胞分泌的抗IXDV 27. SkDa受體蛋白的單克隆抗體；本發(fā)明的另一個目的是提供一種抗LCDV 27. SkDa受體蛋白單克隆抗體的制
備方法。本發(fā)明的目的是由以下技術方案實現(xiàn)的一種抗IXDV 27. SkDa受體蛋白的單克隆抗體，所述的單克隆抗體是由名稱為雜交瘤細胞ALR，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC C201128，保藏日期為2011年4月25日的雜交瘤細胞分泌的。與所述的單克隆抗體發(fā)生特異性結合的抗原決定簇位于TO細胞表面的LCDV 27. SkDa受體蛋白上。在倒置顯微鏡下觀察，生長狀態(tài)良好的該雜交瘤細胞ALR，其外觀飽滿、渾圓、折光性強、細胞大小均一、貼壁良好；該雜交瘤細胞有無限分裂增殖能力；長勢良好的該雜交瘤細胞常規(guī)培養(yǎng)2-3天，其培養(yǎng)基由桃紅色轉變?yōu)辄S色，其中含有該雜交瘤細胞分泌的抗 IXDV 27. 8kDa受體蛋白的單克隆抗體。一種所述抗IXDV 27. SkDa受體蛋白的單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟培養(yǎng)并收集re細胞，經(jīng)細胞裂解及差速離心得到re細胞膜蛋白，利用電泳切膠回收提純LCDV 27. SkDa受體蛋白，以其為抗原免疫Balb/c小白鼠，采用細胞融合制備雜交瘤細胞，經(jīng)過免疫學檢測篩選方法，篩選出分泌抗LCDV 27. SkDa受體蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞ALR， 收集雜交瘤細胞株ALR培養(yǎng)上清液，經(jīng)純化后即得到抗LCDV 27. SkDa受體蛋白單克隆抗體 (單抗G)，并采用該受體蛋白單克隆抗體的免疫學鑒定方法鑒定27. SkDa受體蛋白。所述的免疫學檢測篩選方法是間接酶聯(lián)免疫法和轉印免疫印跡法。利用間接酶聯(lián)免疫吸附法與轉印免疫印跡法確定該單抗G能與TO細胞上的LCDV 27. SkDa受體蛋白結
口 O所述的免疫學鑒定方法是間接免疫熒光法、膠體金標記免疫電鏡法、阻斷酶聯(lián)免疫吸附法和活細胞感染阻斷實驗。間接免疫熒光法、膠體金標記免疫電鏡法證實27. SkDa 受體蛋白位于re細胞膜上；阻斷酶聯(lián)免疫吸附法與活細胞感染阻斷實驗證明該單抗G可封閉re細胞上IXDV的27. 8kDa受體，阻斷IXDV的入侵。本發(fā)明研制的抗LCDV 27. SkDa受體蛋白的單克隆抗體在活細胞感染阻斷實驗中能與re細胞膜上的IXDV 27. 8kDa受體蛋白特異性結合，阻止IXDV吸附于27. 8kDa受體蛋白并與其結合進而感染TO細胞，因此本發(fā)明的單抗G具有阻斷LCDV侵染re細胞的功能。 通過轉印免疫印跡檢測LCDV在re細胞上的27. SkDa受體蛋白結合有該單抗G ；經(jīng)間接免疫熒光方法檢測，該單抗G與TO細胞膜上的LCDV 27. SkDa受體蛋白特異性結合，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，re細胞膜呈現(xiàn)明亮的點狀綠色熒光，而細胞核區(qū)域沒有熒光；膠體金標記免疫電鏡同樣證實IXDV 27. SkDa受體蛋白位于TO細胞膜上。本發(fā)明的單抗G可以為弄清LCDV與宿主細胞相互作用關系及其感染機理提供重要工具，為尋找阻斷LCDV感染的途徑提供技術手段。單抗G或經(jīng)過改造的基因工程抗體很可能成為魚類LCDV的治療藥物或疫苗，通過口服或注射等方式進入魚體內(nèi)，為預防或治療魚類淋巴囊腫病毒病起積極作用。


圖1為抗原IXDV 27. 8kDa受體蛋白純化結果圖。圖2為單抗G的轉印免疫印跡檢測結果圖。圖3為單抗G的間接免疫熒光檢測結果圖。圖4為單抗G膠體金標記免疫電鏡結果圖。圖5為單抗G的活細胞阻斷實驗結果圖。圖6為單抗G的阻斷酶聯(lián)免疫吸附結果圖。參見圖1-圖6。圖1中M是標準分子量蛋白的考馬斯亮藍染色結果；1表示提取的re細胞膜蛋白的考馬斯亮藍染色結果；2表示提純的27. SkDa受體蛋白考馬斯亮藍染色結果。圖2中M是標準分子量蛋白的考馬斯亮藍染色結果；1表示提取的re細胞膜蛋白的考馬斯亮藍染色結果；2表示本發(fā)明的單抗僅與LCDV 27. SkDa受體蛋白發(fā)生反應；3表示陰性對照無反應。圖3中A顯示單抗G與TO細胞膜上的IXDV 27. 8kDa受體蛋白反應呈綠色熒光； B表示陰性對照無熒光。圖4中A顯示完整的re細胞；B，C是A的局部放大，可見膠體金粒子主要存在細胞膜上。圖5表示re細胞感染IXDV 5天后，單抗G阻斷IXDV的效果。A是TO細胞與單抗G預孵育后，re細胞感染LCDV的結果；Β是re細胞與骨髓瘤上清預孵育后，re細胞感染 IXDV的結果；C是正常細胞；*為細胞病變(CPE)。圖6表示利用阻斷酶聯(lián)免疫法檢測單抗G對LCDV的阻斷效果。陽性對照表示TO 細胞膜蛋白和骨髓瘤上清反應，再與LCDV反應，由酶聯(lián)免疫吸附檢測得到的OD值結果；G 表示TO細胞膜蛋白和單抗G反應后再與LCDV反應，由酶聯(lián)免疫吸附檢測得到的OD值結果； 陰性對照表示re細胞膜蛋白和單抗G反應再與失活的LCDV反應，由酶聯(lián)免疫吸附檢測得到的OD值結果。
具體實施例方式下面結合附圖并通過具體實施例來進一步說明本發(fā)明。本發(fā)明的抗IXDV 27. SkDa受體蛋白的單克隆抗體是由名稱為雜交瘤細胞ALR， 保藏號為=CCTCC C201128的雜交瘤細胞分泌的。實施例1
所述的分泌抗IXDV 27. SkDa受體蛋白的一株雜交瘤細胞ALR，其制備方法如下
一、抗原的制備
(ι) re細胞膜蛋白的抽提
利用75cm2培養(yǎng)瓶大量培養(yǎng)TO細胞，將TO細胞用PBS清洗兩遍，用預冷的細胞刮將貼壁生長的細胞從底面刮離，PBS重懸，500g 4°C離心IOmin ；取TO細胞沉淀用預冷的NP-40 細胞裂解液(250 mM 蔗糖，20 mM Tris-HCl ρΗ8· 0，137 mM NaCl, 10% 甘油，1% NP-40，及各種蛋白酶抑制劑lmM PMSF, 2 mM EDTA, 10 mM NaF, 2 μ g / mL Aprotinin 禾口 5 μ g / mL Leupetin)重懸，超聲波冰浴破碎，設定時間為3 min，其中k開，6s關，39%的振幅；破碎后的細胞懸液經(jīng)1，000 4°C離心10 min，去除細胞碎片和細胞核；將上清稀釋4倍，10，OOOg 4°C離心10 min去除溶酶體和線粒體；取上清于100，OOOg 4°C離心20 min，沉淀用PBS重懸，為提取的re細胞膜蛋白。(2)27. 8kDa受體蛋白的提純
將步驟α)提純的re細胞膜蛋白加入等體積含十二烷基磺酸鈉的樣品緩沖液，在沸水中煮3-5min后，加入電泳儀(Mini-PROTEAN II，Bio-Rad)上樣孔中，電泳。取出電泳后的凝膠放在CuCl2可逆染色液(CuCl2 2H20 5. 11克溶于IOOml雙蒸水中)中染色，切下 27. SkDa蛋白條帶，脫色、洗脫、透析、冷凍干燥后，以PBS溶解并調(diào)整蛋白濃度至lmg/ml，分裝50μ 1/管，凍存于-80°C (圖1)。二、免疫小鼠
以步驟一提純的27. SkDa受體蛋白為抗原，免疫Balb/c小鼠，免疫共分4次，前2次免疫間隔為2周，腹腔注射；后2次免疫間隔為1周，為尾靜脈注射
第1次，基礎免疫，提純的27. SkDa受體蛋白與福氏完全佐劑等體積混勻，每只注射 100μ 1 ；
第2次，加強免疫，提純的27. SkDa受體蛋白與福氏不完全佐劑等體積混勻，每只注射 100μ 1 ；
第3-4次，加強免疫，每只注射提純的27. SkDa受體蛋白注射50 μ 1。三、細胞融合(1)脫頸椎處死免疫小鼠，無菌取出脾臟和胸腺后，分別過100目網(wǎng)篩，用RPMI-1640溶液吹打形成單細胞懸液；
(2)分別將脾細胞懸液和胸腺細胞懸液IOOOrpm離心3min，棄去上清液，脾細胞沉淀用 RPMI-1640溶液重懸，胸腺細胞沉淀用含有1%HAT的RPMI-1640 (含10%胎牛血清)選擇性
細胞培養(yǎng)液重懸。(3)取3 X IO7個處于對數(shù)生長期的P3-X63-Ag8Ul骨髓瘤細胞，IOOOrpm離心3min， 去上清液后，用RPMI-1640溶液重懸；
(4)將脾細胞懸液與瘤細胞懸液混合均勻后，IOOOrpm離心3min，完全吸去上清液，輕彈離心管底，使兩種細胞沉淀充分混勻成糊狀；用吸管吸取預溫到37°C的PEG溶液1ml，緩緩滴加到離心管內(nèi)；然后在37°C水浴靜置5min ；
(5)繼續(xù)滴加已經(jīng)預溫到37°C的RPMI-1640溶液15ml，使PEG稀釋而失去作用；
(6)補加RPMI-1640溶液至40ml，經(jīng)IOOOrpm離心3min，棄去上清液；
(7)將沉淀的細胞用3ml37°C的RPMI-1640(含10%胎牛血清)細胞培養(yǎng)液重懸，凍存
2ml ；
(8)將剩下的Iml細胞懸液加入(2)制成的胸腺細胞懸液，混合均勻后滴加到96孔培養(yǎng)板中；
(9)將培養(yǎng)板放入37°C，0)2濃度為4.5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，大約兩周后，取雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液檢測。四、篩選和克隆
(1)初步篩選融合后，待雜交瘤細胞群長到96孔培養(yǎng)板的孔底面積1/3時開始檢測， 采用間接酶聯(lián)免疫技術篩選陽性雜交瘤細胞。①包被抗原將提純的27. 8kDa受體蛋白用碳酸鹽包被液(pH 9. 6)1:10稀釋，加入96孔酶標板中(50μ1/孔)，4°C包被過夜；
②吸出包被液，用含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，每次5min，洗3次；
③每孔加入200μ13%的牛血清白蛋白(PBS配)，37°C封閉Ih ；
④同②法洗滌3次；
⑤將雜交瘤細胞培養(yǎng)上清作為第一抗體按每孔50μ1加入酶標板，37°C溫箱孵育Ih；
⑥同②法洗滌3次；
⑦堿性磷酸酶標記的羊抗小鼠Ig(1:4000稀釋)作為第二抗體按每孔50μ1加入酶標板，37°C溫箱孵育Ih;
⑧同②法洗滌3次；然后每孔加入ΙΟΟμΙ4-硝基酚磷酸鹽(ρΝΡΡ)應用液，暗處反應 5 - 20min,每孔加入50μ1 2Μ的NaOH，穩(wěn)定3_5min即可用405nm工作波長測定OD值。測波長為405nm時各孔光吸收值，計算各實驗孔與陰性對照光吸收值之比(P/N)， 當P/N彡2. 1時該孔為陽性。(2)克隆采用有限稀釋法對檢測為陽性孔的雜交瘤細胞進行克隆，步驟如下
①脫頸椎處死小鼠，取胸腺，制成單細胞懸液；
②胸腺細胞懸液IOOOrpm離心;3min，棄去上清，沉淀用IOmlRPMI-1640 (含10%胎牛血清)細胞培養(yǎng)液重懸；
③取陽性孔的雜交瘤細胞約100個，加入IOml胸腺細胞懸液中；④細胞懸液用滴管吹打均勻，滴加到96孔培養(yǎng)板中，每孔ΙΟΟμΙ，平均每個孔約含有一個雜交瘤細胞；
⑤培養(yǎng)板放入37°CCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
⑥兩周后按照本實施例步驟四(1)所述方法檢測單個克隆孔的雜交瘤細胞培養(yǎng)液；
⑦把所得陽性單個克隆孔的雜交瘤細胞按上述方法再克隆一次，以保證為抗體陽性
單克隆。五、凍存
取生長旺盛，形態(tài)良好的雜交瘤細胞，制成細胞懸液，200g離心5min，去上清，加凍存液(9份RPMI-1640培養(yǎng)基+ 1份二甲亞砜)，使最終細胞密度約為5X IO6個/ml，將Iml細胞懸液裝于2ml凍存管中，擰緊螺蓋，然后將凍存管裝入盛有棉花的小盒內(nèi)，放于-80°C超低溫冰箱內(nèi)過夜(8-12小時)后，再浸入液氮內(nèi)長期保存。本發(fā)明獲得的生長旺盛，形態(tài)良好的雜交瘤細胞，其名稱為雜交瘤細胞ALR，保藏號為CCTCC C201128，保藏日期為2011 年4月25日。實施例2
本發(fā)明單抗的間接酶聯(lián)免疫法鑒定
(1)包被抗原將IXDV27.8kDa受體蛋白用碳酸鹽包被液(pH 9. 6)1 10稀釋，加入96 孔酶標板中(50μ1/孔)，4°C包被過夜；
(2)吸出包被液，用PBST洗滌，每次5min，洗3次；
(3)每孔加入200μ13%的牛血清白蛋白(PBS配)37°C封閉Ih ；
(4)同②法洗滌3次；
(5)將上述篩選和克隆出的雜交瘤細胞培養(yǎng)上清作為第一抗體按每孔50μ1加入酶標板，37°C溫箱孵育Ih;
(6)同②法洗滌3次；
(7)堿性磷酸酶標記的羊抗小鼠Ig(1:4000稀釋)作為第二抗體按每孔50μ1加入酶標板，37°C溫箱孵育Ih ；
(8)同②法洗滌3次；然后每孔加入ΙΟΟμΙρΝΡΡ應用液，暗處反應5-20min，每孔加入 50μ1 2Μ的NaOH，穩(wěn)定3_5min即可用405nm工作波長測定OD值。用包被PBS作為陰性對照，測波長為405nm時各孔光吸收值，計算陽性血清與PBS 光吸收值之比(P/N)，當P/N彡2. 1時為陽性。結果陽性0. 4311 ；陰性對照0. 0967。此結果證實本發(fā)明單抗能與27. SkDa受體蛋白發(fā)生特異性結合反應。實施例3:
本發(fā)明單抗的轉印免疫印跡法鑒定
(1)十二烷基磺酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳
①將TO細胞膜蛋白加入等比例含十二烷基磺酸鈉的樣品緩沖液，在沸水中煮3-5min；
②將①處理過的樣品加入上樣孔中，每孔內(nèi)加樣品10μ1，在恒流條件下，起始時用低電流(30-40mA)，待樣品在濃縮膠部分濃縮成一條線后，加大電流(50-70mA)，電泳至溴酚藍指示劑達到底部邊緣時即可停止電泳，取出凝膠；
③剪取一塊與電泳凝膠相同大小的硝酸纖維素膜(孔徑0.22Mm)以電轉移緩沖液(電轉移緩沖液25mM Tris-Base, 192mM甘氨酸，20%甲醇，pH 8. 3)潤濕，放在電泳后的凝膠上。在硝酸纖維素膜上剪掉一個角，以標志樣品順序的起始端。用潤濕的濾紙支持，將第二塊潤濕的濾紙貼在凝膠片的另一面；按上述放置順序，使膠塊與硝酸纖維素膜及濾紙形成一套夾心的〃三明治〃；
④將“凝膠三明治“置入盛有電轉移緩沖液的電泳槽內(nèi)，將硝酸纖維素膜面向陽極；電泳恒流200mA，通電釙；
⑤轉移完畢，取出硝酸纖維素膜。(2)免疫印跡
①將硝酸纖維素膜用PBS洗lOmin，然后置3%的牛血清白蛋白溶液(PBS配)中封閉lh， 37 °C ；
②用PBST洗3次，每次5min；
③將硝酸纖維素膜置于雜交瘤細胞培養(yǎng)上清中，37°C緩慢搖動Ih ；以骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清孵育硝酸纖維素膜作為陰性對照；
④同②法洗滌3次；
⑤將硝酸纖維素膜加入堿性磷酸酶標記的羊抗小鼠Ig抗體(1:4000稀釋)中，37°C緩慢搖動Ih ；
⑥同②法洗滌3次；
⑦把硝酸纖維素膜放入堿性磷酸酶發(fā)色液(NBT-BCIP發(fā)色液)中發(fā)色，直到顏色清晰為
止；
⑧用去離子水洗滌，以終止反應。將硝酸纖維素膜夾在濾紙間，干燥。置暗處保存。結果本發(fā)明單抗與re細胞膜蛋白上分子量為27. SkDa的蛋白發(fā)生特異性反應， 而陰性對照無條帶顯示(圖2)。實施例4:
本發(fā)明單抗的間接免疫熒光檢測
(ι)取正常培養(yǎng)re細胞，胰蛋白酶消化后制成密度為 ο6的單細胞懸液，滴一滴于干凈的載玻片上，室溫靜置Ih后，丙酮固定，-20°C保存?zhèn)溆茫?br> (2)吸取雜交瘤細胞培養(yǎng)液，滴加在切片上，37°C濕盒中孵育45min；
(3)用PBST洗滌3次，每次5min；
(4)將異硫氰酸熒光素標記的羊抗小鼠IgG抗體液滴加在切片上，37°C濕盒中避光孵育 45min ；
(5)取出載玻片，同步驟③洗滌；封片，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。結果本發(fā)明單抗G與TO細胞膜上的27. SkDa受體蛋白特異性結合，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，F(xiàn)G細胞膜呈現(xiàn)明亮的點狀綠色熒光，F(xiàn)G細胞內(nèi)的細胞核區(qū)域沒有陽性熒光(圖3)。實施例5
本發(fā)明單抗G的膠體金免疫電鏡檢測 (1)電鏡超薄切片的制備
①取正常培養(yǎng)TO細胞，胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，3000rpm離心5min，棄上清；
②沉淀用含1戊二醛的PBS溶液4°C固定池；③用1%鋨酸固定30min;
④乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，干燥，制備超薄切片。(2)免疫電鏡
①超薄切片后，鎳網(wǎng)撈片；
②1% 處理30min，以暴露抗原，雙蒸水清洗；
③3%牛血清白蛋白(溶解于PBS)于37°C封閉45min；
④PBST浸洗3次，每次5min；
⑤加入雜交瘤細胞培養(yǎng)液，37°C孵育45min；
⑥同④法洗滌3次；
⑦加入15-nm的膠體金標記羊抗小鼠IgG,1 :100稀釋，37 °C孵育45 min ；
⑧同④法洗滌3次；
⑨雙蒸水浸洗3次，晾干，然后21的磷鎢酸負染色1min。⑩吸去殘留染液，電鏡觀察，拍照。結果膠體金粒子結合于re細胞膜上，說明本發(fā)明單抗G可與re細胞膜上的 27. SkDa受體蛋白結合(圖4)。實施例6
本發(fā)明制備的抗LCDV 27. SkDa受體蛋白的單抗，利用活細胞感染阻斷法阻斷LCDV對 re細胞感染的應用。(1)將re接種到96孔板中，每孔10(^L，22°C，2% CO2培養(yǎng)，待細胞長成單層，用無菌PBS清洗1-2遍；
(2)將雜交瘤細胞培養(yǎng)液過濾后接種至單層細胞上，每孔4(^L，22°C孵育4h(骨髓瘤細胞培養(yǎng)液為陽性對照)；
(3)吸出抗體，無菌PBS清洗3遍，每孔加入40μ 2_2病毒，22°C吸附Ih ；
(4)加入IOOPL含m血清的細胞維持液，220C，2%CO2培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞病變(CPE)，并進行拍照。結果在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察5d，與骨髓瘤細胞培養(yǎng)液孵育后再加入IXDV感染的re細胞，在感染后2d出現(xiàn)明顯細胞病變；與雜交瘤細胞培養(yǎng)液孵育后再感染LCDV的re 細胞，在感染后5d才出現(xiàn)少量的細胞病變；通過本發(fā)明單抗G阻斷后，細胞出現(xiàn)病變的時間較晚，且病變程度明顯降低，從而說明本發(fā)明單抗G可以有效阻斷LCDV對re細胞的感染 (圖 5)。實施例7
本發(fā)明制備的抗LCDV 27. SkDa受體蛋白的單抗，利用阻斷酶聯(lián)免疫吸附法體外阻斷 LCDV與re細胞膜蛋白的結合的應用。(1)同實施例ι中一(1)，制備re細胞膜蛋白；
(2)包被抗原將re細胞膜蛋白用碳酸鹽包被液(pH9.6) 1:10稀釋，加入96孔酶標板中(50μ1/孔)，4°C包被過夜；
(3)吸出包被液，用PBST洗滌，每次5min，洗3次；
(4)每孔加入200μ13%的牛血清白蛋白(PBS配)37°C封閉Ih ；
(5)同(3)法洗滌3次；(6)每孔加入ΙΟΟμΙ雜交瘤培養(yǎng)上清，37°C溫箱孵育Ih(骨髓瘤細胞培養(yǎng)液為陽性對眧).
(7)同(3)法洗滌3次；
(8)每孔加入50μ1提純的LCDV(15μδ/孔)，PBS代替LCDV為陰性對照，22°C孵育4h ；
(9)同(3)法洗滌3次；
(10)每孔加入ΙΟΟμΙ兔抗LCDV抗體，1 1000稀釋，37°C溫箱孵育Ih ；
(11)同(3)法洗滌3次；
(12)堿性磷酸酶標記的羊抗兔Ig(1:1000稀釋)按每孔ΙΟΟμΙ加入至酶標板，37°C溫箱孵育Ih ；
(13)同(3)法洗滌3次；然后每孔加入ΙΟΟμΙρΝΡΡ應用液，暗處反應5 — 20min，每孔加入50μ1 2Μ的NaOH，穩(wěn)定3 — 5min即可用405nm工作波長測定OD值；
(14)按照阻斷率=(0D卩日性對照-OD實驗組)/0D卩日性對照X100%計算阻斷率，當抑制率大于50% 時為陽性結果。結果陽性0. 4247 ；單抗G :0. 1434 ；陰性0. 0883 ；阻斷率為66. 2%。此結果證實本發(fā)明單抗G具有阻斷病毒結合受體蛋白的能力(圖6)。活細胞感染阻斷法和阻斷酶聯(lián)免疫吸附法證明本發(fā)明的單抗G可以在活細胞內(nèi)或細胞外阻斷LCDV與27. SkDa受體蛋白的結合，進而阻斷LCDV對細胞的入侵。因此，本發(fā)明的單抗G可以作為弄清LCDV與宿主細胞相互作用關系及其感染機理的重要工具，也為尋找阻斷LCDV感染的途徑提供了技術手段。單抗G或經(jīng)過改造的基因工程抗體可成為魚類 LCDV的治療藥物或疫苗，通過口服或注射等方式進入魚體內(nèi)，為預防或治療魚類淋巴囊腫病毒病起積極作用。本領域的普通技術人員都會理解，在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)，對于上述實施例進行修改，添加和替換都是可能的，都沒有超出本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種抗淋巴囊腫病毒27. SkDa受體蛋白的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體是由名稱為雜交瘤細胞ALR，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為 CCTCC C201128，保藏日期為2011年4月25日的雜交瘤細胞ALR分泌的。
2.一種如權利要求1所述抗淋巴囊腫病毒27. SkDa受體蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于它包括如下步驟培養(yǎng)并收集牙鲆鰓細胞，經(jīng)細胞裂解及差速離心得到其細胞膜蛋白，利用電泳切膠回收提純LCDV 27. SkDa受體蛋白，以其為抗原免疫Balb/c小白鼠，采用細胞融合制備雜交瘤細胞，經(jīng)過免疫學檢測篩選方法，篩選出分泌抗淋巴囊腫病毒 27. SkDa受體蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞ALR，收集雜交瘤細胞株ALR培養(yǎng)上清液，經(jīng)純化后即得到抗淋巴囊腫病毒27. SkDa受體蛋白單克隆抗體，并采用免疫學鑒定方法鑒定 27. 8kDa受體蛋白。
3.如權利要求2所述抗淋巴囊腫病毒27.SkDa受體蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的免疫學檢測篩選方法包括間接酶聯(lián)免疫吸附法與轉印免疫印跡法。
4.如權利要求2所述抗淋巴囊腫病毒27.SkDa受體蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的免疫學鑒定方法包括間接免疫熒光法、膠體金標記免疫電鏡法、阻斷酶聯(lián)免疫吸附法和活細胞感染阻斷實驗。
5.如權利要求4所述抗淋巴囊腫病毒27.SkDa受體蛋白的單克隆抗體的制備方法， 其特征在于所述的阻斷酶聯(lián)免疫吸附法包括以下步驟將提純的牙鲆鰓細胞膜蛋白以每孔 ΙΟΟμΙ加入96孔酶標板中，4°C包被過夜；吸出包被液，PBST洗滌3次，每次5min ；每孔加入 200μ1 3%的牛血清白蛋白，37°C封閉Ih ；洗滌3次后，每孔加入雜交瘤細胞培養(yǎng)液ΙΟΟμΙ， 以骨髓瘤細胞培養(yǎng)液為陽性對照，37°C孵育Ih ；洗滌3次后，每孔加入50μ1提純的淋巴囊腫病毒，以PBS代替IXDV為陰性對照，22°C孵育4h ；洗滌3次后，每孔加入ΙΟΟμΙ以純化的淋巴囊腫病毒免疫新西蘭白兔制備的兔抗淋巴囊腫病毒抗體，1:1000稀釋，37°C溫箱孵育 Ih ；洗滌3次后，每孔加入1:1000稀釋的堿性磷酸酶標記的羊抗兔IglO(^l，37°C孵育Ih ； 每孔加入4-硝基酚磷酸鹽發(fā)色液100μ1，暗處反應5-30min，每孔加入50μ1 2Μ的NaOH終止發(fā)色，穩(wěn)定3-5min，以酶標儀測各孔405nm波長處的OD值；按照阻斷率=(0D卩日性對照-OD實驗組)/ODhwm X 100%計算阻斷率，當阻斷率大于50%時為陽性結果。
6.如權利要求4所述抗淋巴囊腫病毒27.SkDa受體蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的活細胞感染阻斷實驗包括以下步驟將生長旺盛的牙鲆鰓細胞接種到96 孔板中，每孔100μ1，22 ，2% CO2培養(yǎng)，待細胞長成單層，用無菌PBS清洗1_2遍；將雜交瘤細胞培養(yǎng)液過濾后接種至單層細胞上，每孔40μ1，22 孵育4h，以骨髓瘤細胞培養(yǎng)液為陽性對照；吸出抗體，無菌PBS清洗3遍，每孔加入40μ 2_2淋巴囊腫病毒，22°C吸附Ih后， 加入10(^1含洲血清的細胞維持液，22°C，2% CO2培養(yǎng)；每天在倒置顯微鏡下觀察細胞病變 (CPE)，并進行拍照。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗淋巴囊腫病毒27.8kDa受體蛋白的單克隆抗體，所述的單克隆抗體是由名稱為雜交瘤細胞ALR，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC C201128，保藏日期為2011年4月25日的雜交瘤細胞分泌的。本發(fā)明的單克隆抗體在活細胞感染阻斷實驗中能與牙鲆鰓細胞膜上的LCDV27.8kDa受體蛋白特異性結合，阻止LCDV吸附于27.8kDa受體蛋白并與其結合進而感染FG細胞，因此本發(fā)明的單抗G具有阻斷LCDV侵染FG細胞的功能。本發(fā)明的單抗G可以為弄清LCDV與宿主細胞相互作用關系及其感染機理提供重要工具，為尋找阻斷LCDV感染的途徑提供技術手段。
文檔編號G01N33/577GK102206278SQ20111011631
公開日2011年10月5日 申請日期2011年5月6日 優(yōu)先權日2011年5月6日
發(fā)明者戰(zhàn)文斌, 汪沐, 繩秀珍, 邢婧 申請人:中國海洋大學